Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisning af lav kopi nummer integreret Viral DNA dannet af In Vitro Hepatitis B infektion

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58202
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University Hospital, 2Gastroenterology and Liver Research Laboratory, Ingham Institute, 3German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Vi beskriver her in vitro- generation af HBV DNA via en Hepatitis B virus infektion system og meget følsomme påvisning af dets (1 – 2 kopier) integration ved hjælp af inverse indlejret PCR.

Abstract

Hepatitis B Virus (HBV) er en fælles blodbårne patogener, der forårsager leverkræft og lever cirrose som følge af kronisk infektion. Virussen normalt replikater gennem en episomal DNA mellemliggende; dog har integration af HBV DNA fragmenter i vært genom overholdt, selv om denne form ikke er nødvendige for viral replikation. Nøjagtige formål, timing og mekanismer af hvilke HBV DNA integration sker er endnu ikke klart, men de seneste data viser, at det sker meget tidligt efter infektion. Her, er in vitro- generation og påvisning af HBV DNA integrationer beskrevet i detaljer. Vores protokol specifikt forstærker enkelteksemplarer af virus-celle DNA integrationer og giver mulighed for både absolutte kvantificering og enkelt-basepar opløsning af krydset sekvens. Denne teknik er blevet anvendt til forskellige HBV-modtagelige celletyper (herunder primær humane hepatocytter), til forskellige HBV mutanter og i forbindelse med forskellige stof engagementer. Vi forudser denne teknik bliver en nøgle assay til at bestemme de underliggende molekylære mekanismer af denne klinisk relevante fænomen.

Introduction

HBV er en dobbelt-strenget DNA-virus, der kan forårsage livslang kronisk infektion, føre til skrumpelever og hepatocellulært carcinom (HCC)1,2,3. Mens der er flere molekylære mekanismer HBV persistens4 (f.eks. høj stabilitet i den epigenetiske viral transcriptional skabelon), unddragelse af immun overvågning og lav omsætning af hepatocytter i leveren og dens tilknyttede kørsel risiko for HCC indledning5,6 (fx, kronisk inflammation og aktivering af cellulære understrege veje), HBV DNA integreres vært celle genomet (en rapporteret mekanisme for begge disse fænomener) er blevet dårligt undersøgt . En væsentlig årsag er manglen på egnede in vitro- infektion systemer for HBV der tillader pålidelig detektering af integration begivenheder. Her, beskriver vi en nyligt udviklede protokol for både in vitro- generation og påvisning af HBV DNA integrationer, der kan bruges til at belyse de underliggende molekylære mekanismer og følgerne heraf.

HBV replikering og dannelsen af HBV DNA integration er tidligere blevet gennemgået i detaljer7. Kort, HBV træder hepatocytter med natrium Taurocholate Co-transporting peptid (NTCP) som den vigtigste cellulær receptor for infektion8,9. HBV nucleocapsids indeholdende HBV-afslappet cirkulære DNA (rcDNA) træder genom atomkernen, hvor rcDNA omdannes til episomal kovalent lukkede cirkulære DNA (cccDNA). Den nukleare cccDNA fungerer som skabelonen transcriptional for viral mRNAs og pre genomisk RNA (pgRNA)10. HBV polymerase og pgRNA er så pakket ind i nydannede nucleocapsids (sammensat af HBV core protein dimerer). HBV pgRNA er omvendt-transskriberet inden for nucleocapsid, hvilket resulterer i enten en rcDNA genom eller en dobbelt-strenget lineære DNA (dslDNA) genom11,12. Disse modne nucleocapsids indeholdende HBV DNA genomer er endelig indhyllet og eksporteres som virioner.

Infektion af hepatocytter af indhyllede partikler indeholdende dslDNA molekyler kan resultere i viral integration i den vært celle genom13, fører til replikering-inkompetente former for HBV DNA7,14,15. HBV DNA integration opstår i stedet for kromosomale dobbelt-strenget DNA pauser15. Akkumulere beviser tyder på, at hver integration begivenhed forekommer i en stort set tilfældig position inden for værten celle genom16,17. Derudover HBV DNA integration sker noget sjældent, med en hastighed på 1 / 104 celler13,18,19,20. Vigtige spørgsmål vedrørende HBV DNA integration forbliver ubesvarede, især med hensyn til præcise molekylære veje involveret, afhængigheden af viral og vært faktorer, de virale antigener udtrykt fra integrerede formularer og deres mulige bidrag til viral persistens7. Vi har oprettet en in vitro- model til at kaste lys over nogle af disse spørgsmål.

Sjældenhed af HBV DNA integration events (både med hensyn til integration sats pr. celle og eksemplarnummer hver unik integration) i in vitro- HBV infektion modeller gør dem udfordrende for at opdage. Celle mitosen er begrænset i vores in vitro- system, som delende celler ikke understøtter effektiv infektion. Således, i modsætning til i patientens leveren væv hvor betydelig klonal ekspansion af hepatocytter opstår18,19,20, meget få (1 til 2) kopier af hver integration er til stede i en given gruppe af celler inficeret in vitro- . Vi har også fundet, at integration hovedsagelig opstår under den initiale infektion af hepatocytter (og ikke løbende i kronisk inficeret hepatocytter)13. I overensstemmelse hermed, HBV DNA integration ikke kan øges ved simpelthen dyrkning af celler i en længere periode.

