Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Algılama düşük kopya sayısı Vitro hepatit B enfeksiyonu tarafından kurulan entegre Viral DNA

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58202
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University Hospital, 2Gastroenterology and Liver Research Laboratory, Ingham Institute, 3German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Biz burada HBV DNA vitro nesil bir Hepatit B virüs enfeksiyonu sistemi üzerinden tarif ve tersini kullanarak (1-2 kopya) entegrasyonu son derece hassas tespiti PCR iç içe.

Abstract

Hepatit B virüsü (HBV) karaciğer kanseri ve karaciğer sirozu kronik enfeksiyon sonucu neden ortak bir kan kaynaklı patojen var. Virüs genellikle bir episomal DNA ara çoğaltır; Bu formu viral çoğaltma için gerekli olmadığı halde ancak, ana bilgisayar genom HBV DNA parçalarının entegrasyonu gözlenmiştir. Tam olarak amacı, zamanlaması ve hangi HBV DNA tarafından tümleştirme oluşur mechanism(s) olduğunu henüz net ama son veri değil göstermek çok erken enfeksiyon sonra oluşur. Burada, vitro üretimi ve HBV DNA entegrasyonlar tespiti ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bizim iletişim kuralı özellikle tek bol-in virüs-hücre DNA entegrasyonlar güçlendirir ve mutlak miktar ve kavşak sıra tek-baz çifti çözümü sağlar. Bu teknik (birincil insan tetkikine de dahil olmak üzere), çeşitli HBV-duyarlı hücre tipleri için çeşitli HBV mutantlar için ve çeşitli uyuşturucu Etkilenmeler ile birlikte uygulanmıştır. Biz bu klinik olgusunun temel moleküler mekanizmaları belirlemek için anahtar bir tahlil olma Bu teknik öngörüyoruz.

Introduction

HBV yaşam boyu süren kronik enfeksiyon neden olabilir bir çift iplikçikli DNA virüs karaciğer siroz ve hepatosellüler karsinom (HCC)1,2,3' e en önemli biri. Orada iken sürüş HBV sebat4 (Örneğin, epigenetik viral transkripsiyon şablonunun yüksek kararlılık), kaçırma immün gözetim ve düşük ciro hepatosit karaciğer ve onun ilişkili birden çok moleküler mekanizmaları risk HCC başlatma5,6 (Örneğin, kronik inflamasyon ve hücresel yolları stres aktivasyonu), konak hücre genomu (her ikisi de bu olgu için bildirilen bir mekanizma) entegrasyon HBV DNA kötü çalışılmıştır . HBV tümleştirme olayların güvenilir algılama izin uygun vitro enfeksiyon sistemlerde eksikliği önemli bir nedendir. Burada, biz son zamanlarda geliştirilen iletişim kuralı vitro üretimi ve temel moleküler mekanizmaları ve bunların sonuçları aydınlatmak için kullanılan HBV DNA entegrasyonlar tespiti için açıklamak.

HBV çoğaltma ve HBV DNA tümleştirme oluşumu önceden gözden ayrıntı7' de. Kısaca, HBV enfeksiyonu8,9için ana hücresel reseptör sodyum Taurocholate Co-transporting peptid (NTCP) kullanarak tetkikine girer. HBV rahat dairesel DNA (rcDNA) içeren HBV nucleocapsids genom çekirdeği, rcDNA episomal kovalent kapalı dairesel DNA (cccDNA) nerede dönüştürülür girer. Nükleer cccDNA viral mRNA'ların ve önceden genomik RNA (pgRNA)10için transkripsiyon şablon gibi davranır. HBV polimeraz ve pgRNA yeni kurulan nucleocapsids (HBV çekirdek protein dimer oluşan) hazırlanmıştır. HBV pgRNA ters bir rcDNA genom ya da bir çift iplikçikli lineer DNA (dslDNA) genom11,12kaynaklanan nükleokapsid içinde transkripsiyonu var. HBV DNA genleri içeren bu olgun nucleocapsids sonunda saran ve virions verilebilir.

Hepatositlerin saran parçacıklar dslDNA molekülleri içeren tarafından enfeksiyon viral entegrasyon HBV DNA7,14,15çoğaltma-beceriksiz formlar için önde gelen ana hücre genomu13, içine neden olabilir. HBV DNA ile tümleştirme kromozom çift iplikçikli DNA sonları15sitesinde oluşur. Kanıt biriken her tümleştirme olayı konak hücre genomu16,17içinde temelde rasgele bir pozisyonda oluşur öneriyor. Buna ek olarak, HBV DNA ile tümleştirme, biraz oluşur nadiren, 1-104 hücreleri13,18,19,20oranında. HBV DNA entegrasyonu ile ilgili önemli sorular cevapsız, özellikle tam moleküler yollar dahil, viral bağımlılığını ve ana faktörler, entegre formları ve olası katkılarından ifade viral antijenler ile ilgili olarak kalır viral sebat7' ye. Biz bu sorulardan bazıları ışık tutacak bir vitro modelini belirledik.

HBV DNA tümleştirme olaylarda (entegrasyon oranı hücre başına ve her benzersiz tümleştirme kopya sayısı açısından hem de) vitro HBV enfeksiyonu nadir yapmak onları tespit etmek zor modelleri. Sayesinde bunun bölünen hücreler verimli enfeksiyon desteklemeyen gibi hücre mitoz vitro sistemimizde sınırlıdır. Böylece, aksine tetkikine önemli klonal genişleme18,19,oluştuğu hastanın karaciğer dokularda20, kaç (1-2) kopya her entegrasyon hücreleri belirli bir havuzda mevcuttur çok vitro enfekte . Entegrasyon özellikle sırasında ilk enfeksiyon tetkikine (ve değil sürekli kronik olarak enfekte tetkikine)13oluşur de bulduk. Buna göre HBV DNA tümleştirme için daha uzun bir süre sadece hücre kültür tarafından yükseltilemez.

