Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identifiering av låg exemplar nummer integrerat virus-DNA bildas av In Vitro hepatit B-infektion

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58202
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University Hospital, 2Gastroenterology and Liver Research Laboratory, Ingham Institute, 3German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Vi beskriver här den in vitro- generationen av HBV-DNA via ett system med hepatit B virus infektion och känslig detektion av dess (1 – 2 kopior) integration med inversen nästlade PCR.

Abstract

HepatitB Virus (HBV) är en gemensam blodburna patogener som orsakar levercancer och levercirros som följd av kronisk infektion. Virusen replikerar generellt genom en episomal DNA mellanliggande; men har integration av HBV-DNA-fragment i värd genomet observerats, trots att denna form inte är nödvändigt för virusreplikation. Den exakta ändamålet, timing och mekanismerna genom vilka HBV-DNA-integreringen sker är ännu inte klart, men senaste data visar att det sker mycket tidigt efter infektion. Här, beskrivs in vitro- generering och påvisande av HBV-DNA integrationer i detalj. Våra protokoll specifikt förstärker lösnummer av virus-cell DNA integrationer och tillåter både absolut kvantifiering och singel-baspar resolution av sekvensen junction. Denna teknik har tillämpats på olika typer av HBV-mottagliga celler (inklusive primära humana hepatocyter), olika HBV mutanter, och i samband med olika drog exponeringar. Vi förutser denna teknik blir en viktig analys att bestämma de underliggande molekylära mekanismerna av detta kliniskt relevanta fenomen.

Introduction

HBV är en dubbelsträngat DNA-virus som kan orsaka livslångt kronisk infektion, vilket leder till levercirros och Hepatocellulär cancer (HCC)1,2,3. Medan det finns flera molekylära mekanismer körning HBV persistens4 (t.ex. hög stabilitet av epigenetiska viral transkriptionell mallen), undvikande av immun övervakning och låg omsättning på hepatocyter i levern och dess associerade risken av HCC inledande5,6 (t.ex. kronisk inflammation och aktivering av cellulär stress vägar), HBV-DNA integrering i den mottagande cell arvsmassan (en rapporterade mekanism för båda dessa fenomen) dåligt har undersökts . En viktig orsak är bristen på lämpliga in vitro- infektion system för HBV som tillåter tillförlitlig upptäckt av integration händelser. Här beskriver vi ett nyligen utvecklade protokoll för både in vitro- generationen och påvisande av HBV-DNA-integrationer som kan användas för att klarlägga de molekylära mekanismer bakom och konsekvenser därav.

HBV-replikation och bildandet av HBV-DNA integration har tidigare granskats i detalj7. Kort, HBV träder hepatocyter med natrium cotransporting Co-transporting peptid (NTCP) som den främsta cellulära receptorn för infektion8,9. De HBV nucleocapsids innehållande HBV-avslappnad cirkulär DNA (rcDNA) in genomet i kärnan, där rcDNA omvandlas till episomal kovalent stängda cirkulär DNA (cccDNA). Den nukleära cccDNA fungerar som transkriptionell mallen för virala mRNA och pre genomisk RNA (pgRNA)10. HBV-polymeras och pgRNA sedan paketeras till nybildade nucleocapsids (bestående av HBV core protein dimerer). HBV-pgRNA är omvänd-transkriberas inom den nucleocapsid, vilket resulterar i antingen en rcDNA arvsmassa eller en dubbelsträngat linjära DNA (dslDNA) genomet11,12. Dessa mogna nucleocapsids innehållande HBV-DNA-genomet är slutligen höljeförsedda och exporteras som virioner.

Infektion i hepatocyter av höljeförsedda partiklar som innehåller dslDNA molekyler kan resultera i viral integrering i den mottagande cell genomet13, leder till replikering-inkompetent former av HBV-DNA7,14,15. HBV-DNA-integreringen sker på platsen för kromosomala dubbelsträngat DNA raster15. Ackumulerande bevis tyder på att varje integration händelse inträffar i en i huvudsak slumpmässig position inom den mottagande cell genomet16,17. Dessutom, HBV-DNA-integreringen sker något sällan, till en växelkurs på 1 per 104 celler13,18,19,20. Viktiga frågor om HBV-DNA integration förblir obesvarade, särskilt när det gäller de exakta molekylära vägar inblandade, beroendet av viral och värd faktorer, de virala antigener som uttrycks från integrerade former och deras möjliga bidrag till viral persistens7. Vi har satt upp en in vitro- modell för att belysa några av dessa frågor.

Sällsynthet av HBV-DNA integration händelser (både när det gäller integration ränta per cell och kopia antalet varje unik integration) i in vitro- HBV-infektion modeller gör dem svåra för att upptäcka. Cell Mitos är begränsad i vårt in vitro- system, som delande celler inte stöder effektiv infektion. Således, till skillnad från i patientens levern vävnader där betydande klonal expansion av hepatocyter uppstår18,19,20, mycket få (1 till 2) exemplar av varje integration finns i en viss pool av celler infekterade in vitro- . Vi har också funnit att integration uppstår främst under den första infektion av hepatocyter (och inte kontinuerligt i kroniskt infekterad hepatocyter)13. HBV-DNA integration inte kan följaktligen ökas enkelt odla celler för en längre period.