I almindelighed, duppes tidligere metoder til at opdage integreret HBV DNA, herunder sydlige hybridisering21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , kassette-medieret ligatur PCR28, og hele genome sequencing29,30,31,32,33, ikke har følsomhed til at opdage Single-kopier af integrationer. Vi og andre forskere har brugt inverse indlejret PCR (invPCR) for at registrere hepadnaviral DNA integration i duck, woodchuck og menneskelige inficerede lever13,14,18,19, 34,35,36. Andre har indført proceduremæssige ændringer til invPCR teknik, der kan ændre generation af falsk-positive signaler og begrænse muligheden for kvantificering37. Hvis analysen udføres som beskrevet i denne protokol, repræsenterer invPCR en specifik og følsom analyse, som identificerer og kvantificerer (i absolut kopi numre) flere HBV DNA integrationer. HBV-celle DNA krydset er sekventeret på en enkelt-basepar resolution, så bioinformatical undersøgelser af viral og vært DNA sekvenser på steder, hvor integration13.

Vi har tidligere beskrevet38 resultater fra invPCR på DNA af HBV-inficeret væv udvundet fra en lang række kilder, herunder snap-frosne leveren væv, paraffin-embedded lever sektioner og ekstremt små vævsprøver isoleret af laser-microdissection19. Denne protokol beskriver en opdateret version af en invPCR analyse ved hjælp af DNA ekstraheret fra celle kultur-afledte væv efter in vitro- infektion, som genereres lav kopi numre af integrationer (1 – 2 kopier pr. integration). HBV DNA integrationer dannet i vitro ligner dem der findes i patientens væv på deres distribution over det cellulære genom og krydset i den viral sekvens, der er integreret13,16, tyder på en sammenlignelige vej til inden for en inficeret leveren.

Protocol

1. celle infektion og DNA-ekstraktion

  1. Vedligeholde kulturperler Huh7-NTCP celler8,9 i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% v/v føtal bovint serum, 1 x Penicillin/Streptomycin og 2 mM L-glutamin.
    Bemærk: Er det tidligere blevet rapporteret i detaljer40.
  2. Frø 2 x 105 celler/mL Huh7-NTCP celler ind i en 12-godt plade med 1 mL af DMEM.
  3. Hvis test celle behandlinger (fx HBV hæmmere), anvende dem til kultur supernatanten 4 h efter såning (1 dag før HBV infektion). For en negativ kontrol, anvende 200 nM Myrcludex B (en potent HBV post hæmmer41).
  4. Brug heparin-kolonne renset42 supernatanten fra HepAD3843 som et inokulum for at inficere celler på 1.000 VGE/celle i 500 µL af kultur medier (DMEM suppleret med 10% v/v føtal bovint serum, 1 x Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-glutamin og 2,5% v/v DMSO), som indeholder 4% w/v polyethylenglycol 8000 [opløst i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS)].
  5. Kultur cellerne i et 37 ° C inkubator (sat til 5% CO2 og 90% fugtighed).
  6. Cellerne vaskes to gange med 1 mL sterilt 1 x PBS på 16-24 h efter infektionen.
  7. Erstatte kultur medierne hver 2 dage efter HBV infektion indtil høsten.
  8. På dag 3 efter infektion, behandling af celler med 5 µM Tenofovir disoproxil og 10 µM lamivudin begrænse produktionen af HBV replicative mellemprodukter, der er amplifiable af invPCR.
  9. På dag 5 efter infektionen, trypsinize celler med 200 µL af Trypsin-EDTA og resuspend dem i 2 mL af DMEM (suppleret med 10% v/v føtal bovint serum, 1 x Penicillin/Streptomycin og 2 mM L-glutamin), der også indeholder 5 µM Tenofovir disoproxil og 10 µM Lamivudin.
  10. Overføre celle suspensioner til en 6-godt plade til at fremkalde en runde i mitosen (som er blevet rapporteret til at fremkalde tab af HBV cccDNA44 og andre HBV DNA mellemprodukter, der er amplifiable af invPCR).
  11. På dag 7 efter infektionen, trypsinize de udvidede celler i 400 µL af Trypsin-EDTA og resuspend blandingen i 1 mL DMEM. Placer suspension i en 1,5 mL tube, sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 500 x g i 5 min, og Fjern supernatanten ved aspiration.
  12. (Valgfrit) Opbevar celle pellets ved-20 ° C, indtil de er klar til DNA-ekstraktion.
  13. Uddrag af DNA fra celle pellet ved hjælp af en DNA-ekstraktion kit, ifølge producentens anvisninger. Vurdere den endelige DNA koncentration ved hjælp af optisk densitometri.
    Bemærk: DNA udbyttet i en 100 μL eluering volumen er generelt ~ 250-400 ng/μl.

2. inversion af DNA

  1. Alikvot ~1.5–2.5 μg af det samlede DNA uddrag fra trin 1 i en 200 μl PCR rør. Tilføje den passende mængde begrænsning enzym master-blanding til at resultere i en 40 μL reaktion volumen indeholdende 1 x digest reaktion buffer (fx., CutSmart buffer) og 10 U Ncojeg-HF.
  2. Bland Reaktionerne grundigt og spin ned i en lille tube centrifuge. Inkuber begrænsning enzym reaktion i en PCR-maskine ved 37 ° C i 1 time til optimal fordøjelse effektivitet.
  3. Deaktiver begrænsning enzym ved at inkubere ved 80 ° C i 20 min.
  4. Overføre hele begrænsning enzym reaktion på en 1,5 mL tube. Tilsæt 400 μL 1 x T4 DNA ligase buffer og 500 U af T4 DNA ligase og bland det grundigt. Den store reaktion volumen tilskynder intra molekylære (i modsætning til Inter Molekylær) ligatur af fordøjet DNA fragmenter.
  5. Inkuber ligatur reaktion ved stuetemperatur i 2 timer til at sikre komplet ligatur.
  6. Inaktivere T4 DNA ligase ved 70 ° C i 20 min.
  7. Tilføje 10 μl af 10% w/v sodium dodecyl sulfat til at sikre fuldstændig inaktivering af T4 ligase.
  8. Bland rør ved puls vortexing og kortvarigt spin ned mastermix. Tilføje NaCl til en endelig koncentration på 100 mM og dextran (35 – 45 kDa) til en slutkoncentration på 90 µg/mL. Bland rør ved puls vortexing og kortvarigt spin ned mastermix.
  9. Tilføje 900 μl af 100% ethanol og mix af inversion. Udfældes DNA ved-20 ° C natten over.
  10. Pellet udfældet DNA ved centrifugering ved 14.000 x g i 15 min. Fjern supernatanten ved aspiration med P200 pipette. Vask pellet med 500 μL af 70% v/v ethanol og centrifugering ved 14.000 x g i 15 min.
  11. Fjerne ethanolen ved aspiration med P200 pipette. Lufttørre DNA pellet ved stuetemperatur i 20 min.
  12. Opløse pellet i 20 μL af H2O. tilføje 20 μL af en restriktion enzym master-blanding til at resultere i en 40 μL reaktion volumen indeholdende 1 x digest reaktion buffer, 5 U i BsiHKAI og 5 U i Sph-HF. Incubate begrænsning enzym reaktion i en varme-blok ved 37 ° C (den optimale temperatur for Sphjeg-HF) i 1 h.
  13. Kort spin ned mastermix. Inkuber begrænsning enzym reaktion i en varme-blok på 65 ° C (den optimale temperatur for BsiHKAI) i 1 time.
  14. Kort spin ned mastermix.
  15. Gemme den inverterede DNA ved-20 ° C indtil det næste skridt.

3. indlejrede PCR

  1. Fjerne potentielle amplikoner fra en genanvendelig silicium mat tætning ved hjælp af en DNA nedbrydning løsning, skyl mat grundigt med DNA-gratis vand og lufttørre det ved stuetemperatur mens de forbereder PCR-blandingen.
  2. Forberede 1 mL af en 1 x PCR blanding indeholdende den ydre frem (5'-TTC GCT TCA FTT CTG CAC G-3') og omvendt (5'-AAA GGA KBRT CCC GCG CAG-3') primere i en koncentration på 0,5 µM.
  3. Tilføje 170 μL af 1 x PCR blandingen til brønde A1 og E1 i en 96-brønd PCR plade.
  4. Tilsæt 120 μL af 1 x PCR mix brønde B1 til H1.
  5. Tilsættes 10 μL inverteret DNA fra trin 2 brønde A1 og E1 (2 forskellige inverteret prøver kan analyseres på de samme PCR-plade). Mix reaktion i hver brønd ved forsigtigt pipettering hver omkring 10 gange ved hjælp af en P1000 indstillet til 100 μL.
  6. Seriefremstillede fortyndede prøver fra wells A1 til D1 i forholdet 1:3 ved at overføre 60 μl på hvert trin. Bland brønde på hvert trin af forsigtigt pipettering dem om 10 gange ved hjælp af en P1000 indstillet til 100 μL. Undgå at danne bobler. Gentag trin 3.6 for godt E1, fortynding ned til godt H1.
  7. Alikvot 10 μL af reaktionsblandingen benytter en multikanal-pipette af wells A1-H1 i brønd A2-H2, A3-H3, og så videre indtil nå pladens huller A12-H12 96-brønd. Dække PCR-plade med tørre silicium mat fra trin 3.1, at trykke på fast.
  8. Pladen anbringes i en PCR-maskine og køre følgende program: 10 min. ved 95 ° C; 35 cyklusser af 15 s ved 95 ° C, 15 s på 54 ° C og 3 min ved 72 ° C; 7 min. ved 72 ° C; derefter holde pladen ved stuetemperatur.
  9. Varme stifter af en 96-pin replicator til rødglødende med en bunsenbrænder og afkøles i mindst 5 min. ved stuetemperatur.
  10. Fylde brøndene af en anden PCR-plade med 10 μL af 1 x PCR mix (der indeholder en gel belastning-ready buffer) og den indre frem (5'-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3') og omvendt (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3') på 0,5 µM.
  11. Omhyggeligt fjerne silicium måtten fra PCR-plade af 96-brønd plade fra første runde PCR, og undgå krydskontaminering mellem brønde.
  12. Brug den afkølede replicator overførsel PCR-produkter af 96-brønd plade fra første runde PCR til den nyligt aliquoted 96 brønde plade. Udføre den indlejrede PCR ved hjælp af de samme betingelser som i trin 3.8, undtagen ændre det oprindelige denaturering skridt ved 95 ° C fra 10 min til 2 min.

