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Immunology and Infection

कम कॉपी नंबर का पता लगाने एकीकृत वायरल डीएनए में द्वारा गठित इन विट्रो हेपेटाइटिस बी संक्रमण

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58202
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University Hospital, 2Gastroenterology and Liver Research Laboratory, Ingham Institute, 3German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

हम यहां का वर्णन इन विट्रो पीढ़ी में एक हेपेटाइटिस बी वायरस संक्रमण प्रणाली के माध्यम से एचबीवी डीएनए और इसके (1-2 प्रतियां) का अत्यधिक संवेदनशील पता लगाने व्युत्क्रम नेस्टेड पीसीआर का उपयोग कर एकीकरण ।

Abstract

हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) एक आम रक्त जनित रोगज़नक़ जिगर कैंसर और जिगर सिरोसिस के कारण पुरानी संक्रमण से उत्पन्न होता है । वायरस आम तौर पर एक episomal डीएनए मध्यवर्ती के माध्यम से दोहराने; हालांकि, मेजबान जीनोम में एचबीवी डीएनए टुकड़े के एकीकरण मनाया गया है, भले ही इस फार्म वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक नहीं है । सटीक प्रयोजन, समय, और तंत्र (ओं) द्वारा जो एचबीवी डीएनए एकीकरण होता है अभी तक स्पष्ट नहीं है, लेकिन हाल के आंकड़ों से पता चलता है कि यह संक्रमण के बाद बहुत जल्दी होता है । यहां, इन विट्रो पीढ़ी और एचबीवी डीएनए एकीकरण का पता लगाने में विस्तार से वर्णित हैं । हमारे प्रोटोकॉल विशेष रूप से वायरस सेल डीएनए एकीकरण की एकल प्रतियां परिलक्षित करता है और दोनों निरपेक्ष ठहराव और जंक्शन अनुक्रम के एकल आधार जोड़ी संकल्प की अनुमति देता है । विभिंन एचबीवी म्यूटेंट के लिए विभिंन एचबीवी-अतिसंवेदनशील सेल प्रकारों (प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स सहित), और विभिंन दवा जोखिम के साथ संयोजन के रूप में इस तकनीक को लागू किया गया है । हम इस तकनीक की उंमीद एक चाबी परख बनने के लिए इस नैदानिक प्रासंगिक घटना के अंतर्निहित आणविक तंत्र का निर्धारण ।

Introduction

एचबीवी एक डबल-कतरा डीएनए वायरस है कि जीवन भर पुराने संक्रमण का कारण बन सकता है, लीवर सिरोसिस और hepatocellular कार्सिनोमा (HCC)1,2,3के लिए अग्रणी । जबकि वहां कई आणविक एचबीवी हठ4 ड्राइविंग तंत्र रहे है (जैसे, epigenetic वायरल transcriptional टेंपलेट के उच्च स्थिरता, प्रतिरक्षा निगरानी के चोरी, और जिगर में हेपैटोसाइट्स के कम कारोबार) और उससे जुड़े HCC दीक्षा के जोखिम5,6 (जैसे, पुरानी सूजन और सेलुलर तनाव रास्ते के सक्रियकरण), मेजबान सेल जीनोम में एचबीवी डीएनए एकीकरण (इन घटनाओं के दोनों के लिए एक रिपोर्ट तंत्र) खराब अध्ययन किया गया है . एक प्रमुख कारण एचबीवी के लिए इन विट्रो संक्रमण प्रणालियों में उपयुक्त की कमी है जो एकीकरण की घटनाओं का विश्वसनीय पता लगाने की अनुमति देते हैं । यहां, हम इन विट्रो पीढ़ी और एचबीवी डीएनए एकीकरण कि अंतर्निहित आणविक तंत्र और तत्संबंधी स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का पता लगाने के लिए एक हाल ही में विकसित प्रोटोकॉल का वर्णन ।

एचबीवी प्रतिकृति और एचबीवी डीएनए एकीकरण के गठन के पहले7विस्तार में समीक्षा की गई है । संक्षेप में, एचबीवी8,9संक्रमण के लिए मुख्य सेलुलर रिसेप्टर के रूप में सोडियम Taurocholate सह-परिवहन पेप्टाइड (NTCP) का उपयोग कर हेपैटोसाइट्स में प्रवेश करती है । एचबीवी-आराम परिपत्र डीएनए (rcDNA) जीनोम युक्त एचबीवी nucleocapsids नाभिक में प्रवेश करती है, जहाँ rcDNA episomal covalently बंद परिपत्र डीएनए (cccDNA) में परिवर्तित हो जाता है । परमाणु cccDNA वायरल mRNAs और पूर्व जीनोमिक आरएनए (pgRNA)10के लिए transcriptional टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है । एचबीवी पोलीमरेज़ और pgRNA तो नए बनते nucleocapsids (एचबीवी कोर प्रोटीन dimers से बना) में पैक कर रहे हैं । एचबीवी pgRNA रिवर्स है nucleocapsid के भीतर टाइप, या तो एक rcDNA जीनोम में जिसके परिणामस्वरूप या एक डबल-कतरा रैखिक डीएनए (dslDNA) 11 जीनोम,12। ये परिपक्व nucleocapsids युक्त एचबीवी डीएनए जीनोम अंत में लिफाफे और virions के रूप में निर्यात कर रहे हैं ।

dslDNA अणुओं युक्त द्वारा हेपैटोसाइट्स का संक्रमण मेजबान सेल जीनोम13में वायरल एकीकरण में परिणाम कर सकते हैं, प्रतिकृति करने के लिए अग्रणी-एचबीवी डीएनए7,14,15के अक्षम रूपों । एचबीवी डीएनए एकीकरण गुणसूत्र के स्थल पर होता है डबल असहाय डीएनए टूटता है15। सबूत जमते पता चलता है कि प्रत्येक एकीकरण घटना मेजबान सेल जीनोम16,17के भीतर एक अनिवार्य रूप से यादृच्छिक स्थिति में होता है । इसके अलावा, एचबीवी डीएनए एकीकरण होता है कुछ शायद ही कभी, 1 प्रति 104 कोशिकाओं13,18,19,20की दर से । एचबीवी डीएनए एकीकरण के बारे में महत्वपूर्ण सवाल अनुत्तरित रहते हैं, विशेष रूप से शामिल सटीक आणविक रास्ते के बारे में, वायरल और मेजबान कारकों पर निर्भरता, वायरल एकीकृत रूपों से व्यक्त एंटीजन, और उनके संभावित योगदान वायरल हठ7के लिए । हम एक इन विट्रो मॉडल में स्थापित किया है इन सवालों में से कुछ पर प्रकाश डाला ।

