Summary
Métodos de medición de las respuestas simpáticas y cardiovasculares a las manipulaciones del sistema nervioso central (SNC) son importantes para el avance de la neurociencia. Este protocolo fue desarrollado para ayudar a los científicos medir y cuantificar los cambios agudos en la actividad nerviosa simpática renal (RSNA) en ratas anestesiadas (no supervivencia).
Abstract
Actividad nerviosa simpática renal (RSNA) y la presión arterial media son parámetros importantes en la investigación cardiovascular y autonómica; sin embargo, existen limitados recursos dirigir a científicos en las técnicas de medición y análisis de estas variables. Este protocolo describe los métodos para la medición de RSNA y la presión arterial media en ratas anestesiadas. El protocolo también incluye los métodos para acceder al cerebro durante grabaciones de RSNA para la manipulación del sistema nervioso central (SNC). Es compatible con la técnica de grabación de RSNA farmacológica, optogenetic, o estimulación eléctrica del SNC. El enfoque es útil cuando un investigador medir a corto plazo respuestas autónomas (min a h) en experimentos de supervivencia no correlacionan anatómicamente con los núcleos de la CNS. El enfoque no está diseñado para ser utilizado para obtener grabaciones de crónica (supervivencia) de RSNA en ratas. Descargas en RSNA, promediados rectificaron RSNA, y la presión arterial media puede ser cuantificados y analizados usando otras pruebas estadísticas paramétricas. También se describen métodos para obtener acceso venoso, la presión arterial media de grabación telemetrically y fijación de cerebro para futuros análisis histológico en el artículo.
Introduction
Los descubrimientos sobre el control autonómico del sistema cardiovascular informan estrategias para el manejo de trastornos tales como hipertensión, insuficiencia cardíaca y enfermedad renal crónica. Exceso de actividad del sistema nervioso simpático y disminución del tono vagal cardíaco contribuyen a la elevada presión arterial (PA)1. Crónicamente elevada salida simpática renal aumenta la secreción de catecolaminas y disminuye el flujo sanguíneo renal, con consecuencias deletéreas para los sistemas cardiovascular, renal2,3. Para definir las vías neurobiológicas que conduce a disfunción autonómica, estudios en roedores son importantes para determinar cómo las neuronas del sistema nervioso central (SNC) regulan parámetros comprensivos. El propósito de este protocolo es proporcionar información técnica sobre medición de la actividad nerviosa simpática renal (RSNA) y BP y delinear las técnicas para cuantificar cambios simpáticos agudos en respuesta a las manipulaciones del CNS en ratas anestesiadas.
Mediciones de RSNA (no sobrevivir) agudas (duración min h) son útiles cuando los científicos sonda el SNC farmacológicamente, eléctricamente, o optogenetically en anestesia ratas para determinar las funciones de los núcleos específicos. Utilizando estos métodos, estructuras como el núcleo solitario, sustancia gris, tegmentum pedunculopontino y médula ventrolateral rostral han sido investigados para definir caminos neurobiológicos que regulan parámetros simpático4, 5,6,7. Este enfoque es importante para la identificación de objetivos de CNS ser investigado más en modelos crónicos de la disfunción autonómica8,9. Para completar estos experimentos, el laboratorio requiere un soldador, microscopio quirúrgico, marco estereotáxicas, amplificador del microelectrodo y monitor audio. Dependiendo de los presentes en el laboratorio de factores que contribuyen al ruido eléctrico, la zona quirúrgica y grabación puede requerir un Faraday cage correa/conexión a tierra reducir el ruido eléctrico en la grabación de la RSNA. Si análisis de cerebro requerirá la fijación de tejido, una bomba y humo de la campana de la perfusión se requiere. Datos pueden ser digitalizados y grabado con varios software y datos fisiológicos adquisición (convertidor análogo-digital) unidades4,5, con opciones de diferentes análisis y compatibilidades para incorporar las señales telemétricas .
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Protocol
Todos los métodos descritos fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado Animal de la Universidad de Illinois en Chicago.
1. crear electrodos bipolares de RSNA
- Para crear el electrodo, corte dos trozos de alambre de acero inoxidable cada aproximadamente 18 mm de largo. Corte una pieza de polietileno (PE-50) tubería aproximadamente 15 mm de largo. Alimentación de dos piezas de alambre en el tubo, dejando el alambre que sobresalen de ambos extremos.
- Quitar el aislante de los extremos de los cables; Corte los hilos dejando 2-3 mm de alambre expuesto. En un extremo, apretar clavijas macho sobre el alambre expuesto. Los pernos firmemente en el alambre de la soldadura, asegurar los pernos dentro de una franja de conector y cubrir la conexión con resina epóxica.
Nota: Un enfoque alternativo que evita soldadura es utilizar pinzas de cocodrilo conectar/liberación rápida. - En el extremo opuesto del electrodo, quitar el aislante de los extremos de los cables, dejando 2-3 mm de alambre expuesto. Esta porción de los cables para crear pequeñas "V" en forma de ganchos en el alambre sin aislar de la curva.
Nota: Esta es la parte del electrodo que estará en contacto con el nervio simpático renal. Es importante sellar este fin para evitar que los líquidos entren en la tubería. Silicona o epoxy con eficacia puede utilizarse.
2. administrar anestesia y preparación quirúrgicos sitios
- Administrar anestesia a una rata de Sprague Dawley masculina (edad 9-11 semanas, 150-400 g de peso). Administrar pentobarbital sódico 50 mg/kg mediante inyección intraperitoneal (IP). Para determinar un plano estable de la anestesia durante la cirugía, revise el reflejo del pellizco del dedo del pie cada 15 min y volver a la dosis de anestesia según sea necesario.
Nota: Pentobarbital sódico (Nembutal) fue utilizado en estudios anteriores para lograr un plano sostenido de anestesia sin interferir con la modulación de la RSNA4,5,6. Este protocolo no es cirugía de supervivencia no hay ninguna recuperación/postoperatoria período de monitoreo. - Preparar el sitio quirúrgico según las pautas de cuidado institucional de los animales (es decir., afeitar el abdomen, la espalda y la cabeza de la rata, limpiar la piel con solución de povidona-yodo al 10%; Aplique lubricante de ojos; y colocar la rata en un cojín de calefacción). Mantener la temperatura corporal a 37 ° C durante los experimentos.
3. canule la vena Femoral (para acceso intravenoso)
- Añadir heparina a la solución salina estéril 0.9% (para conseguir 20 unidades/mL). Llene una jeringa de 1 mL con la solución salina heparinizada a través de una aguja de 22G. Conectar 15 cm de la tubería de PE-50 a la aguja y el tubo de llenado con la solución.
- Con la rata mentira supina, crear una incisión horizontal de 2 cm por la zona inguinal. Utilizando aplicadores con punta de algodón, disecar el tejido conectivo para exponer la vena femoral y la arteria. Para mantener la incisión abierta, o aplique solo-gancho elástico quirúrgico permanece asegurada para el campo quirúrgico con seda cinta o utiliza pinzas hemostáticas pequeñas.
- Use pinzas hemostáticas para doblar la punta de una aguja de 22G en un ángulo de 90° para servir como un catéter introductor de10.
- Visualizar los vasos bajo el microscopio. Separe suavemente la vena y la arteria utilizando fórceps curvado. Sutura de seda 5-0 lugar dos de 12 cm de largo debajo de la vena (uno distal y otro proximal); Coloque la sutura de la misma manera debajo de la arteria.
- Atar la sutura distal (inferior) para ocluir la vena; Fije los bordes de esta sutura en el campo quirúrgico mediante cinta de seda o pequeñas pinzas hemostáticas. Tire suavemente de la vena tenso pero no con tanta fuerza que conseguirá romper el recipiente. Posición de la vena perpendicular a la mano dominante del cirujano.
- Utilice un nudo medio volado suelto en la sutura proximal brevemente ocluir la vena. Con delicadas pinzas hemostáticas, suavemente la abrazadera esta sutura para ocluir el flujo sanguíneo. Sujete la aguja de 22G con la punta doblada en la mano no dominante; cierre el tubo con el fórceps con la mano dominante.
- Perfore un pequeño agujero en la vena con el introductor de catéter (paso 3.3) e inserte el tubo de PE-50 (previamente llenado con solución salina heparinizada) en el buque; utilizar la aguja doblada para mantener la abertura en el vaso abierto y para ayudar en el posicionamiento de la punta del catéter en el vaso10.
- Liberar la sutura proximal y suavemente enjuague 0,2 mL de solución salina heparinizada en la vena; Haga avanzar el catéter. Comprobar el retorno de la sangre de la vena para asegurar la colocación correcta. Completar el nudo proximal y, con el lazo de sutura distal, asegure la tubería dentro de la vena.
- Utilizar un acceso venoso durante los experimentos para la administración de medicamentos o anestesia complementaria y para recolección de sangre. Incorporan un conector de 3 vías si será necesario regulares infusiones intravenosas y muestras de sangre. Valorar anestesia Revise nocivo reflejo del pellizco del dedo del pie cada 15 minutos.
4. canule la arteria Femoral para el monitoreo de la Presión Arterial media
- Visualizar la arteria bajo el microscopio. Similar al método utilizado para la canulación venosa, atar la sutura distal (paso 3.4) para ocluir la arteria; Fije los bordes de esta sutura en el campo quirúrgico con cinta de seda y coloque la arteria perpendicular a la mano dominante del cirujano.
- Acceso arterial si utiliza un sistema de infusión/transductor de presión
- Conectar el transductor de presión/tubo a una bolsa de solución salina de 0,9% de 500 mL. Lave el tubo con solución salina, quitar todas las burbujas y coloque la bolsa dentro de una bolsa de inductor de presión para presurizar el sistema.
- Como se describe en el paso 3.1, llene una jeringa de 1 mL con la solución salina heparinizada a través de una aguja de 22G y conectar 15 cm de PE-50 a la aguja (al ras de tubos con solución salina heparinizada).
- Utilice un nudo medio suelto en la sutura proximal brevemente ocluir la arteria. Sostenga el introductor de catéter (paso 3.3) en la mano no dominante; Sostenga la punta distal de la PE-50 con fórceps de canulación de vasos en la mano dominante. Perfore un agujero en la arteria con la aguja de 22G doblada e Inserte la cánula en el vaso.
- Liberar la sutura proximal, con suavidad al ras 0,2 mL de solución salina heparinizada en la arteria y haga avanzar el catéter lo más lejos posible. Ver para volver a asegurar la colocación correcta de la sangre arterial. Completar el nudo proximal y, con el lazo de sutura distal, asegure la tubería dentro de la arteria. Conectar la línea arterial para el transductor de presión/tubería.
Nota: La porción distal del tubo puede ser adherida con cinta al miembro posterior de la rata para garantizar la línea arterial. Un enfoque alternativo para la canulación de la embarcación es descrito por Jespersen et al.; 11 que protocolo de su diferencia mediante el uso de retractores para extender la incisión, pegamento-algo de sutura para asegurar la tubería y el enfoque no incluye el introductor aguja doblada.
- Acceso arterial si usando telemetría
- Inspeccione el catéter sensor de presión bajo alta ampliación antes de la canulación arterial. Asegúrese de que el catéter esté libre de burbujas/escombros y tiene un menisco intacto entre la llena de líquido (proximal) y componentes (distales) rellenos de gel. Antes de cada implantación, rellenar el gel en la punta distal del catéter. Encienda el transmisor utilizando un imán; monitor BP durante la cirugía para soportar una colocación perfecta.
- Utilice un nudo medio volado suelto en la sutura proximal brevemente ocluir la arteria femoral. Sostenga el introductor de catéter (paso 3.3) en la mano no dominante. Sostenga la punta de la cánula de la unidad de telemetría con pinzas de la canulación de la embarcación para evitar desplazar el gel de la punta.
- Perfore un agujero en la arteria con la aguja de 22G doblada e Inserte la cánula en la arteria con unas pinzas de la canulación de la embarcación para evitar desplazar el gel de la punta. Avanzar la cánula lo más lejos posible. Con los lazos de la sutura proximal y distal, asegure el catéter de presión.
- Meter el cuerpo del implante telemetría dentro el flanco adyacente a la incisión y cierre esta incisión con sutura de nylon 4-0 en una aguja de corte. Apague los dispositivos de telemetría por el imán en la conclusión del período de registro para conservar la duración de la batería.
5. colocar la rata en el marco de la cirugía estereotáctica para acceder al cerebro
- Mueva suavemente la rata en la posición prona en el marco de la cirugía estereotáctica.
- Coloque la rata entre las barras de la oreja y ajustar la barra de incisivos para igualar la altura de lambda y de bregma. Posicionamiento puede depender de la cepa de rata, peso y ubicación de objetivos del CNS.
- Hacer una incisión de bisturí rostrocaudal de 2 cm a través de la línea media del cuero cabelludo. Firmemente utilizando aplicadores con punta de algodón, retirar tejido conectivo de la superficie del cráneo. Aplicar peróxido de hidrógeno en el cráneo para ayudar a visualizar el bregma, lambda y las suturas de la línea media.
- Utilizando un atlas del cerebro de rata para guía dirigida a12, una osteotomía de agujero de las rebabas del taladro, tamaño para el acceso del electrodo, a través del cráneo.
6. aislamiento de los nervios simpáticos renales
- Conecte el electrodo tubular RSNA (pasos 1.1-1.3) a un 10 X preamplificador y amplificador de microelectrodos.
- Aislar los nervios renales a través de una incisión retroperitoneal antes o después, la rata está asegurada en el marco estereotáxicas. Coloque los electrodos de la RSNA una vez que la rata está en el marco estereotáxicas. Hacer un bisturí incisión que se extiende desde 4-5 cm debajo de las costillas en dirección caudal, ligeramente lateral a la columna vertebral. Blunt diseccionar la incisión para visualizar los músculos del paraspinal.
- Utilice tijeras para hacer una incisión de 1-2 cm muy superficiales rostrocaudal donde la grasa se encuentra con el músculo. Utilizando aplicadores con punta de algodón, se separó la grasa de los músculos para visualizar el riñón. Es importante no entrar en el espacio peritoneal.
- Utilizar separadores para separar suavemente el riñón de los músculos paraespinales para visualizar la arteria renal y aorta abdominal. No estire los vasos excesivamente para evitar daños en los nervios renales. Usar una almohadilla de Gasa de algodón de 2 "x 2" empapada en solución salina para proteger el riñón de la lesión.
- Bajo alta ampliación, identificar los nervios renales en el bolsillo de la incisión. Los paquetes del nervio son más fácilmente visibles en el ángulo recto formado por la aorta y la arteria renal. Los nervios renales siguen de cerca la arteria renal desde la aorta a los riñones.
- Seleccione un segmento del paquete del nervio que se colocará en el electrodo de la grabación. Suavemente se disecan las fibras nerviosas del tejido circundante/depósito con unas pinzas de disección micro.
- Asegurar el electrodo de alambre RSNA en un soporte (por ej., una pinza unida a un soporte). Bajar el electrodo hasta el nivel del segmento del nervio. Use un gancho de nervio para levantar suavemente el segmento del nervio renal sobre el electrodo sin estirar el nervio.
Nota: El nervio debe descansar dentro de dos "V" en forma de ganchos en el alambre sin aislar, paralelo al nervio. Los cables del electrodo no deben tocar ningún otro tejido, sangre o linfa. - Llene la incisión con aceite mineral para evitar que el nervio simpático renal expuesto seco. Utilizar una pinza de puesta a tierra con un extremo en la piel de la incisión y el otro conectado a la jaula de Faraday.
- Direccione la señal a los amplificadores con alta - y baja-pass filtrado (10 Hz y 3 kHz). Ajustar la ganancia hasta 10 K. incluye un monitor de audio para evaluar el patrón de estallido de la RSNA. Utilizar frecuencias de muestreo que oscilan entre los 2.000-10.000 Hz4,5,6,7,8. Utilizar un muestreo mayor cuando una manipulación del CNS se presume para causar respuestas simpáticas breve rápido.
7. registro de datos
- Evaluar la calidad de la grabación de RSNA evocando el baroreflejo con la inyección de un bolo de 1 mL de solución salina o fenilefrina 10 de μg/mL (en 0,1 mL) por vía intravenosa. Como se ilustra en la figura 1, la infusión debe aumentar BP e inhiben la RSNA. Un aumento en la presión arterial media de 60-80 mmHg es suficiente para sympathoinhibition renal4,13,14.
- Ajustar la posición de los electrodos para mejorar la señal si es necesario. Reposicionamiento es necesario si el nervio no está en contacto con dos ganchos en el electrodo o cualquier tipo de tejido, sangre o linfa fluido está en contacto con los cables.
Nota: La necesidad de reposicionamiento se basa en las características auditivas de las descargas del nervio.- Si las ráfagas de RSNA no suceden cíclicamente con el ciclo cardiaco, y si hay cualquier interferencia en la grabación, luego cuidadosamente vuelva a colocar el electrodo.
- Como movimientos respiratorios también pueden afectar la calidad de la grabación de RSNA, mejorar la señal moviendo suavemente el electrodo en una posición donde los movimientos del músculo no rompen el electrodo durante la respiración.
- Una vez que se obtiene una señal clara, fije el electrodo de la RSNA en lugar retirando el aceite mineral y aplicar un gel de silicona para cubrir la conexión del nervio/electrodo en el bolsillo de la incisión. No mueva la rata antes de que el gel se ha establecido completamente.
- Realizar protocolos de manipulación de CNS mientras graba continuamente RSNA y presión arterial media. Si se utiliza un emisor de microinyectora para la manipulación de la médula oblonga, una señal lógica de este dispositivo se puede introducir en las grabaciones de RSNA/BP para documentar el momento de las manipulaciones del CNS.
- Al terminar el experimento, determinar el nivel de ruido por aplastamiento del nervio proximal a los electrodos de la grabación entre el gel de sílice y el muscular. Registro de al menos 30 s de este valor "cero" por RSNA4,5,6. Como un enfoque alternativo para el ruido de cuantificación, administrar un bloqueador ganglionar de acción corta tales como atropina, hexametonio, chlorisondamine o pentolinium tartrato8,15,16, 17.
- Con cuidado retire el electrodo RSNA y eliminar cualquier rastro de gel de silicona de los electrodos de alambre. Guardar el electrodo para su reutilización. Apague el transmisor de telemetría y eliminarlo, tomando cuidado para no dañar la punta del catéter.
8. eutanasia (transcardíaco perfusión)
- Identificar las ubicaciones de las manipulaciones del CNS mediante la inyección de colorantes o fluorocromos, creando lesiones electrolíticas, o mediante la detección de la expresión c-fos.
- Si análisis de cerebro requieren fijación, prepara la rata transcardíaco perfusión. Evaluar el reflejo del pellizco del dedo del pie para asegurar que la rata sigue siendo profundamente anestesia. Proporcionar anestesia suplementaria si es necesario. Realizar perfusión transcardíaco de fijador de paraformaldehido en una campana de humos.
PRECAUCIÓN: Irritante de la piel, ojo ávido. - Inserte el tubo en la bomba de perfusión y el primer con solución salina normal 0.9%.
- Hacer una incisión lateral de 5-6 cm a través de la piel y la pared abdominal inmediatamente por debajo de la caja torácica y abrir la cavidad torácica. Separar cuidadosamente el hígado del diafragma. Hacer una pequeña incisión en el diafragma con curva tijeras embotadas. Inyectar 0.1 mL de heparina en el ventrículo izquierdo.
- Pasar una aguja de perfusión hacia el ventrículo izquierdo (una aguja de sonda de acero inoxidable funciona bien para este paso) o pinchar en el corazón o cortando una pequeña incisión utilizando unas tijeras afiladas y pasando la sonda de aguja a través de la punta es visible a través de la pared de la aorta (pero no no debe llegar hasta el arco aórtico). Utilizar una pinza quirúrgica o eléctrica para asegurar la aguja en el lugar.
- Usando una bomba de infusión, administrar solución salina normal 0.9% (temperatura ambiente). Inmediatamente crea una incisión de 2-3 mm en la aurícula derecha para crear una salida para el enjuague de solución salina. No corte la aorta descendente. Continuar el enjuague de solución salino hasta que el color del hígado cambios de marrón a amarillo pálido, una infusión de aproximadamente 400 mL durante 2-3 min.
- Parar la bomba. Cambiar la solución para el fijador (por ej., 10% formalina o 4% paraformaldehído); 400 mL de infundir más de 2-3 minutos retirar el cerebro y almacenar la muestra en solución fijadora durante la noche a 4 ° C antes de transferir el tejido a 30% de sacarosa (30 mL de sacarosa disuelto en 100 mL de solución salina con tampón fosfato de 0,1 M) de al menos 3 días o hasta que el cerebro se hunde , para crioprotección antes cryogenetic seccionamiento18.
9. analizar los datos
- Onda completa rectificación la RSNA cruda para obtener valores absolutos. Onda completa rectificación un segmento s 10 de la señal de ruido crudo. Es importante excluir los estudios que se vieron afectados por una baja relación señal a ruido. En estudios de cuantificación de la RSNA, los investigadores aplicaron criterios a priori como exigir señal a proporción de ruido exceda de 2:1 6:117,19,20.
- Calcular la media rectificado RSNA para segmentos no superpuestos (μV) y resta la estimación del ruido (μV). Dependiendo de los objetivos del experimento, los investigadores pueden seleccionar intervalos de 10 s (figura 1) o 1 s. calcular significa por medio de opciones de análisis de forma de onda en el software fisiológico o exportar los datos a hojas de cálculo para calcular promedios para intervalos de tiempo seleccionados.
- Para normalizar a través de diferentes animales, expresan valores para su posterior análisis como el cambio porcentual desde el inicio. Usar estadística paramétrica para llevar a cabo las comparaciones de grupo.
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Representative Results
La figura 1 ilustra una grabación muestra RSNA y BP de una rata anestesiada de Nembutal. Una inyección intravenosa de fenilefrina fue utilizada para inducir un aumento en la presión arterial media y evocar el barorreflejo y transitorio sympathoinhibition4,6. Para cuantificar la RSNA, la RSNA cruda fue rectificada y promediada para los segmentos sin traslapo 10 s; la estimación del ruido fue restada de cada segmento.
Figura 1: RSNA y BP en respuesta a la inyección de fenilefrina IV. La RSNA cruda (A) era de onda completa rectificada (B); rectificado machacado "cero" RSNA se muestra en el recuadro C. Se calcularon los promedios de s 10 no superpuestos (menos ruido) (D). Para evocar el barorreflejo, 0,1 mL de fenilefrina (1 μg/mL) fue inyectado por vía intravenosa (en la flecha). La infusión de bolo produce un aumento abrupto en la BP e inhibición transitoria de la RSNA. Esta figura fue adaptada de AM de Fink, Dean C, señor Piano, Carley DW. El tegmentum del pedunculopontine controla actividades cardio-respiratorio en la rata anestesiada de Nembutal y actividad nerviosa simpática renal. PLoS One. 2017; 12 (11): e01879564. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pasos críticos para la medición de RSNA incluyen: (1) evitar el estiramiento de la arteria renal y los nervios al separar el riñón de los músculos del paraspinal y al colocar el segmento del nervio en los electrodos de la grabación, disección (2) cuidadosamente las fibras del nervio renales desde el tejido circundante/buque, (3) asegurar que los cables del electrodo están libres de tejido, sangre o linfa y (4) prevenir el nervio de la desecación mediante la aplicación de aceite mineral para el nervio renal y el gel de silicona a la unidad de electrodo del nervio. Para la solución de problemas, es importante asegurarse de que el sistema de grabación está adecuadamente conectado a tierra. Para obtener una señal clara de la RSNA, la posición del electrodo puede ajustarse cuidadosamente al visualizar y escuchar la señal cruda de RSNA, antes en gel de sílice. Culminación exitosa de los resultados de la cirugía en una señal RSNA que puede ser modulada por las manipulaciones del CNS para los experimentos que dura varias horas.
Al interpretar los resultados, los investigadores deben considerar la influencia de la anestesia en la presión arterial media y RSNA. Este protocolo utiliza anestesia barbitúricos (pentobarbital sódico), que puede reducir la presión arterial media y modificar respuestas autónomas21. Según el experimento objetivos, otras formulaciones inyectables o anestesia inhalatoria (mediante cono de nariz o traqueostomía) puede ser utilizado22. Los investigadores pueden considerar alternativas como uretano23 y alpha-chloralose24. Estos agentes tienen menos impacto en embotar reflejos cardiovasculares pero pueden plantear riesgos de salud potenciales para el investigador.
Además de los métodos descritos en este protocolo, distintos criterios han sido utilizados por otros laboratorios para el registro y fabricación de electrodos. RSNA puede grabarse utilizando acero inoxidable4,9, plata25o alambre de platino26 . Además de elevación del segmento del nervio expuesto en el hilo, científicos con éxito registraron monofásicos que RSNA en los extremos centrales de corta los nervios simpáticos renales26. Flexibilidad es diferente en base a la fuerza extensible del alambre (medido con unidades de kPSI). Más alambre kPSI es más frágil pero conserva su forma; kPSI baja el alambre es más flexible y menos propensos a romperse al doblarse repetidamente. Para las grabaciones de la RSNA, es importante seleccionar un cable que puede ser fácilmente doblado y de nuevo durante las grabaciones. El cable no debe ser demasiado flexible, lo que es difícil crear ganchos para colocar bajo el nervio, pero no demasiado duro. Este último aumenta el riesgo de estiramiento y dañar los nervios. Nuestro laboratorio utiliza alambre de acero inoxidable con kPSI 155-185.
Existen muchos enfoques para el análisis de la RSNA. En lugar de los promedios de 10 segmentos de la grabación de s de cuantificación y cálculo de las diferencias como el porcentaje cambio, RSNA puede determinarse mediante la cuantificación de ráfaga frecuencia4,26,27. Este enfoque puede ser preferido cuando los niveles basales y magnitudes de las respuestas de la RSNA difieren entre las ratas en un estudio de15,26. Otro enfoque consiste en la rectificación y la integración de la señal de la RSNA; la amplitud de la RSNA (medida en mV) se suma sobre un intervalo de tiempo seleccionado (por ej., ms 20)15,26. Un integrador se aplica un filtro de fase baja y proporciona la amplitud de descarga media durante ráfagas de actividad superior a la constante de tiempo (por ej., > 20 s)15,27. Señales integradas son útiles para examinar la amplitud y fase de la RSNA, pero este enfoque no proporciona información sobre los cambios oscilatorios. Cuando los investigadores examinan las oscilaciones de la RSNA se han aplicado métodos de dominio de dominio y tiempo de frecuencia. El enfoque utilizado con frecuencia para RSNA es la rápida transformación de Fourier (FFT), que clasifica a una señal en sus oscilaciones sinusoidales, cada una con distinta amplitud y fase20,26. FFT es un enfoque útil para examinar las explosiones de baja y alta frecuencia en la RSNA y para estudiar la modulación respiratoria y cardiaca de la señal de la RSNA.
Los métodos en este protocolo son importantes para abordar la hipótesis sobre la significación funcional de los núcleos de la CNS. Los nervios simpáticos renales dirigen comunicación neuronal entre el CNS y el riñón, y por lo tanto, cambios agudos en la RSNA representan una variable importante en la investigación cardiovascular. Definir mecanismos de CNS regulación simpática de la salida es un área de investigación prioritaria, teniendo en cuenta que sympathoexcitation renal contribuye a la fisiopatología y presentación clínica de muchas enfermedades (por ej., enfermedad crónica del riñón, corazón insuficiencia, arritmias, diabetes mellitus y apnea obstructiva del sueño)28,29. Medidas indirectas de actividad comprensiva del nervio (e.g., BP, variabilidad del ritmo cardíaco, los niveles de catecolaminas) no siempre son adecuados para los estudios sobre la significación funcional de los núcleos de la CNS. Por lo tanto, la medición directa de RSNA y la presión arterial media en ratas anestesiadas representa un valioso método para anatómicamente, funcionalmente definir las fuentes de la función simpática renal aberrante.
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Disclosures
Anne M. Fink es miembro del Consejo Asesor de clientes de datos internacional de Ciencias.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de investigación en enfermería (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
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