Summary
أساليب لقياس استجابات متعاطفة والقلب والأوعية الدموية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) التلاعب هامة للنهوض بعلم الأعصاب. تم تطوير هذا البروتوكول لمساعدة العلماء بقياس وتقدير التغيرات الحادة في نشاط العصب متعاطفة الكلوي (رسنا) في الفئران تخديره (غير--البقاء على قيد الحياة).
Abstract
نشاط العصب متعاطفة الكلوي (رسنا) ومتوسط الضغط الشرياني من المعالم الهامة في أبحاث القلب والأوعية الدموية والاستقلال الذاتي؛ ومع ذلك، هناك موارد محدودة توجيه العلماء في تقنيات لقياس وتحليل هذه المتغيرات. ويصف هذا البروتوكول أساليب لقياس رسنا ومتوسط الضغط الشرياني في تخديره من الفئران. ويشمل البروتوكول أيضا النهج للوصول إلى الدماغ خلال تسجيلات رسنا للتلاعب الجهاز العصبي المركزي (CNS). ومتوافق مع تقنية تسجيل رسنا دوائية، أوبتوجينيتيك، أو التحفيز الكهربائي للجهاز العصبي المركزي. النهج مفيد عند محقق سيتم قياس الاستجابات اللاإرادي (دقيقة إلى ح) القصيرة الأجل في تجارب غير البقاء على قيد الحياة لربط تشريحيا بنوي الجهاز العصبي المركزي. ليس المقصود بالنهج التي ستستخدم للحصول على تسجيلات المزمن (البقاء على قيد الحياة) من رسنا في الفئران. التصريف في رسنا، بلغ متوسط تصحيح رسنا، ويمكن أن يكون الضغط الشرياني يعني كمياً وتحليلها كذلك استخدام الاختبارات الإحصائية حدودي. كما يتم وصف الأساليب للحصول على وصول وريدي وتسجيل الضغط الشرياني يعني تيليميتريكالي، وتثبيت الدماغ للتحليل النسيجي في المستقبل في هذه المادة.
Introduction
إعلام الاكتشافات قبل الإكلينيكية حول التحكم اللاإرادي لنظام القلب والأوعية الدموية استراتيجيات إدارة الاضطرابات مثل ارتفاع ضغط الدم وفشل القلب، وأمراض الكلي المزمنة. فرط النشاط العصبي الودي وانخفاض نغمة القلب تحفيزه تسهم في ارتفاع ضغط الدم (BP)1. تدفق متعاطفة الكلوي المزمن مرتفعة يعزز إفراز الكاتيكولامينات ويقلل من تدفق الدم الكلوي، مع عواقب ضارة على أنظمة القلب والأوعية الدموية/كلوي2،3. لتحديد المسارات العصبية الحيوية المؤدية إلى اختلال وظيفي اللاإرادي، دراسات في القوارض هامة لتحديد كيفية تنظيم الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) متعاطفة مع المعلمات. والغرض من هذا البروتوكول توفير معلومات تقنية حول قياس نشاط العصب متعاطفة الكلوي (رسنا) وشركة بريتيش بتروليوم وتحديد الأساليب لقياس التغييرات الحادة متعاطفة مع ردا على الجهاز العصبي المركزي التلاعب في الفئران تخديره.
قياسات رسنا (عدم بقاء) الحادة (دقيقة دائم إلى ح) مفيدة عند العلماء سيتم التحقيق في الجهاز العصبي المركزي عقاقيري، كهربائياً، أو تخديره أوبتوجينيتيكالي في الفئران لتحديد المهام لنواة محددة. باستخدام هذه الأساليب، هياكل مثل نواة الانفرادي، رمادي بيرياكويدوكتال، تيجمينتوم بيدونكولوبونتيني، ولب فينترولاتيرال روسترال تم التحقيق لتحديد المسارات العصبية الحيوية تنظيم معلمات متعاطفة مع4، 5،،من67. هذا النهج مهم لتحديد أهداف الجهاز العصبي المركزي التحقيق في نماذج المزمن من خلل اللاإرادي8،9. لإكمال هذه التجارب، يتطلب المختبر لحام الحديد ومجهر جراحي، الإطار ستيريوتاكسيك، ميكروليكترودي مكبر للصوت وجهاز الصوت. اعتماداً على العوامل الموجودة في المختبر التي تسهم في الضوضاء الكهربائية، قد تتطلب مجال تسجيل/الجراحية فاراداي قفص/أسس حزام للحد من الضوضاء الكهربائية في تسجيل رسنا. إذا كان تحليل الدماغ سوف يتطلب تثبيت الأنسجة، غطاء المضخة والأبخرة نضح مطلوبة. البيانات يمكن أن تكون رقمية وتسجيلها باستخدام عدة الفسيولوجي البرمجيات والبيانات اقتناء (محول تناظري رقمي) وحدات4،5، مع تحليل مختلف الخيارات والتوافق لإدراج إشارات القياس البعدي .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأساليب الموصوفة بموافقة "اللجنة الرعاية المؤسسية الحيوان" في جامعة إلينوي في شيكاغو.
1-خلق أقطاب رسنا ثنائي القطب
- لإنشاء مسرى، قص قطعتين من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ كل حوالي 18 مم في الطول. قطع قطعة واحدة من البولي إثيلين (PE-50) الأنابيب حوالي 15 ملم منذ وقت طويل. تغذية كل قطعة من الأسلاك في الأنبوب، ترك السلك بارزة من كلا الطرفين.
- إزالة العزل من نهايات الأسلاك؛ قطع الأسلاك يترك 2-3 مم أسلاك المكشوفة. في نهاية واحدة، تجعيد دبابيس الذكور عبر الأسلاك المكشوفة. دبابيس بشكل أمن إلى الأسلاك لحام وتأمين الدبابيس داخل قطاع موصل من تغطية الاتصال مع الإيبوكسي.
ملاحظة: نهج بديل أن يتجنب لحام استخدام مقاطع التمساح الاتصال/الإفراج السريع. - على الطرف المقابل من مسرى، إزالة العزل من نهايات الأسلاك، يترك 2-3 مم أسلاك المكشوفة. ينحني هذا الجزء من الأسلاك لإنشاء "V" صغيرة على شكل خطاطيف في أسلاك الأغلفة.
ملاحظة: هذا هو الجزء القطب التي ستكون على اتصال العصب متعاطفة الكلوي. من المهم أن ختم هذا النهاية الحيلولة دون دخول الأنبوب سوائل. سيليكون أو الإيبوكسي فعالة يمكن استخدامها.
2-إدارة التخدير وتحضير المواقع الجراحية
- إدارة التخدير للفئران "سبراغ داولي" ذكور (سن 9-11 أسبوعا، يزن 150-400 جرام). إدارة بينتوباربيتال الصوديوم 50 مغ/كغ عن طريق حقنه داخل (IP). تقييم طائرة مستقرة للتخدير أثناء الجراحة، تحقق منعكس تو-رشة كل 15 دقيقة وإعادة جرعة التخدير حسب الحاجة.
ملاحظة: استخدمت الصوديوم بينتوباربيتال (نيمبوتال) في الدراسات السابقة لتحقيق طائرة المطرد للتخدير دون التدخل مع تحوير رسنا4،،من56. هذا البروتوكول هو لجراحة غير البقاء على قيد الحياة، حتى لا يكون هناك لا استرداد/ما بعد-التعاونية فترة الرصد. - إعداد موقع الجراحية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان المؤسسية (أي. ويحلق الفئران في البطن والظهر، ورئيس؛ وتطهير الجلد بمحلول بوفيدون 10%؛ وتطبيق مواد التشحيم العين؛ ووضع الفئران على وسادة تدفئة). الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية خلال التجارب.
3-كانولاتي على المنوال فخذي (للوصول عن طريق الحقن الوريدي)
- إضافة الهيبارين إلى 0.9% سالين معقم (لتحقيق 20 وحدة/مل). ملء حقنه 1 مل مع المياه المالحة هيبارينيزيد عن طريق إبرة ز 22. قم بتوصيل 15 سم أنابيب PE-50 إبرة وأنابيب التعبئة مع الحل.
- مع الفئران الكذب مستلق، إنشاء شق أفقي 2 سم في المنطقة الاربية. استخدام القطن ذات الرؤوس قضيب تطبيق، تشريح النسيج الضام لكشف فخذي الوريد والشريان. إجراء الشق مفتوحة، أما تطبيق مرنة هوك واحد-الإقامة الجراحية المضمونة إلى الحقل الجراحي مع الحرير الشريط أو استخدام هيموستاتس الصغيرة.
- استخدم هيموستاتس لثني طرف إبرة ز 22 بزاوية 90 درجة ليكون بمثابة مقدم قسطرة10.
- تصور هذه السفن تحت المجهر. فصل بلطف بالوريد والشريان باستخدام الملقط منحنية. مكان اثنين 12 سم الطويلة الحرير 5-0 خياطة تحت الوريد (واحد القاصي وواحد الدانية)؛ ضع الخياطة بنفس الطريقة تحت الشريان.
- التعادل خياطة القاصي (أسفل) أوككلودي في السياق؛ تأمين حواف هذا الخياطة للحقل الجراحي باستخدام الشريط الحرير أو هيموستاتس الصغيرة. اجذب الوريد مشدود ولكن ليس مع القوة الكثير أن السفينة سوف المسيل للدموع. ضع على المنوال عمودي على يد الجراح المهيمنة.
- استخدم عقده نصف أوفيرهاند فضفاضة في خياطة الدانية إلى أوككلودي بإيجاز على المنوال. مع ملقط مرقئ حساسة، المشبك برفق هذا الخياطة أوككلودي تدفق الدم. اضغط الإبرة ز 22 مع نصيحة بنت في اليد غير المهيمنة. نتصافح الأنبوب مع الملقط استخدام اليد المهيمنة.
- ثقب حفرة صغيرة في الوريد مع المقدم القسطرة (الخطوة 3، 3) وإدراج الأنبوب PE-50 (قبل مليئة بالمياه المالحة هيبارينيزيد) في السفينة؛ استخدام إبرة بنت للحفاظ على فتح في فتح السفينة والمساعدة في تحديد المواقع غيض القسطرة في السفينة10.
- الإفراج عن خياطة الدانية ولطف استواء 0.2 مل من المحلول الملحي هيبارينيزيد في هذا السياق؛ النهوض بالقسطرة. تحقق من عودة الدم من الوريد لضمان التوظيف السليم. إكمال عقده الدانية، ومع التعادل خياطة البعيدة، وتأمين الأنابيب داخل الوريد.
- استخدام access الوريدي أثناء التجارب لإدارة التخدير تكميلية أو الأدوية وجمع الدم. إدراج رابط 3-الطريقة إذا سيكون من الضروري الحقن الوريدي العادية وأخذ عينات من الدم. تحقق المؤذية تو-رشة العاكسة كل 15 دقيقة تيتراتي التخدير.
4-كانولاتي شريان فخذي لرصد متوسط الضغط الشرياني
- تصور الشريان تحت المجهر. مشابهة للطريقة المستخدمة ل cannulation وريدي، ربط خياطة القاصي (3.4 خطوة) أوككلودي الشريان؛ تأمين حواف خياطة هذا الحقل الجراحي مع الشريط الحرير ووضع الشريان عمودي على يد الجراح المهيمنة.
- الوصول إلى الشرايين في حالة استخدام نظام محول طاقة/ضخ الضغط
- قم بتوصيل محول طاقة/أنابيب الضغط كيس مالحة 0.9% 500 مل. تدفق الأنابيب مع المياه المالحة، إزالة جميع فقاعات، ووضع الكيس داخل كيس ضغط محفز للضغط على النظام.
- كما هو موضح في "الخطوة 3، 1"، ملء حقنه 1 مل مع المياه المالحة هيبارينيزيد عن طريق إبرة ز 22 وتوصيل 15 سم PE-50 الإبرة (تدفق الأنابيب مع المالحة هيبارينيزيد).
- استخدم عقده نصف فضفاضة في خياطة الدانية لفترة وجيزة أوككلودي الشريان. عقد المقدم القسطرة (الخطوة 3.3) في اليد غير المهيمنة. عقد تلميح القاصي من PE-50 مع السفينة cannulation الملقط في اليد المهيمنة. ثقب حفرة في الشريان مع الإبرة ز 22 بنت وإدراج القنية في السفينة.
- الإفراج عن خياطة الدانية، دافق بلطف 0.2 مل من المحلول الملحي هيبارينيزيد في الشريان وتقدم القسطرة قدر الإمكان. فحص للدم الشرياني العودة لضمان التوظيف السليم. إكمال عقده الدانية، ومع التعادل خياطة البعيدة، وتأمين الأنابيب داخل الشريان. قم بتوصيل خط الشرياني محول طاقة/أنابيب الضغط.