I allmänhet blot tidigare metoderna att upptäcka integrerat HBV-DNA, inklusive södra hybridisering21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , kassett-medierad ligering PCR28och hela genomet sekvensering29,30,31,32,33, inte har känslan av att upptäcka singel-kopior av integrationer. Vi och andra forskare har använt inversen nästlade PCR (invPCR) för att upptäcka hepadnaviral DNA integration i anka, murmeldjur och mänskliga infekterade lever13,14,18,19, 34,35,36. Andra har infört processuella ändringar till invPCR tekniken som kan förändra generationen av falskt positiva signaler och begränsa möjligheten för kvantifiering37. Om analysen utförs som beskrivs i detta protokoll, representerar invPCR en specifik och känslig analys som identifierar och kvantifierar (i absolut kopia numrerar) flera HBV DNA integrationer. HBV-cell DNA korsningen sekvenseras med singel-baspar upplösning, så att bioinformatiska studier av viral och värd DNA sekvenser på platserna för integration13.

Vi har tidigare beskrivit38 resultat från invPCR på DNA av HBV-infekterade vävnaden utvinns ur ett stort utbud av källor, inklusive snapin-fryst levern vävnader, paraffin-inbäddat lever sektioner och extremt små vävnadsprover som isolerats av Laser-lokalt19. Detta protokoll beskriver en uppdaterad version av ett invPCR test med hjälp av DNA extraheras från cell kultur-derived vävnader efter in vitro- infektion, där låg kopia antal integrationer (1 – 2 kopior per integration) genereras. HBV-DNA integrationer som bildas av in vitro- likna dem som finns i patientens vävnader med avseende på deras fördelning över det cellulära genomet och junction inom viral sekvensen som är integrerad13,16, vilket tyder på en jämförbara väg till inom en infekterad lever.

Protocol

1. cell infektion och DNA-extraktion

  1. Upprätthålla odlade Huh7-NTCP celler8,9 i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 10% v/v fetalt bovint serum, 1 x Penicillin/Streptomycin, och 2 mM L-glutamin.
    Obs: Detta har tidigare rapporterats i detalj40.
  2. Utsäde 2 x 105 celler/mL Huh7-NTCP celler till en 12-well platta med 1 mL DMEM.
  3. Om testning cellen behandlingar (t.ex. HBV-hämmare), tillämpa dem på kulturen supernatant 4 h efter sådd (1 dag före HBV-infektion). För en negativ kontroll, applicera 200 nM Myrcludex B (en potent HBV entry inhibitor41).
  4. Använda heparin-kolumn renat42 supernatanten från HepAD3843 som ett inokulum för att infektera celler på 1.000 VGE/cell i 500 µL av kultur media (DMEM kompletteras med 10% v/v fetalt bovint serum, 1 x Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-glutamin och 2,5% v/v DMSO), som innehåller 4% w/v polyetylenglykol 8000 [upplöst i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS)].
  5. Odla cellerna i en 37 ° C inkubator (inställd på 5% CO2 och 90% luftfuktighet).
  6. Tvätta cellerna två gånger med 1 mL steril 1 x PBS på 16 – 24 h efter infektion.
  7. Ersätta kultur media varje 2 dagar efter HBV infektion tills skörden.
  8. På dag 3 efter infektion, behandla cellerna med 5 µM tenofovirdisoproxil och 10 µM lamivudin att begränsa produktionen av HBV replikationsförmåga intermediärer som är amplifiable av invPCR.
  9. På dag 5 efter infektion, trypsinize cellerna med 200 µL av Trypsin-EDTA och resuspendera dem i 2 mL DMEM (kompletteras med 10% v/v fetalt bovint serum, 1 x Penicillin/Streptomycin, och 2 mM L-glutamin), även innehållande 5 µM tenofovirdisoproxil och 10 µM Lamivudin.
  10. Överföra cellsuspensioner till en 6-bra platta att inducera en runda av Mitos (som har rapporterats inducera förlust av HBV cccDNA44 och andra HBV DNA intermediärer som är amplifiable av invPCR).
  11. På dag 7 efter infektion, trypsinize utökade cellerna i 400 µL av Trypsin-EDTA och resuspendera blandningen i 1 mL DMEM. Placera suspensionen i en 1,5 mL tub, pellet cellerna genom centrifugering vid 500 x g i 5 min och ta bort supernatanten genom aspiration.
  12. (Valfritt) Lagra cell pellets vid-20 ° C tills de är redo för DNA-extraktion.
  13. Extrahera DNA från cellpelleten och använda ett DNA extraktion kit, enligt tillverkarens instruktioner. Uppskatta den slutliga DNA-koncentration med hjälp av optiska densitometry.
    Obs: DNA avkastningen i en 100 μL elutionsvolymen är allmänt ~ 250-400 ng/μl.