एचबीवी डीएनए एकीकरण घटनाओं की दुर्लभ वस्तु (सेल प्रति एकीकरण दर के संबंध में और प्रत्येक अद्वितीय एकीकरण की प्रतिलिपि संख्या के लिए) इन विट्रो में एचबीवी संक्रमण मॉडल उन्हें पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाने के लिए. सेल बँटवारा हमारे इन विट्रो प्रणाली में सीमित है, के रूप में विभाजित कोशिकाओं कुशल संक्रमण का समर्थन नहीं करते. इस प्रकार, रोगी जिगर के ऊतकों के विपरीत जहां हेपैटोसाइट्स के महत्वपूर्ण क्लोनल विस्तार18,19,20, बहुत कुछ होता है (1 से 2) प्रत्येक एकीकरण की प्रतियां इन विट्रो में संक्रमित कोशिकाओं के एक दिए गए पूल में मौजूद हैं . हमने यह भी पाया है कि एकीकरण मुख्य रूप से हेपैटोसाइट्स के प्रारंभिक संक्रमण के दौरान होता है (और लगातार नहीं जीर्ण-संक्रमित हेपैटोसाइट्स में)13. तदनुसार, एचबीवी डीएनए एकीकरण एक लंबी अवधि के लिए बस संवर्धन कोशिकाओं द्वारा नहीं बढ़ाया जा सकता है ।

सामान्य तौर पर, पहले एकीकृत एचबीवी डीएनए का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, दक्षिणी दाग सहित संकरण21,22,23,24,25, Alu-पीसीआर26,27 , कैसेट-मध्यस्थता बंधाव पीसीआर28, और पूरे जीनोम अनुक्रमण29,30,31,३२,३३, का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता नहीं है एकल-एकीकरणों की प्रतियां । हम और अंय शोधकर्ताओं ने उलटा नेस्टेड पीसीआर (invPCR) का इस्तेमाल किया है बतख, woodchuck में hepadnaviral डीएनए एकीकरण का पता लगाने, और मानव संक्रमित जिगर13,14,18,19, ३४,३५,३६. दूसरों invPCR तकनीक है कि झूठी सकारात्मक संकेतों की पीढ़ी को बदल सकता है और३७ठहराव के लिए क्षमता को सीमित करने के लिए प्रक्रियात्मक संशोधनों शुरू की है । यदि परख बाहर किया जाता है के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, invPCR एक विशिष्ट और संवेदनशील परख कि पहचानती है और quantifies (निरपेक्ष प्रति संख्या में) एकाधिक एचबीवी डीएनए एकीकरण का प्रतिनिधित्व करता है । एचबीवी-सेल डीएनए जंक्शन एक एकल आधार युग्म संकल्प पर अनुक्रम है,13एकीकरण की साइटों पर वायरल और मेजबान डीएनए दृश्यों के bioinformatical अध्ययन की अनुमति ।

हम पहले से३८ परिणामों के डीएनए पर invPCR से एचबीवी-संक्रमित ऊतक स्रोतों की एक बड़ी रेंज से निकाले, स्नैप-जमे हुए जिगर के ऊतकों, आयल-एंबेडेड जिगर वर्गों सहित, और बहुत छोटे ऊतक नमूने द्वारा पृथक वर्णित है लेजर-microdissection19. इस प्रोटोकॉल एक invPCR परख के एक अद्यतन संस्करण की रूपरेखा सेल संस्कृति से निकाले डीएनए का उपयोग कर-के बाद इन विट्रो संक्रमण, जिसमें एकीकरण के कम कॉपी संख्या (1-2 एकीकरण प्रति प्रतियां) उत्पंन कर रहे हैं । एचबीवी डीएनए में गठित इन विट्रो उन रोगी ऊतकों में पाया सेलुलर जीनोम और जंक्शन पर वायरल अनुक्रम है कि13एकीकृत है,16के भीतर उनके वितरण के संबंध में, एक सुझाव एक संक्रमित जिगर के भीतर के लिए तुलनीय मार्ग ।