Genel olarak, daha önce Güney de dahil olmak üzere entegre HBV DNA algılamak için kullanılan bir yöntem blot hibridizasyon21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , kaset-aracılı ligasyonu PCR28ve29,30,31,32,33, sıralama tüm genom algılamak için duyarlılık zorunda değilsiniz tek-entegrasyonlar kopyaları. Biz ve diğer araştırmacılar kullanmış ters iç içe ördek, dağ sıçanı ve insan enfekte karaciğerleri13,14,18,19, hepadnaviral DNA tümleştirme algılamak için PCR (invPCR) 34,35,36. Diğerleri invPCR teknik yanlış sinyalleri nesil alter ve miktar37için iznini kısıtlamak yordam değişiklikler girmiştik. Tahlil bu protokol için açıklandığı gibi yapılır, invPCR tanımlar ve (mutlak kopya numaraları) birden fazla HBV DNA entegrasyonlar quantifies özel ve hassas tahlil temsil eder. HBV-hücre DNA kavşak viral çalışmaların bioinformatical sağlayan bir tek-baz çifti çözünürlükte sıralı ve entegrasyon13siteler ana bilgisayar DNA dizileri.

Biz daha önce çok sayıda karaciğer doku ek donmuş, karaciğer bölümleri parafin gömülü ve son derece küçük doku örnekleri tarafından izole kaynaktan çıkarılan HBV DNA enfekte dokular invPCR sonuçlarından38 tarif var Lazer-mikrodiseksiyon19. Bu iletişim kuralı bir invPCR tahlil hücre kültürü elde edilen dokulardan Entegrasyonlar (entegrasyon başına 1-2 kopya) sayıda düşük kopya oluşturulduğu vitro enfeksiyon sonra çıkarılan DNA'yı kullanarak güncelleştirilmiş bir sürümünü özetliyor. HBV DNA oluşan entegrasyonlar vitro bu hücresel genom ve entegre13,16, viral dizisi içinde kavşak üzerinde kendi dağıtım ile ilgili hasta dokularda bulunan benzer düşündüren bir içinde virüslü bir karaciğer için karşılaştırılabilir yol.

Protocol

1. hücre enfeksiyon ve DNA ekstraksiyon

  1. Kültürlü Huh7-NTCP hücreleri8,9 , Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 v/v fetal Sığır serum, 1 x penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile takıma DMEM) korumak.
    Not: Bu daha önce ayrıntılı40rapor edildi.
  2. Tohum 2 x 105 hücre/mL Huh7-NTCP hücreleri ile DMEM 1 mL 12-şey plaka.
  3. Hücre tedavileri (Örneğin, HBV inhibitörleri) sınama olumlu sonuçlanırsa, onları kültür süpernatant 4 h (1 gün önceden HBV enfeksiyonu) tohum sonra uygulanır. Bir negatif kontrol için 200 uygulamak nM Myrcludex B (bir güçlü HBV giriş inhibitörü41).
  4. Heparin sütunlu saf42 süpernatant HepAD3843 üzerinden bir inoculum 1000 VGE/hücreye kültür ortamının (DMEM % 10 v/v fetal Sığır serum, 1 x penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin ve % 2.5 v/v ile takıma 500 µL hücreleri enfekte için kullanın DMSO), [1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x içinde çözünmüş] % 4 w/v Polietilen glikol 8000 içeren.
  5. Hücreleri (%5 CO2 ve % 90 nem ayarla) 37 ° C kuluçka kültür.
  6. 1 mL steril 1 x PBS 16-24 h sonrası enfeksiyon, iki kez hücrelerle yıkayın.
  7. Kültür ortamı her 2 günde HBV enfeksiyonu hasat kadar takip değiştirin.
  8. 3. gün sonrası enfeksiyon 5 µM Tenofovir disoproxil ve 10 µM hücrelerle tedavi lamivudin invPCR tarafından amplifiable HBV ikileştirici ara ürün imalatı sınırlamak için.
  9. 5. gün sonrası enfeksiyon, tripsin-EDTA 200 µL hücrelerle trypsinize ve onları da 5 µM Tenofovir disoproxil ve 10 µM içeren (% 10 v/v fetal Sığır serum, 1 x penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile takıma) DMEM 2 mL resuspend Lamivudin.
  10. Hücre süspansiyonlar (hangi HBV cccDNA44 ve amplifiable diğer HBV DNA ara ürün kaybı ikna etmek için invPCR tarafından bildirilmiştir) mitoz bir tur ikna etmek için 6-şey plaka aktarın.
  11. 7. gün sonrası enfeksiyon, tripsin-EDTA 400 µL genişletilmiş hücrelerde trypsinize ve karışımı 1 mL DMEM resuspend. Süspansiyon bir 1,5 mL tüp içinde yer, hücreleri tarafından Santrifüjü 500 x g 5 min için de cips ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.
  12. (İsteğe bağlı) Kadar DNA ekstraksiyon için hazır hücre granül-20 ° C'de depolayın.
  13. DNA üreticinin talimatlarına göre bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak hücre Pelet ayıklayın. Optik Dansitometresi kullanarak son DNA toplama tahmin ediyoruz.
    Not: DNA 100 μL elüsyon birimindeki genellikle ~ 250-400 verimidir ng/μL.