2. inversion av DNA

  1. Alikvotens ~1.5–2.5 μg av totala DNA extrahera från steg 1 till en 200 μL PCR-rör. Tillsätt lämplig mängd restriktionsenzym master-mix att resultera i en 40 μl reaktionsvolym innehållande 1 x digest reaktion buffert (t.ex., CutSmart-buffert) och 10 U Ncojag-HF.
  2. Blanda reaktionerna och snurra ner i en liten tub centrifug. Inkubera restriktionsenzym reaktionen i en PCR-maskin vid 37 ° C i 1 h för optimal matsmältning effektivitet.
  3. Inaktivera restriktionsenzym genom inkubation vid 80 ° C i 20 min.
  4. Överför hela restriktionsenzym reaktionen till en 1,5 mL tub. Tillsätt 400 μL 1 x T4 DNA-ligase buffert och 500 U av T4 DNA-ligase och blanda noggrant. Den stora reaktionsvolym uppmuntrar inom molekylär (i motsats till mellan molekylär) ligatur av smält DNA fragmenten.
  5. Inkubera ligering reaktionen i rumstemperatur i 2 h att säkerställa fullständig ligering.
  6. Inaktivera den T4 DNA-ligase vid 70 ° C i 20 min.
  7. Tillsätt 10 μL av 10% w/v natrium dodecyl sulfate för att säkerställa fullständig inaktivering av den T4 ligase.
  8. Blanda rören genom puls vortexa och kort snurra ner reaktionsblandning. Lägga till NaCl till en slutlig koncentration på 100 mM och dextran (35 – 45 kDa) till en slutkoncentration på 90 µg/mL. Blanda rören genom puls vortexa och kort snurra ner reaktionsblandning.
  9. Tillsätt 900 μl av 100% etanol och blanda genom inversion. Fällningen DNA vid-20 ° C över natten.
  10. Pellet utfällda DNA genom centrifugering vid 14 000 x g i 15 min. ta bort supernatanten genom aspiration med P200 pipett. Tvätta pelleten med 500 μL av 70% v/v etanol och centrifugering vid 14 000 x g i 15 min.
  11. Ta bort etanol genom aspiration med P200 pipett. Lufttorka DNA pelleten i rumstemperatur i 20 min.
  12. Lös pelleten i 20 μL av H2O. Tillsätt 20 μL av en restriktionsenzym master-mix att resultera i en 40 μl reaktionsvolym innehållande 1 x digest reaktion buffert, 5 U av BsiHKAI och 5 U i Sph-HF. Inkubera restriktionsenzym reaktionen i en värme-block vid 37 ° C (den optimala temperaturen för Sphjag-HF) för 1 h.
  13. Kort snurra ner reaktionsblandning. Inkubera restriktionsenzym reaktionen i en värme-block vid 65 ° C (den optimala temperaturen för BsiHKAI) för 1 h.
  14. Kort snurra ner reaktionsblandning.
  15. Lagra den inverterade DNA vid-20 ° C fram till nästa steg.

3. nästlade PCR

  1. Ta bort potentiella amplikoner från en återanvändbar kisel matta tätning med en lösning för nedbrytning av DNA, skölj mattan med DNA-fritt vatten och lufttorka det i rumstemperatur medan du förbereder PCR-blandningen.
  2. Förbereda 1 mL av en 1 x PCR mix som innehåller den yttersta framåt (5'-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3') och bakåt (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3') grundfärg i en koncentration av 0,5 µM.
  3. Tillsätt 170 μl av 1 x PCR mixen till brunnar A1 och E1 i en PCR-plattan med 96 brunnar.
  4. Tillsätt 120 μL 1 x PCR mix wells B1 till H1.
  5. Tillsätt 10 μL av inverterade DNA från steg 2 till brunnar A1 och E1 (2 olika inverterad prover kan analyseras på samma PCR-plattan). Blanda reaktionen i varje brunn av försiktigt pipettering vardera ca 10 gånger använda en P1000 inställd på 100 μL.
  6. Seriellt utspädda prover från brunnar A1 till D1 i förhållandet 1:3 genom att överföra 60 μl vid varje steg. Blanda brunnarna vid varje steg genom att försiktigt pipettering dem om 10 gånger med en P1000 inställd på 100 μL. Undvika bildar bubblor. Upprepa steg 3.6 för väl E1, späda ner till väl H1.
  7. Alikvotens 10 μL av reaktionsblandningen med flerkanalig pipett från wells A1-H1 i brunnar A2-H2, A3-H3, och så vidare tills de når brunnar A12-H12 i plattan med 96 brunnar. Täcka PCR-plattan med torr kisel mattan från steg 3.1, trycka ordentligt.
  8. Placera plattan i en PCR-maskin och kör följande program: 10 min vid 95 ° C; 35 cykler av 15 s vid 95 ° C, 15 s vid 54 ° C och 3 min vid 72 ° C; 7 min vid 72 ° C; Håll sedan, plattan i rumstemperatur.
  9. Värm stiften på en 96-pin replicator till glödhet med en bunsenbrännare och sedan svalna i minst 5 minuter i rumstemperatur.
  10. Fyll brunnarna andra PCR-platta med 10 μL av 1 x PCR mix (innehållande en gel belastning-klar buffert) och inre framåt (5'-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3') och bakåt (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3') på 0,5 µM.
  11. Försiktigt bort silicon mattan från PCR-plattan med 96 brunnar plattan från första omgången PCR, och Undvik korskontamination mellan brunnarna.
  12. Använd den avsvalnade replicator för att överföra PCR produkter från plattan med 96 brunnar från första omgången PCR till den nyligen aliquoted plattan med 96 brunnar. Genomföra nästlade PCR med på samma villkor som steg 3.8, utom ändra det inledande denaturering steget vid 95 ° C från 10 min till 2 min.