Protocol

1. सेल संक्रमण और डीएनए निष्कर्षण

  1. बनाए रखने के Huh7-NTCP कोशिकाओं8,9 Dulbecco है संशोधित ईगल के माध्यम में (DMEM) 10% v/वी भ्रूण गोजातीय सीरम, 1x पेनिसिलिन/Streptomycin, और 2 मिमी L-glutamine के साथ पूरक ।
    नोट: यह पहले विवरण४०में रिपोर्ट किया गया है ।
  2. बीज 2 x 105 कोशिकाओं/एमएल Huh7-NTCP कोशिकाओं DMEM की 1 मिलीलीटर के साथ एक 12-अच्छी तरह से थाली में ।
  3. यदि परीक्षण सेल उपचार (जैसे, एचबीवी अवरोधकों), उंहें संस्कृति supernatant 4 एच के लिए बोने के बाद लागू (1 दिन एचबीवी संक्रमण से पहले) । एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, लागू २०० एनएम Myrcludex बी (एक शक्तिशाली एचबीवी प्रवेश अवरोध करनेवाला४१) ।
  4. का प्रयोग करें हेपरिन-स्तंभ शुद्ध४२ supernatant HepAD38४३ से एक इनोक्युलम के रूप में संक्रमित कोशिकाओं को १,००० VGE/सेल में ५०० µ संस्कृति मीडिया के एल (DMEM के साथ पूरक 10% v/v भ्रूण गोजातीय सीरम, 1x पेनिसिलिन/Streptomycin, 2 मिमी L-glutamine, और २.५% v/ DMSO), जिसमे 4% w/v पॉलीथीन ग्लाइकोल ८००० [भंग 1x फास्फेट में बफर खारा (पंजाब)] ।
  5. संस्कृति एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में कोशिकाओं (5% सह2 और ९०% आर्द्रता पर सेट) ।
  6. 16-24 एच के बाद संक्रमण में बाँझ 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
  7. संस्कृति मीडिया हर 2 दिन बदलें एचबीवी संक्रमण के बाद जब तक फसल ।
  8. 3 दिन के बाद संक्रमण, 5 µ एम Tenofovir disoproxil और 10 µ मीटर Lamivudine के साथ कोशिकाओं का इलाज एचबीवी द्वारा परिवर्धित मध्यवर्ती है कि invPCR के द्वारा परिलक्षित मध्यस्थों के उत्पादन को सीमित करने के लिए ।
  9. 5 दिन के बाद संक्रमण, Trypsin-EDTA के २०० µ L के साथ कोशिकाओं को trypsinize करें और उन्हें DMEM के 2 मिलीलीटर (10% v/v भ्रूण गोजातीय सीरम, 1x पेनिसिलिन/Streptomycin, और 2 mM l-glutamine) में पुनर्निलंबित करें, साथ ही 5 µ m Tenofovir disoproxil और 10 µ m भी शामिल है Lamivudine ।
  10. एक 6-अच्छी प्लेट के लिए सेल सस्पेंशन का बँटवारा के एक दौर प्रेरित करने के लिए स्थानांतरण (जो एचबीवी cccDNA४४ और अन्य एचबीवी डीएनए मध्यवर्ती है कि invPCR द्वारा परिवर्धित कर रहे हैं के नुकसान के प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया है).
  11. 7 दिन के बाद संक्रमण, Trypsin-EDTA के ४०० µ l में विस्तारित कोशिकाओं trypsinize और DMEM के 1 मिलीलीटर में मिश्रण resuspend । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में सस्पेंशन प्लेस, 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली, और आकांक्षा से supernatant हटा दें ।
  12. वैकल्पिक वे डीएनए निष्कर्षण के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर सेल छर्रों स्टोर.
  13. सेल गोली से डीएनए निकालें एक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर, के रूप में निर्माता के निर्देशों के अनुसार । अंतिम डीएनए एकाग्रता का अनुमान ऑप्टिकल densitometry का उपयोग कर ।
    नोट: एक १०० μL रेफरेंस वॉल्यूम में डीएनए यील्ड आम तौर पर ~ 250-400 एनजी/μL है ।

2. डीएनए का उलटा

  1. Aliquot ~ 1.5 – 2.5 μg कुल डीएनए निकालने के चरण 1 से एक २०० μL पीसीआर ट्यूब में । एक ४० μL प्रतिक्रिया में परिणाम करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम मास्टर-मिश्रण की उचित मात्रा में जोड़ें 1x डाइजेस्ट प्रतिक्रिया बफर युक्त (जैसे, CutSmart बफर) और 10 U NcoI-HF ।
  2. अच्छी तरह से प्रतिक्रियाओं मिश्रण और एक छोटे ट्यूब केंद्रापसारक में नीचे स्पिन । इष्टतम पाचन क्षमता के लिए 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पीसीआर मशीन में प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया मशीन ।
  3. 20 मिनट के लिए ८० ° c पर मशीन द्वारा प्रतिबंध एंजाइम को निष्क्रिय ।
  4. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए पूरे प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया स्थानांतरण । 1x टी-4 डीएनए ligase बफर के ४०० μL और टी-4 डीएनए ligase के ५०० यू जोड़ें और इसे अच्छी तरह से मिलाएं । बड़ी प्रतिक्रिया मात्रा अंतर आणविक को प्रोत्साहित करती है (के रूप में गैर आणविक) पचा डीएनए टुकड़े के बंधाव का विरोध किया ।
  5. 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर बंधाव प्रतिक्रिया मशीन पूरा बंधाव सुनिश्चित करने के लिए ।
  6. 20 मिनट के लिए ७० ° c पर टी-4 डीएनए ligase को निष्क्रिय.
  7. टी-4 ligase की पूरी निष्क्रियता सुनिश्चित करने के लिए 10% w/v सोडियम dodecyl सल्फेट के 10 μL जोड़ें ।
  8. मिश्रण नाड़ी भंवर और संक्षेप में प्रतिक्रिया मिश्रण नीचे स्पिन द्वारा ट्यूबों । १०० मिमी और dextran के अंतिम एकाग्रता के लिए NaCl जोड़ें (35-45 केडीए) ९० µ g/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए । मिश्रण नाड़ी भंवर और संक्षेप में प्रतिक्रिया मिश्रण नीचे स्पिन द्वारा ट्यूबों ।
  9. १००% इथेनॉल के ९०० μL जोड़ें और उलटा द्वारा मिश्रण । -20 ° c रातोंरात डीएनए में हाला ।
  10. 15 मिनट के लिए १४,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा उपजी डीएनए गोली. एक P200 पिपेट के साथ आकांक्षा द्वारा supernatant निकालें । 15 मिनट के लिए १४,००० x जी में ७०% v/v इथेनॉल और केंद्रापसारक के ५०० μL के साथ गोली धो लो ।
  11. एक P200 पिपेट के साथ आकांक्षा द्वारा इथेनॉल निकालें । एयर-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए गोली सूखी ।
  12. एच2ओ के 20 μL में गोली भंग. एक प्रतिबंध एंजाइम मास्टर के 20 μL जोड़ें-मिश्रण एक ४० μL प्रतिक्रिया में परिणाम के लिए 1x डाइजेस्ट प्रतिक्रिया बफर, बीएसआईHKAI के 5 यू, और Sphके 5 u-HF । मशीन एक में प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया हीट-३७ डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक ( SphI-HF के लिए इष्टतम तापमान) 1 एच के लिए
  13. संक्षेप में प्रतिक्रिया मिश्रण नीचे स्पिन । 1 एच के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस ( बीएसआईHKAI के लिए इष्टतम तापमान) में एक गर्मी ब्लॉक में प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया मशीन ।
  14. संक्षेप में प्रतिक्रिया मिश्रण नीचे स्पिन ।
  15. अगले कदम तक-20 डिग्री सेल्सियस पर उल्टे डीएनए की दुकान ।

3. नेस्टेड पीसीआर

  1. एक पुन: प्रयोज्य सिलिकॉन चटाई सील से संभावित amplicons निकालें एक डीएनए क्षरण समाधान का उपयोग कर, अच्छी तरह से डीएनए के साथ चटाई कुल्ला मुक्त पानी, और हवा-यह कमरे के तापमान पर शुष्क जबकि पीसीआर मिश्रण तैयार ।
  2. बाहरी फॉरवर्ड (5 '-टीटीसी GCT टीसीए CCT CTG CAC G-3 ') और रिवर्स (5 '-एएए GGA CGT सीसीसी GCG सीएजी-3 ') प्राइमरों से युक्त एक 1x पीसीआर मिक्स की 1 मिलीलीटर तैयार करें ०.५ µ मीटर की एकाग्रता पर ।
  3. एक ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में वेल्स A1 और E1 के लिए 1x पीसीआर मिक्स के १७० μL जोड़ें ।
  4. द 1x पीसीआर मिक्स के १२० μL को वेल्स B1 से H1 में जोड़ें ।
  5. उल्टे डीएनए के 10 μL को स्टेप 2 से कुएं में डालें A1 और E1 (2 अलग उल्टे नमूने एक ही पीसीआर प्लेट पर विश्लेषण किया जा सकता है) । एक अच्छी तरह से प्रत्येक के बारे में 10 बार pipetting १०० μL के लिए सेट P1000 का उपयोग करके प्रतिक्रिया मिश्रण ।
  6. प्रश्नपत्र 1:3 के अनुपात में वेल्स A1 से D1 के नमूने को हर कदम पर ६० μL स्थानांतरित करके पतला । हर कदम पर कुओं मिश्रण धीरे से उंहें pipetting के बारे में 10 बार १०० μL के लिए सेट P1000 का उपयोग करके । बुलबुले बनाने से बचें । खैर E1 के लिए कदम ३.६ दोहराएँ, अच्छी तरह से H1 के लिए नीचे कमजोर.
  7. Aliquot 10 μL वेल्स से एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग कर मिश्रण के कुओं में A1-H1 A2-H2, A3-H3, और इतने पर ९६-well थाली के कुओं A12-H12 तक पहुँचने तक. मजबूती से दबाने, कदम ३.१ से सूखी सिलिकॉन चटाई के साथ पीसीआर प्लेट को कवर ।
  8. एक पीसीआर मशीन में थाली प्लेस और निंनलिखित कार्यक्रम चलाने के लिए: ९५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट; 15 एस के ३५ चक्र ९५ डिग्री सेल्सियस, 15 एस पर ५४ ° c और 3 मिनट में ७२ ° c; ७२ डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट; फिर, कमरे के तापमान पर थाली पकड़ो ।
  9. एक Bunsen बर्नर के साथ लाल-गर्म करने के लिए एक ९६-पिन रेप्लिकेटर के पिन गर्मी और फिर कमरे के तापमान पर कम से कम 5 मिनट के लिए शांत ।
  10. 1x पीसीआर मिक्स (एक जेल लोड करने के लिए तैयार बफर युक्त) के 10 μL के साथ एक दूसरी पीसीआर प्लेट के कुओं भरें और भीतरी आगे (5 '-CGC ATG झूठ एसीसी एसीसी GTG ए-3 ') और रिवर्स (5 '-CAC AGC CTA जीसीए जीसीसी ATG जी-3 ') पर ०.५ µ मी.
  11. ध्यान रहे कि पहले दौर की पीसीआर से ९६-खैर प्लेट की पीसीआर प्लेट से सिलिकॉन की चटाई निकाल लें और कुओं के बीच-बीच में क्रॉस-प्रदूषित होने से बचें ।
  12. फर्स्ट राउंड पीसीआर से ९६-वेल प्लेट के पीसीआर प्रॉडक्ट्स को नवनिर्मित aliquoted ९६-वेल प्लेट में ट्रांसफर करने के लिए कूल्ड रेप्लिकेटर का इस्तेमाल करें । नेस्टेड पीसीआर कदम ३.८ में, के रूप में एक ही स्थिति का उपयोग कर प्रारंभिक विकार कदम ९५ ° c से 10 मिनट से 2 मिनट के लिए बदलने के लिए छोड़कर बाहर ले ।