2. DNA'ın ters çevirme

  1. Aliquot ~1.5–2.5 μg toplam DNA'ın özü adım 1 200 μL PCR tüp içine. Restriksiyon enzimi master-mix 1 x Özet tepki arabellek içeren 40 μL tepki birimini neden uygun miktarda ekleyin (Örn., CutSmart arabellek) ve 10 U Ncoben-HF.
  2. Tepkiler iyice karıştırın ve bir küçük tüp santrifüje spin aşağı. Restriksiyon enzimi tepki olarak 37 ° C'de bir PCR makinesi en iyi sindirim verimlilik için 1 h için kuluçkaya.
  3. Restriksiyon enzimi 20 dk 80 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
  4. 1.5 mL tüp için tüm Restriksiyon enzimi tepki aktarın. 1 x T4 DNA ligaz arabellek ve 500 U T4 DNA ligaz 400 μL ekleyip iyice karıştırın. Büyük tepki birim sindirilir DNA parçalarının içi (aksine arası moleküler) moleküler ligasyonu teşvik eder.
  5. Tüp ligasyonu tepki tam birleştirmesini sağlamak 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  6. T4 DNA ligaz 70 ° c 20 dk için devre dışı bırakabilirsiniz.
  7. % 10 w/v Sodyum Lauryl Sülfat T4 ligaz tam inactivation emin olmak için 10 μL ekleyin.
  8. Tüpler nabız vortexing tarafından mix ve kısa bir süre tepki karışımı spin. NaCl 100 mM ve dextran (35-45 kDa) son bir konsantrasyon 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Tüpler nabız vortexing tarafından mix ve kısa bir süre tepki karışımı spin.
  9. INVERSION tarafından 900 μL % 100 etanol ve karışımı ekleyin. -20 ° C'de DNA gecede çökelti.
  10. Pelet zarlarını DNA tarafından Santrifüjü 14.000 x g 15 dakika süreyle de kaldırmak süpernatant aspirasyon P200 pipet ile tarafından. 14.000 x g 15dk için de % 70 v/v etanol ve Santrifüjü 500 μL ile Pelet yıkayın.
  11. Etanol aspirasyon P200 pipet ile çıkarın. DNA Pelet, oda sıcaklığında 20 dakika kuruması.
  12. H2O. Ekle 20 μL bir Restriksiyon enzimi master için Özet tepki arabellek x 1, 5 BSIHKAI U ve 5 Sph-HF. Incubate U içeren bir 40 μL tepki hacmindeki neden mix-20 μL Pelet Restriksiyon enzimi tepki olarak dağıtılması bir ısı-blok 37 ° c ( Sphben-HF için en uygun sıcaklık) 1 h için.
  13. Kısa bir süre tepki karışımı spin. Restriksiyon enzimi tepki 65 ° c ( BSIHKAI için en uygun sıcaklık) 1 h için bir ısı bloğundaki kuluçkaya.
  14. Kısa bir süre tepki karışımı spin.
  15. -20 ° C'de ters DNA sonraki adım kadar saklayın.

3. iç içe PCR

  1. Potansiyel amplicons bir yeniden kullanılabilir silikon mat mühür bir DNA bozulması çözümünü kullanarak kaldırmak, mat DNA ücretsiz su ile iyice durulayın ve oda sıcaklığında PCR karışımı hazırlarken kuruması.
  2. 1 mL 1 x PCR Mix dış ileri içeren hazırlamak (5'-TTC GCT TCA SKK CTG CAC G-3') ve ters (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3') 0.5 µM bir konsantrasyon, astar.
  3. 1 x PCR Mix 170 μL wells A1 ve E1 bir 96-şey PCR plaka ekleyin.
  4. 1 x PCR karışımı 120 μL wells B1 H1 için ekleyin.
  5. Ters DNA'ın 10 μL--dan adım 2 A1 ve E1 wells için Ekle (2 farklı ters örnekleri analiz aynı PCR plaka üzerinde). Hamuru hafifçe her biri hakkında 10 kez pipetting tarafından her şey tepki için 100 μL ayarla P1000 kullanılarak.
  6. Seri olarak seyreltik örnekleri oranı 1:3 her adımda 60 μL aktararak A1 D1 için Kuyu yapımı. Her adımda wells yavaşça onları 10 kat için 100 μL ayarla P1000 kullanma hakkında pipetting tarafından karıştırın. Kabarcıklar oluşturan kaçının. Aşağı iyi H1 sulandrarak 3.6 iyi E1 için adımları yineleyin.
  7. Aliquot 10 μL bir çok kanallı pipet içine kuyu A2-H2, A3-H3, A1-H1 kuyulardan wells A12-H12 96-şey plaka erişene dek filtreler tepki karışımı. PCR plaka ile sıkıca basarak adım 3.1, Kuru silikon mat kapak.
  8. Plaka PCR makinesinde yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştır: 10 min 95 ° c; 15 35 döngüleri s 95 ° c, 15 s 54 ° C ve 3 dak 72 ° c; 7 dk. 72 ° c; ardından, plaka oda sıcaklığında tutun.
  9. 96-pin Çoğalıcı eliydi Bunsen burner ile için iğne ısı ve oda sıcaklığında en az 5 min için serin.
  10. İkinci PCR plaka kuyu ile 1 x PCR mix (jel yük hazır arabellek içeren) ve iç ileri 10 μL doldurun (5'-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3') ve ters (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3'), 0,5 µM.
  11. Dikkatle ilk turda PCR 96-şey plaka PCR tabak silikon mat kaldırmak ve çapraz bulaşma kuyular arasında kaçının.
  12. Soğutmalı Çoğalıcı 96-şey plaka PCR ürünlerinin ilk turda PCR yeni bölünmemeli 96-şey plakasına aktarmak için kullanın. İlk denatürasyon adım 95 ° C'de 10 dakika için 2 dk değiştirme dışında adım 3,8, olduğu gibi aynı koşullar kullanarak iç içe geçmiş PCR yerine getirir.