4. PCR-produkt isolering och Gel utvinning

  1. Analysera de PCR-produkterna med gelelektrofores med en 96-brunn med 1,3% w/v agarosgel. För en 100 mL agarosgel, kör på 200 V för 10 – 15 min.
  2. Punktskatt banden DNA från agaros gelerna använda disponibla Dricksvatten halmstrån. För varje PCR-produkt, placera halmen och agarosgel koppla in i en 1,5 mL tub och trimma halmen till storlek med en sax.
    Obs: Räcker det att isolera band bara från de utspädningar som enda PCR-produkter kan lösas.
  3. (Valfritt) Förvara rören vid-20 ° C för senare utvinning.
  4. Mata ut agaros pluggarna i varje rör genom att klämma på slutet av halm fragmentet. Tillsätt 300 μL av gel utvinning buffert och 5 μL av gel utvinning glas pärla flytgödsel i varje rör.
  5. Extrahera de PCR-produkterna enligt tillverkarens instruktioner för gel utvinning kit (utom med halv-volymer för tvätt steg) och eluera DNA från pärlorna med 30 μL av vatten.
  6. Skicka den renade DNA för Sanger sekvensering (enligt leverantörens anvisningar) med Forward primer används i den andra omgången nästlade PCR.

5. sequence Analysis

  1. Bekräfta virus-cell DNA korsningar genom att utföra nukleotid BLAST analys (med standardinställningarna för att anpassa till samlingen hela nukleotid).
    Obs: Representativa resultat redovisas i figur 3 nedan.
    1. Om endast partiell justering av sekvensen observeras, trimma den 5' HBV-DNA-sekvensen innan du kör en BLAST analys.
  2. Tillämpa strikta urvalskriterier för att bestämma om en viss sekvens representerar en verklig integration junction som följer:
    1. Omfatta endast sekvenser som innehåller > 20 bp av en cellulär sekvens för säker mappning till cellulära genomet.
    2. Bortse från eventuella sekvenser som innehåller begränsning platser av några enzymer som används inom 10 bp av förmodade virus-cell integration korsningen, eftersom de sannolikt representerar in vitro ligering händelser i stället för verklig integration korsningar.
    3. Bortse från eventuella sekvenser med uppenbart olika fluorescens toppnivåer på vardera sidan av förmodade integration korsningen i sekvensering vätskeanalys, eftersom dessa är sannolikt artefakter som genereras av korskontaminering under sekvensering reaktionen eller Kapillär kromatografi.
    4. Definiera unika integration händelser som de med exakta HBV och cellulära sekvenser vid virus-cell korsningen.
      Obs: Upprepning av unika integration händelser kan resultera från klonal expansion av celler som innehåller dessa integrationer eller korskontaminering under PCR (som kan testas med negativ-kontroll reaktioner, mer detaljerad i representativa resultat nedan). Upprepade integrationer i specifika cellulära sekvenser förväntas visa olika HBV terminal platser för varje integration händelse, som icke-homolog slutet-förbinder vägar används15.
  3. Beräkna frekvensen integration genom att multiplicera utspädningsfaktorn för inverterade DNA mallar av antalet virus-cell korsningar upptäckas vid den utspädning, följt av normalisering till mängden tillförda DNA i inversion reaktionen. I allmänhet integration frekvensen är storleksordningen 1:104 celler.

Representative Results

En schematisk representation av tekniken med invPCR visas i figur 1. Ett exempel agaros gelelektrofores av en framgångsrik invPCR visas i figur 2 före och efter den PCR-produkt isoleringen. Figur 3 visar BLAST analys utdata från steg 5.1 i fall av (i) förstärkning av virus-cell DNA junction och (ii) förstärkningsnivå en HBV-DNA replikationsförmåga intermediär.

Förväntade resultat från positiva kontroller: Huh7-NTCP celler som smittats med heparin-renat HBV bestånd som beskrivs ovan (figur 1) kan fungera som en positiv kontroll. I detta fall bör enda PCR-produkter uppnås genom andra eller tredje 1:3 utspädning av varje prov (motsvarande ~ 104 cell-ekvivalenter per utspädning, figur 2). Dessa utspädningar, kommer att cirka 50% av produkter representera sann virus-cell DNA korsningar, medan den andra hälften utgör förstärkning av HBV-DNA intermediärer (figur 3).