4. पीसीआर उत्पाद अलगाव और जेल निष्कर्षण

  1. जेल ट्रो द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण एक ९६-१.३% w/वी agarose जेल के साथ अच्छी तरह से उपयोग कर । एक १०० मिलीलीटर agarose जेल के लिए, 10-15 मिनट के लिए २०० V पर चला रहे हैं ।
  2. डिस्पोजेबल पीने के तिनके का उपयोग कर agarose जैल से डीएनए बैंड एक्साइज । प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के लिए, भूसे और agarose जेल प्लग एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में जगह और भूसे कैंची के साथ आकार करने के लिए ट्रिम कर दीजिए ।
    नोट: यह बैंड केवल उन कमजोर पड़ने से जिसमें एकल पीसीआर उत्पादों को हल किया जा सकता से अलग करने के लिए पर्याप्त है ।
  3. वैकल्पिक बाद में निष्कर्षण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों की दुकान ।
  4. भूसे के टुकड़े के अंत पर फैलाएंगे द्वारा प्रत्येक ट्यूब में agarose प्लग निकालें । जोड़ें ३०० μL जेल निष्कर्षण बफर और 5 जेल निष्कर्षण कांच मनका घोल के μL प्रत्येक ट्यूब के लिए ।
  5. जेल निष्कर्षण किट के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर उत्पादों को निकालने (धोने चरणों के लिए आधे संस्करणों का उपयोग कर के अलावा) और पानी की 30 μL के साथ मोतियों से डीएनए elute ।
  6. (आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के अनुसार) एक दूसरे दौर नेस्टेड पीसीआर में इस्तेमाल आगे प्राइमर के साथ के रूप में सैंज अनुक्रमण के लिए शुद्ध डीएनए सबमिट करें ।

5. अनुक्रम विश्लेषण

  1. न्यूक्लियोटाइड ब्लास्ट विश्लेषण प्रदर्शन द्वारा वायरस सेल डीएनए जंक्शनों की पुष्टि करें (पूरे न्यूक्लियोटाइड संग्रह करने के लिए संरेखित डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करके) ।
    नोट: प्रतिनिधि परिणाम नीचे चित्रा 3 में विस्तृत रहे हैं.
    1. यदि अनुक्रम का केवल आंशिक संरेखण मनाया जाता है, तो फिर से एक विस्फोट विश्लेषण चलाने से पहले 5 ' एचबीवी डीएनए अनुक्रम ट्रिम कर दीजिए ।
  2. यदि किसी दिए गए अनुक्रम एक सत्य एकीकरण जंक्शन निम्नानुसार का प्रतिनिधित्व करता है यह निर्धारित करने के लिए कड़े चयन मापदंड लागू करें:
    1. सेलुलर जीनोम के लिए आत्मविश्वास मानचित्रण के लिए एक सेलुलर अनुक्रम के > 20 बीपी युक्त केवल दृश्यों को शामिल करें ।
    2. किसी भी दृश्य है कि किसी भी वायरस-सेल एकीकरण जंक्शन के 10 बीपी के भीतर इस्तेमाल किया एंजाइमों के प्रतिबंध साइटों को शामिल उपेक्षा, के रूप में वे की संभावना इन विट्रो बंधाव घटनाओं के बजाय सच एकीकरण जंक्शनों में प्रतिनिधित्व करते हैं ।
    3. sequencing chromatographs में माना जाता एकीकरण जंक्शन के दोनों ओर स्पष्ट समान पीक प्रतिदीप्ति स्तरों के साथ किसी भी अनुक्रम उपेक्षा, इन की संभावना है कि sequencing प्रतिक्रिया के दौरान पार-संदूषण द्वारा उत्पन्न कलाकृतियों रहे हैं या केशिका क्रोमैटोग्राफी ।
    4. वायरस सेल जंक्शन पर सटीक एचबीवी और सेलुलर दृश्यों के साथ उन लोगों के रूप में अद्वितीय एकीकरण घटनाओं को परिभाषित करें ।
      नोट: अद्वितीय एकीकरण घटनाओं की पुनरावृत्ति पीसीआर के दौरान उन एकीकरण या पार-संदूषण युक्त कोशिकाओं के क्लोनल विस्तार से परिणाम कर सकते है (जो नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है, और प्रतिनिधि परिणामों में विस्तृत नीचे) । विशिष्ट सेलुलर अनुक्रम में दोहराया एकीकरण प्रत्येक एकीकरण घटना के लिए अलग एचबीवी टर्मिनल साइटों को प्रदर्शित करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं, के रूप में गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने रास्ते15इस्तेमाल कर रहे हैं.
  3. कि कमजोर पड़ने पर पता चला वायरस सेल जंक्शनों की संख्या से उल्टे डीएनए टेम्पलेट्स के कमजोर पड़ने कारक गुणा करके एकीकरण आवृत्ति की गणना, व्युत्क्रम प्रतिक्रिया में कुल डीएनए इनपुट की राशि के लिए सामान्यीकरण के बाद. सामान्यतया, एकीकरण आवृत्ति 1:104 कक्षों के क्रम पर है ।

Representative Results

invPCR तकनीक का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1में दिखाया गया है । एक सफल invPCR का एक उदाहरण agarose जेल ट्रो से पहले और बाद में पीसीआर उत्पाद अलगाव चित्रा 2 में दिखाया गया है । चित्रा 3 के मामलों में ५.१ कदम से विस्फोट विश्लेषण उत्पादन से पता चलता है (i) वायरस के प्रवर्धन-सेल डीएनए जंक्शन और (द्वितीय) एक एचबीवी डीएनए नकल मध्यस्थ के प्रवर्धन.

सकारात्मक नियंत्रण से अपेक्षित परिणाम: Huh7-NTCP ऊपर वर्णित के रूप में हेपरिन-शुद्ध एचबीवी शेयरों से संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 1) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकते हैं । इस उदाहरण में, एकल पीसीआर उत्पादों प्रत्येक नमूने के दूसरे या तीसरे 1:3 कमजोर पड़ने से प्राप्त किया जाना चाहिए (इसी के लिए ~ 104 कमजोर पड़ने प्रति सेल समकक्ष, चित्रा 2) । इन कमजोर पड़ने पर, उत्पादों के लगभग ५०% सच वायरस-सेल डीएनए जंक्शनों का प्रतिनिधित्व करेंगे, जबकि अंय आधा एचबीवी डीएनए मध्यवर्ती (चित्रा 3) के प्रवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है ।

पिछले अध्ययन13में, हम दोहराया वायरस सेल जंक्शनों के कुछ उदाहरणों पाया है, कोई सेलुलर जीनोमिक साइटों अधिमानी एचबीवी डीएनए एकीकरण का सुझाव । हम यह भी पाते है कि >वायरस के ८०%-सेल जंक्शनों न्यूक्लियोटाइड १७३२ और १८३२ के बीच होते है (एचबीवी जीनोटाइप डी के न्यूक्लियोटाइड क्रमांकन के अनुसार, GenBank प्रवेश #U95551 .1), जहां उत्तरार्द्ध एचबीवी dslDNA फार्म का सही हाथ टर्मिनस का प्रतिनिधित्व करता है । सच वायरस के जुगाड़-सेल जंक्शनों में हमारी विधि के माध्यम से मिला इन विट्रो प्रयोगों पर सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है GenBank (प्रवेश संख्या MH057851 करने के लिए MH058006).

ऋणात्मक नियंत्रणों से अपेक्षित परिणाम: या तो संक्रमित Huh7-NTCP कक्ष या inoculated Huh7-NTCP कक्षों Myrcludex B के साथ पूर्व-इलाज नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य कर सकते हैं । इन कोशिकाओं से निकाले गए डीएनए का InvPCR विश्लेषण कोई पीसीआर उत्पादों का उत्पादन करना चाहिए । सकारात्मक नमूने के रूप में एक ही पीसीआर प्लेट पर इन नकारात्मक नियंत्रण नमूने चल रहे नेस्टेड-पीसीआर प्रक्रिया के दौरान पार संदूषण के परीक्षण के लिए अनुमति देता है । क्रॉस-संदूषण के लिए सबसे कड़े परीक्षण कुओं में एक नकारात्मक नियंत्रण के नमूने ए डी और एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट पर कुओं ई एच में सकारात्मक नमूना के चल रहा है । इस मामले में, सकारात्मक नमूने के सबसे केंद्रित कमजोर पड़ने के नकारात्मक नमूना के कम केंद्रित कमजोर पड़ने के लिए सीधे आसंन एक पंक्ति में चलाया जाता है । यदि प्रवर्धन उत्पादों नकारात्मक नियंत्रण नमूनों में मनाया जाता है, इस चर्चा में सुझाव दिया उपायों को पार करने के लिए संदूषण घटनाओं को कम ।

Figure 1
चित्रा 1: एचबीवी डीएनए एकीकरण का पता लगाने के लिए invPCR प्रक्रिया का योजनाबद्ध आंकड़ा. एचबीवी संक्रमण के बाद, केवल Huh7-NTCP कोशिकाओं के एक अल्पसंख्यक एचबीवी dslDNA (लाल) मेजबान सेल जीनोम (लाल), शीर्ष अनुभाग में चित्रित में एकीकृत होते हैं । कुल डीएनए तो कोशिकाओं से निकाला जाता है (चरण 1), औंधा (चरण 2), और नेस्टेड पीसीआर द्वारा परिवर्धित (चरण 3). दिखाया गया है कि उत्पाद वायरस-सेल डीएनए जंक्शन में प्रतिबंध एंजाइम साइटों (Ncoमैं और बीएसआईHKAI) के सापेक्ष पदों रहे हैं । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन13से अनुकूलित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Agarose जेल ट्रो और एक सफल invPCR के बाद जेल निष्कर्षण । "एम" डीएनए मार्कर सीढ़ी का प्रतिनिधित्व करता है । 12 की प्रत्येक पंक्ति पीसीआर प्लेट पर एक एकल कमजोर पड़ने पर तकनीकी प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है । प्रति पीसीआर प्लेट/agarose जेल में दो उल्टे डीएनए नमूने चलाए जा सकते हैं । प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए पीसीआर उत्पादों ~ 1:3 अनुपात में बाहर अनुमापन चाहिए । एचबीवी डीएनए एकीकरण दर अंत बिंदु अनुमापन द्वारा निर्धारित किया जाता है के रूप में एक बैंड आसानी से अलग हो सकता है, जहां दो से कम ध्यान केंद्रित कमजोर पड़ने से उत्पादों की निष्कर्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: invPCR उत्पाद दृश्यों का विस्फोट विश्लेषण । अनुक्रम के लंबे समय तक के रूप में सैंज sequencing से उत्पन्न होते हैं, डीएनए दृश्यों का स्रोत आम तौर पर अस्पष्ट है. एचबीवी और सेलुलर जीनोम के लिए मजबूत संरेखण एक सच्चे वायरस सेल डीएनए जंक्शन का सुझाव है, शीर्ष पैनल में सैंज अनुक्रमण से उत्पन्न फसता अनुक्रम फ़ाइल के विभिन्न क्षेत्रों में मनाया जाता है । नीचे पैनल में, अनुक्रम केवल एचबीवी जीनोम के टुकड़े करने के लिए संरेखित करता है, एक पुनर्व्यवस्थित एचबीवी डीएनए जीनोम के प्रवर्धन द्वारा उत्पंन उत्पाद का सुझाव । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने से पहले, यह ध्यान दें कि इस invPCR परख एक अति संवेदनशील तकनीक, डीएनए की एकल प्रतियां बढ़ाना करने में सक्षम है महत्वपूर्ण है टेंपलेट । इसलिए, पीसीआर उत्पादों से संक्रमण सीमित अत्यंत महत्वपूर्ण है । पीसीआर उत्पाद संदूषण को सीमित करने के लिए सामांय रणनीतियों में निंनलिखित शामिल हैं । (i) विधि के विभिंन चरणों के लिए भौतिक रूप से पृथक क्षेत्र स्थापित करना । प्रत्येक क्षेत्र अलग लैब कोट होना चाहिए, और दस्ताने जब इन क्षेत्रों के बीच चलती परिवर्तित किया जाना चाहिए । हम नीचे इन क्षेत्रों सूचीबद्ध किया है क्रम में सबसे अधिक से कम करने के लिए दूषित होने की संभावना: पीसीआर उत्पाद निष्कर्षण और sequencing प्रतिक्रिया सेट-अप क्षेत्र (पोस्ट-पीसीआर); पीसीआर टेम्पलेट इसके अलावा और ज्वाला-पिन स्थानांतरण क्षेत्र (हम अच्छे परिणाम के साथ एक दूषित यूवी लैंप के साथ पीसीआर डाकू का इस्तेमाल किया है); डीएनए निष्कर्षण और उलटा क्षेत्र (पूर्व पीसीआर); और एक "डीएनए टेंपलेट मुक्त" क्षेत्र केवल स्टॉक और पीसीआर समाधान की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया । (ii) प्रयोगशाला में वायु प्रवाह को क्रॉस-संदूषण के संभावित चालक के रूप में जागरूक करना । विशेष रूप से, क्रॉस-संदूषण पीसीआर प्रतिक्रियाओं के दौरान लौ पिन स्थानांतरण चरण होने की संभावना है और एकीकरण आवृत्ति के गलत ठहराव करने के लिए नेतृत्व करेंगे । पीसीआर डाकू इन पार धाराओं को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । नकारात्मक नियंत्रण कुओं (जैसे, Myrcludex बी-इलाज नमूने या कोई टेम्पलेट नियंत्रण) पीसीआर में भी क्रॉस-संदूषण के लिए परीक्षण किया जा सकता है । (iii) एक डीएनए क्षरण समाधान के साथ नियमित रूप से उंहें नीचे पोंछते द्वारा पिपेट और काम सतहों पर संभावित पीसीआर दूषित पदार्थों की सीमा ।

यहां निर्दिष्ट प्रोटोकॉल एक ज्ञात संक्रामक एचबीवी HepAD38 सेल लाइन४२से उत्पंन क्लोन के एकीकरण का पता लगाने के लिए व्यवस्था की है । यदि इनोक्युलम इस्तेमाल एक अलग एचबीवी डीएनए अनुक्रम का है (जैसे, रोगी सीरम से), तो एचबीवी जीनोम पहले पीसीआर प्राइमरों और उलटा डिजाइन की अनुकूलता की पुष्टि करने के लिए अनुक्रम किया जाना चाहिए । में पहले प्रकाशित अध्ययन19, हम प्राइमरों कि बांध संरक्षित एचबीवी डीएनए एचबीवी डीएनए एकीकरण जंक्शनों की उंमीद की साइट पार्श्व दृश्यों के 3 सेट का इस्तेमाल किया है । अन्य प्राइमरी दृश्यों और प्रोटोकॉल एचबीवी४४,४५,४६,४७,४८ के जीनोमिक अनुक्रम का निर्धारण करने के लिए वर्णित किया गया है और सफलतापूर्वक काम कर सकते हैं.

इसके अलावा, विभिंन एचबीवी अतिसंवेदनशील कोशिकाओं (जैसे, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स, विभेदित HepaRG, HepG2-NTCP कोशिकाओं) इस्तेमाल किया जा सकता है; लेकिन, हमने पाया है कि Huh7-NTCP कोशिकाओं को सबसे बड़ा संकेत-शोर अनुपात प्रदान करते हैं, जब वायरस सेल डीएनए जंक्शनों कि वायरस मध्यवर्ती डीएनए है कि13प्रवर्धित है की तुलना में परिवर्धित कर रहे है की संख्या पर विचार । विशेष रूप से, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स या विभेदित HepaRG जैसे टर्मिनल विभेदित कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक बँटवारा से गुजरना नहीं पड़ता, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के भीतर शेष प्रवर्धित एचबीवी डीएनए नकलत्मक मध्यवर्ती होते हैं । हमने पाया है कि ~ ९०% प्रवर्धित अनुक्रम एचबीवी डीएनए पुनर्व्यवस्थाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं (और नहीं एकीकरण की घटनाओं) में टर्मिनल-विभेदित कोशिकाओं, 70 की तुलना में-hepatoma सेल लाइनों13में 50%. इन उत्पादों को आम तौर पर कर रहे है डीएनए जीनोम एचबीवी सतह और कोर खुले पढ़ने के फ्रेम में बड़े विलोपन युक्त, या वे एक अतिरिक्त Ncoमैं Sphसाइट से पहले साइट के साथ एचबीवी अर्ध प्रजातियों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । इन एचबीवी प्रजातियों के प्रवर्धन (एक योजनाबद्ध आरेख सहित) विस्तार से वर्णित किया गया है पहले13।

इस विधि में कई कमियां हैं । इस प्रोटोकॉल की श्रमसाध्य और बहु-दिवसीय प्रकृति के कारण, invPCR नमूनों की एक बड़ी संख्या का उच्च प्रवाह विश्लेषण करने के लिए अनुकूल नहीं है । इसके अलावा, के रूप में यह कमजोर पड़ने अनुमापन सीमित पर निर्भर करता है, हमारी विधि ठहराव में अत्यधिक सटीक नहीं है; हालांकि, यह आसानी से एकीकरण आवृत्ति में लॉग-स्तर परिवर्तन को मापने चाहिए ।

इसके अलावा, हमारे उलटा प्रोटोकॉल केवल एचबीवी जीनोम के DR2 और DR1 क्षेत्र के बीच होने वाले एकीकरण का पता लगाने के लिए अनुकूल है, एचबीवी एकीकरण के बहुमत के रूप में इस क्षेत्र४९के भीतर होते हैं । एचबीवी रोगी ऊतकों के NGS विश्लेषण से पता चला है कि एक बड़े अल्पसंख्यक (अप करने के लिए ~ ५०%) भी इस क्षेत्र के बाहर हो सकता है४९। नई invPCR डिजाइन सैद्धांतिक रूप से इन अंय एकीकरण साइटों का पता लगाने में सक्षम हैं, हालांकि वे (हमारे ज्ञान के लिए) नहीं किया गया है अभी तक । संबंधित, आवश्यक प्रतिबंध के कारण एंजाइम साइटों के लिए वायरस से बहाव की आवश्यकता-सेल जंक्शन अनुक्रम उलटा प्रतिक्रिया के लिए, invPCR सभी DR2 और एचबीवी जीनोम के DR1 क्षेत्रों के भीतर होने वाले एकीकरण का पता नहीं लगाता है (यानी, हम अनुमान है कि ~ सभी एकीकरण के 10% silico सिमुलेशन13 में उपयोग कर रहे हैं) । हालांकि, जब विभिंन उपचार की छोटी संख्या के साथ नमूनों की एक केंद्रित बैच के लिए आवेदन किया, invPCR एक ही आधार युग्म संकल्प पर एकीकृत एचबीवी डीएनए का पता लगाने के लिए केवल व्यावहारिक तरीकों में से एक है ।

इसलिए हम इस विधि के अनुप्रयोगों के वायरल खोजने में एक महत्वपूर्ण भूमिका की सेवा कल्पना (एचबीवी इनोक्युलम के उत्परिवर्तनों के द्वारा), सेलुलर (विशिष्ट सेलुलर जीन के नॉकआउट या के माध्यम से, या विभिंन दवाओं के आवेदन के माध्यम से), और पर्यावरण ( उदाहरण के लिए, ऑक्सीडेटिव तनाव के जोखिम) कारकों है कि एचबीवी डीएनए एकीकरण प्रेरित । इस विधि और नव विकसित एचबीवी संक्रमण प्रणालियों के साथ, हम इन कारकों का अभूतपूर्व नियंत्रण इतना है कि वे अच्छी तरह से अलग और बेहतर विशेषता हो सकता है सक्षम करें । हम यह भी उंमीद करते है कि यह एचबीवी डीएनए एकीकरण के सेलुलर परिणामों की एक महत्वपूर्ण समझ के लिए नेतृत्व करेगा, सहित किस हद तक वायरल एंटीजन (जैसे, HBx या HBsAg५०) एकीकृत रूप से व्यक्त कर रहे हैं, क्या इस अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, और चाहे या नहीं एचबीवी एकीकरण काफी सेलुलर phenotype एक अधिक समर्थक oncogenic राज्य की ओर बदलता है । इन भावी अध्ययनों के परिणामों में क्रोनिक हेपेटाइटिस बी के इलाज और वायरस की बुनियादी समझ पर इस्तेमाल होने वाली चिकित्सीय रणनीतियों पर गहरा असर पड़ेगा.

Disclosures

S.U. एक सह आवेदक और सह एक एचबीवी/HDV प्रवेश अवरोधक के रूप में Myrcludex बी की रक्षा पेटेंट के आविष्कारक है । टीटी ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की ।

Acknowledgments

इस काम के लिए जर्मन सेंटर फॉर इंफेक्शन रिसर्च (DZIF), TTU हेपेटाइटिस प्रोजेक्ट्स ५.८०७ और ५.७०४, ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (टी. एस. 15), और ऑस्ट्रेलियन सेंटर फॉर एचआईवी एंड हेपेटाइटिस वायरोलॉजी रिसर्च से फंडिंग मिली ।

हम प्रोफेसर विलियम मेसन के लिए मूल invPCR विधि के विकास में अपनी भूमिका के लिए ऋणी है और यह हमारे लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । हम डीआरएस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । Yi Ni और फ्लोरियन A. Lempp के लिए रिएजेंट (सेल लाइंस और एचबीवी इनोक्युलम) । हम आंजा Rippert, Franziska Schlund, सारा Engelhardt, और तकनीकी सहायता के लिए डॉ Katrin Schöneweis स्वीकार करते हैं । हम ठीक करने के लिए मरियम Kleinig के लिए आभारी हैं, और प्रोफेसरों निकोलस Shackel और Ralf Bartenschlager निरंतर समर्थन के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s PBS PAA H15-002
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 41965
Fetal bovine serum PAA A15-151 Heat-inactivate before use
Penicillin, 10,000 U/mL; Streptomycin 10mg/ml, 100× PAA P11-010
L-glutamine, 200 mM PAA M11-004
Trypsin, 0.5 mg/mL; EDTA, 0.22 mg/mL, 1× PAA L11-004
PEG, MW 8000 Sigma-Aldrich 89510 Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use
DMSO for spectroscopy Merck 102950
Tenofovir disoproxil Sigma-Aldrich CDS021622 Dissolve in DMSO
Lamivudine Sigma-Aldrich L1295 Dissolve in DMSO
NucleoSpin Tissue kit Macherey Nagel 740952.250
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
NcoI-HF NEB R3193L
T4 DNA ligase NEB M0202T
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 433209
Dextran (35-45 kDa) Sigma-Aldrich D1662-10G
Absolute Ethanol Sigma-Aldrich 32205-1L-D
BsiHKAI NEB R0570L
SphI-HF NEB R3182L
Amplitaq Gold Taq kit Thermo Fisher Scientific 4331816 Use for first nest PCR
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates Biorad 2239442
DNAZap PCR DNA Degradation Solution Thermo Fisher Scientific AM9890
96-well PCR plates Sigma Aldrich CLS6509 SIGMA
96-pin replicator Thermo Fisher Scientific 250520
GoTaq Flexi PCR kit Promega M8295 Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel
Biozym LE Agarose Biozym 840004
QIAEX II Gel extraction kit QIAGEN 20051

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १४१ एचबीवी डीएनए एकीकरण Myrcludex बी hepatocellular कार्सिनोमा डबल फंसे रैखिक डीएनए व्युत्क्रम नेस्टेड पीसीआर वायरस प्रविष्टि वायरल हठ
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Tu, T., Urban, S. Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection. J. Vis. Exp. (141), e58202, doi:10.3791/58202 (2018).

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