ملاحظة: يمكن مسجلة الجزء القاصي من الأنابيب إلى اللكتات للفئران لتأمين الخط الشرياني. وقد وصف نهج بديل للسفينة cannulation يسبرسن et al.؛ ولا يشمل 11 على البروتوكول يختلف باستخدام الكامشات لنشر الشق، الغراء بدلاً من خياطة لتأمين الأنابيب، والنهج المقدم إبرة بنت.
- الوصول إلى الشرايين إذا كان استخدام القياس عن بعد
- فحص القسطرة الضغط الاستشعار تحت تكبير عالية قبل cannulation الشرياني. ضمان أن القسطرة خالية من الفقاعات/الحطام وغضروف سليمة بين بالسائل (الدانية) وشغل جل مكونات (القاصي). قبل كل غرس، عبوة الجل على الحافة البعيدة للقسطرة. قم بتشغيل جهاز الإرسال باستخدام مغناطيس؛ رصد BP أثناء عملية جراحية لتحمل موضع الكمال.
- استخدم عقده نصف أوفيرهاند فضفاضة في خياطة الدانية لفترة وجيزة أوككلودي شريان فخذي. عقد المقدم القسطرة (الخطوة 3.3) في اليد غير المهيمنة. عقد غيض قنية لوحدة القياس عن بعد مع السفينة cannulation الملقط لتجنب تشريد جل من الحافة.
- ثقب حفرة في الشريان مع الإبرة ز 22 بنت وإدراج القنية في الشريان استخدام الملقط كانولاتيون السفينة لتجنب تشريد جل من الحافة. تقدم قنية قدر الإمكان. استخدام العلاقات خياطة الدانية والبعيدة، تأمين القسطرة الضغط.
- شد جسم زرع القياس عن بعد داخل الجناح المجاور للشق، وإغلاق هذا الشق باستخدام خياطة نايلون 4-0 في إبرة قطع. إيقاف تشغيل أجهزة القياس عن بعد بالمغناطيس في ختام فترة التسجيل الحفاظ على عمر البطارية.
5-موقف الفئران في إطار الجراحة ستيريوتاكسيك للوصول إلى المخ
- تحرك بلطف الفئران في موقف المعرضة في إطار عملية جراحية ستيريوتاكسيك.
- ضع الفئران بين القضبان الإذن، وضبط شريط القاطعة لتحقيق التكافؤ في ذروة أمداً وبريجما. تحديد المواقع قد تعتمد على سلالة الفئران، والوزن، ومواقع لأهداف الجهاز العصبي المركزي.
- جعل شق مشرط روستروكاودال 2 سم من خلال خط الوسط لفروة الرأس. استخدام القطن ذات الرؤوس قضيب تطبيق، إيمانا راسخا إزالة النسيج الضام من سطح الجمجمة. تطبيق بيروكسيد الهيدروجين في الجمجمة للمساعدة في تصور بريجما، لامدا، وخط الوسط خياطة الجروح.
- استخدام أطلس الدماغ الفئران بدليل استهداف12، وحفر لدغ ثقب العظم، الحجم للوصول إلى القطب، من خلال الجمجمة.
6-عزل الأعصاب متعاطفة الكلوي
- قم بتوصيل السلك الكهربائي رسنا (الخطوات 1، 1، 1-3) إلى 10 العاشر ما قبل مكبر للصوت ومكبر للصوت ميكروليكترودي.
- عزل الأعصاب الكلي من خلال شق خلف الصفاق قبل أو بعد، يتم تأمين الفئران في الإطار ستيريوتاكسيك. ضع أقطاب رسنا بمجرد الفئران في الإطار ستيريوتاكسيك. جعل شق مشرط تمتد من 4-5 سم تحت الأضلاع باتجاه والذيلية، قليلاً الجانبي للعمود الفقري. تشريح بلانت شق لتصور العضلات باراسبينال.
- استخدام مقص لجعل شق روستروكاودال سطحية جداً 1-2 سم حيث يلتقي الدهون في العضلات. استخدام القطن ذات الرؤوس قضيب تطبيق، تنتشر الدهون بعيداً عن العضلات لتصور الكلي. من المهم عدم إدخال مساحة البريتوني.
- استخدام الكامشات للفصل الكلي بلطف من العضلات باراسبينال لتصور شريان كلوي والشريان الاورطي البطني. لا تمتد هذه السفن مفرطة لتجنب إتلاف الأعصاب الكلوية. استخدام وسادة شاش القطن 2 "x 2" غارقة في المياه المالحة لحماية الكلي من الإصابة.
- إطار التكبير عالية، تحديد الأعصاب الكلوية في جيب شق. الحزم العصبية مرئية بسهولة في الزاوية اليمنى التي شكلتها الشريان الاورطي والشريان الكلوي. الأعصاب الكلوية تتبع عن كثب شريان كلوي من الشريان الاورطي إلى الكليتين.
- حدد جزء من الحزمة العصبية التي سيتم وضعها على مسرى التسجيل. تشريح الألياف العصبية من الأنسجة المحيطة بها/السفينة باستخدام الملقط تشريح الصغرى بلطف.
- تأمين السلك الكهربائي رسنا في حامل (على سبيل المثال-، إحدى قصاصات التمساح يعلق على موقف دعم). أقل الكهربائي على مستوى الجزء العصبية. استخدام ربط عصب لرفع جزء العصب الكلوي على مسرى بلطف دون تمتد على العصب.
ملاحظة: يجب أن يقوم العصب داخل كل "V" على شكل خطاف في أسلاك الأغلفة، موازية للعصب. يجب أن لا تلمس الأسلاك الكهربائي الأنسجة، الدم، أو أخرى سوائل الليمفاوية. - ملء الشق مع الزيوت المعدنية للحيلولة دون أن تصبح جافة العصب متعاطفة الكلوي المكشوفة. استخدام قصاصة تأريض مع نهاية واحدة على الجلد للشق وأخرى مرفقة قفص فاراداي.
- توجيه إشارة إلى مكبرات الصوت باستخدام عالية ومنخفضة-تمرير التصفية (10 هرتز و 3 كيلو هرتز). ضبط كسب ما يصل إلى 10 ك. تضمين جهاز صوت تقييم نمط انفجار رسنا. استخدام معدلات أخذ العينات تتراوح بين 2,000 10,000 هرتز4،5،6،،من78. استخدام معدل أخذ عينات زيادة عند تلاعب بالجهاز العصبي المركزي هو الافتراض تتسبب في الاستجابات السريعة/موجز متعاطفة.
7-تسجيل البيانات
- تقييم جودة التسجيل رسنا باستحضار باروريفليكس مع حقن بلعه 1 مل من المحلول الملحي أو 10 ميكروغرام/مل فينيليفريني (في 0.1 مل) عن طريق الوريد. كما هو موضح في الشكل 1، ينبغي زيادة BP التسريب وتمنع رسنا. زيادة في متوسط الضغط الشرياني من 60-80 مم زئبق كاف سيمباثوينهيبيشن الكلوي4،،من1314.
- ضبط موضع الأقطاب لتحسين الإشارة إذا لزم الأمر. إعادة تموضع مطلوب إذا كان العصب ليس على اتصال بكلا خطاطيف على مسرى، أو إذا كان أي سوائل الأنسجة أو الدم أو الليمفاوية على اتصال بالأسلاك.
ملاحظة: الحاجة إلى إعادة تموضع تستند إلى خصائص الإفرازات العصب السمعي.- إذا رشقات نارية رسنا لا تحدث دورياً مع دورة القلب، وإذا كان هناك أي تدخل في التسجيل، ثم إعادة بعناية مسرى.
- كما الحركات التنفسية يمكن أن تؤثر أيضا على جودة التسجيل رسنا، تحسين الإشارة بتحريك بلطف مسرى في موقف حيث حركات العضلات عدم تعطيل الكهربائي أثناء التنفس.
- حالما يتم الحصول على إشارة واضحة، تأمين مسرى رسنا في مكان بسحب الزيوت المعدنية وتطبيق هلام السليكا لتغطية الاتصال العصب/القطب في جيب شق. لا تقم بتحريك الفئران قبل الجل وحددت تماما.
- تنفيذ البروتوكولات التلاعب بالجهاز العصبي المركزي أثناء تسجيل رسنا باستمرار ويعني الضغط الشرياني. إذا تم استخدام ميكروينجيكتور/بولسير للتلاعب جذع الدماغ، يمكن إدخال إشارة منطق من هذا الجهاز إلى تسجيلات رسنا/BP لتوثيق توقيت التلاعب الجهاز العصبي المركزي.
- عند الانتهاء من هذه التجربة، تحديد مستوى الضوضاء بسحق العصب الدانية إلى أقطاب تسجيل بين هلام السليكا وعضلة العمود الفقري. سجل على الأقل 30 ثانية لهذه القيمة "صفر" رسنا4،،من56. كنهج بديل لتحديد الضوضاء، إدارة عائقا ganglionic المفعول القصير الأمد مثل الأتروبين "أو" هيكساميثونيوم "أو" تشلوريسونداميني "أو" بينتولينيوم طرطرات8،،من1516، 17.
- بعناية إزالة مسرى رسنا وإزالة أي آثار لجل السليكا من أقطاب الأسلاك. حفظ الكهربائي لإعادة استخدامها. إيقاف تشغيل جهاز الإرسال القياس عن بعد وإزالته، مع الحرص على عدم الأضرار غيض القسطرة.
8-القتل الرحيم (نضح ترانسكاردياك)
- تحديد مواقع التلاعب الجهاز العصبي المركزي عن طريق حقن الأصباغ أو فلوروتشروميس، خلق آفات كهربائياً، أو عن طريق الكشف عن التعبير ج-المنحدر.
- إذا كان تحليل الدماغ سوف يتطلب التثبيت، إعداد الفئران لنضح ترانسكاردياك. تقييم منعكس تو-قرصه لضمان بقاء الفئران عميق أنيسثيتيزيد. يقدم التخدير تكميلية إذا لزم الأمر. إجراء نضح ترانسكاردياك من بارافورمالدهيد مثبت في غطاء دخان.
تنبيه: طماع الجلد/العين مهيجة. - إدراج أنابيب ضخ نضح ورئيس الوزراء مع المحلول الملحي العادي 0.9 في المائة.
- جعل شق الوحشي 5-6 سم عن طريق الجلد وجدار البطن مباشرة تحت القفص الصدري وفتح تجويف الصدر. فصل الكبد بعناية من الحجاب الحاجز. إجراء شق صغير في الحجاب الحاجز باستخدام مقص حادة منحنية. حقن 0.1 مل الهيبارين مباشرة في البطين الأيسر.
- تمرير إبرة التروية في البطين الأيسر (إبرة تزقيمية فولاذ المقاوم للصدأ ويعمل جيدا لهذه الخطوة) بأي ثقب في القلب أو بقطع شق صغير باستخدام مقص حاد وتمرير تزقيمية مدتها إبرة عن طريق حتى التلميح مرئياً من خلال جدار الشريان الاورطي (لكن يجب أن لا تصل إلى قوس الاورطي). استخدام قصاصة الجراحية أو الكهربائية لتأمين الإبرة في المكان.
- باستخدام مضخة تسريب، تدير المحلول الملحي العادي 0.9% (درجة حرارة الغرفة). فور إنشاء شق 2-3 مم في الاذين الأيمن لإنشاء منفذ شطف المالحة. لا تقطع الشريان الاورطي تنازلي. يستمر الشطف المالحة اللون التغييرات الكبد من الأحمر/براون إلى أصفر باهت، ضخ ما يقرب من 400 مل أكثر من 2-3 دقيقة.
- إيقاف المضخة. التبديل بيرفوساتي لمثبت (على سبيل المثال.، بارافورمالدهيد 10% فورمالين أو 4 في المائة)؛ صب 400 مل أكثر من 2-3 دقيقة إزالة الدماغ وتخزين العينة في حل مثبت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية قبل نقل الأنسجة إلى السكروز 30% (30 مل سكروز المذاب في 100 مل من 0.1 م مخزنة الفوسفات المالحة) لمدة 3 أيام على الأقل، أو حتى المصارف الدماغ ، كريوبروتيكشن قبل كريوجينيتيك تمزيقها18.
9-تحليل البيانات
- كامل-موجه تصحيح رسنا الخام للحصول على القيم المطلقة. كامل-موجه تصحيح قطعة s 10 إشارة الضوضاء الخام. من المهم أن استبعاد أي من الدراسات التي تأثرت انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. في دراسات قياس رسنا، طبقت المحققين معايير مسبقاً مثل اشتراط إشارة إلى نسب الضوضاء تتجاوز19،،2:1 إلى 6:11720.
- حساب المتوسط تصحيح رسنا لقطاعات غير متداخلة (µV) وطرح التقدير الضوضاء (µV). اعتماداً على أهداف التجربة، قد حدد المحققون فترات مثل 10 s (الشكل 1) أو حساب س. 1 يعني باستخدام خيارات التحليل الموجي في البرنامج الفيزيولوجي أو تصدير البيانات إلى جداول البيانات لحساب المتوسطات ل الفواصل الزمنية المحددة.
- لتطبيع عبر مختلف الحيوانات، التعبير عن قيم لمزيد من التحليل كتغيير المائة من خط الأساس. استخدام إحصاءات بارامتريه لإجراء المقارنات بين المجموعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 تسجيل عينة من الفئران تخديره نيمبوتال رسنا وشركة بريتيش بتروليوم. حقن الوريد فينيليفريني واستخدمت للحث على زيادة في متوسط الضغط الشرياني واستحضار باروريفليكس وعابر4،سيمباثوينهيبيشن6. لتحديد مقدار رسنا، تصحيح رسنا الخام ومتوسط غير متداخلة الأجزاء s 10؛ طرح تقدير الضجيج من كل مقطع.
رقم 1: رسنا وشركة بريتيش بتروليوم في استجابة لحقن فينيليفريني الرابع- وكان رسنا الخام (A) كامل-موجه تصحيحه (ب)؛ تصحيح سحقت "صفر" ويبين رسنا اقحم ج. وحسبت المتوسطات s 10 عدم تداخل (ناقص الضوضاء) (د). أن تثير في باروريفليكس، تم حقن 0.1 مل فينيليفريني (1 ميكروغرام/مل) عن طريق الوريد (بالسهم). ضخ بلعه أثارت زيادة مفاجئة في شركة بريتيش بتروليوم، وتثبيط عابرة من رسنا. وهذا الرقم هو مقتبس من فينك صباحا، ج عميد الكلية، والسيد بيانو، DW أسير آلة م. يتحكم تيجمينتوم بيدونكولوبونتيني نشاط العصب متعاطفة الكلوية وأنشطة القلبية في الفئران تخديره نيمبوتال. لوس واحد. عام 2017؛ 12 (11): e01879564. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتشمل الخطوات الحاسمة لقياس رسنا: (1) تجنب تمتد من شريان كلوي والأعصاب عند فصل الكلي من العضلات باراسبينال وعند وضع الجزء العصب على أقطاب تسجيل، (2) بعناية تشريح ألياف العصب الكلوي من الأنسجة المحيطة بها/السفينة، (3) ضمان أن أسلاك الكهربائي خالية من الأنسجة والدم، أو السوائل الليمفاوية ومنع (4) العصب من الجفاف عن طريق تطبيق الزيوت المعدنية للعصب الكلوي وهلام السليكا إلى وحدة العصب الكهربائي. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، من المهم التأكد من أن نظام تسجيل يستند على نحو كاف. للحصول على إشارة واضحة إلى رسنا، يمكن تعديل موقف القطب بعناية بينما تصور والاستماع إلى إشارة رسنا الخام، قبل تضمينها في هلام السليكا. نتائج الإنجاز الناجح لعملية جراحية في إشارة رسنا التي يمكن أن تكون عن طريق التلاعب الجهاز العصبي المركزي للتجارب التي استمرت ساعات عدة التضمين.
المحققون عند تفسير النتائج، ينبغي النظر في تأثير التخدير على متوسط الضغط الشرياني ورسنا. هذا البروتوكول يستخدم المسكنة التي يصفها الطبيب التخدير (بينتوباربيتال الصوديوم)، التي يمكن أن تقلل متوسط الضغط الشرياني وتعديل استجابات اللاإرادي21. اعتماداً على التجربة أهداف أخرى تركيبات القابلة للحقن أو التخدير استنشاق (عبر مخروط الآنف أو القصبة الهوائية) يمكن أن تستخدم22. الباحثين قد تنظر في البدائل مثل يوريتان23 وألفا-تشلورالوسي24. هؤلاء الوكلاء أقل تأثيراً على أحبطت ردود الفعل القلب والأوعية الدموية ولكن يمكن أن تشكل مخاطر صحية محتملة للمحقق.
بالإضافة إلى الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول، وقد استخدمت النهج البديلة بمختبرات أخرى لتسجيل واختلاق أقطاب. يمكن تسجيل رسنا استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ4،9أو الفضة25سلك البلاتين26 . بالإضافة إلى رفع الجزء العصب مكشوف على السلك الكهربائي، سجلت العلماء بنجاح أحادية الطور قطع رسنا في وسط نهايات الأعصاب متعاطفة الكلوي26. المرونة تختلف استناداً إلى قوة الشد للأسلاك (تقاس بوحدات كبسي). أعلى كبسي سلك أكثر هشاشة ولكن يحتفظ بشكله؛ أسلاك كبسي المنخفضة أكثر مرونة وأقل احتمالاً لكسر عندما عقدوا العزم، متكررة. لتسجيلات رسنا، من المهم تحديد أسلاك أن تكون عازمة بسهولة وإعادة تحديد موضعها خلال التسجيلات. لا ينبغي الأسلاك مرنة جداً، مما يجعل من الصعب إنشاء hooks لوضع إطار على العصب، ولكن ليس قاسية جداً. هذا الأخير يزيد من خطر الأضرار بالاعصاب وتمتد. المختبر يستخدم أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ مع كبسي 155-185.
وتتوفر العديد من نهج لتحليل رسنا. بدلاً من أن التحديد الكمي للمتوسطات للجزء المتعلق بتسجيل s 10 وحساب الفروق بالنسبة المئوية يمكن تحديد التغيير، رسنا بالتحديد الكمي للاندفاع التردد4،،من2627. قد يكون هذا النهج المفضل عند مستويات خط الأساس ومقادير الردود رسنا تختلف بين الفئران في15،دراسة26. نهج آخر ينطوي على تقويم والتكامل من إشارة رسنا؛ السعة رسنا (يتم قياسها في mV) هو قد لخص خلال فاصل زمني محدد (على سبيل المثال.، 20 مللي ثانية)15،26. موحد ينطبق عامل تصفية منخفض-المرحلة ويوفر سعة التصريف متوسط خلال رشقات نارية من نشاط يتجاوز وقت ثابت (على سبيل المثال-, s > 20)15،27. إشارات متكاملة مفيدة لدراسة مرحلة رسنا والسعة، ولكن هذا النهج لا يوفر معلومات حول التغييرات متذبذبة. تم تطبيق أساليب المجال المجال والوقت تردد عند الباحثين دراسة ذبذبات رسنا. هو النهج الذي كثيرا ما يستخدم رسنا سريعة فورييه تحويل (FFT)، الذي يصنف بإشارة إلى أن ذبذبات جيبية، مع كل السعة متميزة والمرحلة20،26. الاتحاد الفرنسي للتنس نهجاً مفيداً لدراسة رشقات منخفضة وعالية التردد في رسنا ودراسة تحوير إشارة رسنا القلب والجهاز التنفسي.
الأساليب في هذا البروتوكول هامة للتصدي للفرضيات حول أهمية وظيفية نوى الجهاز العصبي المركزي. كلوي الأعصاب متعاطفة مع توجيه الاتصالات العصبية بين الجهاز العصبي المركزي والكلى، وتمثل بالتالي، التغيرات الحادة في رسنا متغيراً هاما في أبحاث القلب والأوعية الدموية. تحديد آليات الجهاز العصبي المركزي التي تنظم تدفق متعاطفة مع مجال ذو أولوية بحث، إذ ترى أن سيمباثوكسسيتيشن الكلوي يسهم الفيزيولوجيا المرضية وعرض العديد من الأمراض السريرية (على سبيل المثال-، أمراض الكلي المزمنة، وقلب الفشل وعدم انتظام ضربات القلب، والسكري، ومعرقلة توقف التنفس أثناء النوم)28،29. التدابير غير المباشرة لنشاط العصب متعاطفة (مثلاً.، شركة بريتيش بتروليوم، وتقلب معدل ضربات القلب، ومستويات الكاتيكولامينات) لا تكون دائماً مناسبة للدراسات المتعلقة بالأهمية الوظيفية لنوى الجهاز العصبي المركزي. ولذلك، يمثل القياس المباشر رسنا ومتوسط الضغط الشرياني في الفئران تخديره أسلوب قيمة تشريحيا وظيفيا، وتحديد مصادر الشاذة في وظيفة الكلي متعاطفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أن م. فينك عضو في "المجلس الاستشاري للعملاء" "بيانات العلوم الدولية".
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة المعهد الوطني "أبحاث التمريض" (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).