I tidigare studier13, har vi hittat några instanser av upprepade virus-cell korsningar, föreslår inga cellulära genomisk platser av förmånliga HBV DNA integration. Vi finner också att >80% av virus-cell korsningar uppstår mellan nukleotider 1732 och 1832 (enligt nukleotid numreringen av HBV genotyp D, GenBank anslutning #U95551.1), där den sistnämnda motsvarar den högra ändpunkten av HBV dslDNA form. Sekvenser av sanna virus-cell korsningar hittade genom vår metod för in vitro- försök är offentligt tillgängliga på GenBank (anslutningen nummer MH057851 till MH058006).

Förväntade resultat från negativa kontroller: antingen infekterade Huh7-NTCP celler eller inokuleras Huh7-NTCP celler förbehandlade med Myrcludex B kan fungera som negativa kontroller. InvPCR analys av DNA extraheras från dessa celler bör producera ingen PCR-produkter. Kör dessa negativa-kontrollprover på samma PCR-plattan som positiva prover medger provning av korskontaminering under nästlade PCR-processen. Det strängaste testet för korskontaminering är driften av en negativ-kontrollprov i brunnarna A-D och positiva provet i brunnar E-H på en plattan med 96 brunnar. I det här fallet körs mest koncentrerade utspädning av det positiva provet i rad i direkt anslutning till minst koncentrerade utspädning av negativa provet. Om förstärkning produkter observeras i negativ-kontrollprover, Institut de åtgärder som föreslås i diskussionen att minimera förorening händelser.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av invPCR processen att upptäcka HBV DNA integrationer. Efter HBV-infektion, bara en minoritet av Huh7-NTCP celler innehåller HBV dslDNA (röd) integreras i den mottagande cell arvsmassan (röd), skildras i den övre delen. Totala DNA är sedan utvinns ur cellerna (steg 1), inverterad (steg 2) och förökas med nästlade PCR (steg 3). Som visas är de relativa positionerna för restriktionsenzym webbplatser (Ncojag och BsiHKAI) i exciderad virus-cell DNA korsningen. Siffran är anpassade från en tidigare publikation13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: agaros gel elektrofores och efterföljande gel utvinning av en framgångsrik invPCR. ”M” representerar DNA markör stege. Varje rad 12 representerar teknisk replikat på en enda utspädning på PCR-plattan. Två inverterade DNA-prover kan köras per PCR-plattan/agarosgel. PCR-produkterna för varje spädning bör titrera ut i en ~ 1:3 baserat. Utvinning av produkter från de två minst koncentrerade utspädningar där enda band enkelt kan isoleras är generellt tillräckliga som HBV DNA integration bestäms av slutpunkten titrering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: BLAST analys av invPCR produkt-sekvenser. Som lång skrifter av sekvens genereras från Sanger sekvensering, källan till DNA-sekvenser är allmänt entydig. Stark anpassning till HBV och cellulära genomen observeras i olika områden i FASTA sekvens fil som genereras från Sanger sekvensering i den övre panelen, vilket tyder på en sann virus-cell DNA junction. I den nedre panelen justerar sekvensen endast till fragment av HBV genomet, vilket tyder på en produkt som genereras av förstärkning av en ordnas HBV-DNA-genomet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Innan du utför protokollet, är det viktigt att notera att denna invPCR-analys är en mycket känslig teknik, kan förstärka enstaka kopior av DNA mall. Att begränsa förorening från PCR-produkter är därför av yttersta vikt. Allmänna strategier för att begränsa PCR-produktkontaminering inkluderar följande. a upprätta fysiskt avskilda områden för olika steg i metoden. Varje område bör ha separata lab rockar och handskar ska ändras när du flyttar mellan dessa områden. Vi har listat dessa områden nedan i ordning från mest till minst sannolikt vara smittbärande: PCR-produkt utvinning och sekvensering reaktion uppställningsområdet (post-PCR); PCR-mall tillägg och flammade-pin överföra område (vi har använt PCR huvor med en dekontaminering UV-lampa med gott resultat). DNA-extraktion och inversion området (pre-PCR); och ett ”DNA mall-fri” område används enbart för att förbereda lager och PCR-lösningar. (ii) vara medveten av luftflödet i labbet som en potentiell drivkraft för korskontaminering. I synnerhet förorening av PCR-reaktioner under flammade pin överföring steg är mest sannolikt att uppstå och kommer att leda till felaktiga kvantifiering av integration frekvens. PCR-huvor kan användas för att begränsa dessa cross-strömmar. Negativa kontrollbrunnar (t.ex. Myrcludex B-behandlade prover eller ingen mall kontroller) i PCR kan också användas för att testa för korskontaminering. (iii) begränsar potentiell PCR föroreningar på pipetter och arbete ytor genom att regelbundet torka dem med en lösning för nedbrytning av DNA.

Protokollet anges här arrangeras att upptäcka integration av en känd smittsam HBV klon genereras från den HepAD38 cell linje42. Om den inokulum som används är av en annan HBV-DNA-sekvens (t.ex. från patientens serum), sedan bör HBV genomet sekvenseras för att bekräfta kompatibilitet av PCR primers och inversion design först. I tidigare publicerade studier19, har vi använt 3 uppsättningar av primers som binder bevarade HBV-DNA-sekvenser som flankerar beräknade platsen av HBV-DNA integration korsningar. Andra primer sekvenser och protokoll har beskrivits för att avgöra den genomiska sekvensen av HBV-44,45,46,47,48 och kan arbeta framgångsrikt.

Dessutom kan olika HBV-mottagliga celler (t.ex. primära humana hepatocyter, differentierade HepaRG, HepG2-NTCP celler) användas; Vi har dock funnit att Huh7-NTCP celler ger det största signal-brus-förhållandet, när med tanke på antalet virus-cell DNA korsningar som förstärks jämfört med virus mellanliggande DNA som är förstärkta13. I synnerhet genomgår terminalt differentierade celler som primära humana hepatocyter eller differentierade HepaRG effektivt inte Mitos, vilket resulterar i en hög av amplifiable HBV DNA replikationsförmåga intermediärer kvar i cellerna. Vi har funnit att ~ 90% av förstärkta sekvenser representerar HBV DNA rearrangements (och inte integration händelser) i terminalt differentierade celler, jämfört med 70 – 50% i hepatom cell linjer13. Dessa produkter är i allmänhet HBV DNA genomen som innehåller stora borttagningar i ytan och core öppen läsning ramar, eller de kan representera HBV kvasi arter med en ytterligare Ncojag webbplats före den Sphjag webbplats. Förstärkning av dessa HBV arter (inklusive en principskiss) har beskrivits i detalj tidigare13.

I området i närheten finns det flera nackdelar med denna metod. På grund av mödosamma och flerdagars hur detta protokoll lämpar invPCR sig inte till hög genomströmning analyser av ett stort antal prover. Eftersom det bygger på att begränsa utspädning titrering, är vår metod dessutom inte mycket exakt i kvantifiering; även om det bör enkelt mäta loggnivå förändringar i integration frekvens.

Dessutom är våra inversion protokoll endast lämpad för att upptäcka integrationer mellan regionen DR2 och DR1 av HBV genom, eftersom majoriteten av HBV integrationer inträffar inom denna region49. NGS analys av HBV patienten vävnader har visat att en stor minoritet (upp till ~ 50%) kan också förekomma utanför denna region49. Nya invPCR mönster är teoretiskt kunna upptäcka dessa andra integration webbplatser, även om de inte (såvitt vi vet) har genomförts ännu. Relatedly, på grund av de nödvändiga restriktionsenzym webbplatser krävs nedströms från virus-cell korsningen sekvensen för inversion reaktionen, invPCR inte upptäcker alla integrationer som inträffar inom regionerna DR2 och DR1 HBV genomets (dvs vi har beräknat att ~ 10% av alla integrationer är detekterbara med i silico simuleringar13). När tillämpas på en fokuserad sats av prover med litet numrerar av olika behandlingar, är invPCR dock en av de enda praktiska metoderna för att upptäcka integrerat HBV-DNA på ett enda baspar upplösning.

Därför föreställer vi tillämpningar av denna metod som serverar en viktig roll i att hitta viral (via mutationer av den HBV inokulatet), mobilnät (via knockout eller överuttryck av specifika cellulära gener eller genom tillämpning av olika droger) och miljö ( t.ex. exponering för oxidativ stress) faktorer som inducerar HBV DNA integration. Med denna metod och nyutvecklade HBV infektion system aktivera vi oöverträffad kontroll av dessa faktorer så att de kan vara väl isolerade och bättre karakteriserade. Vi förväntar oss också att detta kommer att leda till en viktig förståelse av cellulära konsekvenserna av HBV-DNA integration, inklusive till vilken utsträckning virala antigener (t.ex. HBx eller HBsAg50) uttrycks från integrerad form, vad styr detta uttryck, och huruvida HBV integration avsevärt ändras den cellulära fenotypen mot ett mer pro-onkogena tillstånd. Resultaten av dessa framtida studier kommer att ha en djupgående inverkan på de terapeutiska strategier som används för att behandla kronisk hepatit B och på den grundläggande förståelsen av själva viruset.

Disclosures

S.U. är en medsökande och meduppfinnare av patent som skyddar Myrcludex B som inhibitor HBV/HDV inträde. T.T. förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete fick finansiering från tyska centrum för infektion forskning (DZIF), TTU hepatit projekt 5.807 och 5.704, Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) TRR179 (TP 15), och Australian centrum för HIV och hepatit virologi forskning.