4. PCR ürünü yalıtım ve jel çıkarma

  1. PCR ürünlerinin % 1.3 w/v özel jel ile 96-iyi kullanarak jel elektroforez tarafından analiz. 100 mL özel jel için 200 V 10-15 dk için çalıştırın.
  2. Tek kullanımlık içme kamış kullanarak özel jelleri DNA grup tüketim. Her PCR ürününün saman yerleştirin ve özel jel 1,5 mL tüp içine takın ve boyuta saman makasla kesme.
    Not: Sadece tek PCR ürünleri çözülebilir dilutions grup izole etmek yeterlidir.
  3. (İsteğe bağlı) Tüpler daha sonra çıkarılması için-20 ° C'de depolayın.
  4. Özel prizler her tüpün içine saman parçası ucunda sıkarak dışarı atmak. 300 μL jel ayıklama arabelleği ve jel ayıklama cam boncuk Bulamaç 5 μL her tüp için ekleyin.
  5. PCR ürünleri (hariç yarım-birimleri adımları yıkama için kullanma) jel ekstraksiyon kiti için üreticinin yönergelerine göre ayıklamak ve boncuk ile su 30 μL DNA'dan elute.
  6. Saf DNA Sanger için gönderin (üreticinin yönergeleri göre) sıralama ikinci turda kullanılan ileri astar ile iç içe PCR.

5. dizi analizi

  1. Virüs-hücre DNA kavşak (tüm nükleotid koleksiyonuna hizalama varsayılan ayarları kullanarak) nükleotit patlama analizi gerçekleştirerek onaylayın.
    Not: Temsilcisi sonuçları Şekil 3 ' te aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
    1. Dizinin kısmi hizalama gözlenen yalnızca, trim 5' HBV DNA dizisi bir patlama analiz yeniden çalıştırmadan önce.
  2. Belirli bir sıra gerçek entegrasyon kavşak aşağıdaki gibi ifade ediyorsa belirlemek için sıkı seçim ölçütleri uygulayın:
    1. Sadece içeren dizileri içerir > 20 bp emin eşlemek için hücresel genom hücresel dizisi.
    2. Kısıtlama siteleri 10 sözde virüs-hücre tümleştirme Kavşağı, onlar büyük olasılıkla temsil vitro ligasyonu olaylar olarak bp yerine içinde gerçek entegrasyon kavşak kullanılan herhangi bir enzim içerir herhangi bir sıraları dikkate almayın.
    3. Bu büyük olasılıkla eserler sıralama reaksiyonu sırasında çapraz bulaşma tarafından üretilen olarak herhangi bir sıralarıyla bariz birbirine benzemeyen en yüksek floresans seviyeleri sözde tümleştirme Kavşağı'nda sıralama Kromatograflar, her iki tarafında göz ardı veya kapiller Kromatografi.
    4. Bu tam HBV ve virüs hücreli kavşağında hücresel dizileri ile benzersiz tümleştirme olayları tanımlamak.
      Not: Benzersiz tümleştirme olaylar tekrarı (ki negatif kontrol reaksiyonlar, daha fazla temsilcisi sonuçlarında detaylı kullanarak test PCR sırasında bu entegrasyonlar ve çapraz bulaşma içeren hücre klonal genişlemesi neden olabilir aşağıda). Homolog olmayan yollar son katılma kullanılan15olarak tekrarlanan entegrasyonlar belirli hücresel dizileri içine her tümleştirme olay için farklı HBV terminal siteleri görüntülemek için bekleniyor.
  3. Entegrasyon frekans seyreltme faktörü ters DNA şablonları virüs hücreli kavşaklar, normalleştirme tarafından toplam DNA giriş miktarı ters tepki izleyen bu seyreltme algılanan sayısıyla çarparak hesaplar. Genel olarak, entegrasyon sıklığıdır 1:10 sırasına4 hücreleri.

Representative Results

İnvPCR tekniği şematik gösterimi Şekil 1' de gösterilen. Bir örnek özel jel elektroforez başarılı bir invPCR, öncesi ve sonrası PCR ürünü yalıtım Şekil 2 ' de gösterilmiştir. Şekil 3 adım HBV DNA ikileştirici orta 5.1 (i) virüs-hücre DNA kavşak amplifikasyon ve (ii) amplifikasyon vakalarında patlama analiz çıktısını gösterir.

Beklenen olumlu denetimlerinden Sonuç: Huh7-NTCP hücreleri (Şekil 1) açıklandığı gibi heparin saf HBV stokları ile enfekte olumlu bir denetim olarak hizmet verebilir. Bu durumda, tek PCR ürünleri (~ 104 hücre eşdeğerlerine seyreltme, Şekil 2başına karşılık gelen) her örneğinin ikinci veya üçüncü 1:3 seyreltme tarafından elde edilmelidir. Diğer yarısı HBV DNA ara ürün (Şekil 3) amplifikasyon temsil ederken bu dilutions gerçek virüs-hücre DNA kavşaklar, ürünlerin yaklaşık % 50 temsil edecek.

Önceki çalışmalar13' te, biz birkaç tekrarlanan virüs-hücre kavşaklar, tercihli HBV DNA entegrasyon hücresel hiç genomik site önerme örneklerini bulduk. Biz de >%80-in virüs-hücre kavşak nukleotid ve 1732 (göre nükleotit HBV genotip D, GenBank katılım #U95551.1 numaralandırma), 1832 arasında burada ikinci HBV dslDNA formunun sağ terminus gösterir gerçekleşmemesini bulmak. Bizim yöntemle vitro deneyler bulundu gerçek virüs-hücre kavşak dizisi genel olarak GenBank (katılım sayıları MH057851 MH058006 için) kullanılabilir.

Beklenen negatif denetimlerinden Sonuç: bulaşmamış Huh7-NTCP hücreleri ya da Huh7-NTCP aşı Myrcludex B ile önceden tedavi hücre negatif denetimler olarak hareket edebilir. InvPCR çıkarılan bu hücrelerden DNA analizini PCR ürün üretmek gerekir. Bu negatif kontrol örnekleri aynı PCR plaka olumlu örnekler olarak çalışan iç içe-PCR işlemi sırasında çapraz bulaşma test etmek için izin verir. En sıkı çapraz bulaşma için çalışan bir negatif-denetimi örneğini Wells A-D ve Wells E-H bir 96-şey plaka üzerinde olumlu örnek testidir. Bu durumda, olumlu örnek en yoğun seyreltme üst üste olumsuz örnek az konsantre seyreltme için bitişik çalıştırılır. Amplifikasyon ürünleri negatif kontrol örnekleri gözlenir, çapraz bulaşma olaylar en aza indirmek için tartışmada önerilen önlemler Enstitüsü.

Figure 1
Şekil 1: HBV DNA entegrasyonlar algılamaya invPCR işleminin şematik şekil. HBV enfeksiyonu, sadece bir azınlık Huh7 NTCP hücre içeren sonra konak hücre genomu (kırmızı) entegre HBV dslDNA (kırmızı), üst kısmında tasvir. Toplam DNA sonra çıkarılan hücrelerden (adım 1), (adım 2) ters ve iç içe geçmiş PCR (adım 3) tarafından güçlendirilmiş. Restriksiyon enzimi sitelerin göreli konumları gösterilmiştir (Astsubayben ve BSIHKAI) eksize virüs-hücre DNA Junction. Bir önceki yayın13adapte bir rakamdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: özel Jel Elektroforez ve sonraki jel çıkarma başarılı bir invPCR. "M" DNA işaretleyicisi merdiven temsil eder. Her satır 12 Teknik çoğaltır, PCR plaka üzerinde tek bir seyreltme temsil eder. PCR plaka/özel jel iki ters DNA örneği çalıştırabilirsiniz. PCR ürünleri her seyreltme için dışarı bir ~ 1 titre: 3 oranı. HBV DNA tümleştirme oranı son nokta titrasyon tarafından belirlenen ürün çıkarma nereye tek bantları-ebilmek var olmak kolayca izole iki az konsantre dilutions genellikle yeterlidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: invPCR ürün serileri analizini patlama. Sıra uzun yolları sıralama, kaynağı Sanger oluşturulan DNA dizileri genellikle kesin. HBV ve hücresel genleri güçlü hizalama Sanger oluşturulan FASTA sıra dosyasının farklı alanlarda gözlenen bir gerçek virüs-hücre DNA kavşak düşündüren üst paneldeki sıralama. Alt panelinde yeniden düzenlenmiştir HBV DNA genom amplifikasyon tarafından üretilen bir ürün düşündüren HBV genomu parçaları için yalnızca sıra hizalar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Protokol gerçekleştirmeden önce bu invPCR tahlil son derece hassas bir teknik, tek DNA şablonu kopyalarını yükseltecek yeteneğine sahip olduğunu unutmamak gerekir. Bu nedenle, PCR ürünleri kirlenme sınırlama son derece önemlidir. PCR ürün kontaminasyon sınırlamak için genel stratejiler aşağıda belirtilmiştir. (i) yöntem farklı adımlar için fiziksel olarak ayrı alanda kurmak. Her alan ayrı laboratuvar mont olmalı ve bu alanları arasında hareket ederken eldiven değiştirilmelidir. Biz bu gibi yerlerde aşağıda sipariş için en büyük olasılıkla az kirlenmiş için listeledik: PCR ürün çıkarma ve sıralamanın tepki kurulum alanı (post-PCR); PCR şablonu ek ve alevli-pin (biz iyi sonuçlar ile decontaminating bir UV lamba PCR davlumbaz kullanmış) alan transfer; DNA ekstraksiyon ve inversiyon alan (pre-PCR); ve bir "DNA ücretsiz şablon" alan yalnızca stok ve PCR çözümleri hazırlamak için kullanılır. (ii) olmak hava akımı çapraz bulaşma potansiyel bir faktörü olarak laboratuarda farkında. Özellikle, çapraz bulaşma PCR reaksiyonların durumda PIN transfer adım sırasında oluşur ve -ecek büyük olasılıkla hatalı miktar tümleştirme frekans için kurşun. PCR davlumbaz bu çapraz akıntılar sınırlandırmak için kullanılabilir. PCR negatif kontrol wells (Örneğin, Myrcludex B tedavi örnekleri veya denetim şablonu yok), çapraz bulaşma için test etmek için de kullanılabilir. (III) potansiyel PCR kirletici pipetler üzerinde limit ve yüzeyler düzenli olarak onları silerek bir DNA bozulması çözüm çalışır.

Burada belirtilen iletişim kuralı HepAD38 hücre satırı42oluşturulan bilinen bulaşıcı HBV klon entegrasyonunu algılamak için ayarlandı. Kullanılan inoculum farklı HBV DNA dizisi (Örneğin, gelen hasta serumu) ise, o zaman HBV genomu ilk PCR astar ve inversiyon tasarım uyumluluğunu onaylamak için sıralı. Önceden yayınlanmış çalışmaları19HBV DNA tümleştirme kavşak beklenen sitenin kanat korunmuş HBV DNA dizileri bind astar 3 set kullanmış. Diğer astar dizileri ve protokolleri HBV44,45,46,47,48 genomik sırasını belirlemek için açıklanan ve başarılı bir şekilde çalışabilir.

Ayrıca, farklı HBV-duyarlı hücreleri (Örneğin, birincil insan tetkikine, farklılaşmış HepaRG, HepG2-NTCP)-ebilmek var olmak kullanılmış; Ancak, Huh7-NTCP hücreleri virüs-hücre sayısı güçlendirilmiş13yaşında virüs ara DNA için karşılaştırıldığında güçlendirilmiş DNA kavşak göz önünde bulundurarak en iyi sinyal-gürültü oranı sağlar bulduk. Özellikle, birincil insan tetkikine veya farklı HepaRG gibi ölümcül farklılaşmış hücreler verimli bir şekilde amplifiable HBV DNA ikileştirici ara ürün hücrelerin içinde kalan yüksek düzeyde sonuçlanan mitoz, tabi olmayan. ~ %90 güçlendirilmiş sıralarının HBV DNA düzenlemeler (ve değil entegrasyon olaylar) ölümcül Ayrıştırılan hücrelerde, hepatoma hücre hatları13' te % 70 – 50'ye göre temsil bulduk. Bu ürünler genellikle yüzey ve çekirdek çerçeveler okuma açık büyük silme işlemlerini içeren HBV DNA genleri vardır veya HBV yarı türler önceden Sphı site için site ek bir Astsubayile temsil edebilir. Amplifikasyon (Şematik diyagramı dahil) bu HBV türlerin açıklanan ayrıntılı olarak daha önce13.

Bu yöntem birçok dezavantajları vardır. Bu iletişim kuralı zahmetli ve çok günlük doğası nedeniyle, invPCR örnekleri, çok sayıda yüksek üretilen iş analizleri için uygun değildir. Ayrıca, seyreltme titrasyon sınırlama dayanıyor gibi bizim Yöntem miktar içinde son derece kesin değildir; Her ne kadar kolayca tümleştirme frekans günlük düzeyi değişiklikleri ölçmek gerekir,.

Ayrıca, bizim inversiyon Protokolü sadece HBV entegrasyonlar çoğunluğu içinde bu bölge49oluşurken HBV genomu DR2 ve DR1 bölge arasında meydana gelen entegrasyonlar algılamak için uygundur. NGS analiz HBV hasta dokuların büyük bir azınlık bu göstermiştir (~ 50 %'e kadar) bu bölge49dışında da oluşabilir. Yeni invPCR tasarımlar bunlar diğer tümleştirme siteleri algılamaya teorik olarak mümkün olsa da onlar değil (bizim bilgi için) olmuştur henüz yürütülmektedir. Relatedly, aşağı ters tepki için virüs hücreli kavşak serisinden gerekli gerekli Restriksiyon enzimi siteler nedeniyle invPCR HBV genomu DR2 ve DR1 bölgeler içinde meydana gelen bütün entegrasyonlar algılamaz (Yani, biz Bütün entegrasyonlar ~ %10 silico simülasyonlar13kullanarak algılanabilir olduğu tahmin). Ancak, farklı tedaviler az sayıda örnekleriyle odaklı bir dizi uygulandığında, invPCR entegre HBV DNA tek baz çifti çözünürlükte algılamak için sadece pratik yöntemleri biridir.

Biz bu nedenle uygulamaları cep (nakavt veya belirli hücresel genlerin overexpression, ya da üzerinden uygulama çeşitli ilaçların) ve çevre ( (mutasyonlar HBV inoculum), viral bulma konusunda önemli bir rol hizmet veren bu yöntemin öngörülüyor Örneğin, oksidatif stres maruz) HBV DNA entegrasyonu teşvik faktörler. Böylece iyi izole ve daha iyi karakterize olabilir bu yöntemi ve yeni geliştirilen HBV enfeksiyonu sistemleri ile bu faktörlerin benzersiz kontrol sağlar. Biz de bu HBV DNA tümleştirme, ne ölçüde viral antijenler (Örneğin, HBx veya HBsAg50) ne bu ifade denetleyen tümleşik formdan ifade edilir için de dahil olmak üzere hücresel sonuçlarını temel bir anlayış sağlayacaktır bekliyoruz, ve olup olmadığı HBV entegrasyon önemli ölçüde daha pro oncogenic bir duruma doğru hücresel fenotip değiştirir. Bu gelecekteki çalışmaların sonuçları kronik hepatit B tedavisinde kullanılan tedavi stratejileri ve virüs kendisi temel anlayış derin bir etkiye sahip olacaktır.

Disclosures

S.Ü bir eş başvuran ve Co-Myrcludex B bir HBV/HDV giriş inhibitörü olarak koruma patent mucidi olduğunu. T.T. hiçbir çıkar çatışmaları bildirir.

Acknowledgments

Alman merkezinden finansman enfeksiyon araştırma (DZIF), TTU hepatit projeleri 5.807 ve 5.704, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 için alınan bu eser (TP 15) ve HIV ve hepatit Viroloji araştırma Avustralya merkezi.

Biz Profesör William Mason için orijinal invPCR yöntemi geliştirmek ve bize gösteren onun parçası için borçlu bulunmaktadır. Drs. Yi Ni ve Florian A. Lempp kimyasalları (hücre satırları ve HBV inoculum) teşekkür etmek istiyorum. Teknik yardım için Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt ve Dr Katrin Schöneweis kabul edersiniz. Miriam için yazım denetleme Kleinig ve Profesör Nicholas Shackel ve Ralf Bartenschlager sürekli destek için minnettarız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s PBS PAA H15-002
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 41965
Fetal bovine serum PAA A15-151 Heat-inactivate before use
Penicillin, 10,000 U/mL; Streptomycin 10mg/ml, 100× PAA P11-010
L-glutamine, 200 mM PAA M11-004
Trypsin, 0.5 mg/mL; EDTA, 0.22 mg/mL, 1× PAA L11-004
PEG, MW 8000 Sigma-Aldrich 89510 Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use
DMSO for spectroscopy Merck 102950
Tenofovir disoproxil Sigma-Aldrich CDS021622 Dissolve in DMSO
Lamivudine Sigma-Aldrich L1295 Dissolve in DMSO
NucleoSpin Tissue kit Macherey Nagel 740952.250
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
NcoI-HF NEB R3193L
T4 DNA ligase NEB M0202T
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 433209
Dextran (35-45 kDa) Sigma-Aldrich D1662-10G
Absolute Ethanol Sigma-Aldrich 32205-1L-D
BsiHKAI NEB R0570L
SphI-HF NEB R3182L
Amplitaq Gold Taq kit Thermo Fisher Scientific 4331816 Use for first nest PCR
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates Biorad 2239442
DNAZap PCR DNA Degradation Solution Thermo Fisher Scientific AM9890
96-well PCR plates Sigma Aldrich CLS6509 SIGMA
96-pin replicator Thermo Fisher Scientific 250520
GoTaq Flexi PCR kit Promega M8295 Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel
Biozym LE Agarose Biozym 840004
QIAEX II Gel extraction kit QIAGEN 20051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, X., et al. Chronic hepatitis B virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  2. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  3. Huang, Y. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643-3650 (2011).
  4. Nassal, M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut. 64 (12), 1972-1984 (2015).
  5. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Jilbert, A. R. Conceptual models for the initiation of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. Liver International. 35 (7), 1786-1800 (2015).
  6. Tu, T., Buhler, S., Bartenschlager, R. Chronic viral hepatitis and its association with liver cancer. Biological Chemistry. 398 (8), 817-837 (2017).
  7. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Urban, S. HBV DNA Integration: Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Viruses. 9 (4), (2017).
  8. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, e00049 (2012).
  9. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  10. Tuttleman, J. S., Pourcel, C., Summers, J. Formation of the pool of covalently closed circular viral DNA in hepadnavirus-infected cells. Cell. 47 (3), 451-460 (1986).
  11. Staprans, S., Loeb, D. D., Ganem, D. Mutations affecting hepadnavirus plus-strand DNA synthesis dissociate primer cleavage from translocation and reveal the origin of linear viral DNA. Journal of Virology. 65 (3), 1255-1262 (1991).
  12. Wang, G. H., Seeger, C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis. Cell. 71 (4), 663-670 (1992).
  13. Tu, T., Budzinska, M. A., Vondran, F. W. R., Shackel, N. A., Urban, S. Hepatitis B virus DNA integration occurs early in the viral life cycle in an in vitro infection model via NTCP-dependent uptake of enveloped virus particles. Journal of Virology. , (2018).
  14. Yang, W., Summers, J. Integration of hepadnavirus DNA in infected liver: evidence for a linear precursor. Journal of Virology. 73 (12), 9710-9717 (1999).
  15. Bill, C. A., Summers, J. Genomic DNA double-strand breaks are targets for hepadnaviral DNA integration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11135-11140 (2004).
  16. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Sequence Analysis of Integrated Hepatitis B Virus DNA during HBeAg-Seroconversion. Emerging Microbes and Infections. , (2018).
  17. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Cellular genomic sites of HBV DNA integration. Genes. , (2018).
  18. Mason, W. S., Liu, C., Aldrich, C. E., Litwin, S., Yeh, M. M. Clonal expansion of normal-appearing human hepatocytes during chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 84 (16), 8308-8315 (2010).
  19. Tu, T., et al. Clonal expansion of hepatocytes with a selective advantage occurs during all stages of chronic hepatitis B virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 22 (9), 737-753 (2015).
  20. Mason, W. S., et al. HBV DNA Integration and Clonal Hepatocyte Expansion in Chronic Hepatitis B Patients Considered Immune Tolerant. Gastroenterology. 151 (5), 986-998 (2016).
  21. Shafritz, D. A., Shouval, D., Sherman, H. I., Hadziyannis, S. J., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into the genome of liver cells in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Studies in percutaneous liver biopsies and post-mortem tissue specimens. New England Journal of Medicine. 305 (18), 1067-1073 (1981).
  22. Hino, O., et al. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinomas in Japan. Hepatology. 4 (1), 90-95 (1984).
  23. Fowler, M. J., et al. Integration of HBV-DNA may not be a prerequisite for the maintenance of the state of malignant transformation. An analysis of 110 liver biopsies. Journal of Hepatology. 2 (2), 218-229 (1986).
  24. Chen, J. Y., Harrison, T. J., Lee, C. S., Chen, D. S., Zuckerman, A. J. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinoma: analysis by hybridization with subgenomic DNA fragments. Hepatology. 8 (3), 518-523 (1988).
  25. Esumi, M., Tanaka, Y., Tozuka, S., Shikata, T. Clonal state of human hepatocellular carcinoma and non-tumorous hepatocytes. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 23 Suppl, S1-S3 (1989).
  26. Murakami, Y., et al. Large scaled analysis of hepatitis B virus (HBV) DNA integration in HBV related hepatocellular carcinomas. Gut. 54 (8), 1162-1168 (2005).
  27. Kimbi, G. C., Kramvis, A., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B. World Journal of Gastroenterology. 11 (41), 6416-6421 (2005).
  28. Tamori, A., et al. Alteration of gene expression in human hepatocellular carcinoma with integrated hepatitis B virus DNA. Clinical Cancer Research. 11 (16), 5821-5826 (2005).
  29. Sung, W. K., et al. Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nature Genetics. 44 (7), 765-769 (2012).
  30. Fujimoto, A., et al. Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators. Nature Genetics. 44 (7), 760-764 (2012).
  31. Jiang, S., et al. Re-evaluation of the Carcinogenic Significance of Hepatitis B Virus Integration in Hepatocarcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 7 (9), e40363 (2012).
  32. Jiang, Z., et al. The effects of hepatitis B virus integration into the genomes of hepatocellular carcinoma patients. Genome Research. 22 (4), 593-601 (2012).
  33. Kan, Z., et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in hepatocellular carcinoma. Genome Research. 23 (9), 1422-1433 (2013).
  34. Summers, J., et al. Hepatocyte turnover during resolution of a transient hepadnaviral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (20), 11652-11659 (2003).
  35. Mason, W. S., Jilbert, A. R., Summers, J. Clonal expansion of hepatocytes during chronic woodchuck hepatitis virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (4), 1139-1144 (2005).
  36. Mason, W. S., et al. Detection of clonally expanded hepatocytes in chimpanzees with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 83 (17), 8396-8408 (2009).
  37. Chauhan, R., Churchill, N. D., Mulrooney-Cousins, P. M., Michalak, T. I. Initial sites of hepadnavirus integration into host genome in human hepatocytes and in the woodchuck model of hepatitis B-associated hepatocellular carcinoma. Oncogenesis. 6 (4), e317 (2017).
  38. Tu, T., Jilbert, A. R. Detection of Hepatocyte Clones Containing Integrated Hepatitis B Virus DNA Using Inverse Nested PCR. Methods in Molecular Biology. 1540, 97-118 (2017).
  39. Ni, Y., Urban, S. Hepatitis B Virus Infection of HepaRG Cells, HepaRG-hNTCP Cells, and Primary Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 15-25 (2017).
  40. Schulze, A., Schieck, A., Ni, Y., Mier, W., Urban, S. Fine mapping of pre-S sequence requirements for hepatitis B virus large envelope protein-mediated receptor interaction. Journal of Virology. 84 (4), 1989-2000 (2010).
  41. Lempp, F. A., et al. Evidence that hepatitis B virus replication in mouse cells is limited by the lack of a host cell dependency factor. Journal of Hepatology. 64 (3), 556-564 (2016).
  42. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  43. Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. , (2017).
  44. Yang, Z. T., et al. Characterization of Full-Length Genomes of Hepatitis B Virus Quasispecies in Sera of Patients at Different Phases of Infection. Journal of Clinical Microbiology. 53 (7), 2203-2214 (2015).
  45. Chook, J. B., et al. Universal Primers for Detection and Sequencing of Hepatitis B Virus Genomes across Genotypes A to G. Journal of Clinical Microbiology. 53 (6), 1831-1835 (2015).
  46. Li, F., et al. Whole genome characterization of hepatitis B virus quasispecies with massively parallel pyrosequencing. Clinical Microbiology and Infection. 21 (3), 280-287 (2015).
  47. Zhou, T. C., et al. Evolution of full-length genomes of HBV quasispecies in sera of patients with a coexistence of HBsAg and anti-HBs antibodies. Scientific Reports. 7 (1), 661 (2017).
  48. Long, Q. X., Hu, J. L., Huang, A. L. Deep Sequencing of the Hepatitis B Virus Genome: Analysis of Multiple Samples by Implementation of the Illumina Platform. Methods in Molecular Biology. 1540, 211-218 (2017).
  49. Li, X., et al. The function of targeted host genes determines the oncogenicity of HBV integration in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 60 (5), 975-984 (2014).
  50. Wooddell, C. I., et al. RNAi-based treatment of chronically infected patients and chimpanzees reveals that integrated hepatitis B virus DNA is a source of HBsAg. Science Translational Medicine. 9 (409), (2017).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 141 HBV DNA entegrasyon Myrcludex B hepatosellüler karsinom çift doğrusal DNA iplikçikli PCR virüs Giriş viral sürekliliği ters iç içe
Algılama düşük kopya sayısı <em>Vitro</em> hepatit B enfeksiyonu tarafından kurulan entegre Viral DNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tu, T., Urban, S. Detection of Low… More

Tu, T., Urban, S. Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection. J. Vis. Exp. (141), e58202, doi:10.3791/58202 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter