Summary
نقدم استخدام الفحص المجهري 2-فوتون مكان ميكروبيبيتي داخل الفضاء بومان في المسالك البولية في الفئران، الجمع بين تقنيات التأسيسية 2 الفسيولوجيا الكلوي. استخدام الفحص المجهري 2-فوتون يتغلب على القيود الحرجة للفحص المجهري التقليدي للدراسات فيزيولوجيا الكلي ميكروبونكتوري.
Abstract
ميكروبونكتوري الكلوية والتصوير 2-فوتون الكلوي تقنيات المنوي في فيزيولوجيا الكلي. ومع ذلك، ميكروبونكتوري محدودة بالاعتماد على الفحص المجهري التقليدي لميزات كليون السطحية، وتقتصر الدراسات 2-فوتون في أنه لا يمكن تقييم التدخلات في الجهاز، بدلاً من مستوى كليون. على وجه الخصوص، قد واجهت تحديات الدراسات ميكروبونكتوري من جلوميرولي الفئران بندرة glomeruli السطحية في الفئران. لمعالجة هذا القيد من أجل مواصلة الدراسات aspirate من الفضاء بومان في النماذج الفسيولوجية الماوس، قمنا بتطوير ميكروبونكتوري 2-فوتون الكبيبي. ونقدم إعداد جراحية رواية التي تسمح بالوصول الأفقي للكلى مع المحافظة على العمود التصوير الرأسي المطلوب للفحص المجهري 2-فوتون. الإدارة من ارتفاع الوزن الجزيئي fluorescein isothiocyanate (فيتك)-ديكستران هو استخدامها لتقديم المفرج الكلوي ومن ثم glomeruli مرئية لتصوير 2-فوتون. ثم قدم ماصة المغلفة دوت كم تحت توجيه المناظير باستخدام الأشعة على الكبيبة اختيارهم من العديد العديد من التي قد يمكن تصور داخل إطار التصوير. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم تفاصيل إعداد المواد والوسائل اللازمة للقيام بهذا الإجراء. ويسهل هذا الأسلوب سابقا من المستحيل دراسة الفسيولوجي الكلي، بما في ذلك استرداد فيلتراتي من الفضاء بومان في وجميع قطاعات كليون حدود عمق التصوير، حوالي 100 ميكرون أسفل الكبسولة الكلوي. الضغط والاتهام وتدفق كل ما يمكن قياس استخدام ماصة أدخلت. هنا، نحن نقدم بيانات تمثيلية من السائل اللوني/قياس الطيف الكتلي على aspirate من الفضاء بومان. ونحن نتوقع هذا الأسلوب إلى انطباق واسع في التحقيق الفسيولوجي الكلي.
Introduction
والغرض من هذا الإجراء توفير الوصول ميكروبونكتوري الروتينية إلى الفضاء في بومان وغيرها من الهياكل الكبيبي في الفئران. الدراسات ميكروبونكتوري لفيزيولوجيا الكلي كانت محدودة للفحص المجهري 1-فوتون، التي يمكن فقط صورة داخل بضعة ميكرونات من السطح الكلي، والذي يوفر دقة محدودة في z-البعد. نظراً لأن الفئران قد glomeruli السطحية القليلة، أنها ليست دائماً من الممكن العثور الكبيبة سطحية بالفحص المجهري 1 فوتون، ولذلك أجريت معظم الدراسات ميكروبونكتوري في ميونيخ ويستار، الذي قد glomeruli السطحية أكثر عددا. ولذلك، كانت محدودة فوائد العمل في النماذج الماوس في ميكروبونكتوري الدراسات1،،من23. التقدم الذي أحرز مؤخرا في التصوير التكنولوجيات، بما في ذلك،الصغرى-ط45، عززت نانوحبيبات التصوير6، والتصوير الطيف الكتلي7 إلى حد كبير المجموعة من الطرائق المطبقة لفسيولوجيا الكبيبي، ولكن ولا يزال هناك ليس بديلاً عن فريدة من نوعها توفر القدرة على التدخل وعينه أن ميكروبونكتوري. ولتوسيع نطاق استخدام ميكروبونكتوري استخدام التقنيات المعروضة هنا من المتوقع أن يسهل الدراسات فيزيولوجيا الكلي الرواية، على وجه الخصوص، تقييم محتوى filtrate الكلوي (أي، جميع) وعلم وظائف الأعضاء الأساسية من الفئران المعدلة وراثيا، مثل قياسات الضغط filtrate والاتهام، كان يقوم فقط بالنسبة للفئران.
في هذا الأسلوب، يتيح استخدام الفحص المجهري 2-فوتون ميكروبيبيتي الوصول إلى هياكل الكلي يصل إلى حوالي 100 ميكرومتر والتصور أدناه كبسولة الكلي. ولذلك متاحة متعددة (5 – 10) جلوميرولي إلى ميكروبونكتوري في كل الكلي الماوس تصويرها حتى الآن. على الرغم من أن هذا الأسلوب تشاطر بعض الميزات مع ميكروبونكتوري الكلوي التقليدية، وكان المصممة حيثياته وتعديلات واسعة من تقنيات تقليدية مطلوبة. في هذا البروتوكول وإظهار الطموح للسائل من الفضاء بومان في، وإظهار مثال نتائج التحليل اللاحق مع الطيف الكتلي (نانوبروتيوميكس)8،9،،من1011. يتطلب استخدام الطيف الكتلي المصب سير إعداد عينة متخصصة، التي كما يتضح هنا.
Protocol
وافق جميع الإجراءات الموضحة هنا برعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام من ولاية أوريغون للصحة والعلوم بجامعة.
1-الإعداد المستخدمة للمظاهرة
- استخدام وحدة تحكم مرحلة 3-المحور وحامل هيدستاجي/ماصة، مجهر 2-فوتون تستقيم ووحدة تحكم 3-محور لحامل هيدستاجي/ماصة؛ مطلوبة من كل أربعة من هذه العناصر.
ملاحظة: تتوفر العديد من الأجهزة المماثلة وسوف يكون كافياً طالما تتوفر مستقلة التحكم 3-محور الكمية المرحلة ماصة والمجهر، والمجهر يتم إعداده لتصوير تستقيم في فيفو .
2-المواد اللازمة قبل البدء بالبروتوكولات التجريبية
- استخدام فيتك-ديكستران، 2,000,000 دا، حل 5% في المحلول الملحي العادي أو مخزنة الفوسفات المالحة لحقن ريتروربيتال بمناسبة المفرج الكلوي. يتم تحديد هذا الوزن الجزيئي (ميغاواط) لأنه لا يزال في المفرج وعدم تصفية.
- آلة سحب زجاج البورسليكات ميكروبيبيتيس: سحب ميكروبيبيتيس إلى 6 – 10 ميكرون تلميح استخدام إعدادات نصيحة تفتق منذ فترة طويلة، ومغلقة (مثل الحرارة = 610، السرعة = 150، وقت = 250 مللي ثانية، يحلق) على ساحبة ميكروبيبيتي. مجسم مشطوف الحواف إلى 45° واللهب-البولندية طفيفة.
- طلاء الكم-نقطة من ميكروبيبيتيس: معطف نصائح ميكروبيبيتي مع نقاط الكم وفقا للبروتوكول المشار إليه. 12
- الدعم الكلي Polysiloxane/فاصل. استخدم المعجون polysiloxane للحرف دعم الكلي/فاصل. أزياء 1 × 1 سم2 من 5 مم سميكة المعيني الزاوية اليمنى (أي، مكعب مبتوراً) من المعجون بوليسيلوكساني. إزالة الأوسط 70% من بوليسيلوكساني من حافة واحدة ودائرة تضم حوالي 70% مركز المعيني. السماح polysiloxane الجافة ح 24. انظر الشكل 1.
- إعداد ميكروينجيكتور: بريفيل طول الأنابيب المصنوعة من البولي إيثيلين (PE)-50 وحامل ميكروبيبيتي ميكروبيبيتي محملة بالنفط. إذا كان من المعتزم الكتلي، بيروفلوروديكالين مطلوب، وإلا يمكن استخدام الزيوت المعدنية. إعداد ميكروينجيكتور بحقنه من نوع هاملتون والتعبئة مع بيروفلوروديكالين الغاز محكم. هذا وسوف تكون متصلاً الأنبوب PE-50 وحامل ماصة.
- طرأت الماصة صاحب ماصة وقدما ملء الأنبوب PE-50 وماصة، ثم إرفاق نهاية الدانية من 50 PE أنابيب للمحاقن هاملتون المملوءة بالنفط، وخلق نظام هيدروليكي من ماصة المحاقن.
3-الأفقي ماصة الوصول إلى الكلي أدناه سائل التصوير العمود عن طريق إجراء العمليات جراحية رواية
ملاحظة: الجمعية العامة لدعم نظام التصوير والإعدادية الجراحية يرد في الشكل 1. يتم تنفيذ الإجراء الموضح في الفئران C57BL/6 وزنها 20 – 25 ز.
- وزن الماوس.
- حمل التخدير باستخدام إيسوفلوراني 4% والاحتفاظ بها مع isoflurane 1.5 – 2.5% في مزيج الهواء/الأكسجين. تأكد من أن الماوس يتم تخديره بعدم وجود استجابة لحافز مؤلمة وانخفاض معدل التنفس.
- تليين العينين وموقف الجانبية الحيوانية على اللوح الأساس. شل الأطراف 4 باستخدام الشريط.
- حقن المحلول الملحي العادي، 200 ميليلتر، تحت الجلد ووضع مجس درجة حرارة المستقيم. مراقبة درجة الحرارة باستخدام مصباح تدفئة أثناء الجراحة ووسادة تدفئة أثناء التصوير.
- قم بإزالة جميع الشعر على الجانب الأيمن من الماوس باستخدام كريم مزيل الشعر.
- موقع الطحال، الذي يكون مرئياً تحت الجلد، وتحديد موقع استئصال كليته اليسرى في الجهة الظهرية ووالذيليه من الطحال.
- جعل شق 0.5 سم في الجلد وشق أصغر في الصفاق، ما يكفي للكلى للمضي قدما بسهولة.
- بثق الكلي مع ضغط لطيف. وضع النموذج مثبت الكلي مع بوليسيلوكساني حول الكلي والإصلاح بمادة لاصقة cyanoacrylate. الكلي مع خط فاصل حيث أن السطح الجانبي-معظم الكلي يمتد إلى أبعد من استقرار بحوالي 1 ملم.
- إصلاح لوحة رأس بشكل مثبت مع الغراء وجبل لوحة الرأس لتركيب القضبان على الصفيحة القاعدية.
- سد البئر في دعم بوليسيلوكساني المحيطة بالكلى مع الحل 1% [اغروس] ومكان ساترة 10 ملم في الأعلى وحتى [اغروس] الراسخ. ختم ساترة للوحة الرأس مع الغراء وإنشاء حلقة حول ساترة مع الأسمنت الأسنان.
- حقن فيتك-ديكستران (دا 2,000,000، حل 5%، 100 – 150 ميليلتر) أوربيتالي الرجعية ونقل لوحة الماوس والتثبيت إلى مرحلة مجهر 2-فوتون بسرعة، المحافظة على التخدير وضمان كاف النفايات غاز المسح على المسرح المجهر.
4-انتقاء مناسبة الكبيبة وماصة الوصول إلى الفضاء بومان
-
التعاريف:
- تعريف X كالتي تواجه المجهر اليسار واليمين واليسار واليمين على الشاشة
- قراءة ساكس (المرحلة العاشرة) من وحدة تحكم المرحلة
- تعريف مقصف ماصة العاشر، على ماصة الاتصال بوحدة تحكم
- تعريف Y على الشاشة من أعلى إلى أسفل وإلى الأمام نحو المجهر والعودة نحو الإعداد 2-فوتون
- تعريف Z كما يصل نحو السقف، نزولا نحو الأرض، ويقاس على المسرح مع موقف الهدف Z.
- تعريف ق (س) Z كذروة المرحلة (حقاً الهدف).
-
العثور على السطح الكلي، يمكن تحديدها باستخدام إعدادات تصفية البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في العين. بسبب حقن فيتك-ديكستران، سيكون المفرج أخضر ساطع.
- التعرف الكبيبة مناسبة. بعد تحديد السطح الكلي العين باستخدام، قم بالتبديل إلى 2-فوتون (الوضع غير المسح) واستكشاف نافذة التصوير. خصائص مواتية ميكروبونكتوري فيما يلي: المسافة العمودية أدناه ساترة > 30 ميكرومتر (لمنع التصادم بين ماصة وساترة أثناء الوصول) والأفقي المسافة بين كبسولة الكلي الأفقي الكبيبة < 400 ميكرومتر (خارج هذه المسافة قد يزيد هذا الانحراف الماصة احتمال الموت).
- سجل الجانبي والمسافة العمودية إلى ثقب نقطة، ونقطة في الكبسولة الكلوية مباشرة إلى الجانب الماصة الكبيبة.
- رفع هدف الوصل في عمود الماء، حفظ x و y إحداثيات المرحلة دون تغيير، على مسافة من فقط حوالي السنتيمتر.
- محرك طرف الماصة في عمود الماء وتشغيل 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) الإثارة. نقل أبعاد ماصة x و y لنقطة الأسفار القصوى من الطرف، وسيكون هذا مركز الهدف. من الصعب العثور الماصة في العين دون هذا للط دقيقة. لأن النقاط الكم فلوريس في الطول الموجي نفسه (في هذه الحالة، أحمر) بغض النظر عن الطول الموجي الإثارة، الإثارة DAPI ينتج fluorescence الحمراء التي يتركز مشددة على الحافة، هو موضح في الشكل 2.
- تغيير إعداد الإثارة للبروتين الأحمر نيون (RFP) وتصور الماصة في العين، ثم أنها مركز الضبط في رأي العين.
- قم بالتبديل إلى 2-فوتون والعثور الماصة تحت 2-فوتون، وضعه في مركز الصورة تحديداً. وهذا هو موقف التسجيل.
- حفظ صورة الماصة.
- سجل المرحلة واحداثيات جهاز تحكم ميكروبيبيتي.
ملاحظة: استخدام ملف.html التكميلي، الذي سيقوم بتنفيذ العمليات الحسابية باستخدام شفرة جافا سكريبت، (المفيد في النظم التي لا تملك برامج جداول البيانات المثبتة) أو جدول بيانات لحساب الإزاحة بين إحداثيات المرحلة وماصة، وإلى حساب إحداثيات الهدف لوحدة تحكم ماصة. - إزالة الماصة من عمود الماء في المحور س، إبقاء z و y نفسه.
- نقل ماصة Z إلى الكبيبة الهدف Z (أي، نقل الماصة أسفل في اتجاه Z أدناه ساترة)
- نقل ماصة Y إلى إحداثيات الكبيبة Y الهدف.
- نقل عرض ناري 2-فوتون إلى الكبيبة الهدف Z، ومن ثم إلى الحافة للكلى، وملاحظة ساكس.
- حساب حافة الكلي مقصف استخدام الإزاحة من تسجيل SX.
- نقل المرحلة نحو الماصة (الزيادة ساكس) مثل حافة الكلي الآن على الجانب الأيمن الشاشة، ولكن لا تزال مرئية.
- النهوض الماصة بسرعة إلى حوالي 100 ميكرومتر أقل من حافة الكلي مقصف المحسوبة أعلاه.
- تحديد تلميح ماصة، تتقدم الماصة ببطء. زيادة المكسب الحمراء ومشاهدة الرسم البياني الأحمر بكسل (بكسل توزيع التحولات قبل أن يتم تصويرها الماصة في الإطار، بسبب السطوع المتطرفة من النقاط الكم والأسفار خارج الهدف).
- المضي قدما إلى حافة الكلي تحت يعيش 2-فوتون التصوير.
ملاحظة: قبل دخول كبسولة الكلي، من الممكن إعادة توجيه الماصة في أبعاد Y و Z. ولكن هذا قد كسر طرف ماصة. تدبير أكثر تحفظا، إذا كان الماصة قبالة الهدف، هو الانسحاب في البعد س يصل إلى 2 سم وإعادة توجيه ثم العودة في البعد س إلى حافة الكلي. بمجرد الماصة داخل الأنسجة، الحركة في أي محور خلاف س يؤدي إلى الانحناء ماصة الذي يتطلب خبرة كبيرة لجعل استخدام، وكثيراً ما يؤدي إلى الكسر. - محرك الماصة في المحور س ببطء إلى الهدف يسرق مقصف، إبقاء عين على ساكس. (من المفيد أحياناً العودة إلى الكبيبة لمعرفة إذا كان قد تحول على الإطلاق عند الإدراج ميكروبيبيتي).
- عندما كنت في الموقع الصحيح، موضع المستند مع كومة z.
ملاحظة: مع ميكروبيبيتي في المكان، المخدرات، والبروتينات، أو تتبع الفلورية قد يكون حقن، وقد يستنشق السائل لتحليلها في وقت لاحق، أو يمكن قياس الضغط أو تهمة بالنسبة إلى قطب كهربائي آخر.
5-التطلع للسائل من الفضاء بومان
- تعيين ميكروبومب حقن 100 nL بيروفلوروديكالين أكثر من 2 دقيقة لضمان سالكيه ماصة وتقليل الخلط من ماصة يسد أثناء دخول. Reimage لضمان موقف ماصة.
- الانتظار حتى 4 – 6 دقيقة لتنقية إضافية.
- تعيين ميكروبومب نضح تصل إلى 300 nL بمعدل يصل إلى 50 nL/دقيقة.
ملاحظة: التغييرات في مورفولوجيا الكبيبي لا تراعي بهذا المعدل، مما يوحي بأنها لا تغير معدل التسليم السائل إلى الفضاء خلال الطموح. كما أن هناك لا كتلة النفط كما هو الحال في ميكروبونكتوري التقليدية، ويمكن أن تشمل استرداد وحدة التخزين هذه، اللازمة الكتلي، بعض حقن بيرفلوروديكالين والسوائل ربما أنبوبي. لفحوصات مثل القطب أيون تراعي قياسات fluorescence التحليل الطيفي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل ونقاط النهاية الحساسة الأخرى، يمكن استخدام كميات أقل. إذا لم يكن الكتلي نقطة النهاية، يمكن استخدام الزيوت المعدنية والتقنيات ميكروبونكتوري القياسية لقياس حجم يستنشق قبل التخزين. - الصورة مرة أخرى.
- سحب الماصة والحفاظ على العينة، مشيراً إلى المخزن المؤقت تريس وتخزينها في-80 درجة قبل التحليل.
- Euthanize الماوس باستخدام جرعة زائدة من إيسوفلوراني أو أي طريقة أخرى معتمدة.
ملاحظة: فيلتراتي يدخل في الفضاء عن طريق الترشيح من الشعيرات الدموية الكبيبي. ويقال أن معدل الترشيح الكبيبي كليون واحد (سنجفر) في الفئران بين 8 – 14 دقيقة nL/3 قوات ستارلينغ تحكم سنجفر، ومع ذلك، والضغط الهيدروستاتيكي السلبي في الفضاء بومان لذا قد يزيد سنجفر. استخدام الأساليب القياسية ميكروبونكتوري الحصار أنبوبي مع النفط والضغط محايدة لأخذ عينات السوائل أنبوبي، بيد أن تتداخل هذه المركبات مع الطيف الكتلي (انظر أدناه)؛ ولذلك، في هذا الأسلوب لا يزال أنبوب الدانية المبكر براءات الاختراع. علاوة على ذلك، في الوقت تطلع، تتضمن الفضاء بومان لمجهول، لكن حجم الإيجابية فيلتراتي. ولذلك، قد تتجاوز معدل تطلع السوائل سنجفر.
ملاحظة: في التجارب الموضحة هنا، وكان الهدف الحصول على أكبر من المعتاد عينة من filtrate الكبيبي لتحليل الطيف الكتلي بتقنيات نانوبروتيوميك. نظراً لاستخدام الطيف الكتلي يحول دون استخدام كتل النفط مع الزيت المعدني أو الشمع (خلائط معقدة من الجزيئات العضوية التي تقلل من الإشارات: الضوضاء في الطيف الكتلي) يستخدم بيروفلوروديكالين لملء ميكروبيبيتي والمحاقن. بيرفلوروديكالين غير معروف لمنع تدفق أنبوبي، لكن خامل بيولوجيا ولا تتداخل مع الطيف الكتلي.
Representative Results
يتطلب هذا الإجراء إعداد جراحية فريدة من نوعها الكلي لتصوير 2-فوتون والوصول، وهو موضح في الشكل 1. يسمح هذا الإعداد هو موضح هنا عمود تصوير رأسي مع الهدف أعلاه الكلي مع تغييرات قليلة الكثافة للبصريات ممكن أفضل للفحص المجهري 2-فوتون في وقت واحد مع الوصول الأفقي الماصة، مدفوعة بصورة حصرية الأفقي (x ) البعد. النتوء الجزئي للكلى يمنع التوتر الزائد على بيديكلي الكلوية ويحافظ على تدفق الأوعية الدموية، وبناء الدعم الكلي مخصص تمكن الهدفين للتصوير والوصول. ويتمثل التحدي الثاني في هذا الإجراء تحديد المواقع بدقة من الماصة داخل الكلي في ثلاثة أبعاد، الأمر الذي يتطلب التسجيل لتنسيق النظم ماصة والمرحلة. ويتضح أن الخطوة الحاسمة لهذه العملية في الشكل 2، الذي يبين الماصة التي رصدت في عمود الماء المجهر 2-فوتون تحت الإثارة DAPI. إدخال عمود الماء وتسجيل إحداثيات ماصة لتلك المرحلة قبل دخول الكلي أمر بالغ الأهمية لتمكين تحديد المواقع المناظير باستخدام الأشعة بدقة من الماصة داخل الفضاء بومان الهدف. الماصة يدخل عمود الماء التصوير من اليمين. مع الإثارة DAPI قيد التشغيل، ماصة المغلفة بنقطة حمراء الكم فلوريسسيس الزاهية الأحمر-اللون البرتقالي، وأنه يمكن أن توضع بعناية تحت منتصف الهدف. كشعاع الإثارة يمر من خلال مركز الهدف، قد يتم نقل الماصة بحرية إلى حد أقصى الأسفار، ضمان أنه سيكون مرئياً في العدسة.
اختيار سحب والكبيبه ماصة السليم أمرا حاسما لنجاح هذا البروتوكول، كما هو موضح في الشكل 3، الشكل 4، الرقم 5. في الشكل 3 ألف، يمكن رؤية ميكروبيبيتي زجاج المغلفة دوت كم سحبت بشكل صحيح، الأحمر نيون تصويرها في عمود السوائل أثناء جزء التسجيل ماصة للإجراء. التلميح من 6 ميكرون في العرض. في الشكل 3B، يرد ماصة سيئة سحبت مع 12 ميكرومتر تلميح. لا يمكن اختراق هذا الماصة الكبسولة الكلوي دون أن تسبب الصدمة الوعائية نتيجة 12 ميكرومتر القطر والسطح تلميح غير النظامية (ملاحظة بر في أعلى المجسم مشطوف الحواف). ويرد في الشكل 3 و 3D، أهمية الأمثل لتحديد المواقع بدلاً من التصوير من الكبيبة المستهدفة. الكبيبة جميلة، القريبة من السطح هو موضح في الشكل 3 يوضح تصوير مواتية (بسبب موقفها السطحية في 20 ميكرومتر أدناه كبسولة الكلي) ولكن سوف لا تكون مناسبة للوصول بهذا الإجراء لأنها قريبة جداً من السطح، و سوف تضرب الماصة ساترة. وترد في الشكل 3D، glomeruli المتمركزة على النحو الأمثل. ملاحظة حجم مختلفة تستخدم لتوضيح كلا جلوميرولي (مقياس الحانات هي كل 50 ميكرومتر). تظهر هذه glomeruli أقل حادة بسبب الانكسار الناجمة عن عمق؛ هذه الصورة التقطت في 70 ميكرومتر أدناه كبسولة الكلي. الحافة الجانبية الكلي هو 250 ميكرون إلى اليمين، مما يجعل كل من هذه جلوميرولي موجوداً. أثناء إجراء وصول، تصوير محكم يركز على الكبيبة الهدف كما في الشكل 4، ويستخدم اقتناء الصورة الثانية وكل، يسمح للمحقق لمراقبة دقة تحديد المواقع من الماصة في الفضاء بومان.
ويبين الشكل 4 إدخال كلوي نموذجية ونتيجة لذلك، تلميح ماصة داخل الفضاء بومان. في الشكل 4A، يوضح متوسط كثافة إسقاط من كدسة z مع آراء متعامد نصيحة ماصة في الفضاء بومان. علما بأن هناك ماصة أحمر نصيحة الطيفية أثرية (جولة الكرة من الأسفار) بسبب الأسفار مشرق للغاية النقاط الكم رتبت على المقطع المخروطي من الطرف. في الشكل 4 باء، يوضح إسقاط حجم البيانات z-مكدس ماصة أخرى في الفضاء بومان. لاحظ أن الماصة جر كبسولة بومان الشعبية في اتجاه السفر في الدخول وخلق الظاهر التخييم وراء التلميح كما هو موضح في البروتوكول.
في الشكل 5، تظهر نتائج إجراء الفاشلة التي اندلعت ماصة مع فتحه كبيرة جداً في كبسولة الكلي، مما تسبب في النزيف. ماصة كان صريحا جداً؛ في محاولة لتمرير كبسولة كلوية، دفعت الكبسولة قبل تلميح ماصة حتى حدوث الكسر. في هذه الصورة، كبسولة الكلي مرئياً، تتعزز نزيف سوبكاسبولار، في فيتك الفلورية الخضراء. إشارة فيتك مرئياً ضمن ماصة نفسها، مما يشير إلى أن دخل الدم تحت ضغط التجويف ماصة. يشير السهم إلى العديد من خلايا الدم الحمراء التي تظهر داخل التجويف ماصة كملء العيوب في فيتك-ديكستران.
ويصور الشكل 6 طائفة شامل تمثيلية التي تم الحصول عليها من الفضاء أسبيراتي في بومان، الماوس البولي البروتين 17 (MUP17). وأخيراً، يوضح الجدول 1 مثال نتائج الإجراءات تطلع ناجحة، قائمة البروتينات المحددة باستخدام النانو الكتلي على أسبيراتي التي جمعت أكثر من 6 دقائق من كل من الفئران 3. في كل حالة من الحالات، تم تصويرها الماصة تم سحبه من بومان في الفضاء، ولوحظ لا الأسفار فيتك داخل الفضاء بومان في أو التجويف ماصة، مما يشير إلى عدم وجود تلوث aspirate مع البلازما. وتم تحديد البروتينات 17، أساسا من انخفاض الوزن الجزيئي، من الحد أدنى من 2 الببتيدات فريدة من نوعها للبروتين. التهم الطيفية منخفضة، بما يتفق مع التقديرات السابقة للبروتين في filtrate الكبيبي، ويعرف بالبروتينات التي تمت تصفيتها، مثل فيتامين (د) البروتين (فتدب)، الزلال (البو)، البروتين البولي الرئيسية 17 (MUP17) وموجودة.
رقم 1: النتوء الجزئي الكلي مع دعم مخصصة والتثبيت للوصول الأفقي. على اليسار، تظهر الأجزاء من الدعم الكلي والعمود التصوير، مع الجمعية كاملة في مركز. على اليمين، يتم عرض إعداد الكلي قبل (أعلاه)، وبعد تطبيق الدعم (أدناه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أكملت الإعدادية الكلي في خطوة التسجيل ماصة للبروتوكول. وهنا يستخدم الإثارة DAPI لوضع ميكروبيبيتي ضمن عمود الماء المجهر فوتون 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التصوير الماصات والكلى بعد حقن فيتك-ديكستران، مما يدل على جلوميرولي مناسبة وغير مناسبة ميكروبونكتوري. ألف ماصة سحبت جيدا مع 6 ميكرومتر تلميح. باء طرف الخام ذو حدين، غير حادة. جيم- الكبيبة هذا محددة تحديداً جيدا، ولكن قريبة جداً من ساترة ميكروبونكتوري. دال المتمركزين تأهيلاً مناسباً glomeruli. هي أشرطة مقياس كل 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مرور ماصة الناجح يؤدي إلى الإيداع في الفضاء وجهات النظر في بومان من إجراءات مختلفة 2. ألف Z-مكدس مع إسقاطات متعامد يوضح تلميح ماصة في الفضاء بومان في المتاخم خصل الكبيبي. هو مقياس بار 50 ميكرومتر. باء وبالمثل يوضح حجم التقديم من z-المكدس ماصة في الفضاء بومان في المتاخم خصل الكبيبي. شريط الحجم هو 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 5: إجراء غير ناجحة بسبب ماصة غير حادة، تمزق كبسولة الكلي وتؤدي إلى نزيف في التجويف ماصة. فيتك الأسفار من البلازما اكسترافاساتيد، وخلايا الدم الحمراء (السهم) مرئية داخل الماصة. يشير السهم إلى خلايا الدم الحمراء تظهر داخل التجويف ماصة. هو مقياس بار 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: الطيف الشامل للبروتين البولي الرئيسية 17 (MUP17)، التي تم الحصول عليها من تحليل قياس الطيف الكتلي كروماتوغرافيا سائلة/الجماهيري النانو الفضاء أسبيراتي في بومان- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| البروتين | ميغاواط (دينار كويتي) | يعني العد الطيفية |
| ACTA_MOUSE | 42 | 2 |
| ACTB_MOUSE | 42 | 1 |
| CLPX_MOUSE | 69 | 2.5 |
| DHSA_MOUSE | 73 | 1 |
| FOLR2_MOUSE | 29 | 1 |
| GBLP_MOUSE | 35 | 1 |
| ALBU_MOUSE | 66 | 6.7 |
| HBA_MOUSE | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MOUSE | 110 | 1 |
| MUP17_MOUSE | 21 | 1 |
| PERI_MOUSE | 54 | 1 |
| RNAS4_MOUSE | 17 | 2 |
| SPTB1_MOUSE | 2 | 1 |
| VIME_MOUSE | 54 | 1 |
| VTDB_MOUSE | 53 | 1 |
الجدول 1: قائمة البروتينات المحددة في الفضاء aspirate في بومان من الفئران 3.
تكميلية الفيديو 1: عرض وحدة تخزين من كدسة z المكتسبة بعد ماصة لتحديد المواقع في الفضاء بومان ليوضح تلميح الماصة داخل الفضاء، المتاخم خصل شعري. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
نحن نقدم طريقة الوصول إلى الفضاء بومان لمن جلوميرولي غير السطح في الفئران، يسر بالفحص المجهري 2-فوتون. قمنا بتطوير هذا الإجراء لمعالجة قيداً رئيسيا من الكبيبي ميكروبونكتوري، ندرة السطحية glomeruli سعته بالفحص المجهري 1-فوتون في الفئران، بغية تسهيل موضوعي تجريبية والتطلع للسائل من الفضاء بومان لأجل التحليل اللاحق. تطوير وممارسة هذا الأسلوب يعتمد على ست خطوات حاسمة. أولاً، إعداد العمليات الجراحية رواية يجب أن بعناية يتم حيث أن عمود الماء التصوير لا يتم تشغيل إيقاف ساترة وساترة يمتد فوق منطقة الكلي وهو الهدف المتمثل الماصة. ثانيا، يجب تقديم ماصة زجاجية تستخدم ميكروبونكتوري مرئية للفحص المجهري 2-فوتون، الذي يتم إنجازه باستخدام نقاط الكم. تقنية الثالث، والمناظير باستخدام الأشعة مطلوب لدقة موقف ماصة في الفضاء بومان في ثلاثة أبعاد، ما يصل إلى 100 ميكرومتر تحت السطح الكلي. ولذلك، تسجيل تنسيق النظم ماصة والمرحلة بدقة خطوات حاسمة. اختيار الكبيبة الهدف الرابع، والحذر ضروري لضمان وصول الماصة دون اصطدام بهيكل الدعم الكلي والعمود التصوير. وأخيراً، يجب النظر بعناية إلى خطوات تحليلية لمتابعة إجراءات اقتناء، وحجم وتوقيت الحصول على عينات السوائل يجب أن تكون مطابقة للتحليل وفسيولوجيا الكبيبي.
لقد قمنا بتصميم إجراء اكتساب يمكن أن تمتد إلى العديد من التحليلات، بما في ذلك نقاط النهاية ميكروبونكتوري التقليدية، مثل لهب قياس الضوء أو قياسات قطب أيون تراعي قياسات الضغط أو الحجم أو تهمة. بالإضافة إلى ذلك، نعتقد أن هذا الأسلوب سوف تكون قابلة لرواية النهاية تحليلية بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل (ربما بعد النسخ العكسي لميرنا) وجميع مجرى النهر من الطيف الكتلي. التعديلات الخاصة المستخدمة لتسهيل الكتلي تستحق مزيدا من المناقشة، وهي تفرض بعض القيود. أولاً، على الرغم من الطيف الكتلي حساسة للغاية، محتوى البروتين منخفضة وحجم العينات ميكروبونكتوري يجعل تحليل البروتين أدناه النطاق الديناميكي لاستكشاف البروتين التقليدية، ولذلك كانت نانوبروتيوميكس مبسطة الضرورية. 8 , 13 ثانية، لتحسين إنتاج البروتين لفحوصات مبكرة، عقدنا العزم أن nL 200-300 من أسبيراتي ومن الضروري، ولكن حيثياته filtrate اقتناء هذا الحجم سيتطلب ربما ما دامت 20 دقيقة طموح إذا كان الماوس GFR فقط 8-14 nL 3من دور/دقيقة. وكما أظهرت توجو واندو أن تطلع طويلة يغير مضمون ألبومين السائل من أوائل أنبوب الدانية14، انتخبنا لنضح أكثر من 6 دقائق؛ ولكن هذا يعني أن يتجاوز لدينا طموح معدل تدفق فيلتراتي. المستخدمين لهذا الإجراء مدعوة إلى النظر فسيولوجيا الترشيح الكبيبي في نظام تجريبي في تصميم سير العمل الخاصة بهم. أن تطغى الكتلي، تقنية حساسة، بالإشارة من قطارة البترول عرض مثل الزيت المعدني، الذي يستخدم عادة في ميكروبونكتوري لتشمل النظام الهيدروليكي للطموح وعزل قطاعات كليون. ولذلك، نحن لا يمكن استخدام الزيوت المعدنية لهذا الغرض، أو المشتركة الأخرى استخدام، التحديد الكمي لحجم العينات مجموعة نانولتر. بدلاً من ذلك نحن ملء النظام مع بيروفلوروديكالين الذي هو بيولوجيا الخاملة، وعدم الإزعاج الكتلي، والخصائص البصرية الملائمة. ونحن نعتقد القيود المفروضة بموجب بيروفلوروديكالين يمكن التغلب عليها وتعمل على الابتكارات التقنية الإضافية التي نتوقع أن تسمح الحصار الجزء الأنبوبي وقياس حجم العينة.
أجريت معظم الدراسات ميكروبونكتوري في ميونيخ ويستار، التي تبين زيادة في إعداد جلوميرولي السطحية، ولكن هذه الدراسة الفسيولوجية محدودة إلى حد كبير من النقل الأنبوبي وغيرها فيزيولوجيا الكلي بسبب فقدان الأساسية أداة للبيولوجيا الجزيئية، الفئران المعدلة وراثيا2،3. تقنية جديدة لأنه يسهل الوصول إلى الفضاء بومان في الفئران في ميكروبيبيتي، ولذلك يخفف هذه القيود الحرجة. لقد اعتمدنا هذا الأسلوب من أجل الوصول إلى فيلتراتي الكلي لدراسات البروتين باستخدام حساسية عالية الطيف الكتلي، المعروف باسم نانوبروتيوميكس9. ومع ذلك، هناك تطبيقات إضافية المحتمل. على سبيل المثال، دراسة الفسيولوجي الكلي من البروتين التي تمت تصفيتها تم إلى حد كبير ساعد باستخدام تتبع الفلورسنت مع الفحص المجهري 2-فوتون15،،من1617. إضافة ميكروبونكتوري إلى 2-فوتون الفحص المجهري يوفر إمكانية إجراء دراسة الفسيولوجية كليون واحد مع جزيئات الفلورسنت، السماح النيفرون المجاورة، غير حقن بمثابة عناصر التحكم. ونأمل أن تسمح هذه شرح واضح للخطوات الضرورية الاعتماد الواسع النطاق في مختبرات مجهزة بالفعل للفحص المجهري 2-فوتون و/أو ميكروبونكتوري. على الرغم من أنها معقدة، ونحن الآن إجراء هذا الإجراء عدة مرات والتحسينات المقدمة في هذه الوثيقة تمثل أرضية مستقرة لاكتشاف الفسيولوجية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نيدك K08 DK090754 إلى GM103493 P41 MPH. نيجمس إلى RDS. هذه المواد هو نتيجة للعمل (بواسطة ميلا في الساعة) الذي كان مدعوما بالموارد واستخدام المرافق المركز الطبي لشؤون قدامى المحاربين في بورتلاند. المحتويات لا تمثل وجهات نظر حكومة الولايات المتحدة أو إدارة شؤون قدامى المحاربين في الولايات المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| 3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
| 3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
| Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
| PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Microinjector | WPI | UMP-3 | |
| Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
| Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| 30 G needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
| Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |
References
- Schnermann, J. Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).
- Lorenz, J. N. Micropuncture of the kidney: a primer on techniques. Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).
- Vallon, V. Micropuncturing the nephron. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
- Gimenez, Y., et al. 3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. Scientific Reports. 6, 29936 (2016).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
- Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling. Methods in Molecular Biology. , (2017).
- Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications. Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).
- Clair, G., et al. Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples. Scientific Reports. 6, 39223 (2016).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).
- Andrasfalvy, B. K., et al. Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology. Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), (2016).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
- Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).
- Salmon, A. H., et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).