4. PCR produkt Isolation og Gel udvinding

  1. Analysere PCR-produkter af gelelektroforese ved hjælp af en 96-brønd med 1,3% w/v agarosegel. Til en 100 mL agarosegel, køre på 200 V for 10-15 min.
  2. Punktafgifter DNA bands fra agarosegelitris bruge engangs drikke sugerør. For hver PCR produkt, placere halmen og agarosegel tilsluttes en 1,5 mL tube og trim halm til størrelse med saks.
    Bemærk: Det er tilstrækkeligt at isolere bands kun fra de fortyndinger som enkelt PCR produkter kan løses.
  3. (Valgfrit) Gemme rør ved-20 ° C for senere udvinding.
  4. Skubbe Agarosen stik i hver tube ved at klemme på enden af den halm fragment. Tilføje 300 μL af gel ekstraktionsbuffer og 5 μl af gel udvinding glas perle gylle til hver tube.
  5. Uddrag af PCR produkter ifølge producentens anvisninger for gel udvinding kit (undtagen ved hjælp af halv-diskenheder til at vaske trin) og elueres DNA fra perler med 30 μL af vand.
  6. Indsend oprenset DNA til Sanger sekventering (ifølge leverandørens anvisninger) med den fremadrettede primer anvendes i anden runde indlejret PCR.

5. Sekvensanalyse

  1. Bekræfte virus-celle DNA vejkryds ved at udføre nukleotid BLAST analyse (ved hjælp af standardindstillingerne for tilnærmelse til samlingen hele nukleotid).
    Bemærk: Repræsentative resultater er beskrevet i figur 3 nedenfor.
    1. Hvis der kun delvis justering af sekvensen er observeret, trim 5' HBV DNA sekvens før du igen kører en BLAST analyse.
  2. Gælde strenge udvælgelseskriterier for at afgøre, om en given sekvens repræsenterer en sand integration junction som følger:
    1. Omfatter kun sekvenser der indeholder > 20 bp af en cellulær sekvens for sikker tilknytning til cellular genomet.
    2. Se bort fra enhver sekvenser, der indeholder begrænsning websteder af alle enzymer, der anvendes inden for 10 bp formodede virus-celle integration vejkryds, som de sandsynligvis repræsenterer in vitro- ligatur arrangementer snarere end ægte integration vejkryds.
    3. Se bort fra enhver sekvenser med indlysende ulige peak fluorescens niveauer på begge sider af den formodede integration junction i sekventering gaskromatografer, da disse er sandsynligvis artefakter genereret af krydskontaminering under sekventering reaktion eller kapillar kromatografi.
    4. Definere unik integration begivenheder som dem med nøjagtige HBV og cellulære sekvenser i virus-celle krydset.
      Bemærk: Gentagelse af unik integration begivenheder kan skyldes klonal ekspansion af celler, der indeholder disse integrationer eller kontaminering under PCR (som kan testes ved hjælp af negative-kontrol reaktioner, yderligere detaljerede i de repræsentative resultater nedenfor). Gentagne integrationer til specifikke cellulære sekvenser forventes at vise forskellige HBV terminal websteder for hver hændelse, integration, som ikke-homologe at deltage i slutningen veje er brugt15.
  3. Beregne integration frekvens ved at multiplicere fortyndingsfaktoren inverteret DNA skabeloner med antallet af virus-celle vejkryds opdaget på den fortynding, efterfulgt af normalisering til mængden af samlede DNA input i inversion reaktion. Generelt, integration frekvens er på rækkefølgen af 1:104 celler.

Representative Results

En skematisk gengivelse af invPCR teknikken er vist i figur 1. Et eksempel Agarosen gelelektroforese af en succesfuld invPCR er vist i figur 2 før og efter PCR produkt isolation. Figur 3 viser den BLAST analyse output fra trin 5.1 i tilfælde af (i) forstærkning af virus-celle DNA junction og (ii) forstærkning af HBV DNA replicative mellemliggende.

Forventede resultater fra positive kontroller: Huh7-NTCP celler inficeret med heparin-renset HBV bestande som beskrevet ovenfor (figur 1) kan tjene som positiv kontrol. I dette tilfælde, bør single PCR produkter opnås ved anden eller tredje 1:3 fortynding af hver prøve (svarende til ~ 104 celle ækvivalenter pr. fortynding, figur 2). På disse fortyndinger, vil cirka 50% af produkter repræsenterer ægte virus-celle DNA vejkryds, mens anden halvdelen repræsenterer forstærkning af HBV DNA mellemprodukter (figur 3).

