Summary
Metoder for måling sympatisk og hjerte svar på sentralnervesystemet (CNS) manipulasjoner er viktig for fremme nevrovitenskap. Denne protokollen ble utviklet for å hjelpe forskere med måling og kvantifisere akutte endringer i nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA) i bedøvet rotter (ikke-overlevelse).
Abstract
Nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA) og mener arteriell press er viktige parametere i hjerte og autonome forskning; men er det begrensede ressurser regi forskere i teknikker for å måle og analysere disse variablene. Denne protokollen beskriver metodene for å måle RSNA og mener arteriell trykket i bedøvet rotter. Protokollen inneholder også tilnærminger for tilgang til hjernen under RSNA innspillinger for sentralnervesystemet (CNS) manipulasjoner. RSNA opptak teknikken er kompatibel med pharmacologic, optogenetic, eller elektrisk stimulering av CNS. Tilnærmingen er nyttig når en etterforsker vil måle kortsiktige (min til h) autonome responsen i ikke-overlevelse eksperimenter å korrelere anatomisk med CNS kjerner. Tilnærmingen er ikke ment å brukes til å få kronisk (overlevelse) innspillinger av RSNA i rotter. Utslipp i RSNA, gjennomsnitt utbedret RSNA, og mener arteriell press kan være kvantifisert og analysert ytterligere ved hjelp av parametriske statistiske tester. Metoder for venøs tilgang, innspilling mener arteriell press telemetrically og hjernen fiksering for fremtidige histologiske analyse er også beskrevet i artikkelen.
Introduction
Pre-klinisk funn om autonome kontroll av det kardiovaskulære systemet informere strategier for å behandle sykdommer som høyt blodtrykk, hjertesvikt og kronisk nyresykdom. Over-aktivitet i sympatiske nervesystemet og redusert vagal hjerte tone bidra til forhøyet blodtrykk (BP)1. Kronisk opphøyet nyre sympatisk utløp forbedrer katekolaminer sekresjon og reduserer nyre blodstrøm, skadelige konsekvenser hjerte/nyre systemer2,3. Definere nevrobiologiske veier fører til autonome dysfunksjon, er studier i gnagere viktig for å bestemme hvordan sentralnervesystemet (CNS) neurons regulere sympatisk parametere. Formålet med denne protokollen er å gi teknisk informasjon om måling nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA) og BP og skissere teknikkene for å kvantifisere akutt sympatisk endringer i respons til CNS manipulasjoner i bedøvet rotter.
Akutt (ikke-overlevelse) RSNA målinger (varig min til h) er nyttige når forskere vil undersøke CNS farmakologisk, elektrisk, eller optogenetically i anesthetized rotter å bestemme funksjonene til spesifikke kjerner. Ved hjelp av disse metodene, strukturer som enslig kjernen, periaqueductal grå, er pedunculopontine tegmentum og rostral ventrolateral marg gransket for å definere nevrobiologiske trasé regulere sympatisk parametere4, 5,6,7. Denne tilnærmingen er viktig for å identifisere CNS mål undersøkes i kronisk modeller av autonome dysfunksjon8,9. For å fullføre disse eksperimentene, krever laboratoriet en loddebolt, kirurgisk mikroskop, stereotaxic ramme, microelectrode forsterker og lyd skjermen. Avhengig av hvilke faktorer i laboratoriet som bidrar til elektrisk støy, krever kirurgiske/opptak området en Faraday bur/jording stropp å redusere elektrisk støy i RSNA innspillingen. Hvis hjernen analyser krever vev fiksering, kreves perfusjon pumpe og fume hette. Data kan digitaliseres og spilt inn med flere fysiologiske programvare/data oppkjøp (analog-digital omformer) enheter4,5, med forskjellige alternativer og kompatibilitet for omfatter telemetrisk signaler .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene beskrevet ble godkjent av institusjonelle dyr omsorg komiteen på University of Illinois i Chicago.
1. Opprett Bipolar RSNA elektroder
- For å opprette elektroden, cut to stykker av rustfritt stål wire hver omtrent 18 mm lang. Klipp en del av polyetylen (PE-50) rør ca 15 mm lang. Mate begge delene av ledningen inn i slangen, forlater ledningen stikker fra begge ender.
- Fjerne isolasjon fra endene av ledningene; klippe ledningene forlate 2-3 mm av eksponert wire. Den ene enden crimp mannlige pinner over utsatte ledningen. Loddetinn pinnene på ledningen, sikre pinnene innenfor et koblingen stripe og dekke forbindelse med epoxy.
Merk: En alternativ tilnærming som unngår lodding er å bruke rask koble/release alligator klipp. - På den motsatte enden av elektroden, fjerne isolasjon fra endene av ledningene, forlater 2-3 mm av eksponert wire. Bøy denne delen av ledningene til lage små "V" formet kroker i uisolert ledningen.
Merk: Dette er delen av elektroden at vil klontakte nyre sympatiske nerve. Det er viktig å tette dette formål å hindre væske inn slangen. Silikon eller epoxy kan effektivt brukes.
2. administer anestesi og forberede kirurgiske områder
- Administrere anestesi, en mannlig Sprague Dawley rotten (alder 9-11 uker, veier 150-400 g). Administrere pentobarbital natrium 50 mg/kg via en intraperitoneal (IP)-injeksjon. For å vurdere et stabilt fly av anestesi under operasjonen, sjekk tå-klype refleks hver 15 min og re dose anestesi etter behov.
Merk: Pentobarbital natrium (Nembutal) ble brukt i tidligere studier for å oppnå vedvarende flyet bedøvelse uten å forstyrre modulering RSNA4,5,6. Denne protokollen er for ikke-overleve kirurgi, så det er ingen utvinning/post-operative overvåking periode. - Forberede kirurgisk nettstedet dyr institusjon retningslinjer (dvs., barbere rottas magen, ryggen og hodet, rense huden med 10% povidon-jod løsning; bruke øye smøremiddel, og plassere rotta på en varmeputen). Opprettholde kroppstemperatur på 37 ° C under forsøkene.
3. cannulate femur venen (for intravenøs tilgang)
- Legge til heparin 0,9% sterilt saltvann (for å oppnå 20 enheter/mL). Fyll en 1 mL sprøyte med den heparinized saltvann gjennom en 22G nål. Koble 15 cm PE-50 rør til nål og fylle slangen med løsningen.
- Rotte ligger supine, opprette en 2 cm vannrett snitt gjennom lysken området. Bruker bomull-tipped påføring, dissekere connective vev for å avsløre femur vene og arterien. For å holde i snitt åpen, bruke enten én-krok elastisk kirurgisk opphold sikret til kirurgiske feltet med silke bånd eller bruke små hemostats.
- Bruk hemostats for å bøye spissen på en 22G nål i 90° vinkel å tjene som et kateter introducer10.
- Visualisere fartøyene under mikroskopet. Skille forsiktig venen og arterien bruke buede tang. Sted to 12 cm lang 5-0 silke Sutur under venen (en distale og en proksimale); plass suture på samme måte under arterien.
- Knytte den distale (nederst) Sutur å occlude åre; sikre kantene av denne Sutur kirurgiske feltet silke tape eller liten hemostats. Trekk forsiktig i venen stram, men ikke med så mye kraft at fartøyet vil rive. Plasser venen vinkelrett kirurgens dominante hånd.
- Bruk en løs overhand halv knute i det proksimale suture til kort occlude venen. Med delikate hemostatic tang, forsiktig klemme denne Sutur å occlude blodstrøm. Hold 22G nålen bøyd spissen i ikke-dominante hånd; hekte slangen med tang bruker den dominante hånden.
- Punktere et lite hull i stemning med kateter introducer (trinn 3.3) og sette inn PE-50 slangen (forhåndsutfylt med heparinized saltvann) i fartøyet; Bruk bøyd nålen å holde åpningen i fartøyet åpne og bistå i posisjoneringen spissen av kateter inn i fartøyet10.
- Slipp den proksimale Sutur og forsiktig flush 0,2 mL heparinized saltvann i venen; gå til kateter. Når blodet tilbake fra venen å sikre riktig plassering. Fullføre den proksimale knuten, og med distale Sutur slips, sikre slangen inne i venen.
- Bruke venøs tilgang under eksperimenter for administrasjon av supplerende anestesi eller medisiner og blod samling. Innlemme en 3-veis kobling hvis vanlig intravenøs infusjoner og blodprøve vil være nødvendig. Kontroller skadelige tå-klype refleks hvert 15 min sjarmere anestesi.
4. cannulate arteria Femoral for mener arteriell trykk overvåking
- Visualisere arteria under mikroskopet. Ligner på metoden brukt for venøs cannulation, knytte den distale Sutur (trinn 3,4) til occlude arterien; sikre kantene av denne Sutur til kirurgiske feltet med silke tape og plasser arteria vinkelrett kirurgens dominante hånd.
- Arterial tilgang hvis bruker press svinger/infusjon systemet
- Koble svinger/trykkslangen til en 500 mL 0,9% saltvann bag. Rødme slangen med saltvann, fjerne alle bobler, og plasser posen inne en trykk induser bag å presse systemet.
- Som beskrevet i trinn 3.1, fyll 1 mL sprøyte med den heparinized saltvann gjennom en 22G nål og koble 15 cm PE-50 til nålen (flush rør med heparinized saltvann).
- Bruk en løs halv knute i det proksimale suture til kort occlude arterien. Hold kateter introducer (trinn 3.3) i den ikke-dominante hånden; Hold den distale tuppen av PE-50 med fartøyet cannulation tang i den dominante hånden. Punktere hull i arterien med bøyde 22G nålen og sett kanyle inn fartøyet.
- Slippe den proksimale Sutur, forsiktig flush 0,2 mL heparinized saltvann i arterien og forhånd kateter så langt som mulig. Sjekk for arterial blod tilbake å sikre riktig plassering. Fullføre den proksimale knuten, og med distale Sutur slips, sikre slangen i arterien. Koble arteriell linjen til svinger/trykkslangen.
Merk: For rør kan tapes rottas hindlimb å sikre arteriell linjen. En alternativ tilnærming til fartøyet cannulation er beskrevet av Jespersen et al.; 11 deres protokollen er forskjellig ved hjelp retractors for å spre snitt, lim-snarere enn Sutur til sikre slangen, og tilnærmingen omfatter ikke bøyd nål introducer.
- Arterial tilgang hvis bruker telemetri
- Kontrollere press-sensing kateter under forstørring før arteriell cannulation. Sikre at kateter uten bobler/rusk og har en intakt menisk mellom den væskefylte (proksimale) og gel-fylt (distale) komponenter. Før hver implantasjon, fylle gel på den distale tuppen på kateter. Slå på senderen bruker en magnet; Monitor BP under operasjonen tåle perfekt plassering.
- Bruk en løs overhand halv knute i det proksimale suture til kort occlude arteria femoral. Hold kateter introducer (trinn 3.3) i ikke-dominante hånd. Hold spissen på kanyle av telemetri med fartøyet cannulation tang å unngå fortrenge gel fra spissen.
- Punktere hull i arterien med bøyde 22G nålen og sett kanyle inn arteria bruke fartøy cannulation tang for å unngå fortrenge gel fra spissen. Forhånd kanyle så langt som mulig. Bruker den proksimale og distale Sutur bånd, sikre press kateter.
- Brette kroppen av telemetri implantatet i flanken tilstøtende innsnitt, og Lukk denne snitt med 4-0 nylon Sutur på en klippe nål. Deaktivere telemetri enheter av magnet ved avslutningen av opptak periode for å spare batteriets levetid.
5. Plasser rotta i Stereotaxic kirurgi rammen til hjernen
- Forsiktig flytte rotta til liggende stilling i stereotaxic kirurgi rammen.
- Plasser rotta mellom øret barer, og justere helikopteret baren for å utjevne høyden på lambda og bregma. Posisjonering kan avhenge rotte belastning, -tykkelse og -lokasjoner med CNS mål.
- Gjøre en 2 cm rostrocaudal skalpell snitt gjennom midtlinjen av hodebunnen. Bruk av bomull-tipped påføring, fast fjerne bindevev fra skallen overflaten. Bruke hydrogenperoksid på skallen for å hjelpe til med visualisering av bregma, lambda og midtlinjen suturer.
- Bruker en atlas av rotte hjernen til å guide målretting12, bore en burr hull osteotomi, størrelse elektrode tilgang, gjennom skallen.
6. isolere nyre sympatiske nerver
- Koble ledningen RSNA elektroden (trinn 1,1-1,3) til et 10 X pre forsterker, microelectrode forsterker.
- Isolere nyre nervene gjennom en retroperitoneal snitt før eller etter, rotta er sikret i stereotaxic rammen. Plasser RSNA elektrodene når rotta er stereotaxic rammen. Gjøre en skalpell snitt utvide fra 4-5 cm nedenfor ribbeina caudal retning og lett lateralt til ryggraden. Blunt dissekere snittet til å visualisere paraspinal musklene.
- Bruk saks for å gjøre en veldig overfladisk 1-2 cm rostrocaudal snitt hvor fettet møter muskelen. Bruker bomull-tipped påføring, spre fettet fra muskler til å visualisere nyrene. Det er viktig å ikke angi peritoneal plass.
- Bruk retractors til å forsiktig skille nyre fra paraspinal musklene å visualisere nyre arterien og abdominal aorta. Ikke strekk fartøyene overdrevet for å unngå skade nyre nerver. Bruk en 2 "x 2" bomull gasbind puten dynket i saltvann å beskytte nyre fra skade.
- Under forstørring, identifisere nyre nervene i snitt lomme. Nerve pakker er lettest synlige i riktig vinkel av aorta og arteria nyre. Nyre nervene følger tett arteria nyre fra aorta til nyrene.
- Velg et segment av nerve bunt som plasseres på opptak elektroden. Forsiktig dissekere nervefibrene fra omkringliggende vev/fartøyet ved hjelp av mikro-dissekere pinsett.
- Sikre wire RSNA elektroden i en holder (f.eks., en alligator klipp knyttet til en støtte stativ). Lavere elektroden til nivået av nerve segmentet. Bruk en nerve krok til løft segmentet av nyre nerve på elektroden uten strekking nerve.
Merk: Nerve bør hvile inne begge "V" formet kroker i uisolert ledningen, parallelt nerve. Elektroden ledningene må ikke ta noen andre vev, blod eller lymfe væske. - Fyll i snitt med mineralolje å hindre eksponert nyre sympatiske nerve blir tørr. Bruk en hefte jording ene enden på huden i snitt og andre knyttet til buret.
- Direkte signal forsterkere bruker high - og low-pass filtrering (10 Hz og 3 kHz). Justere forsterkningen til 10 K. inkluderer en lyd skjerm å vurdere sprengning mønster av RSNA. Bruk prøvetaking priser varierer mellom 2000-10 000 Hz,4,,5,,6,,7,,8. Bruk en økt samplingsfrekvens når en CNS manipulasjon er hypotesen til rask/kort sympatisk svar.
7. registrere Data
- Vurdere kvaliteten på RSNA innspillingen ved baroreflex med en bolus injeksjon av 1 mL av saltvann eller 10 µg/mL phenylephrine (i 0,1 mL) intravenøst. Som illustrert i figur 1, bør infusjonen øke BP og hemme RSNA. En økning i gjennomsnittlig arteriell presset av 60-80 mmHg er tilstrekkelig for nyre sympathoinhibition4,13,14.
- Juster plasseringen av elektrodene for å forbedre signal om nødvendig. Reposisjonering kreves hvis nerve ikke er i kontakt med både kroker på elektroden eller hvis noen vev, blod eller lymfe væske er i kontakt med ledninger.
Merk: Behovet for omplassering er basert på auditory egenskapene til nerve utslipp.- Hvis bursts av RSNA ikke oppstår syklisk med hjerte syklus, og hvis det er forstyrrelser i opptaket, deretter forsiktig flytte elektroden.
- Som åndedretts bevegelser kan også påvirke kvaliteten på RSNA innspillingen, forbedre signalet ved forsiktig flytte elektroden i en posisjon hvor muskelbevegelser ikke avbryter elektroden under puste.
- Når et klart signal er oppnådd, sikre RSNA elektroden på plass ved uttak mineralolje og bruke en silica gel å dekke nerve/elektrode tilkoblingen i snitt lomme. Ikke Flytt rotta før gel har satt helt.
- Utføre CNS manipulasjon protokoller mens kontinuerlig RSNA og betyr arterieblodtrykk. Hvis en microinjector/pulser brukes for hjernestammen manipulasjoner, kan en logikk signal fra denne enheten bli introdusert i RSNA/BP opptakene å dokumentere tidspunktet for CNS manipulasjoner.
- Når eksperimentet er fullført, kan du bestemme støynivået ved knusing nerve proksimale til opptak elektrodene mellom silica gel og spinal muskel. Post minst 30 s "zero" verdien i RSNA4,5,6. Som en alternativ tilnærming for kvantifisere støy, administrere et korttidsvirkende ganglionic blokkering som atropin, hexamethonium, chlorisondamine eller pentolinium tartrate8,15,16, 17.
- Nøye fjerne RSNA elektroden og fjerne alle spor av silica gel fra wire elektrodene. Lagre elektroden for gjenbruk. Slå av telemetri senderen og fjerne den, ta vare ikke for å skade spissen av kateter.
8. euthanasia (Transcardiac perfusjon)
- Identifisere plasseringen av CNS manipulasjoner injeksjonsbruk fargestoffer eller fluorochromes, skape elektrolytisk lesjoner, eller oppdage c-fos uttrykk.
- Hvis hjernen analyser krever fiksering, forberede rotta transcardiac perfusjon. Vurdere den toe-klype refleks for å sikre at rotta fortsatt dypt bedøvet. Gi supplerende anestesi hvis nødvendig. Utføre transcardiac perfusjon av paraformaldehyde bindemiddel i avtrekksvifte.
FORSIKTIG: Ivrig hud/øye irriterende. - Sett inn rør i perfusjon pumpen og prime med 0,9% normal saline.
- Gjør en 5-6 cm lateral snitt gjennom huden og bukveggen umiddelbart under ribbe buret og åpne brystet hulrom. Forsiktig skille leveren fra membranen. Lag et lite innsnitt i mellomgulvet med buet sløv saks. Injisere 0,1 mL av heparin direkte i venstre ventrikkel.
- Passerer en perfusjonsmåling nål i venstre ventrikkel (en rustfritt stål gavage nål fungerer godt for dette trinnet) enten punktering det inn i hjertet eller ved å klippe et lite innsnitt med skarp saks og passerer gavage p gjennom så spissen er synlig gjennom den veggen av aorta (men bør ikke komme aortabuen). Bruk ett inngrep eller elektriske for å sikre nålen i stedet.
- Bruker en infusjon pumpe, administrere 0,9% normal saline (romtemperatur). Umiddelbart opprette en 2-3 mm snitt i høyre atrium opprette et utløp for saltvann skylling. Ikke klippe den synkende aortabuen. Fortsett saltvann skylling til leveren skifter fra rød/brun til blek gul, en infusjon av ca 400 mL over 2-3 minutter.
- Stopp pumpen. Bytte av perfusate til bindemiddel (f.eks., 10% formalin eller 4% paraformaldehyde); infundere 400 mL over 2-3 min. fjerne hjernen og lagre prøven i etappe, den stabiliserende løsning overnatting på 4 ° C før du overfører vevet til 30% sukrose (30 mL av sukrose oppløst i 100 mL 0.1 M fosfat-bufret saltvann) i minst 3 dager eller til hjernen vasker , for cryoprotection før cryogenetic snitting18.
9. analysere Data
- Full-bølge utbedre rå RSNA å få absolutte verdier. Full-bølge utbedre et 10 s segment av rå støyen signalet. Det er viktig å ekskludere noen studier som ble berørt av en lav signal-til-støy-forhold. I studier kvantifisere RSNA, etterforskere søkte en priori kriterier som krever signal til støy forhold å overstige 2:1 til 6/117,19,20.
- Beregn gjennomsnittet utbedret RSNA for ikke-overlappende segmenter (µV) og trekke støy anslå (µV). Avhengig av målet for eksperimentet, etterforskere kan velge intervaller som 10 s (figur 1) eller 1 s. Beregn betyr ved hjelp av bølgeform analysealternativer i fysiologiske programvaren eller eksportere dataene til regneark til å beregne gjennomsnitt for valgt tidsintervaller.
- For å normalisere over forskjellige dyr, uttrykke verdier for videre analyse som Prosentvis endring fra grunnlinjen. Bruke parametrisk statistikk for å gjennomføre gruppe sammenligninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer et eksempel RSNA og BP opptak fra rotte Nembutal-anesthetized. Intravenøs injeksjon av phenylephrine ble brukt å indusere en økning i gjennomsnittlig arteriell presset og å fremkalle den baroreflex og forbigående sympathoinhibition4,6. For å kvantifisere RSNA, ble rå RSNA utbedret og gjennomsnitt for ikke-overlappende 10 s segmenter: støy estimatet ble trukket fra hvert segment.
Figur 1: RSNA og BP svar på phenylephrine injeksjon IV. Rå RSNA (A) var full-bølge utbedret (B); korrigere knust "null" RSNA vises i rammemarg C. Ikke-overlappende 10 s gjennomsnitt (minus støy) ble beregnet (D). For å fremkalle baroreflex, var 0,1 mL av phenylephrine (1 µg/mL) injiseres intravenøst (på pil). Bolusinfusjon vakte en brå økning i BP og forbigående hemming av RSNA. Dette tallet var tilpasset fra Fink AM, Dean C, Piano MR, Carley DW. Pedunculopontine tegmentum kontroller nyre sympatiske nerve aktivitet og cardiorespiratory aktiviteter i Nembutal-anesthetized rotter. PLoS One. 2017; 12 (11): e01879564. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avgjørende skritt for å måle RSNA inkluderer: (1) å unngå strekking av nyre arterien og nerver når skille nyre fra paraspinal muskelen og når å plassere nerve segmentet på opptak elektrodene, (2) nøye dissekere nyre nervefibrene fra omkringliggende vev/fartøyet, (3) sikrer at elektroden ledninger er vev, blod, eller lymfe væske eller (4) hindrer nerve tørker ut ved å bruke mineralolje nyre nerve og silica gel til nerve elektrode enhet. For feilsøking er det viktig å sikre at opptaket systemet er tilstrekkelig jordet. For å få et klart signal om RSNA, justeres plasseringen av elektroden nøye mens visualisere og lytte til rå RSNA signalet, før innebygging i silica gel. Vellykket gjennomføring av operasjonen gir et RSNA signal som kan være modulert av CNS manipulasjoner for eksperimenter varer flere timer.
Når tolke resultatene, bør etterforskerne vurdere påvirker anestesi mener arteriell press og RSNA. Denne protokollen bruker barbiturat anestesi (pentobarbital natrium), som kan redusere mener arteriell trykk og endre autonomic tiltak21. Avhengig av eksperimentet kan mål, andre injiserbare formuleringer eller innånding anestesi (via forpart eller tracheostomi) være brukt22. Forskere kan vurdere alternativer som uretan23 og alpha-chloralose24. Disse agentene ha mindre innvirkning på blunting hjerte reflekser, men kan utgjøre potensielle helsefarer til etterforskeren.
I tillegg til metodene som er beskrevet i denne protokollen, har alternative tilnærminger vært ansatt av andre laboratorier for innspilling og fabrikasjon elektroder. RSNA kan registreres med rustfritt stål4,9, sølv25eller platina26 wire. I tillegg til løfting eksponert nerve segmentet på elektroden tråden, har forskere er registrert monophasic RSNA på sentrale enden av klippe nyre sympatiske nerver26. Fleksibiliteten er forskjellig basert på strekkfasthet av ledningen (målt med kPSI enheter). Høyere kPSI wire er mer sprø men beholder formen; lav kPSI wire er mer fleksible og mindre sannsynlighet for å bryte når bøyd, gjentagelser. For RSNA innspillinger er det viktig å velge en ledning som lett kan bøyd og omplasseres under opptak. Ledningen bør ikke være for fleksible, noe som gjør det vanskelig å opprette kroker å plassere under nerve, men ikke for stiv. Sistnevnte øker risikoen for strekking og skade nerver. Vårt laboratorium bruker rustfritt stål wire med 155-185 kPSI.
Det finnes mange metoder for RSNA analyse. I stedet for å kvantifisere gjennomsnitt for 10 s opptak segmenter og beregner forskjellene som prosent endring, RSNA kan bestemmes av kvantifisere burst frequency4,26,27. Denne tilnærmingen kan bli foretrukket når den opprinnelige nivåer og størrelsen av RSNA svar varierer for rotter i en studie15,26. En annen tilnærming innebærer retting og integrering av RSNA signalet; RSNA amplituden (målt i mV) er summert over et valgt intervall av tid (f.eks., 20 ms)15,26. En integrator bruker en lav-fase filter og gir middelvannføring amplituden under burst aktivitet over tiden konstant (f.eks., > 20 s)15,27. Integrert signaler er nyttig for å undersøke amplitude og fase av RSNA, men denne tilnærmingen gir ikke informasjon om oscillasjon endringer. Frekvens domene og tid domenet metoder er brukt når forskere undersøker RSNA svingninger. Tilnærmingen brukte for RSNA er rask Fourier transformasjon (FFT), som anser et signal til sine sinusformet svingninger, hver med en distinkt amplitude og fase20,26. FFT er en nyttig metode for å undersøke lav - og høyfrekvent serieopptak i RSNA og studere luftveissykdommer og hjerte modulering av RSNA signalet.
Metodene i denne protokollen er viktig for adressering hypoteser om funksjonelle betydningen av CNS kjerner. Nyre sympatiske nerver direkte neural kommunikasjon mellom CNS og nyre, og derfor akutte endringer i RSNA representerer en viktig variabel i hjerte forskning. Definere CNS mekanismer regulere sympatisk utløp er satsingsområde forskning, vurderer at nyre sympathoexcitation bidrar til patofysiologi og kliniske presentasjonen mange sykdommer (f.eks., kronisk nyresykdom, hjerte feil, arytmi, diabetes mellitus og hindrende sleep apnea)28,29. Indirekte tiltak sympatiske nerve aktivitet (f.eks., BP, hjertefrekvens, katekolaminer nivåer) er ikke alltid egnet for studier av funksjonelle betydningen av CNS kjerner. Derfor representerer direkte måling av RSNA og mener arteriell trykket i bedøvet rotter en nyttig metode for funksjonelt, anatomisk definere kildene til avvikende sympatisk nyrefunksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Anne M. Fink er medlem av kunden Advisory Board for Data Sciences International.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Institute for sykepleie forskning (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).
