Summary
Methoden voor het meten van sympathiek en cardiovasculaire reacties op het centrale zenuwstelsel (CNS) manipulaties zijn belangrijk voor het bevorderen van de neurowetenschappen. Dit protocol werd ontwikkeld om te helpen wetenschappers met meten en kwantificeren van acute wijzigingen in renal sympathiek zenuw activiteit (RSNA) bij narcose ratten (niet-overleving).
Abstract
Renale sympathiek zenuw activiteit (RSNA) en gemiddelde arteriële druk zijn belangrijke parameters in de cardiovasculaire en autonome onderzoek; echter, er zijn beperkte middelen leiden wetenschappers in de technieken voor het meten en analyseren van deze variabelen. Dit protocol beschrijft de methoden voor het meten van de RSNA en gemiddelde arteriële druk bij narcose ratten. Het protocol bevat ook de benaderingen voor toegang tot de hersenen tijdens RSNA opnames voor manipulaties van het centrale zenuwstelsel (CNS). De RSNA opname-techniek is compatibel met farmacologische, optogenetic, of elektrische stimulatie van het centraal zenuwstelsel. De aanpak is handig wanneer een onderzoeker zal op korte termijn (min tot en met h) en autonome reacties in niet-survival experimenten te correleren anatomisch met CNS kernen meten. De aanpak is niet bedoeld om te worden gebruikt voor het verkrijgen van chronische (overleving) opnames van de RSNA in ratten. Lozingen in RSNA, gemiddeld gerectificeerd RSNA en gemiddelde arteriële druk kan worden gekwantificeerd en geanalyseerd verder met parametrische statistische toetsen. Methoden voor het verkrijgen van veneuze toegang, gemiddelde arteriële druk telemetrically opnemen en hersenen fixatie voor toekomstige histologische analyse worden ook beschreven in het artikel.
Introduction
Pre-klinische ontdekkingen over autonome controle van het cardiovasculaire systeem informeren strategieën voor het beheer van aandoeningen, zoals hypertensie, hartfalen en chronische nierziekte. Overmatige activiteit van het sympathische zenuwstelsel en verminderde vagale cardiale Toon bijdragen tot een verhoogde bloeddruk (BP)1. Chronisch verhoogde renale sympathiek uitstroom verbetert catecholamine secretie en vermindert renale doorbloeding, met schadelijke gevolgen voor de cardiovasculaire/renale systemen2,3. Als u wilt definiëren de neurobiologische trajecten leiden tot autonome dysfunctie, zijn studies in knaagdieren belangrijk voor het bepalen hoe centrale zenuwstelsel (CNS) neuronen reguleren sympathiek parameters. Het doel van dit protocol is bedoeld als technische informatie over het meten van de renale sympathiek zenuw activiteit (RSNA) en BP en te schetsen van de technieken voor het kwantificeren van acute sympathiek veranderingen in reactie op CNS manipulaties bij narcose ratten.
Acute (niet-overleving) RSNA metingen (duurzame min tot en met h) zijn handig als wetenschappers de CNS farmacologisch, elektrisch sonde zal, of optogenetically in verdoofd ratten om de functies van specifieke kernen te bepalen. Met behulp van deze methoden, structuren zoals de eenzame kern, Periaqueductale grijs, zijn pedunculopontine tegmentum, en de rostraal ventrolateral medulla onderzocht om te definiëren neurobiologische trajecten regulering van de sympathieke parameters4, 5,6,7. Deze benadering is belangrijk voor het identificeren van de CNS doelstellingen worden onderzocht verder in chronische modellen van autonome disfunctie8,9. Voltooi deze experimenten, vereist het laboratorium een soldeerbout, chirurgische Microscoop, stereotaxic frame, micro-elektrode versterker en monitor audio. Afhankelijk van de factoren die in het laboratorium aanwezig die aan elektrische ruis bijdragen, kan de omgeving van het chirurgische/opname een Faraday kooi/aarding riem om elektrische ruis in de RSNA opname vereisen. Als de hersenen analyses vergt weefsel fixatie, een perfusie pomp en fume hood zijn vereist. Gegevens kunnen worden gedigitaliseerd en opgenomen met behulp van meerdere fysiologische software/data acquisition (analoog / digitaal-converter) eenheden4,5, met verschillende analyse opties en compatibiliteit voor de integratie van telemetrische signalen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven methoden werden goedgekeurd door de Commissie institutionele Animal Care zaken aan de Universiteit van Illinois te Chicago.
1. Maak bipolaire RSNA elektroden
- Als wilt maken van de elektrode, Knip twee stukken van roestvrij staaldraad elke ongeveer 18 mm lang. Knip een stukje van polyethyleen (PE-50) buizen ongeveer 15 mm lang. Voer beide stukken draad in de buis, waardoor de draad aan beide kanten uitsteekt.
- Verwijderen van de isolatie van de uiteinden van de draden; Knip de draden verlaten van 2-3 mm van blootgestelde draad. Aan de ene kant, krimp mannelijke pinnen over de blootgestelde draad. Soldeer de pinnen veilig met de draad, beveiligen van de pinnen binnen een strip connector en dekking van de verbinding met epoxy.
Opmerking: Een alternatieve benadering die solderen vermijdt is het gebruik van snelle verbinding/release alligator clips. - Aan de andere kant van de elektrode, verwijder de isolatie van de uiteinden van de draden, verlaten van 2-3 mm van blootgestelde draad. Dit gedeelte van de draden maken kleine "V" vormige haken in de ongeïsoleerde draad buigen.
Opmerking: Dit is het gedeelte van de elektrode die in contact met de renale sympathiek zenuw zal worden. Het is belangrijk om zegel dit einde om te voorkomen dat vocht uit het invoeren van de buis. Siliconen of epoxy kan effectief worden gebruikt.
2. beheer van anesthesie en bereiden van chirurgische Sites
- Het toedienen van anesthesie aan een mannelijke Sprague-Dawley ratten (leeftijd 9-11 weken, met een gewicht van 150-400 g). Pentobarbital natrium beheren 50 mg/kg via een intraperitoneale injectie (IP). Controleren om te beoordelen een stabiele vlak van verdoving tijdens de operatie, Teen-snuifje reflex elke 15 min en opnieuw dosis verdoving zo nodig.
Opmerking: Pentobarbital natrium (Nembutal) werd gebruikt in eerdere studies voor het bereiken van een duurzame vlak van verdoving zonder interferentie met de modulering van de RSNA4,5,6. Dit protocol is voor niet-survival chirurgie, dus er geen herstel/na-operative monitoring periode is. - De chirurgische site volgens de richtlijnen van de institutionele dierenverzorgers voorbereiden (dwz., scheren van de rat buik, rug en hoofd; reinigen van de huid met 10% Povidon-jodium oplossing; toepassing van oog smeermiddel; en plaats de rat op een verwarming pad). Het handhaven van de lichaamstemperatuur bij 37 ° C tijdens de experimenten.
3. cannulate de femorale ader (voor intraveneuze toegang)
- Heparine toevoegen aan de steriele zoutoplossing 0,9% (tot 20 eenheden/mL). Vul een spuit van 1 mL met de heparinized zoutoplossing via een naald 22G. 15 cm van PE-50 buizen verbinden met de naald en opvulling buizen met de oplossing.
- Met de rat liggende liggen, maak een horizontale snede van 2 cm via de inguïnale gebied. Met behulp van katoen-tipped applicatoren, het bindweefsel om bloot de femorale ader en slagader te ontleden. Om de snede open te houden, ofwel single-haak elastieken chirurgische blijft bevestigd aan het chirurgische gebied met zijde tape of gebruiken van kleine hemostats van toepassing.
- Gebruik hemostats om te buigen van het uiteinde van een naald 22G in een hoek van 90° om te dienen als een katheter introducer10.
- Visualiseren van de schepen onder de Microscoop. Zachtjes scheiden de ader en slagader met behulp van gebogen pincet. Plaats twee 12 cm lang 5-0 zijde hechtdraad onder de ader (één distale en een proximale); plaats de hechtdraad op dezelfde wijze onder de slagader.
- Tie van de hechtdraad distale (onder) om de occlude van de ader; Beveilig de randen van deze hechtdraad aan het chirurgische gebied met zijden band of kleine hemostats. Trek voorzichtig de ader strak maar niet met zoveel kracht dat het vaartuig zal scheuren. Plaats de ader loodrecht op de surgeon's dominante hand.
- Gebruik een losse bovenhandse halve knoop in de proximale hechtdraad te kort occlude de ader. Met een delicate hemostatische Tang, zachtjes klem deze hechtdraad om te occlude van de bloedstroom. Houd de naald 22G met het gebogen uiteinde in de niet-dominante hand; gesp de buis met een tang met behulp van de dominante hand.
- Aanprikken van een klein gaatje in de ader met de katheter introducer (stap 3.3) en steek de buis van de PE-50 (vooraf gevuld met EDTA saline) in het vaartuig; de gebogen naald gebruiken om te houden van de opening in de open vaartuig en te helpen bij het plaatsen van het puntje van de katheter in de schip10.
- Vrijgeven van de proximale hechtdraad en voorzichtig spoelen van 0,2 mL EDTA zoutoplossing in de ader; verder de katheter. Controleer de terugkeer van bloed uit de ader om de juiste plaatsing. Voltooien van de proximale knoop en beveiligen met distale hechtdraad stropdas, de buis in de ader.
- Gebruik veneuze toegang tijdens de experimenten voor het beheer van aanvullende anesthesie of medicijnen en voor bloedinzameling. Nemen een 3-weg-connector als regelmatige intraveneuze infusies en bloedmonsters nodig zal zijn. Controleer dat schadelijke teen-snuifje reflex elke 15 min Titreer anesthesie.
4. cannulate de femorale slagader voor de controle van de gemiddelde arteriële druk
- Visualiseer de slagader onder de Microscoop. Vergelijkbaar met de methode gebruikt voor veneuze cannulation, binden de distale hechtdraad (stap 3.4) naar het occlude van de slagader; beveiligen van de randen van deze hechtdraad aan het chirurgische gebied met zijde tape en de positie van de slagader die loodrecht op de surgeon's dominante hand.
- Arteriële toegang als met behulp van een druk transducer/infusie systeem
- De transducer/drukslang verbinden met 500 mL 0.9% zout en cadeauzakje. Spoel de buis met zoutoplossing, het verwijderen van alle bubbels, en plaats de zak in een zak inductor druk aan het oefenen van het systeem.
- Zoals beschreven in stap 3.1, vul een spuit van 1 mL met de heparinized zoutoplossing via een naald 22G en sluit 15 cm van PE-50 aan de naald (flush buizen met EDTA zoutoplossing).
- Gebruik een losse halve knoop in de proximale hechtdraad te kort occlude de slagader. Houd de katheter introducer (stap 3.3) in de niet-dominante hand; Houd het distale uiteinde van de PE-50 met een vaartuig cannulation Tang in de dominante hand. Aanprikken van een gat in de slagader met de gebogen 22G naald en steek de canule in het schip.
- Introductie van de proximale hechtdraad, zachtjes flush 0,2 mL EDTA zoutoplossing in de slagader en vooraf de katheter zoveel mogelijk. Check voor arteriële bloed terug te keren naar het juiste plaatsing zorgen. De proximale knoop te voltooien en, met distale hechtdraad stropdas, veilig de buis binnen de slagader. De arteriële lijn sluit aan op de transducer/drukslang.
Opmerking: Het distale gedeelte van de buis kan worden geplakt is aan de rat's stuk teneinde de arteriële lijn. Een alternatieve benadering vaartuig cannulation wordt beschreven door Jespersen et al.; 11 die hun protocol verschilt met behulp van oprolmechanismen te verspreiden van de incisie, lijm-eerder dan hechtdraad-naar secure de slang, en de aanpak omvat niet de gebogen naald introducer.
- Arteriële toegang als met behulp van telemetrie
- Inspecteer de druk-ontdekkende katheter onder hoge vergroting voor arteriële cannulation. Ervoor zorgen dat de katheter vrij van bubbels/vuil is en een intacte meniscus tussen de met vloeistof gevulde (proximale heeft) en gel gevulde (distale) onderdelen. Voorafgaand aan elke implantatie, vullen de gel op de distale uiteinde van de katheter. Zet de zender met behulp van een magneet; monitor BP tijdens de operatie te verduren van perfecte plaatsing.
- Gebruik een losse bovenhandse halve knoop in de proximale hechtdraad te kort occlude de femorale slagader. Houd de katheter introducer (stap 3.3) in de niet-dominante hand. Houd het uiteinde van de canule van de telemetrie-unit met een vaartuig cannulation Tang te vermijden verdringt gel van de tip.
- Aanprikken van een gat in de slagader met de gebogen 22G naald en steek de canule in de slagader met behulp van vaartuig cannulation pincet te vermijden verdringt gel van de tip. Verder de canule zo ver mogelijk. Met behulp van de banden van de proximale en distale hechtdraad, Beveilig de katheter druk.
- Plooi het lichaam van de telemetrie implantaat binnen de flank grenzend aan de incisie en sluit deze incisie met 4-0 nylon hechtdraad op een scherpe naald. De telemetrie apparaten uitschakelen door de magneet aan het einde van de periode van de opname tot het besparen van batterijleven.
5. plaats de Rat in het Frame Stereotaxic chirurgie voor toegang tot de hersenen
- Zachtjes gaan de rat de vatbaar positie in het kader van stereotaxic operatie.
- Plaats de rat tussen de balken van het oor en de snijtand balk om te egaliseren van de hoogte van de lambda en bregma aanpassen. Positionering kan afhangen van de rat strain, gewicht en locaties van CNS doelstellingen.
- Het maken van een 2 cm rostrocaudal scalpel incisie door de middellijn van de hoofdhuid. Met behulp van katoen-tipped applicators, verwijder stevig bindweefsel van het oppervlak van de schedel. Waterstofperoxide toepassen in de schedel om te helpen bij het visualiseren van de bregma, lambda en middellijn hechtingen.
- Met behulp van een atlas van de rat hersenen gids targeting12, boor een burr gat osteotomie, formaat voor elektrode toegang, via de schedel.
6. het isoleren van de renale sympathische zenuwen
- De draad RSNA elektrode (stappen 1.1-1.3) verbinden met een 10 X voorversterker en een micro-elektrode versterker.
- Isoleren van de renale zenuwen door middel van een retroperitoneal incisie voorafgaand aan of na, de rat is beveiligd in het stereotaxic frame. Plaats de elektroden van de RSNA zodra de rat in het stereotaxic frame is. Maak een scalpel incisie zich uitstrekt van 4-5 cm onder de ribben in de caudal richting, iets lateraal aan de wervelkolom. Bot ontleden de incisie te visualiseren de paraspinal spieren.
- Gebruik schaar om een zeer oppervlakkig 1-2 cm rostrocaudal incisie waar het vet voldoet aan de spier. Met behulp van katoen-tipped applicators, verspreid het vet uit de buurt van de spier te visualiseren van de nier. Het is belangrijk om niet in te voeren van de peritoneale ruimte.
- Gebruik van oprolmechanismen zachtjes scheiden de nieren van de paraspinal spieren te visualiseren de renale slagader en abdominale aorta. De schepen overdreven om te voorkomen beschadiging van de renale zenuwen niet te rekken. Gebruik een 2 "x 2" gaas wattenschijfje gedrenkt in een zoutoplossing de nieren beschermen tegen schade.
- Identificeer de renal zenuwen in de zak van de incisie onder hoge vergroting. De zenuw bundels zijn meest gemakkelijk zichtbaar in de juiste hoek gevormd door de aorta en de renale slagader. De renale zenuwen volgen de renale slagader van de aorta naar de nieren.
- Selecteer een segment van de zenuw bundel die zal worden gelegd op de opname-elektrode. Zachtjes ontleden de zenuwvezels van het omringende weefsel/vaartuig met behulp van micro-ontrafeling pincet.
- Beveiligen van de draad RSNA elektrode in een houder (bv., een alligator-clip aangesloten op een steun staan). Het verlagen van de elektrode naar het niveau van het segment van de zenuw. Gebruik een zenuw haak te voorzichtig het segment van de renale zenuw op de elektrode te heffen zonder het uitrekken van de zenuw.
Opmerking: De zenuw moet liggen binnen beide "V"-vormige haken in de ongeïsoleerde draad, parallel aan de zenuw. De draden van de elektrode moeten niet aanraken een andere weefsels, bloed en lymfe vloeistof. - Vul de incisie met minerale olie om te voorkomen dat de blootgestelde renale sympathiek zenuw droog. Een aarding clip gebruikt met een uiteinde op de huid van de incisie en anderzijds aan de kooi van Faraday.
- Direct het signaal naar de versterkers met behulp van high - en low-pass filter (10 Hz en 3 kHz). Aanpassen van de winst tot 10 K. opnemen een audio monitor te beoordelen van de barst patroon van de RSNA. Samplingfrequenties variërend tussen 2.000-10.000 Hz4,5,6,7,8te gebruiken. Gebruik een hogere samplefrequentie wanneer een manipulatie van de CNS is hypothetische snelle/korte sympathiek reacties veroorzaken.
7. recordgegevens
- Beoordeling van de kwaliteit van de RSNA opname door de baroreflex met een bolus injectie van 1 mL zoutoplossing of 10 µg/mL phenylephrine (in 0,1 mL) intraveneus oproept. Zoals geïllustreerd in Figuur 1, moet de infusie verhogen BP en remmen RSNA. Een toename van de gemiddelde arteriële druk van 60-80 mmHg is voldoende voor renale sympathoinhibition4,13,14.
- De positie van de elektroden te verbeteren van het signaal indien nodig aanpassen. Herpositionering is vereist als de zenuw niet in contact met beide haken op de elektrode of als een weefsel, bloed of lymfe vloeistof in contact met de draden is.
Opmerking: De noodzaak van herpositionering is gebaseerd op de auditieve kenmerken van de lozingen van de zenuw.- Als de uitbarstingen van de RSNA niet cyclisch plaatsvinden met de cardiale cyclus, en er is elke vorm van inmenging in de opname, vervolgens zorgvuldig verplaatsen de elektrode.
- Respiratoire bewegingen kunnen ook invloed hebben op de kwaliteit van de opname van de RSNA, het signaal verbeteren door zachtjes de elektrode te verplaatsen naar een positie waar de spierbewegingen niet de elektrode tijdens de ademhaling verstoren.
- Zodra een duidelijk signaal wordt verkregen, beveiligde de RSNA elektrode in plaats door intrekking van de minerale olie en het toepassen van een silica gel ter dekking van de verbinding van de zenuw/elektrode in de zak van de snede. Verplaats de rat niet voordat de gel is volledig ingesteld.
- Het uitvoeren van de protocollen van de manipulatie van de CNS continu terwijl RSNA en gemiddelde arteriële druk. Als een microinjector/pulser wordt gebruikt voor de hersenstam manipulaties, kan een signaal van de logica van dit apparaat in de RSNA/BP opnames voor het documenteren van de timing van de CNS manipulaties worden binnengebracht.
- Wanneer het experiment voltooid is, bepaalt u het geluidsniveau door het breken van de zenuw proximale aan de elektroden van de opname tussen de silicagel en de spinale spier. Record ten minste 30 s van deze waarde "nul" voor RSNA4,5,6. Als een alternatieve benadering voor quantifying lawaai, het beheren van een korte-waarnemend ganglionaire blocker zoals atropine, hexamethonium, chlorisondamine of pentolinium tartraat8,15,16, 17.
- Zorgvuldig de RSNA elektrode verwijderen en verwijder eventuele sporen van silica gel van de draad elektroden. Sla de elektrode voor hergebruik. De zender met telemetrie uitschakelen en verwijderen, niet te beschadigen het puntje van de katheter verzorgen.
8. euthanasie (Transcardiac perfusie)
- De locaties van CNS manipulaties te identificeren door het injecteren van kleurstoffen of fluorochromes, maken van elektrolytische laesies, of door het detecteren van c-fos expressie.
- Als de hersenen analyses vergt fixatie, voorbereiden op de rat transcardiac perfusie. Beoordelen van de teen-snuifje reflex om ervoor te zorgen dat de rat diep narcose blijft. Verstrekken aanvullende verdoving indien nodig. Transcardiac perfusie van paraformaldehyde-fixeerspray uitvoeren in een zuurkast.
Let op: Avid huid/ogen irriterend. - Invoegen buizen in de perfusie pomp en prime met 0,9% normale zout.
- Maken van een 5-6 cm van de laterale incisie door de huid en de buikwand onmiddellijk onder de ribbenkast en open de borstholte. Zorgvuldig de lever te scheiden van het middenrif. Maak een kleine snede in het middenrif met gebogen botte schaar. 0,1 mL van heparine injecteert direct in het linkerventrikel.
- Voorbij een perfusie naald in het linkerventrikel (een RVS maagsonde naald werkt goed voor deze stap) ofwel het prikken van het in het hart of door het snijden van een kleine incisie met behulp van scherpe schaar en het passeren van de maagsonde naald via de tip dus zichtbaar door de wand van de aorta (maar moet niet bereiken de aortaboog). Een chirurgische of elektrische clip gebruikt om de naald in plaats veilig te stellen.
- Met behulp van een infusiepomp, beheren 0,9% normale zout (kamertemperatuur). Maak onmiddellijk een incisie van 2-3 mm in het juiste atrium maken een uitlaatklep voor de zoutoplossing spoelen. De aflopende aorta niet worden gesneden. De zoute spoelen blijven tot de kleur van de lever wijzigingen uit rood/bruin naar lichtgeel, een infusie van ongeveer 400 mL meer dan 2-3 min.
- Stoppen met de pomp. Het perfusaat overschakelen naar de fixeer (bv., 10% formaline of 4% paraformaldehyde); infusie van 400 mL meer dan 2-3 min. verwijderen de hersenen en het model opslaan in kleefpoeders oplossing 's nachts bij 4 ° C vóór de overbrenging van het weefsel tot 30% sucrose (30 mL van sacharose opgelost in 100 mL 0,1 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing) gedurende ten minste 3 dagen of totdat de hersenen putten , voor cryoprotection voor cryogenetic segmenteren18.
9. het analyseren van gegevens
- Full-wave corrigeren de ruwe RSNA om absolute waarden te verkrijgen. Full-wave corrigeren een 10 s segment van het rauwe geluid signaal. Het is belangrijk om uit te sluiten van alle studies die werden getroffen door een lage signaal-/ ruisverhouding. In studies RSNA te kwantificeren, toegepast onderzoekers een priori criteria zoals vereisen signaal ruisverhoudingen maximaal 2:1 tot 6:117,19,20.
- Bereken het gemiddelde RSNA gecorrigeerd voor niet-overlappende segmenten (µV) en aftrekken van de schatting van de noise (µV). Afhankelijk van de doelstellingen van het experiment, onderzoekers kunt intervallen zoals 10 s (Figuur 1) of 1 s. berekenen betekent met behulp van golfvorm analyse opties in de fysiologische software of exporteren van de gegevens in de werkbladen voor het berekenen van gemiddelden voor geselecteerde tijdsintervallen.
- Als u wilt normaliseren over verschillende dieren, express waarden voor verdere analyse als het percentage van basislijn veranderen. Parametrische statistieken te voeren groep vergelijkingen gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 illustreert een voorbeeld RSNA en BP opname van een rat Nembutal-verdoofd. Een intraveneuze injectie van phenylephrine werd gebruikt voor het opwekken van een toename van de gemiddelde arteriële druk en te roepen van de baroreflex en van voorbijgaande aard sympathoinhibition4,6. Om te kwantificeren RSNA was de ruwe RSNA verholpen en gemiddeld voor niet-overlappende 10 s segmenten; de schatting van het lawaai werd afgetrokken van elk segment.
Figuur 1: RSNA en BP in reactie op phenylephrine injectie IV. De ruwe RSNA (A) was full-wave verholpen (B); gerectificeerd geplette "nul" RSNA in verzonken vlak Cwordt weergegeven. Niet-overlappende 10 s gemiddelden (minus lawaai) werden berekend (D). Om op te roepen de baroreflex, was 0,1 mL van phenylephrine (1 µg/mL) geïnjecteerd intraveneus (pijl). De bolus infusie ontlokte een plotselinge toename van BP en voorbijgaande remming van de RSNA. Dit cijfer werd aangepast van Fink AM, Dean C, heer van de Piano, Carley DW. De pedunculopontine tegmentum besturingselementen renale sympathiek zenuw activiteiten en Cardiorespiratoire bij ratten Nembutal-verdoofd. PLoS One. 2017; 12 (11): e01879564. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen voor het meten van de RSNA omvatten: (1) het voorkomen van stretching van de renale slagader en de zenuwen bij het scheiden van de nier van de paraspinal spier en bij het plaatsen van het zenuw-segment op de elektroden van de opname, (2) zorgvuldig ontrafeling van de renale zenuwvezels van het omringende weefsel/vaartuig, (3) ervoor te zorgen dat de elektrode draden zijn vrij van weefsel, bloed of lymfe vloeistof en (4) beletten de zenuw uitdrogen door toepassing van minerale olie op de renale zenuw en silica gel aan de zenuw-elektrode-eenheid. Voor het oplossen van problemen is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het opnamesysteem voldoende is geaard. Voor het verkrijgen van een duidelijk signaal van de RSNA, kan de positie van de elektrode zorgvuldig worden aangepast terwijl visualiseren en luisteren naar de ruwe RSNA signaal, voorafgaand aan insluiten in silicagel. Succesvolle afronding van de operatie leidt tot een RSNA-signaal dat kan worden gedifferentieerd door CNS manipulaties voor de experimenten die enkele uren duren.
Bij de interpretatie van de resultaten, moeten de onderzoekers de invloed van de verdoving op gemiddelde arteriële druk en RSNA overwegen. Dit protocol maakt gebruik van Barbituraat anesthesie (pentobarbital natrium), die kan verminderen de gemiddelde arteriële druk en autonome reacties21wijzigen. Afhankelijk van het experiment kunnen doelstellingen, andere injecteerbare formuleringen of inademing verdoving (via neus of tracheostomy) gebruikte22. Onderzoekers kunnen overwegen de alternatieven zoals urethaan23 en alpha-chloralose24. Deze agenten hebben minder invloed op het cardiovasculaire reflexen afstomping maar kunnen opleveren voor de potentiële gevaren voor de gezondheid aan de onderzoeker.
Naast de methoden beschreven in dit protocol, zijn alternatieve benaderingen tewerkgesteld door andere laboratoria voor het registreren en fabriceren van elektroden. RSNA kan worden opgenomen met behulp van RVS4,9, zilver25of platina26 draad. Naast het opheffen van het segment van de blootgestelde zenuw op de elektrode draad, hebben wetenschappers met succes opgenomen monofasische die RSNA aan de centrale uiteinden van renale sympathische zenuwen26 gesneden Flexibiliteit verschilt op basis van de treksterkte van de draad (gemeten met eenheden van kPSI). Hogere kPSI draad is meer breekbaar maar vormvast; lage kPSI draad is meer flexibel en minder waarschijnlijk te breken wanneer gebogen, installeerden. Voor RSNA opnamen is het belangrijk om te kiezen van een draad die gemakkelijk kan worden gebogen en verplaatst tijdens opnames. De draad mag niet te soepel, waardoor het moeilijk om te haken te plaatsen onder de zenuw creëren, maar niet te stijf. De laatste verhoogt het risico van stretching en beschadiging van de zenuwen. Ons laboratorium maakt gebruik van roestvrij staaldraad met 155-185 kPSI.
Er zijn vele benaderingen voor RSNA analyse beschikbaar. In plaats van de gemiddelden voor 10 s opname segmenten te kwantificeren en de berekening van de verschillen als het percentage verandering, RSNA kan worden bepaald door de uitbarsting frequentie4,26,27te kwantificeren. Deze aanpak kan worden aangewezen wanneer de basislijn niveaus en groottes van RSNA reacties verschilt de ratten in een studie15,26. Een andere benadering impliceert de rectificatie en de integratie van de RSNA signaal; de amplitude van de RSNA (gemeten in mV) wordt opgeteld over een geselecteerde tijdsinterval (bv., 20 ms)15,26. Een integrator een lage-fase-filter toegepast en biedt de gemiddelde kwijting amplitude tijdens uitbarstingen van activiteit meer dan de tijdconstante (bv., > 20 s)15,27. Geïntegreerde signalen zijn nuttig voor de behandeling van de amplitude en fase van de RSNA, maar deze aanpak levert geen informatie over oscillerende wijzigingen. Frequentie-domein en tijd domein methoden zijn toegepast wanneer onderzoekers RSNA oscillaties onderzoeken. De aanpak die veelvuldig worden gebruikt voor de RSNA is de snelle Fourier transformatie (FFT), die een signaal in haar sinusvormige trillingen categoriseert, elk met een verschillende amplitude en fase20,26. FFT is een nuttige benadering voor de behandeling van het laag - en hoogfrequente barst in de RSNA en voor de studie van respiratoire en cardiale modulatie van het signaal van de RSNA.
De methoden in dit protocol zijn belangrijk voor de aanpak van de hypothesen over de functionele betekenis van CNS kernen. Renale sympathische zenuwen directe neurale communicatie tussen de CNS en de nier, en daarom, acute veranderingen in RSNA vertegenwoordigen een belangrijke variabele bij cardiovasculair onderzoek. Definiëren van CNS mechanismen tot regeling van de sympathieke uitstroom is een prioriteitsgebied onderzoek, gezien het feit dat renale sympathoexcitation draagt bij aan de pathofysiologie en de klinische presentatie van vele ziekten (bv., chronische nierziekten, hart fout, aritmieën, diabetes mellitus en obstructieve slaap apneu)28,29. Indirecte maatregelen van sympathieke activiteit (bijv., BP, hartfrequentie-variabiliteit, catecholamine niveaus) zijn niet altijd geschikt voor de studies over de functionele betekenis van CNS kernen. Dus vertegenwoordigt de rechtstreekse meting van de RSNA en gemiddelde arteriële druk bij narcose ratten een waardevolle methode voor het functioneel, anatomisch definiëren van de bronnen van afwijkende sympathiek nierfunctie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Anne M. Fink is een lid van de Advisory Board van de klant voor gegevens wetenschappen International.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Rijksinstituut voor verpleegkunde onderzoek (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).