I tidligere studier13, har vi fundet få forekomster af gentagne virus-celle vejkryds, foreslår ingen cellulære genomisk lokaliteter af præferentiel HBV DNA integration. Vi finder også, at >80% af virus-celle vejkryds sker mellem nukleotider 1732 og 1832 (ifølge nukleotid nummereringen af HBV genotype D, GenBank tiltrædelse #U95551.1), hvor sidstnævnte repræsenterer den højre endestation for HBV dslDNA form. Sekvenser af ægte virus-celle vejkryds fundet gennem vores metode i in vitro- eksperimenter er offentligt tilgængelige på GenBank (tiltrædelse numre MH057851 til MH058006).

Forventede resultater fra negative kontroller: enten inficerede Huh7-NTCP celler eller podes Huh7-NTCP celler forbehandlet med Myrcludex B kan fungere som negative kontroller. InvPCR analyse af DNA ekstraheret fra disse celler skal producere ingen PCR produkter. Kører disse negative kontrolprøver på den samme PCR-plade som positive prøver giver mulighed for afprøvning af krydskontaminering under indlejrede PCR-processen. Den strengeste test for krydskontaminering er driften af en negativ kontrolprøve i wells A-D og den positive prøve i wells E-H på en 96-brønd plade. I dette tilfælde køres den mest koncentrerede fortynding af den positive prøve i rækken støder direkte op til den mindste koncentreret fortynding af den negative prøve. Hvis forstærkning produkter er observeret i negative kontrolprøver, Institut de foranstaltninger, som foreslås i diskussionen at minimere kontaminering begivenheder.

Figure 1
Figur 1: skematisk figur af invPCR processen til at registrere HBV DNA integrationer. Efter HBV infektion, kun et mindretal af Huh7-NTCP celler indeholder HBV dslDNA (rød) integreret i vært celle genom (rød), afbildet i den øverste del. Samlede DNA er derefter udvundet fra celler (trin 1), inverteret (trin 2), og forstærket af indlejrede PCR (trin 3). Vist er de relative holdninger af begrænsning enzym websteder (Ncojeg og BsiHKAI) i skåret virus-celle DNA junction. Tallet er tilpasset fra en tidligere publikation13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Agarosen gel elektroforese og efterfølgende gel udvinding af en vellykket invPCR. "M" repræsenterer DNA markør stigen. Hver række med 12 repræsenterer teknisk replikater i en enkelt fortynding på PCR-plade. To inverteret DNA-prøver kan køre pr. PCR plade/agarosegel. PCR produkter for hver fortynding skal titreres ud i en ~ 1:3 ratio. Udvinding af produkter fra de to mindste koncentreret fortyndinger hvor enkelt bands kan være let isoleret er normalt tilstrækkeligt, som HBV DNA integration satsen bestemmes af end-point titrering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: BLAST analyse af invPCR produkt sekvenser. Som lang skrifter af sekvens er genereret fra Sanger sekventering, kilden til DNA-sekvenser er generelt utvetydige. Stærk tilpasning til HBV og cellulære genomer er observeret i forskellige områder af filen FASTA sekvens genereret fra Sanger sequencing i det øverste panel, hvilket tyder på en sand virus-celle DNA junction. I det nederste panel justeres sekvensen kun til fragmenter af HBV genom, tyder på et produkt, der er genereret af forstærkningen af en omarrangeret HBV DNA genom. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Før du udfører protokollen, er det vigtigt at bemærke, at denne invPCR assay er en yderst følsom teknik, i stand til at forstærke enkelt kopier af DNA skabelon. Derfor er begrænse forurening fra PCR produkter af allerstørste betydning. Generelle strategier til at begrænse PCR produktkontaminering omfatter følgende. a etablere fysisk adskilte områder til forskellige trin i metoden. Hvert område skal have separate lab frakker, og handsker bør ændres, når du flytter mellem disse områder. Vi har opført disse områder nedenfor i rækkefølge fra mest at det mindste sandsynligt være kontamineret: PCR produkt udvinding og sekventering reaktion set-up område (post-PCR); PCR skabelon tilsætning og flammede-benet overføre område (vi har brugt PCR emhætter med en dekontaminering UV lampe med gode resultater); DNA-ekstraktion og inversion område (pre-PCR); og et "DNA-skabelon-fri" område anvendes udelukkende til udarbejdelsen af materiel og PCR løsninger. (ii) være opmærksom på luft flow i lab som en potentiel drivkraft for krydskontaminering. Især krydskontaminering af PCR reaktioner under trinnet flammede pin overførsel er mest sandsynligt at forekomme og vil føre til unøjagtige kvantificering af integration frekvens. PCR hætter kan bruges til at begrænse disse cross-strømme. Negativ kontrol wells (f.eks. Myrcludex B-behandlede prøver eller ingen skabelon kontrol) i PCR kan også bruges til at teste for krydskontaminering. (iii) begrænse potentielle PCR forureninger på pipetter og arbejde overflader jævnligt tørre dem med en DNA nedbrydning løsning.

Den protokol, der er angivet her er arrangeret at opdage integration af en kendt smitsomme HBV klon genereret fra HepAD38 celle linje42. Hvis inokulum bruges af en anden HBV DNA sekvens (f.eks. fra patientens serum), bør derefter HBV genom være første sekventeret for at bekræfte kompatibilitet af PCR primere og inversion design. I tidligere offentliggjorte studier19, har vi brugt 3 sæt primere, som binder bevarede HBV DNA sekvenser flankerer den forventede site af HBV DNA integration vejkryds. Andre primer sekvenser og protokoller er blevet beskrevet til at bestemme genomisk rækkefølgen af HBV44,45,46,47,48 og kan arbejde med succes.

Derudover kan forskellige HBV-følsomme celler (f.eks. primære humane hepatocytter, differentierede HepaRG, HepG2-NTCP celler) bruges; Vi har dog konstateret, at Huh7-NTCP celler giver den største signal / støj-forhold, når de overvejer antallet af virus-celle DNA vejkryds, der er forstærket i forhold til virus mellemliggende DNA, der er forstærket13. Især undergår terminalt differentieret celler som primære humane hepatocytter eller differentierede HepaRG ikke effektivt mitose, hvilket resulterer i et højt niveau af amplifiable HBV DNA replicative mellemprodukter resterende i cellerne. Vi har fundet, at ~ 90% af forstærkede sekvenser repræsenterer HBV DNA rearrangementer (og ikke integration begivenheder) i terminalt differentieret celler, i forhold til 70-50% i hepatoma celle linjer13. Disse produkter er generelt HBV DNA genomer indeholdende store sletninger i overfladen og core åben læsning rammer, eller de kan repræsentere HBV kvasi arter med en ekstra Ncojeg site forud for Sphjeg site. Forstærkningen af disse HBV arter (herunder et skematisk diagram) er blevet beskrevet i detaljer tidligere13.

Der er flere ulemper til denne metode. På grund af den besværlige og multi-dages karakter af denne protokol, er invPCR ikke velegnet til høj overførselshastighed analyser af et stort antal prøver. Desuden, som det bygger på begrænsning af fortynding titrering, vores metode er ikke meget præcise i kvantificering; selv om det bør nemt måle log-niveau ændringer i integration frekvens.

Desuden er vores inversion protokol kun egnet til at opdage integrationer mellem regionen DR2 og DR1 af HBV genom, som fleste af HBV integrationer forekomme inden for denne region49. NGS analyse af HBV patient væv har vist, at et stort mindretal (op til ~ 50%) kan også forekomme uden for denne region49. Nye invPCR designs er teoretisk købedygtig opdager disse andre websteder, integration, selv om de har ikke (til vores viden) blevet gennemført endnu. Boligområdet, på grund af de nødvendige begrænsning enzym steder kræves nedstrøms fra virus-celle junction sekvens for inversion reaktion, invPCR ikke registrerer alle integrationer forekommer inden for DR2 og DR1 regionerne af HBV genom (dvs, vi har anslået at ~ 10% af alle integrationer kan registreres ved hjælp af i siliciummangan simuleringer13). Men når de påføres en fokuseret batch af prøver med et lille antal forskellige behandlinger, invPCR er en af de eneste praktiske metoder til påvisning af integrerede HBV DNA på en enkelt basepar opløsning.

Vi derfor envision anvendelser af denne metode tjener en nøglerolle i at finde viral (via mutationer af HBV inokulum), cellular (gennem knockout eller overekspression af specifikke cellulære gener, eller ved anvendelse af forskellige stoffer) og miljømæssige ( fx eksponering for oxidativt stress) faktorer, der inducerer HBV DNA integration. Med denne metode og nyudviklede HBV infektion systemer aktivere vi hidtil uset kontrol af disse faktorer, så de kan være godt isoleret og bedre karakteriseret. Vi forventer også, at dette vil føre til en afgørende forståelse af cellulære konsekvenserne af HBV DNA integration, herunder til hvilken grad virale antigener (fx HBx eller HBsAg50) udtrykkes fra integreret form, hvad styrer dette udtryk, og eller ej HBV integration væsentligt ændrer den cellulære fænotype hen imod en mere pro-mutationer tilstand. Resultaterne af disse fremtidige undersøgelser vil have en dybtgående indflydelse på de terapeutiske strategier, der anvendes til behandling af kronisk hepatitis B og på den grundlæggende forståelse af selve virus.

Disclosures

S.U. er en co ansøgeren og medopfinderen af patenter beskytter Myrcludex B som en HBV/HDV post hæmmer. T.T. erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde fik støtte fra den tyske infektion forskning (DZIF), TTU Hepatitis projekter 5.807 og 5.704, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (TP 15), og den australske Center for HIV og Hepatitis virologi forskning.