Vi står i skuld till Professor William Mason för hans del i att utveckla den ursprungliga invPCR-metoden och visar det för oss. Vi vill tacka Drs. Yi Ni och Florian A. Lempp för reagenser (cellinjer och HBV inokulum). Vi erkänner Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt och Dr Katrin Schöneweis för tekniskt bistånd. Vi är tacksamma att Miriam Kleinig för korrekturläsning och professorer Nicholas Shackel och Ralf Bartenschlager för kontinuerligt stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s PBS PAA H15-002
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 41965
Fetal bovine serum PAA A15-151 Heat-inactivate before use
Penicillin, 10,000 U/mL; Streptomycin 10mg/ml, 100× PAA P11-010
L-glutamine, 200 mM PAA M11-004
Trypsin, 0.5 mg/mL; EDTA, 0.22 mg/mL, 1× PAA L11-004
PEG, MW 8000 Sigma-Aldrich 89510 Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use
DMSO for spectroscopy Merck 102950
Tenofovir disoproxil Sigma-Aldrich CDS021622 Dissolve in DMSO
Lamivudine Sigma-Aldrich L1295 Dissolve in DMSO
NucleoSpin Tissue kit Macherey Nagel 740952.250
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
NcoI-HF NEB R3193L
T4 DNA ligase NEB M0202T
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 433209
Dextran (35-45 kDa) Sigma-Aldrich D1662-10G
Absolute Ethanol Sigma-Aldrich 32205-1L-D
BsiHKAI NEB R0570L
SphI-HF NEB R3182L
Amplitaq Gold Taq kit Thermo Fisher Scientific 4331816 Use for first nest PCR
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates Biorad 2239442
DNAZap PCR DNA Degradation Solution Thermo Fisher Scientific AM9890
96-well PCR plates Sigma Aldrich CLS6509 SIGMA
96-pin replicator Thermo Fisher Scientific 250520
GoTaq Flexi PCR kit Promega M8295 Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel
Biozym LE Agarose Biozym 840004
QIAEX II Gel extraction kit QIAGEN 20051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, X., et al. Chronic hepatitis B virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  2. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  3. Huang, Y. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643-3650 (2011).
  4. Nassal, M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut. 64 (12), 1972-1984 (2015).
  5. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Jilbert, A. R. Conceptual models for the initiation of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. Liver International. 35 (7), 1786-1800 (2015).
  6. Tu, T., Buhler, S., Bartenschlager, R. Chronic viral hepatitis and its association with liver cancer. Biological Chemistry. 398 (8), 817-837 (2017).
  7. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Urban, S. HBV DNA Integration: Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Viruses. 9 (4), (2017).
  8. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, e00049 (2012).
  9. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  10. Tuttleman, J. S., Pourcel, C., Summers, J. Formation of the pool of covalently closed circular viral DNA in hepadnavirus-infected cells. Cell. 47 (3), 451-460 (1986).
  11. Staprans, S., Loeb, D. D., Ganem, D. Mutations affecting hepadnavirus plus-strand DNA synthesis dissociate primer cleavage from translocation and reveal the origin of linear viral DNA. Journal of Virology. 65 (3), 1255-1262 (1991).
  12. Wang, G. H., Seeger, C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis. Cell. 71 (4), 663-670 (1992).
  13. Tu, T., Budzinska, M. A., Vondran, F. W. R., Shackel, N. A., Urban, S. Hepatitis B virus DNA integration occurs early in the viral life cycle in an in vitro infection model via NTCP-dependent uptake of enveloped virus particles. Journal of Virology. , (2018).
  14. Yang, W., Summers, J. Integration of hepadnavirus DNA in infected liver: evidence for a linear precursor. Journal of Virology. 73 (12), 9710-9717 (1999).
  15. Bill, C. A., Summers, J. Genomic DNA double-strand breaks are targets for hepadnaviral DNA integration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11135-11140 (2004).
  16. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Sequence Analysis of Integrated Hepatitis B Virus DNA during HBeAg-Seroconversion. Emerging Microbes and Infections. , (2018).
  17. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Cellular genomic sites of HBV DNA integration. Genes. , (2018).
  18. Mason, W. S., Liu, C., Aldrich, C. E., Litwin, S., Yeh, M. M. Clonal expansion of normal-appearing human hepatocytes during chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 84 (16), 8308-8315 (2010).
  19. Tu, T., et al. Clonal expansion of hepatocytes with a selective advantage occurs during all stages of chronic hepatitis B virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 22 (9), 737-753 (2015).
  20. Mason, W. S., et al. HBV DNA Integration and Clonal Hepatocyte Expansion in Chronic Hepatitis B Patients Considered Immune Tolerant. Gastroenterology. 151 (5), 986-998 (2016).
  21. Shafritz, D. A., Shouval, D., Sherman, H. I., Hadziyannis, S. J., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into the genome of liver cells in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Studies in percutaneous liver biopsies and post-mortem tissue specimens. New England Journal of Medicine. 305 (18), 1067-1073 (1981).
  22. Hino, O., et al. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinomas in Japan. Hepatology. 4 (1), 90-95 (1984).
  23. Fowler, M. J., et al. Integration of HBV-DNA may not be a prerequisite for the maintenance of the state of malignant transformation. An analysis of 110 liver biopsies. Journal of Hepatology. 2 (2), 218-229 (1986).
  24. Chen, J. Y., Harrison, T. J., Lee, C. S., Chen, D. S., Zuckerman, A. J. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinoma: analysis by hybridization with subgenomic DNA fragments. Hepatology. 8 (3), 518-523 (1988).
  25. Esumi, M., Tanaka, Y., Tozuka, S., Shikata, T. Clonal state of human hepatocellular carcinoma and non-tumorous hepatocytes. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 23 Suppl, S1-S3 (1989).
  26. Murakami, Y., et al. Large scaled analysis of hepatitis B virus (HBV) DNA integration in HBV related hepatocellular carcinomas. Gut. 54 (8), 1162-1168 (2005).
  27. Kimbi, G. C., Kramvis, A., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B. World Journal of Gastroenterology. 11 (41), 6416-6421 (2005).
  28. Tamori, A., et al. Alteration of gene expression in human hepatocellular carcinoma with integrated hepatitis B virus DNA. Clinical Cancer Research. 11 (16), 5821-5826 (2005).
  29. Sung, W. K., et al. Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nature Genetics. 44 (7), 765-769 (2012).
  30. Fujimoto, A., et al. Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators. Nature Genetics. 44 (7), 760-764 (2012).
  31. Jiang, S., et al. Re-evaluation of the Carcinogenic Significance of Hepatitis B Virus Integration in Hepatocarcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 7 (9), e40363 (2012).
  32. Jiang, Z., et al. The effects of hepatitis B virus integration into the genomes of hepatocellular carcinoma patients. Genome Research. 22 (4), 593-601 (2012).
  33. Kan, Z., et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in hepatocellular carcinoma. Genome Research. 23 (9), 1422-1433 (2013).
  34. Summers, J., et al. Hepatocyte turnover during resolution of a transient hepadnaviral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (20), 11652-11659 (2003).
  35. Mason, W. S., Jilbert, A. R., Summers, J. Clonal expansion of hepatocytes during chronic woodchuck hepatitis virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (4), 1139-1144 (2005).
  36. Mason, W. S., et al. Detection of clonally expanded hepatocytes in chimpanzees with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 83 (17), 8396-8408 (2009).
  37. Chauhan, R., Churchill, N. D., Mulrooney-Cousins, P. M., Michalak, T. I. Initial sites of hepadnavirus integration into host genome in human hepatocytes and in the woodchuck model of hepatitis B-associated hepatocellular carcinoma. Oncogenesis. 6 (4), e317 (2017).
  38. Tu, T., Jilbert, A. R. Detection of Hepatocyte Clones Containing Integrated Hepatitis B Virus DNA Using Inverse Nested PCR. Methods in Molecular Biology. 1540, 97-118 (2017).
  39. Ni, Y., Urban, S. Hepatitis B Virus Infection of HepaRG Cells, HepaRG-hNTCP Cells, and Primary Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 15-25 (2017).
  40. Schulze, A., Schieck, A., Ni, Y., Mier, W., Urban, S. Fine mapping of pre-S sequence requirements for hepatitis B virus large envelope protein-mediated receptor interaction. Journal of Virology. 84 (4), 1989-2000 (2010).
  41. Lempp, F. A., et al. Evidence that hepatitis B virus replication in mouse cells is limited by the lack of a host cell dependency factor. Journal of Hepatology. 64 (3), 556-564 (2016).
  42. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  43. Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. , (2017).
  44. Yang, Z. T., et al. Characterization of Full-Length Genomes of Hepatitis B Virus Quasispecies in Sera of Patients at Different Phases of Infection. Journal of Clinical Microbiology. 53 (7), 2203-2214 (2015).
  45. Chook, J. B., et al. Universal Primers for Detection and Sequencing of Hepatitis B Virus Genomes across Genotypes A to G. Journal of Clinical Microbiology. 53 (6), 1831-1835 (2015).
  46. Li, F., et al. Whole genome characterization of hepatitis B virus quasispecies with massively parallel pyrosequencing. Clinical Microbiology and Infection. 21 (3), 280-287 (2015).
  47. Zhou, T. C., et al. Evolution of full-length genomes of HBV quasispecies in sera of patients with a coexistence of HBsAg and anti-HBs antibodies. Scientific Reports. 7 (1), 661 (2017).
  48. Long, Q. X., Hu, J. L., Huang, A. L. Deep Sequencing of the Hepatitis B Virus Genome: Analysis of Multiple Samples by Implementation of the Illumina Platform. Methods in Molecular Biology. 1540, 211-218 (2017).
  49. Li, X., et al. The function of targeted host genes determines the oncogenicity of HBV integration in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 60 (5), 975-984 (2014).
  50. Wooddell, C. I., et al. RNAi-based treatment of chronically infected patients and chimpanzees reveals that integrated hepatitis B virus DNA is a source of HBsAg. Science Translational Medicine. 9 (409), (2017).

Tags

Immunologi och infektion fråga 141 HBV-DNA integration Myrcludex B levercellscancer dubbelsträngat linjära DNA inversen nästlade PCR virus inresa viral persistens
Identifiering av låg exemplar nummer integrerat virus-DNA bildas av <em>In Vitro</em> hepatit B-infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tu, T., Urban, S. Detection of Low… More

Tu, T., Urban, S. Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection. J. Vis. Exp. (141), e58202, doi:10.3791/58202 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter