Summary
Méthodes pour mesurer les réponses sympathiques et cardiovasculaires aux manipulations du système nerveux central (SNC) sont importants pour faire progresser la neuroscience. Ce protocole a été développé pour aider les scientifiques à mesurer et quantifier les changements aigus dans l’activité nerveuse sympathique rénale (RSNA) chez des rats anesthésiés (sans survie).
Abstract
L’activité nerveuse sympathique rénale (RSNA) et la pression artérielle moyenne sont des paramètres importants dans la recherche cardiovasculaire et le système nerveux autonome ; Cependant, il sont a des ressources limitées, diriger des scientifiques dans les techniques de mesure et d’analyse de ces variables. Ce protocole décrit les méthodes pour mesurer la RSNA et la pression artérielle moyenne chez le rat anesthésié. Le protocole inclut également les approches permettant d’accéder à du cerveau pendant les enregistrements de la RSNA pour des manipulations du système nerveux central (SNC). La technique d’enregistrement de la RSNA est compatible avec pharmacologique, optogenetic, ou la stimulation électrique du SNC. L’approche est utile lorsque l’enquêteur mesurera à court terme (min h) réponses autonomes dans les expériences sans survie en corrélation anatomique avec des noyaux de CNS. L’approche n’est pas prévue pour être utilisé pour obtenir des enregistrements de chronique (survie) de RSNA chez les rats. Rejets au RSNA, en moyenne corrigée RSNA, et la pression artérielle moyenne peut être quantifié et analysés en utilisant des tests statistiques paramétriques. Méthodes pour obtenir des accès veineux, l’enregistrement de la pression artérielle moyenne telemetrically et fixation du cerveau pour des analyses histologiques sont également décrits dans l’article.
Introduction
Des découvertes précliniques sur contrôle autonome du système cardio-vasculaire informent des stratégies de gestion des troubles tels que l’hypertension artérielle, insuffisance cardiaque et l’insuffisance rénale chronique. Une activité excessive du système nerveux sympathique et tonus cardiaque vagal réduit contribuent à la tension artérielle élevée (BP)1. Chroniquement élevé débit sympathique rénale augmente la sécrétion de catécholamines et diminue le débit sanguin rénal, avec des conséquences délétères pour les systèmes cardiovasculaires/rénale2,3. Pour définir les voies neurobiologiques conduisant à un dysfonctionnement autonomique, les études chez les rongeurs sont importants pour déterminer comment les neurones du système nerveux central (SNC) régulent paramètres sympathiques. Le but du présent protocole est de fournir des informations techniques sur la mesure de l’activité nerveuse sympathique rénale (RSNA) et BP et de décrire les techniques utilisées pour quantifier les changements aigus de sympathiques en réponse à des manipulations de CNS chez des rats anesthésiés.
Mesures de RSNA aiguës (sans survie) (durée min à h) sont utiles lorsque les scientifiques sondera la CNS sur le plan pharmacologique, électriquement, ou optogenetically en anesthésiés rats pour déterminer les fonctions des noyaux spécifiques. À l’aide de ces méthodes, ouvrages d’art tels que le noyau solitaire, grise périaqueducale, tegmentum pedunculopontine et la moelle ventro rostral ont été étudiées pour définir les voies neurobiologiques réglementant les paramètres sympathique4, 5,6,7. Cette démarche est importante pour l’identification des cibles de la CNS à étudier plus en détail dans les modèles chroniques du dysfonctionnement autonomique8,9. Pour compléter ces expériences, le laboratoire nécessite un fer à souder, microscope chirurgical, cadre stéréotaxique, amplificateur de microélectrodes et moniteur audio. Selon les facteurs présents dans le laboratoire qui contribuent au bruit électrique, la zone chirurgicale/enregistrement peut exiger un Faraday cage/mise à la terre, sangle réduire le bruit électrique dans l’inscription de RSNA. Si les analyses de cerveau nécessite la fixation tissulaire, un capot de pompe et de fumées de perfusion sont nécessaires. Données peuvent être numérisées et enregistrement à l’aide de plusieurs logiciels/données physiologiques acquisition (convertisseur analogique / numérique) unités4,5, avec analyse différentes options et compatibilités pour incorporer des signaux télémétriques .
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection des Animal à l’Université de l’Illinois à Chicago.
1. créer des électrodes bipolaires RSNA
- Pour créer l’électrode, coupez deux morceaux de fil d’acier inoxydable chaque mesure environ 18 mm de long. Couper un morceau de polyéthylène (PE-50) tube environ 15 mm de long. Les deux morceaux de fil dans le tube, en laissant le fil par rapport aux deux extrémités de l’alimentation.
- Enlever l’isolant des extrémités des fils ; Coupez les fils en laissant dépasser 2-3 mm de fil dénudé. À une extrémité, sertir broches mâles sur le fil dénudé. Souder les broches solidement au fil, sécuriser les broches à l’intérieur d’une bande de connecteur et couvrir la connexion à l’époxy.
Remarque : Une approche alternative qui évite de brasage consiste à utiliser des pinces pour relier/déclenchement rapide. - À l’autre extrémité de l’électrode, enlever l’isolant des extrémités des fils, laissant dépasser 2-3 mm de fil dénudé. Plier cette partie des fils pour créer de petit « V » en forme de crochets dans le fil non isolé.
NOTE : Ceci est la portion de l’électrode qui sera en contact avec le nerf sympathique rénal. Il est important de sceller cette fin pour empêcher les fluides de pénétrer dans le tube. Silicone ou époxy efficacement peut être utilisé.
2. administrer l’anesthésie et préparer les Sites chirurgicaux
- Administrez un anesthésiant pour un rat Sprague Dawley mâle (âge 9-11 semaines, pesant 150-400 g). Administrer le pentobarbital sodique 50 mg/kg par injection intrapéritonéale (IP). Pour évaluer un plan stable de l’anesthésie pendant l’opération, vérifier orteil-pinch réflexe toutes les 15 min et re-doser l’anesthésie si nécessaire.
NOTE : sodium Pentobarbital (Nembutal) a été utilisé dans des études pour obtenir un plan durable de l’anesthésie sans interférer avec la modulation de la RSNA4,5,6. Ce protocole n’est sans survie chirurgicaux, donc il n’y a aucune récupération/post-opératoires période de surveillance. - Préparer le site chirurgical conformément aux directives institutionnelles de soins aux animaux (i.e., se raser le ventre, le dos et tête de rat ; nettoyer la peau avec solution de povidone-iode 10 % ; appliquer du lubrifiant oculaire ; et placez le rat sur un coussin chauffant). Maintenir la température corporelle à 37 ° C au cours des expériences.
3. Cathétériser la veine fémorale (pour accès intraveineux)
- Ajouter l’héparine à 0,9 % solution saline stérile (pour atteindre 20 unités/mL). Remplir une seringue de 1 mL avec du sérum physiologique hépariné à travers une aiguille de 22G. Se connecter à 15 cm de tube PE-50 à l’aiguille et la tubulure de remplissage avec la solution.
- Le rat se trouvant en position couchée, de créer une incision horizontale de 2 cm à travers la région inguinale. En utilisant les cotons-tiges, disséquer les tissus conjonctifs pour exposer la veine fémorale et artère. Pour maintenir l’incision ouverte, soit appliquer élastique simple crochet chirurgical reste fixée sur le champ opératoire avec soie tape ou utilise une pince hémostatique petite.
- Utilisez une pince hémostatique pour plier la pointe d’une aiguille de 22G à un angle de 90° pour servir un cathéter introducteur10.
- Visualiser les vaisseaux sous le microscope. Doucement, séparer la veine et l’artère avec une pincette courbée. Place deux 12 cm de long de 5-0 soie suture sous la veine (un distal et proximale) ; Placez la suture de la même manière sous l’artère.
- Attacher la suture distale (en bas) pour occlure la veine ; fixer les bords de cette suture au champ chirurgical à l’aide de ruban de soie ou de petite hémostatique. Tirez doucement la veine tendue mais pas avec autant de force que le navire va déchirer. Positionner la veine perpendiculaire à la main du chirurgien dominante.
- Utilisez un demi-nœud pronation lâche dans la suture proximale de brièvement occlure la veine. Avec une pince hémostatique délicat, légèrement pince cette suture pour bloquer le flux sanguin. Tenir l’aiguille 22G l’extrémité pliée dans la main non dominante ; Entourez le tube avec une pince à l’aide de la main dominante.
- Percer un petit trou dans la veine avec l’introduction du cathéter (étape 3.3) et insérez le tube PE-50 (pré-rempli avec du sérum physiologique hépariné) dans le vaisseau ; utiliser l’aiguille tordue pour maintenir l’ouverture à l’extérieur du navire et d’aider au positionnement de l’extrémité du cathéter dans le vaisseau10.
- Libérer la suture proximale et rincer doucement 0,2 mL de sérum physiologique hépariné dans la veine ; avancez la sonde. Vérifier le retour du sang de la veine afin d’assurer un placement correct. Remplir le noeud proximal et, avec une cravate de la suture distale, fixer le tube à l’intérieur de la veine.
- Utiliser les accès veineux au cours des expériences pour administrer l’anesthésie supplémentaire ou médicaments et pour la collecte de sang. Incorporer un connecteur à 3 voies, si les perfusions intraveineuses régulières et prélèvements sanguins seront nécessaires. Vérifiez nocive orteil-pinch réflexe toutes les 15 min pour titrer l’anesthésie.
4. canule dans l’artère fémorale pour la surveillance de la pression artérielle moyenne
- Visualiser l’artère sous le microscope. Similaire à la méthode utilisée pour le cathétérisme veineux, attacher la suture distale (étape 3.4) d’occlure l’artère ; fixer les bords de cette suture au champ chirurgical avec du ruban de soie et positionner l’artère perpendiculaire à la main du chirurgien dominante.
- Accès artériel si vous utilisez un système de capteur/perfusion sous pression
- Connectez le transducteur de pression/tube d’une poche de solution saline 0,9 % 500 mL. Rincer la tubulure avec du sérum physiologique, pour éliminer toutes les bulles et placer le sac dans un sac d’inducteur de pression pour pressuriser le système.
- Tel que décrit à l’étape 3.1, remplir une seringue de 1 mL avec du sérum physiologique hépariné à travers une aiguille de 22G et 15 cm de PE-50 à l’aiguille (tube rincer avec du sérum physiologique hépariné).
- Utilisez un demi-nœud lâche dans la suture proximale de brièvement occlure l’artère. Maintenez l’introduction du cathéter (étape 3.3) dans la main non dominante ; Tenez l’extrémité distale de la PE-50 avec une pince de canulation du navire dans la main dominante. Percez un trou dans l’artère avec l’aiguille de 22G tordue et insérer la canule dans le navire.
- Libérer la suture proximale, doucement RAS 0,2 mL de sérum physiologique hépariné dans l’artère et avance le cathéter dans la mesure du possible. Vous recherchez du sang artériel retour afin d’assurer le positionnement correct. Remplir le noeud proximal et, avec une cravate de la suture distale, fixer le tube à l’intérieur de l’artère. Connectez la ligne artérielle au transducteur de pression/tuyau.
Remarque : La partie distale du tube peut être collée sur le membre postérieur du rat pour fixer la ligne artérielle. Une approche alternative à la canulation de navire est décrite par Jespersen et al. ; 11 que leur protocole est différent en utilisant des rétracteurs à répandre l’incision, colle, plutôt que de suture-pour fixer le tuyau et l’approche ne comprend pas l’introducteur d’aiguille tordue.
- Accès artériel si par télémétrie
- Inspecter la sonde de détection de pression sous fort grossissement avant canulation artérielle. S’assurer que le cathéter est exempt de bulles/débris et a un ménisque intact entre les remplis de liquide (proximal) et remplis de gel de composants (distales). Avant chaque implantation, remplir de nouveau le gel à l’extrémité distale du cathéter. Allumez l’émetteur à l’aide d’un aimant ; moniteur BP pendant la chirurgie d’endurer un positionnement parfait.
- Utilisez un demi-nœud pronation lâche dans la suture proximale de brièvement occlure l’artère fémorale. Tenir l’introduction du cathéter (étape 3.3) dans la main non dominante. Tenir l’extrémité de la canule de l’appareil de télémesure avec une pince de canulation du navire afin d’éviter de déplacer le gel de la pointe.
- Percez un trou dans l’artère avec l’aiguille de 22G tordue et insérer la canule dans l’artère avec une pincette de canulation de navire pour éviter de déplacer le gel de la pointe. Faire avancer la canule aussi loin que possible. En utilisant les liens de la suture proximale et distale, fixer la sonde de pression.
- Rentrez le corps de l’implant de télémétrie dans le flanc adjacent à l’incision et fermer cette incision à l’aide de suture nylon 4-0 sur une aiguille de découpage. Éteignez les appareils de télémétrie en aimant à la fin de la période d’enregistrement pour économiser la batterie.
5. Positionner le Rat dans le cadre de la chirurgie stéréotaxique pour accéder le cerveau
- Déplacez doucement le rat en position couchée dans le cadre de la chirurgie stéréotaxique.
- Positionner le rat entre les barres de l’oreille et ajuster la barre incisive pour égaliser la hauteur de lambda et bregma. Positionnement peut dépendre de la souche de rat, poids et emplacements des cibles de la CNS.
- Faire une incision de 2 cm Rostro bistouri par l’intermédiaire de la ligne médiane du cuir chevelu. Cotons-tiges fermement prélever du tissu conjonctif de la surface du crâne. Appliquer de peroxyde d’hydrogène sur le crâne pour aider à visualiser le bregma, lambda et les sutures de la ligne médiane.
- À l’aide d’un atlas du cerveau de rat pour guider le ciblage12, percer une ostéotomie de trou de ronce, de taille pour l’accès de l’électrode, à travers le crâne.
6. isoler les nerfs sympathiques rénaux
- Connectez le fil-électrode RSNA (étapes 1.1 à 1.3) à un préamplificateur de 10 X et un amplificateur de la microélectrode.
- Isoler les nerfs rénaux par une incision rétropéritonéale avant ou après, le rat est fixé dans le cadre stéréotaxique. Placer les électrodes de la RSNA une fois que le rat est dans le cadre stéréotaxique. Faire une incision de bistouri s’étendant de 4 à 5 cm sous les côtes en direction caudale, légèrement latérale de la colonne vertébrale. Blunt disséquer l’incision pour visualiser les muscles paravertébraux.
- Utiliser des ciseaux pour faire une incision de Rostro très superficielle de 1-2 cm où la graisse réunit le muscle. En utilisant les cotons-tiges, étaler la graisse loin le muscle afin de visualiser les reins. Il est important de ne pas entrer dans l’espace péritonéal.
- Rétracteurs permet de séparer doucement les reins des muscles paravertébraux de visualiser l’artère rénale et l’aorte abdominale. Ne tendez pas les navires trop pour éviter d’endommager les nerfs rénaux. Utiliser un tampon de gaze de coton 2 "x 2" trempé dans une solution saline pour protéger les reins contre les blessures.
- Sous fort grossissement, identifier les nerfs rénaux dans la poche de l’incision. Les faisceaux nerveux sont plus facilement visibles dans l’angle droit formé par l’aorte et l’artère rénale. Les nerfs rénaux suivent de près l’artère rénale de l’aorte aux reins.
- Sélectionner un segment de la botte de nerf qui sera placé sur l’électrode d’enregistrement. Doucement, disséquer les fibres nerveuses du navire/tissus environnant à l’aide de pinces micro-dissection.
- Fixer le fil-électrode RSNA dans un support (par ex.., une pince crocodile attaché à un stand de soutien). Abaisser l’électrode au niveau du segment du nerf. Utiliser un crochet de nerf pour soulever doucement le segment du nerf rénal sur l’électrode sans étirer le nerf.
Remarque : Le nerf devrait incomber à l’intérieur de ces deux « V » en forme de crochets dans le fil non isolé, parallèle au nerf. Les fils de l’électrode ne doivent pas toucher les autres tissus, le sang ou liquide lymphatique. - Remplir l’incision avec de l’huile minérale pour empêcher le nerf sympathique rénal exposé de devenir sec. Utiliser une pince de mise à la terre avec une extrémité sur la peau de l’incision et l’autre attachée à la cage de Faraday.
- Diriger le signal à l’amplificateur à l’aide de haut - et filtre passe-bas (10 Hz et 3 kHz). Ajuster le gain jusqu'à 10 K. inclure un moniteur audio pour évaluer le modèle de rupture de la RSNA. Utiliser des fréquences d’échantillonnage allant de 2 000-10 000 Hz4,5,6,7,8. Utiliser une fréquence accrue d’échantillonnage lorsqu’une manipulation de la CNS l’hypothèse provoque des réponses sympathiques rapides et brèves.
7. enregistrement des données
- Évaluer la qualité de l’enregistrement de la RSNA en évoquant le baroréflexe avec une injection d’un bolus de 1 mL de solution saline ou 10 µg/mL la phényléphrine (dans 0,1 mL) par voie intraveineuse. Tel qu’illustré à la Figure 1, la perfusion doit augmenter BP et inhiber la RSNA. Une augmentation de la pression artérielle moyenne de 60-80 mmHg est suffisante pour rénale sympathoinhibition4,13,14.
- Ajustez la position des électrodes pour améliorer le signal si nécessaire. Il est nécessaire de repositionner si le nerf n’est pas en contact avec les deux crochets sur l’électrode ou si n’importe quel tissus, sang ou la lymphe, liquide est en contact avec les fils.
Remarque : La nécessité de repositionner repose sur les caractéristiques des rejets du nerf auditifs.- Si les éclats de la RSNA ne surviennent pas corrigé des variations conjoncturelles avec le cycle cardiaque, et si il n’y a aucune interférence dans l’enregistrement, puis repositionnez soigneusement l’électrode.
- Comme les mouvements respiratoires peuvent également affecter la qualité de l’enregistrement de la RSNA, améliorer le signal en déplaçant doucement l’électrode dans une position où les mouvements musculaires ne perturbent pas l’électrode au cours de la respiration.
- Après avoir obtenu un signal clair, fixer la RSNA d’électrodes en place en retirant l’huile minérale et en appliquant un gel de silice pour couvrir la connexion nerveuse/électrode dans la poche de l’incision. Ne déplacez pas le rat avant que le gel a pris complètement.
- Exécuter des protocoles de manipulation CNS tout en enregistrant en continu RSNA et la pression artérielle moyenne. Si un microinjector/générateur d’impulsions est utilisé pour des manipulations du tronc cérébral, un signal logique de cet appareil peut être introduit dans les enregistrements de la RSNA/BP pour documenter le timing des manipulations de la CNS.
- Une fois l’expérience terminée, déterminer le niveau de bruit en écrasant le nerf proximal pour les électrodes d’enregistrement entre le gel de silice et les muscles spinaux. Enregistrement au moins 30 s de cette valeur « zéro » pour RSNA4,5,6. Comme approche alternative pour le bruit de quantification, administrer un bloqueur ganglionnaire de courte durée d’action comme l’atropine, hexaméthonium, chlorisondamine ou pentolinium tartrate8,15,16, 17.
- Retirez l’électrode RSNA soigneusement et enlever toutes traces de gel de silice des fils-électrodes. Enregistrez l’électrode pour réutilisation. Éteindre l’émetteur de télémesure et retirez-le, en prenant soin de ne pas pour endommager l’extrémité du cathéter.
8. l’euthanasie (Perfusion de Transcardiac)
- Identifier les emplacements des manipulations de la CNS en injectant des colorants ou des fluorochromes, créant des lésions électrolytiques, ou par détection de l’expression de c-fos.
- Si les analyses de cerveau nécessite la fixation, préparer le rat pour perfusion transcardiac. Évaluer le réflexe d’orteil-pincée pour s’assurer que le rat reste profondément anesthésié. Fournir l’anesthésie supplémentaire si nécessaire. Exécuter transcardiac perfusion de fixateur de paraformaldéhyde sous une hotte.
ATTENTION : Irritant Avid peau/yeux. - Insérer le tuyau dans la pompe à perfusion et le premier avec sérum physiologique 0,9 %.
- Faire une incision latérale 5-6 cm à travers la peau et la paroi abdominale immédiatement sous la cage thoracique et ouvrir la cage thoracique. Séparer soigneusement le foie du diaphragme. Faire une petite incision dans la membrane à l’aide de ciseaux émoussé incurvé. Injecter 0,1 mL d’héparine directement dans le ventricule gauche.
- Passez une aiguille de perfusion dans le ventricule gauche (une aiguille de gavage en acier inoxydable fonctionne bien pour cette étape) soit il perforera au cœur ou en pratiquant une petite incision à l’aide de ciseaux pointus et en passant le gavage aiguille à travers la pointe est visible à travers le paroi de l’aorte (mais ne devrait pas atteindre la crosse aortique). Utilisez une pince chirurgicale ou électrique pour fixer l’aiguille en place.
- À l’aide d’une pompe à perfusion, administrer le sérum physiologique 0,9 % (température ambiante). Créer immédiatement une incision de 2 à 3 mm dans l’oreillette droite pour créer un débouché pour le rinçage au sérum physiologique. Ne pas couper l’aorte descendante. Continuer le rinçage au sérum physiologique jusqu'à le foie change de couleur du rouge/brun à jaune pâle, une infusion d’environ 400 mL pendant 2-3 min.
- Arrêter la pompe. Placez-vous dans le perfusat du fixateur (e.g., 10 % de formol, soit 4 % de paraformaldéhyde) ; faire infuser 400 mL plus 2-3 min. Retirer le cerveau et stocker l’échantillon en solution de fixation durant la nuit à 4 ° C avant de transférer le tissu à 30 % de saccharose (30 mL de saccharose dissous dans 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate 0,1 M) pendant au moins 3 jours ou jusqu'à ce que le cerveau éviers , pour cryoprotection avant cryogenetic la section18.
9. analyser les données
- Pleine onde rectifier la RSNA brute pour obtenir des valeurs absolues. Pleine onde rectifier un segment s 10 du signal bruit raw. Il est important d’exclure toutes les études qui ont été touchés par un faible rapport signal sur bruit. Dans les études quantifiant RSNA, enquêteurs a appliqué des critères a priori comme exigeant des rapports signal sur bruit de dépasser 2:1 à 6:117,19,20.
- Calculer la moyenne corrigée RSNA pour les segments de non-cumul (µV) et soustraire l’estimation de bruit (µV). Selon les objectifs de l’expérience, les enquêteurs peuvent sélectionner des intervalles tels que 10 s (Figure 1) ou 1 s. calculer signifie en utilisant les options d’analyse de forme d’onde dans le logiciel physiologique ou exportez les données dans des tableurs pour calculer des moyennes pour intervalles de temps sélectionné.
- Pour normaliser à travers différents animaux, exprimer des valeurs pour une analyse plus approfondie que le pourcentage de changement de ligne de base. Utilisation statistique paramétrique afin d’effectuer des comparaisons de groupe.
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Representative Results
La figure 1 illustre un enregistrement de RSNA et BP d’échantillon d’un rat anesthésié Nembutal. Une injection intraveineuse de phényléphrine a été utilisée pour induire une augmentation de la pression artérielle moyenne et pour évoquer le baroréflexe et transitoires sympathoinhibition4,6. Afin de quantifier la RSNA, la RSNA raw a été redressée et inscrivit en 10 segments s sans chevauchement ; l’estimation de bruit a été soustraite de chaque segment.
Figure 1 : RSNA et BP en réponse à l’injection IV de la phényléphrine. La cru RSNA (A) a été pleine-onde rectifiée (B) ; rectifiées concassée « zéro » RSNA est illustrée dans médaillon C. Non chevauchantes 10 s moyennes (moins de bruit) ont été calculées (D). Evoquer le baroréflexe, 0,1 mL de la phényléphrine (1 µg/mL) a été injecté par voie intraveineuse (à la flèche). L’injection d’un bolus a suscité une augmentation abrupte des BP et inhibition transitoire de la RSNA. Ce chiffre est une adaptation de Fink AM, de Dean C, de M. de Piano, de Carley DW. Le tegmentum pedunculopontine contrôle l’activité nerveuse sympathique rénale et cardiorespiratoire chez des rats anesthésiés Nembutal. PLoS One. 2017 ; 12 (11) : e01879564. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les étapes essentielles pour mesurer la RSNA comprennent : (1) en évitant de s’étendant de l’artère rénale et des nerfs en séparant les reins des muscles paravertébraux et lorsque vous placez le segment de nerf sur les électrodes d’enregistrement, (2) soigneusement disséqué les fibres nerveuses rénales du tissu environnant/navire, (3) s’assurer que les fils de l’électrode sont libres de tissus, le sang, ou liquide lymphatique et (4) empêchant le nerf ne se dessèchent pas en appliquant l’huile minérale à la nerveuse rénale et le gel de silice à l’unité de nerf-électrode. Pour un dépannage, il est important de s’assurer que le système d’enregistrement est correctement relié à la terre. Pour obtenir un signal clair de la RSNA, la position de l’électrode peut être soigneusement réglée tout en visualisant et en écoutant le signal brut de la RSNA, avant l’incorporation dans le gel de silice. La réussite de la chirurgie se traduit par un signal RSNA qui peut être modulé par des manipulations de CNS pour les expériences de plusieurs heures.
Lorsqu’on interprète les résultats, les chercheurs devraient envisager l’influence de l’anesthésie sur la pression artérielle moyenne et RSNA. Ce protocole utilise l’anesthésie barbiturique (pentobarbital sodique), qui permet de réduire la pression artérielle moyenne et de modifier les réponses autonomes21. Selon l’expérience vise d’autres formulations injectables ou l’anesthésie par inhalation (via le cône de nez ou trachéotomie) peut être utilisé22. Les chercheurs peuvent envisager les alternatives telles que l’uréthane23 et alpha-chloralose24. Ces agents ont moins d’impact sur la diminution des réflexes cardiovasculaires mais peuvent poser des risques sanitaires potentiels à l’enquêteur.
Outre les méthodes décrites dans le présent protocole, des approches alternatives ont été employées par d’autres laboratoires d’enregistrement et la fabrication d’électrodes. RSNA peut être enregistrée à l’aide de fil de platine26 , argent25ou en acier inoxydable4,9. En plus de soulever le segment de nerf exposée sur le fil-électrode, scientifiques ont enregistré avec succès de monophasique RSNA aux extrémités centrales de coupe les nerfs sympathiques rénaux26. Souplesse est différent basé sur la résistance à la traction du fil (mesurée avec kPSI unités). Supérieure kPSI fils est plus fragile mais conserve sa forme ; kPSI faible fil est plus souple et moins susceptibles de se briser lorsque pliée, de façon répétitive. Pour les enregistrements de la RSNA, il est important de choisir un fil qui peut être facilement plié et repositionné pendant les enregistrements. Le fil ne doit pas être trop souple, rendant difficile de créer des crochets à placer sous le nerf, mais pas trop raide. Ce dernier augmente le risque d’étirement et d’endommager les nerfs. Notre laboratoire utilise des fils en acier inoxydable avec kPSI 155-185.
Il existe plusieurs approches pour l’analyse de la RSNA. Plutôt que de quantifier les moyennes pour 10 segments d’enregistrement s et en calculant les différences comme le pourcentage change, RSNA peut être déterminé en quantifiant la rafale fréquence4,26,27. Cette approche peut être préférable, lorsque les niveaux de base et les amplitudes des réponses de la RSNA diffèrent parmi les rats dans une étude de15,26. Une autre approche consiste à la rectification et l’intégration du signal RSNA ; l’amplitude de la RSNA (mesuré en mV) est résumé dans un intervalle sélectionné de temps (p. ex.., 20 ms)15,26. Un intégrateur applique un filtre low-phase et fournit l’amplitude du débit moyen pendant les salves d’activité supérieure à la constante de temps (p. ex.., > 20 s)15,27. Signaux intégrés sont utiles pour étudier l’amplitude et la phase de la RSNA, mais cette approche ne fournit pas d’informations sur les modifications oscillatoires. Les méthodes de domaine domaine et temps fréquence ont été appliqués lorsque les chercheurs examiner les oscillations de la RSNA. L’approche utilisée fréquemment pour RSNA est le Fourier rapide (FFT), qui catégorise un signal en ses oscillations sinusoïdales, chacun avec une amplitude distincte et la phase20,26. FFT est une approche utile pour examiner les éclats de basse et haute fréquence dans la RSNA et pour l’étude de modulation respiratoire et cardiaque du signal RSNA.
Les méthodes de ce protocole sont importantes pour répondre aux hypothèses sur la signification fonctionnelle de noyaux de CNS. Nerfs sympathiques rénaux directement communication neuronale entre le CNS et les reins, et des variations aiguës RSNA représentent donc une variable importante en recherche cardiovasculaire. Définir des mécanismes de CNS régulation débit sympathique est un domaine de recherche prioritaire, considérant que sympathoecitation rénale contribue à la physiopathologie et présentation clinique de nombreuses maladies (p. ex.., la maladie rénale chronique, coeur échec, arythmies, diabète sucré et l’apnée obstructive du sommeil)28,29. Mesures indirectes de l’activité nerveuse sympathique (e.g., BP, la variabilité du rythme cardiaque, taux de catécholamines) ne sont pas toujours adaptés pour les études sur la signification fonctionnelle de noyaux de CNS. Par conséquent, la mesure directe de la RSNA et la pression artérielle moyenne chez des rats anesthésiés représente une méthode utile pour fonctionnellement, anatomiquement définir les sources de la fonction sympathique rénale aberrante.
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Disclosures
Anne M. Fink est membre du Conseil consultatif client pour Data Sciences International.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par le National Institute for Nursing Research (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).