Vi står i gæld til Professor William Mason for sin rolle i udviklingen af den oprindelige invPCR metode og viser det til os. Vi vil gerne takke Drs. Yi Ni og Florian A. Lempp for reagenser (cellelinjer og HBV inokulum). Vi anerkender Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt og Dr. Katrin Schöneweis for teknisk bistand. Vi er taknemmelige for Miriam Kleinig til korrekturlæsning og professorer Nicholas Shackel og Ralf Bartenschlager for løbende support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s PBS PAA H15-002
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 41965
Fetal bovine serum PAA A15-151 Heat-inactivate before use
Penicillin, 10,000 U/mL; Streptomycin 10mg/ml, 100× PAA P11-010
L-glutamine, 200 mM PAA M11-004
Trypsin, 0.5 mg/mL; EDTA, 0.22 mg/mL, 1× PAA L11-004
PEG, MW 8000 Sigma-Aldrich 89510 Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use
DMSO for spectroscopy Merck 102950
Tenofovir disoproxil Sigma-Aldrich CDS021622 Dissolve in DMSO
Lamivudine Sigma-Aldrich L1295 Dissolve in DMSO
NucleoSpin Tissue kit Macherey Nagel 740952.250
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
NcoI-HF NEB R3193L
T4 DNA ligase NEB M0202T
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 433209
Dextran (35-45 kDa) Sigma-Aldrich D1662-10G
Absolute Ethanol Sigma-Aldrich 32205-1L-D
BsiHKAI NEB R0570L
SphI-HF NEB R3182L
Amplitaq Gold Taq kit Thermo Fisher Scientific 4331816 Use for first nest PCR
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates Biorad 2239442
DNAZap PCR DNA Degradation Solution Thermo Fisher Scientific AM9890
96-well PCR plates Sigma Aldrich CLS6509 SIGMA
96-pin replicator Thermo Fisher Scientific 250520
GoTaq Flexi PCR kit Promega M8295 Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel
Biozym LE Agarose Biozym 840004
QIAEX II Gel extraction kit QIAGEN 20051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, X., et al. Chronic hepatitis B virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  2. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  3. Huang, Y. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643-3650 (2011).
  4. Nassal, M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut. 64 (12), 1972-1984 (2015).
  5. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Jilbert, A. R. Conceptual models for the initiation of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. Liver International. 35 (7), 1786-1800 (2015).
  6. Tu, T., Buhler, S., Bartenschlager, R. Chronic viral hepatitis and its association with liver cancer. Biological Chemistry. 398 (8), 817-837 (2017).
  7. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Urban, S. HBV DNA Integration: Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Viruses. 9 (4), (2017).
  8. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, e00049 (2012).
  9. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  10. Tuttleman, J. S., Pourcel, C., Summers, J. Formation of the pool of covalently closed circular viral DNA in hepadnavirus-infected cells. Cell. 47 (3), 451-460 (1986).
  11. Staprans, S., Loeb, D. D., Ganem, D. Mutations affecting hepadnavirus plus-strand DNA synthesis dissociate primer cleavage from translocation and reveal the origin of linear viral DNA. Journal of Virology. 65 (3), 1255-1262 (1991).
  12. Wang, G. H., Seeger, C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis. Cell. 71 (4), 663-670 (1992).
  13. Tu, T., Budzinska, M. A., Vondran, F. W. R., Shackel, N. A., Urban, S. Hepatitis B virus DNA integration occurs early in the viral life cycle in an in vitro infection model via NTCP-dependent uptake of enveloped virus particles. Journal of Virology. , (2018).
  14. Yang, W., Summers, J. Integration of hepadnavirus DNA in infected liver: evidence for a linear precursor. Journal of Virology. 73 (12), 9710-9717 (1999).
  15. Bill, C. A., Summers, J. Genomic DNA double-strand breaks are targets for hepadnaviral DNA integration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11135-11140 (2004).
  16. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Sequence Analysis of Integrated Hepatitis B Virus DNA during HBeAg-Seroconversion. Emerging Microbes and Infections. , (2018).
  17. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Cellular genomic sites of HBV DNA integration. Genes. , (2018).
  18. Mason, W. S., Liu, C., Aldrich, C. E., Litwin, S., Yeh, M. M. Clonal expansion of normal-appearing human hepatocytes during chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 84 (16), 8308-8315 (2010).
  19. Tu, T., et al. Clonal expansion of hepatocytes with a selective advantage occurs during all stages of chronic hepatitis B virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 22 (9), 737-753 (2015).
  20. Mason, W. S., et al. HBV DNA Integration and Clonal Hepatocyte Expansion in Chronic Hepatitis B Patients Considered Immune Tolerant. Gastroenterology. 151 (5), 986-998 (2016).
  21. Shafritz, D. A., Shouval, D., Sherman, H. I., Hadziyannis, S. J., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into the genome of liver cells in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Studies in percutaneous liver biopsies and post-mortem tissue specimens. New England Journal of Medicine. 305 (18), 1067-1073 (1981).
  22. Hino, O., et al. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinomas in Japan. Hepatology. 4 (1), 90-95 (1984).
  23. Fowler, M. J., et al. Integration of HBV-DNA may not be a prerequisite for the maintenance of the state of malignant transformation. An analysis of 110 liver biopsies. Journal of Hepatology. 2 (2), 218-229 (1986).
  24. Chen, J. Y., Harrison, T. J., Lee, C. S., Chen, D. S., Zuckerman, A. J. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinoma: analysis by hybridization with subgenomic DNA fragments. Hepatology. 8 (3), 518-523 (1988).
  25. Esumi, M., Tanaka, Y., Tozuka, S., Shikata, T. Clonal state of human hepatocellular carcinoma and non-tumorous hepatocytes. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 23 Suppl, S1-S3 (1989).
  26. Murakami, Y., et al. Large scaled analysis of hepatitis B virus (HBV) DNA integration in HBV related hepatocellular carcinomas. Gut. 54 (8), 1162-1168 (2005).
  27. Kimbi, G. C., Kramvis, A., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B. World Journal of Gastroenterology. 11 (41), 6416-6421 (2005).
  28. Tamori, A., et al. Alteration of gene expression in human hepatocellular carcinoma with integrated hepatitis B virus DNA. Clinical Cancer Research. 11 (16), 5821-5826 (2005).
  29. Sung, W. K., et al. Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nature Genetics. 44 (7), 765-769 (2012).
  30. Fujimoto, A., et al. Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators. Nature Genetics. 44 (7), 760-764 (2012).
  31. Jiang, S., et al. Re-evaluation of the Carcinogenic Significance of Hepatitis B Virus Integration in Hepatocarcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 7 (9), e40363 (2012).
  32. Jiang, Z., et al. The effects of hepatitis B virus integration into the genomes of hepatocellular carcinoma patients. Genome Research. 22 (4), 593-601 (2012).
  33. Kan, Z., et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in hepatocellular carcinoma. Genome Research. 23 (9), 1422-1433 (2013).
  34. Summers, J., et al. Hepatocyte turnover during resolution of a transient hepadnaviral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (20), 11652-11659 (2003).
  35. Mason, W. S., Jilbert, A. R., Summers, J. Clonal expansion of hepatocytes during chronic woodchuck hepatitis virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (4), 1139-1144 (2005).
  36. Mason, W. S., et al. Detection of clonally expanded hepatocytes in chimpanzees with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 83 (17), 8396-8408 (2009).
  37. Chauhan, R., Churchill, N. D., Mulrooney-Cousins, P. M., Michalak, T. I. Initial sites of hepadnavirus integration into host genome in human hepatocytes and in the woodchuck model of hepatitis B-associated hepatocellular carcinoma. Oncogenesis. 6 (4), e317 (2017).
  38. Tu, T., Jilbert, A. R. Detection of Hepatocyte Clones Containing Integrated Hepatitis B Virus DNA Using Inverse Nested PCR. Methods in Molecular Biology. 1540, 97-118 (2017).
  39. Ni, Y., Urban, S. Hepatitis B Virus Infection of HepaRG Cells, HepaRG-hNTCP Cells, and Primary Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 15-25 (2017).
  40. Schulze, A., Schieck, A., Ni, Y., Mier, W., Urban, S. Fine mapping of pre-S sequence requirements for hepatitis B virus large envelope protein-mediated receptor interaction. Journal of Virology. 84 (4), 1989-2000 (2010).
  41. Lempp, F. A., et al. Evidence that hepatitis B virus replication in mouse cells is limited by the lack of a host cell dependency factor. Journal of Hepatology. 64 (3), 556-564 (2016).
  42. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  43. Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. , (2017).
  44. Yang, Z. T., et al. Characterization of Full-Length Genomes of Hepatitis B Virus Quasispecies in Sera of Patients at Different Phases of Infection. Journal of Clinical Microbiology. 53 (7), 2203-2214 (2015).
  45. Chook, J. B., et al. Universal Primers for Detection and Sequencing of Hepatitis B Virus Genomes across Genotypes A to G. Journal of Clinical Microbiology. 53 (6), 1831-1835 (2015).
  46. Li, F., et al. Whole genome characterization of hepatitis B virus quasispecies with massively parallel pyrosequencing. Clinical Microbiology and Infection. 21 (3), 280-287 (2015).
  47. Zhou, T. C., et al. Evolution of full-length genomes of HBV quasispecies in sera of patients with a coexistence of HBsAg and anti-HBs antibodies. Scientific Reports. 7 (1), 661 (2017).
  48. Long, Q. X., Hu, J. L., Huang, A. L. Deep Sequencing of the Hepatitis B Virus Genome: Analysis of Multiple Samples by Implementation of the Illumina Platform. Methods in Molecular Biology. 1540, 211-218 (2017).
  49. Li, X., et al. The function of targeted host genes determines the oncogenicity of HBV integration in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 60 (5), 975-984 (2014).
  50. Wooddell, C. I., et al. RNAi-based treatment of chronically infected patients and chimpanzees reveals that integrated hepatitis B virus DNA is a source of HBsAg. Science Translational Medicine. 9 (409), (2017).

Tags

Immunologi og infektion sag 141 HBV DNA integration Myrcludex B hepatocellulært carcinom dobbelt-strenget lineære DNA inverse indlejrede PCR virus løsning viral vedholdenhed
Påvisning af lav kopi nummer integreret Viral DNA dannet af <em>In Vitro</em> Hepatitis B infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tu, T., Urban, S. Detection of Low… More

Tu, T., Urban, S. Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection. J. Vis. Exp. (141), e58202, doi:10.3791/58202 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter