Summary
Vi præsenterer anvendelse af 2-foton mikroskopi til at placere en mikropipette inden for Bowmans urin plads i mus, kombinere 2 grundlagsforskning teknikker af renal fysiologi. Anvendelse af 2-foton mikroskopi overvinder kritiske begrænsninger af konventionelle mikroskopi for micropuncture renal fysiologi undersøgelser.
Abstract
Nyre micropuncture og renal 2-foton imaging er skelsættende teknikker i renal fysiologi. Men micropuncture er begrænset af afhængighed af konventionelle mikroskopi til overflade nephron funktioner, og 2-foton undersøgelser er begrænset i, at interventioner kan kun vurderes på orgel, snarere end nephron plan. Især er micropuncture studier af glomeruli af mus blevet anfægtet af sparsomme overflade glomeruli i mus. For at afhjælpe denne begrænsning for at fortsætte studier af aspirat fra Bowmans plads i mus fysiologiske modeller, udviklet vi 2-foton glomerulær micropuncture. Vi præsenterer en roman kirurgisk forberedelse, der giver mulighed for lateral adgang til nyrerne samtidig bevare den nødvendige imaging vertikalsøjlen for 2-foton mikroskopi. Administration af høj molekylvægt fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran bruges til at gengive renal vaskulatur og derfor glomeruli synlige for 2-foton imaging. Quantum dot-belagt pipette er derefter indført under stereotactic vejledning til en glomerulus valgt fra flere mange som kan visualiseres i vinduet billeddannelse. I denne protokol give vi oplysninger til forberedelse, materialer og metoder, der er nødvendige for at gennemføre proceduren. Denne teknik letter tidligere umuligt fysiologisk undersøgelse af nyrerne, herunder genopretning af filtratet fra Bowmans plads og alle segmenter af nephron for billedbehandling dybdegrænse, ca. 100 µm nedenfor den renale kapsel. Pres, afgift og flow kan alle måles ved hjælp af den indførte pipette. Her give vi repræsentative data fra flydende kromatografi/massespektrometri udføres på aspirat fra Bowmans plads. Vi forventer, at denne teknik at have bred anvendelighed i renal fysiologisk undersøgelse.
Introduction
Formålet med denne fremgangsmåde er at give rutine micropuncture adgang til Bowmans plads og andre glomerulær strukturer i mus. Micropuncture undersøgelser for renal fysiologi har været begrænset til 1-foton mikroskopi, som kan kun billedet inden for nogle få mikrometer af nyre overflade, og som tilbyder begrænset præcision i z-dimension. Fordi mus har par overflade glomeruli, det er ikke altid muligt at finde en overflade glomerulus af 1-foton mikroskopi, derfor de fleste micropuncture undersøgelser er blevet udført i München-Wistar rotter, som har mere talrige overflade glomeruli. Derfor, fordelene ved arbejder i musemodeller har været begrænset i micropuncture undersøgelser1,2,3. De seneste fremskridt i imaging-teknologier, herunder mikro-CT4,5, nanopartikel imaging6, og imaging massespektrometri7 har stærkt forbedret rækken af retningslinjer for glomerulær fysiologi, men der er stadig ingen erstatning for den unikke evne til at gribe ind og prøve at micropuncture giver. Derfor udvidet anvendelse af micropuncture ved hjælp af de teknikker præsenteret her forventes at lette roman renal fysiologi undersøgelser, i særdeleshed evaluering af indholdet af renal filtratet (dvs., metabolomics) og grundlæggende fysiologi Transgene mus, såsom målinger af filtratet pres og afgift, tidligere udføres kun i rotter.
I denne teknik tillader anvendelse af 2-foton mikroskopi visualisering og mikropipette adgang til renal strukturer op til omkring 100 µm nedenfor den renale kapsel. Flere (5 – 10) glomeruli er derfor tilgængelig for micropuncture i hver musenyre hidtil afbildet. Selv om denne teknik deler nogle funktioner med konventionelle renal micropuncture, det var designet de novo og omfattende ændringer fra konventionel teknik er påkrævet. I denne protokol vi demonstrere aspiration af væske fra Bowmans plads og Vis eksempel resultaterne af efterfølgende analyse med massespektrometri (nanoproteomics)8,9,10,11. Downstream anvendelsen af massespektrometri kræver en specialiseret prøve forberedelse arbejdsproces, der er også vist her.
Protocol
Alle procedurer beskrevet heri blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Oregon Health & Science University.
1. opsætning bruges til Demonstration
- Bruge en opretstående 2-foton mikroskop, en 3-akse fase controller, et headstage/pipette indehaveren og en 3-akse controlleren til headstage/pipette indehaveren; alle fire af disse elementer er påkrævet.
Bemærk: Mange lignende opsætninger er tilgængelige og er nok så længe uafhængige kvantitative 3-akse kontrol af stadiet pipette og mikroskop er tilgængelige, og mikroskop er sat op til i vivo oprejst billeddannelse.
2. materialer nødvendigt før du starter eksperimentelle protokoller
- Bruge FITC-dextran, 2.000.000 Da 5% opløsning i normal saltvand eller fosfatbufferet saltopløsning til retroorbital injektion til at markere den renale Vaskulaturen. Denne molekylvægt (MW) er valgt fordi det forbliver i Vaskulaturen og ikke filtreres.
- Maskine-trukket borsilikatglas Mikropipetter: trække Mikropipetter til 6-10 µm tip ved hjælp af lange-koniske, lukkede tip indstillinger (fx varme = 610, hastighed = 150, tid = 250 ms, sløjfet) på en mikropipette puller. Facet på 45° og flamme-polske let.
- Kvante-dot belægning af Mikropipetter: pels mikropipette tips med quantum dots efter den refererede protokol. 12
- Polysiloxane nyre support/spacer. Bruge polysiloxane kit til håndværk en nyre support/spacer. Mode en 1 x 1 cm2 af 5 mm tyk retvinklet rombeformede (dvs., en afkortet kube) fra polysiloxane kit. Fjern den midterste 70% af polysiloxane fra kanten og en cirkel bestående af omkring 70% af rombeformede centrum. Tillad polysiloxane tørre i 24 timer. Se figur 1.
- Microinjector forberedelse: Prefill en længde af polyethylen (PE)-50 slanger og mikropipette-loaded mikropipette indehaveren med olie. Hvis massespektrometri er planlagt, perfluorodecalin er påkrævet, ellers mineralsk olie anvendes. Oprettet microinjector med en lufttæt Hamilton-type sprøjte og fyld op med perfluorodecalin. Dette vil være forbundet til PE-50 slanger og pipette indehaveren.
- Placere pipetten i pipette indehaveren og frem fylde PE-50 slanger og pipette og derefter vedhæfte den proksimale ende af PE-50 slanger til oliefyldte Hamilton sprøjte, at skabe et hydraulisk system fra pipette til sprøjten.
3. tværgående pipetten adgang til nyre under en væske Imaging kolonne via en roman kirurgisk Procedure
Bemærk: Forsamling støtte billedbehandlingssystem og kirurgisk prep er vist i figur 1. Den beskrevne procedure er udført på C57BL/6 mus vejer 20-25 g.
- Veje musen.
- Fremkalde anæstesi ved hjælp af 4% isofluran og vedligeholde med 1,5-2,5% isofluran i luft/ilt blanding. Bekræfte, at musen er bedøvede ved fravær af svar til smertefulde stimuli og reduceret respirationsfrekvens.
- Smøre øjnene og placere den animalske laterale på en sokkel. Immobilisere 4 ekstremiteter ved hjælp af tape.
- Injicere normale saltvand, 200 µL, subkutant og placere en rektal temperatur sonde. Kontrol temperatur ved hjælp af en varme lampe under kirurgi og en varmepude under imaging.
- Fjerne alle hår på den venstre side af musen ved hjælp af en depilatory creme.
- Find milt, som er synlig under huden, og Find den venstre nyre på ryg og halefinne side af milten.
- Gøre en 0,5 cm indsnit på huden og mindre snit på bughinden, lige nok til nyre at skubbe let.
- Presse nyre med blide tryk. Placer nyre stabilisator form lavet med polysiloxane rundt i nyre og fix med ren klæbemiddel. Line nyrerne op med spacer, lateral-mest overfladen af nyrerne indhalingsmetoden stabilisator af omkring 1 mm.
- Lave en hoved plade til formen stabilisator med lim og montere den hoved plade til montering barer på bundpladen.
- Fylde godt i den polysiloxane støtte omkring nyre med 1% Agarosen løsning og læg 10 mm coverslip ovenpå og holde indtil Agarosen er fast. Forsegle coverslip til hovedet pladen med lim og skabe en ring omkring coverslip med dental cement.
- Injicere FITC-dextran (2.000.000 Da, 5% opløsning, 100 – 150 µL) retro-orbitally og flytte musen og fiksering pladen på 2-foton mikroskop scenen hurtigt, vedligeholdelse af anæstesi og sikre passende spilde gas scavenging på stadiet mikroskop.
4. udvælgelse af en egnet Glomerulus og pipetten adgang til Bowmans plads
-
Definitioner:
- Definere X som venstre-højre på skærmen og venstre-højre vender mikroskopet
- Læs SX (trin X) fra scenen controller
- Definere PX som pipette X, på pipetten ringe controller
- Definere Y som op-ned på skærmen og fremad mod mikroskop og tilbage mod 2-foton setup
- Definere Z så op mod loftet, ned mod gulvet, og målt på scenen med mål Z stilling.
- Definere S (O) Z som fase (virkelig mål) højde.
-
Find overfladen af nyre, identificerbare ved hjælp af grøn fluorescerende proteiner (NGL) filterindstillinger i okulære. Som følge af injektion af FITC-Dextran bliver Vaskulaturen lysegrønt.
- Identificere en passende glomerulus. Efter at identificere overfladen af nyre ved hjælp af okulære, skifte til 2-foton (ikke-scanning mode) og udforske vinduet billeddannelse. Positiv egenskaber for micropuncture er følgende: lodret afstand under coverslip > 30 µm (for at undgå kollision mellem pipette og coverslip under adgang) og lateral afstand fra den laterale nyre kapsel til glomerulus < 400 µm (ud over denne afstand afvigelse af pipetten kan øge sandsynligheden for en miss).
- Optag tværgående og lodret afstand til at punktere punkt, et punkt på den renale kapsel direkte til pipette-side af glomerulus.
- Øge den objektive omdrejningspunkt i vandsøjlen, holde x og y stage koordinater uændret, en afstand af næsten en centimeter.
- Drive pipette tip i vandsøjlen og tænde 4', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) excitation. Flytte pipette i x og y dimensioner til punktet af maksimal fluorescens i spidsen, det vil være centrum for målet. At finde pipetten i okulære er vanskeligt uden denne præcise prepositioning. Fordi quantum dots fluorescerer på (i dette tilfælde, rød) bølgelængde uanset excitation bølgelængde, producerer DAPI excitation røde fluorescens, der er stramt fokuseret på spidsen, illustreret i figur 2.
- Skift indstillingen for excitation til rødt fluorescerende proteiner (RFP) og visualisere pipette i okulære, så netop centrere det i visningen okulær.
- Skift til 2-foton og finde pipette under 2-foton, placere den præcist i midten af billedet. Dette er registrering holdning.
- Gemme et billede af en pipette.
- Registrere scenen og mikropipette controller koordinater.
Bemærk: Brug supplerende .html-fil, som vil udføre beregninger ved hjælp af JavaScript-kode, (fordelagtige på systemer, der ikke har installeret regneark software) eller et regneark til at beregne forskydningen mellem fase og pipette koordinater og til beregne mål koordinater for pipette-controller. - Fjerne pipetten fra vandsøjlen i x-aksen, holde z og y det samme.
- Flytte pipette Z til target glomerulus Z (dvs., flytte pipetten ned i Z-retning under coverslip)
- Flytte pipette Y til target glomerulus Y-koordinat.
- Flytte 2-foton live view til target glomerulus Z og derefter til kanten af nyrerne og Bemærk SX.
- Beregne nyre kant PX ved hjælp af forskydningen fra registrering SX.
- Flyt fase mod pipette (stigning SX), sådan at kanten af nyrerne er langt til venstre side af skærmen, men stadig synlige.
- Forhånd pipetten hurtigt til ca. 100 µm mindre end nyre kanten PX som beregnet ovenfor.
- Find pipette tip, rykkede pipetten langsomt. Øge den røde gevinst og se røde pixel histogram (pixel distribution Skift før pipetten er afbildet i vinduet, på grund af den ekstreme lysstyrke af quantum dots og off-target fluorescens).
- Gå videre til den nyre kant under live 2-foton billeddannelse.
Bemærk: Før du indtaster den renale kapsel, det er muligt at omdirigere pipette i dimensionerne Y og Z. Dog kan dette bryde pipette tip. En mere konservativ foranstaltning, er hvis pipetten er væk fra målet, at trække i X-dimension, op til 2 cm, omdirigering og derefter tilbage i dimensionen X til nyre kant. Når pipetten er inden for væv, bevægelse i enhver akse end X fører til pipette fleksion, som kræver stor erfaring til at gøre brug af, og ofte fører til brud. - Drive pipetten på X-aksen langsomt at glom target PX, at holde øje med SX. (Det er nyttigt at lejlighedsvis gå tilbage til glomerulus at se, hvis det har skiftet overhovedet ved indsættelse af mikropipette).
- Når du er i den berigtige placering, dokument position med en z-stak.
Bemærk: Med mikropipette sted, narkotika, proteiner eller fluorescerende sporstoffer kan injiceres, væske kan være indsugning til senere analyse eller pres eller afgift i forhold til en anden elektrode kan måles.
5. aspiration af væske fra Bowmans plads
- Angive micropump til indsprøjtes 100 nL af perfluorodecalin over 2 min at sikre passage af pipetten og reducere confounding fra pipette plugging under indtastning. Reimage for at sikre pipette holdning.
- Vente 4-6 min. til ekstra filtrering.
- Angive micropump til Aspirér op til 300 nL med en hastighed på op til 50 nL/min.
Bemærk: Ændringer i glomerulær morfologi ikke overholdes med denne sats, hvilket tyder på, det ikke ændrer ved satsen på levering af væske til rummet under aspiration. Da der er ingen olie blok som i konventionelle micropuncture, kunne genopretning af dette volumen, nødvendige for massespektrometri, omfatte nogle af den injicerede perflourodecalin og eventuelt rørformede væske. For assays som ion-følsomme elektrode målinger fluorescens spektroskopi, polymerase kædereaktion og andre følsomme slutpunkter, kan der anvendes lavere mængder. Hvis massespektrometri ikke er slutpunktet, kan mineralsk olie og standard micropuncture teknikker bruges til at måle den indsugning volumen inden deponering. - Billede en gang mere.
- Trække pipetten og bevare stikprøven, tilføje TRIS buffer og lagring ved-80 ° inden analyse.
- Aflive den mus ved hjælp af en overdosis af isofluran eller anden godkendt metode.
NOTE: Filtratet kommer ind i rummet ved filtrering fra glomerulær kapillærerne. Single-nephron glomerulær filtrationshastighed (SNGFR) i mus er rapporteret mellem 8-14 nL/min.3 Starling kræfter styrer SNGFR, dog, og negative hydrostatisk tryk i Bowman's space derfor kan øge SNGFR. Standard micropuncture metoder bruger rørformede blokade med olie og neutral pres for rørformede væske prøveudtagning, men disse forbindelser forstyrre massespektrometri (se nedenfor); derfor i denne teknik forbliver tidlige proksimale tubulus patent. Yderligere, samtidig med aspiration Bowmans plads indeholder en ukendt, men positive volumen af filtratet. Derfor kan væske aspiration overstige SNGFR.
Bemærk: I eksperimenter beskrevet her, målet var at opnå en større end sædvanlige stikprøve af glomerulær filtratet for massespektrometri analyse af nanoproteomic teknikker. Da anvendelsen af massespektrometri er til hinder for anvendelse af olie blokke med mineralsk olie eller voks (komplekse blandinger af organiske molekyler, der reducerer signal: støj i massespektrometri) bruges perfluorodecalin til at udfylde mikropipette og sprøjte. Perflourodecalin er ikke kendt for at blokere rørformede flow, men er biologisk inaktivt og forstyrrer ikke massespektrometri.
Representative Results
Denne procedure kræver en unik kirurgisk forberedelse af nyrerne for 2-foton imaging og adgang, som er illustreret i figur 1. Denne forberedelse vist her giver mulighed for en imaging vertikalsøjlen med målsætningen ovenfor nyrerne med få tæthed ændringer for bedst mulige optik til 2-foton mikroskopi samtidig med lateral adgang til pipette, drevet udelukkende i vandret (x ) dimension. Delvis ekstrudering af nyre forhindrer overskydende spænding på den renale pedicle og bevarer vaskulære flow, og opførelsen af en brugerdefineret nyre støtte gør det muligt for de to mål af billedbehandling og adgang. Den anden udfordring i denne procedure er præcis positionering af afpipetteres inden for nyre i 3 dimensioner, der kræver registrering af koordinatsystemer pipette og fase. Det afgørende skridt for denne proces er illustreret i figur 2, som viser pipette bliver spottet i kolonnen vand i 2-foton mikroskop under DAPI-excitation. Indtastning af vandsøjlen og registrere koordinaterne for pipette til dem af scenen før nyren er afgørende for at aktiverer præcise stereotactic positionering af afpipetteres inden for target Bowman plads. Pipetten træder imaging vandsøjlen fra højre. Med DAPI excitation tændt, rød quantum dot-belagt pipette fluorescerer smukt i rød-orange, og det kan være omhyggeligt placeret under midten af målet. Som excitation strålen passerer gennem midten af målet, kan pipetten flyttes frit til punktet af maksimale fluorescens, at sikre, at det vil være synlig i okularet.
Ordentlig pipette trække og glomerulus udvalg er afgørende for succes i denne protokol, som illustreret i figur 3, figur 4, figur 5. I figur 3Ases en korrekt trak, rødt-fluorescerende quantum dot-belagt glas mikropipette afbildet i kolonnen væske under pipette registrering del af proceduren. Spidsen er 6 mikrometer i bredden. I figur 3B, er et dårligt-trukket pipette med 12 µm tip vist. Denne pipette ikke kan trænge igennem den renale kapsel uden at forårsage vaskulær traumer på grund af 12 µm diameter og uregelmæssige tip overflade (Bemærk bur øverst på facet). I figur 3 c og 3D, er betydningen af optimal positionering snarere end imaging af target glomerulus vist. Den smukke, nær overfladen glomerulus illustreret i figur 3 c viser gunstige imaging (på grund af dets overflade position på 20 µm nedenfor den renale kapsel) men ville ikke være egnet til adgang af denne procedure, fordi det er for tæt på overfladen, og pipetten vil ramme coverslip. I figur 3D, er optimalt placeret glomeruli vist. Bemærk den forskellige skala bruges til at illustrere både glomeruli (skala barer er alle 50 µm). Disse glomeruli vises mindre skarpe på grund af refraktion skyldes dybden; Dette billede blev taget på 70 µm nedenfor den renale kapsel. Den laterale nyre kant er 250 µm til højre, gør begge disse glomeruli tilgængelige. Under en adgang procedure, imaging er stramt fokuseret på målet glomerulus som i figur 4, og hvert andet billede erhvervelse anvendes, tillader investigator netop konstatere positionering af pipette i Bowmans plads.
Figur 4 illustrerer en typisk renal løsning og resultatet, en pipette tip i Bowmans plads. I figur 4Aviser en gennemsnitlig intensitet fremskrivning fra et z-stakken med ortogonale udsigt pipette tip i Bowmans plads. Bemærk, at der er rød pipette tip spektrale artefakt (rund bold af fluorescens) på grund af ekstremt lyse fluorescens af quantum dots arrangeret på den koniske del af spidsen. I figur 4Bviser en volumen projektion af z-stakken data en anden pipette i Bowmans plads. Bemærk at pipetten trukket Bowman's kapsel i kørselsretningen på post, skaber tilsyneladende tenting bag spidsen som beskrevet i protokollen.
I figur 5vises resultaterne af en mislykket procedure, hvor en pipette med en alt for stor åbning brød på den renale kapsel, forårsager blødning. Pipetten var for stump; på forsøger at passere den renale kapsel, blev kapslen skubbet foran pipette spidsen indtil brud opstod. I dette billede er renal kapslen synlige, forstærket af subcaspular blødning, i FITC-fluorescerende grøn. FITC signal er synlige inden for den pipette, der angiver, at blod pres indtastet pipette lumen. Pilen peger på mange røde blodlegemer synlige inden for pipette lumen som udfylder defekter i FITC-dextran.
Figur 6 viser en repræsentant masse spektrum fra Bowmans plads aspirat, mus urin protein 17 (MUP17). Endelig viser tabel 1 eksempel resultater af vellykket aspiration procedurer, notering proteiner ved hjælp af nanoskala massespektrometri på aspirat indsamlet over 6 minutter fra hver af 3 mus. I hvert tilfælde var pipetten afbildet som det blev trukket tilbage fra Bowmans plads, og ingen FITC fluorescens blev observeret i Bowmans plads eller pipette lumen, der angiver mangel aspirat kontaminering med plasma. 17 proteiner, primært med lav molekylevægt, blev identificeret af et minimum af 2 unikke peptider pr. protein. Spektrale tæller er lav, i overensstemmelse med tidligere estimater af protein i glomerulær filtratet, og kendt filtrerede proteiner, såsom vitamin D bindende protein (VTDB), albumin (ALBU) og store urin protein 17 (MUP17) er til stede.
Figur 1: delvis ekstrudering af nyrerne med brugerdefinerede support og immobilisering for lateral adgang. Til venstre vises delene af imaging kolonne og nyre støtte med den komplette samling i centrum. Højre nyre forberedelse er vist før (ovenfor) og efter (under) anvendelse af støtte. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: afsluttet nyre prep på pipette registrering trin i protokollen. Her, bliver DAPI excitation brugt til at placere mikropipette i vandsøjlen af 2 foton mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Imaging pipetter og nyrerne efter injektion af FITC-dextran, demonstrerer egnet og uegnet glomeruli for micropuncture. A. et godt trukket pipette med 6 µm spids. B. en grove kanter, stump spids. C. denne glomerulus er veldefinerede, men også tæt på coverslip for micropuncture. D. Passende placeret glomeruli. Skala barer er alle 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: vellykket pipette passage fører til placering i Bowmans plads-udsigt fra 2 forskellige procedurer. A. Z-stakken med retvinklede projektioner viser pipette tip i Bowmans plads abutting glomerulær tuft. Skalalinjen er 50 µm. B. Volume rendering fra z-stakken viser ligeledes en pipette i Bowmans plads abutting glomerulær tuft. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: et mislykket proceduren på grund af en stump pipette, rive den renale kapsel og fører til blødning i pipette lumen. FITC fluorescens fra røde plasma og røde blodlegemer (pil) er synlige inden for pipetten. Pilen peger på røde blodlegemer synlige inden for pipette lumen. Skalalinjen er 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: masse spektret for store urin protein 17 (MUP17), fremstillet af nanoskala liquid chromatography/masse massespektrometri analyse af Bowmans plads aspirat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Protein | MW (kD) | Betyde spektrale Count |
| ACTA_MOUSE | 42 | 2 |
| ACTB_MOUSE | 42 | 1 |
| CLPX_MOUSE | 69 | 2.5 |
| DHSA_MOUSE | 73 | 1 |
| FOLR2_MOUSE | 29 | 1 |
| GBLP_MOUSE | 35 | 1 |
| ALBU_MOUSE | 66 | 6.7 |
| HBA_MOUSE | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MOUSE | 110 | 1 |
| MUP17_MOUSE | 21 | 1 |
| PERI_MOUSE | 54 | 1 |
| RNAS4_MOUSE | 17 | 2 |
| SPTB1_MOUSE | 2 | 1 |
| VIME_MOUSE | 54 | 1 |
| VTDB_MOUSE | 53 | 1 |
Tabel 1: Liste over proteiner identificeret i Bowmans plads aspirat fra 3 mus.
Supplerende Video 1: en volumen gengivelse fra en z-stak erhvervet efter positionering pipette i Bowmans plads viser pipette tip i rummet, abutting kapillær tuft. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Vi præsenterer en metode til at få adgang til Bowmans plads af ikke-overflade glomeruli i mus, lettes ved 2-foton mikroskopi. Vi udviklede denne procedure for at løse en afgørende begrænsning af glomerulær micropuncture, sjældenhed af overflade glomeruli adresseres af 1-foton mikroskopi i mus, for at lette en eksperimentel mål, aspiration af væske fra Bowmans plads til efterfølgende analyse. Udvikling og praksis af denne teknik hviler på seks kritiske trin. Først, den nye kirurgiske forberedelse omhyggeligt foretages således at billeddannelse vandsøjlen kører ikke ud af coverslip og coverslip strækker sig over området i nyrerne, som er målet for pipetten. For det andet skal glas pipette bruges til micropuncture gengives synlige for 2-foton mikroskopi, som er udført ved hjælp af quantum dots. Tredje, stereotactic teknik er forpligtet til at netop placere en pipette i Bowmans plads i tre dimensioner, op til 100 µm under nyre overflade. Derfor, registrering koordinatsystemer pipetten og scenen med præcision er kritiske trin. Fjerde, omhyggelig udvælgelse af mål glomerulus er nødvendige for at sikre, at det er tilgængeligt for pipette uden impingement ved nyre støttestruktur og billedbehandling kolonne. Endelig nøje overvejelser skal gives til de analytiske trin til at følge proceduren for erhvervelse og volumen og tidsplanen for erhvervelse af flydende prøver skal modsvares at analysen og glomerulær fysiologi.
Vi designede en erhvervelse procedure, der kan udvides til mange analyser, herunder traditionelle micropuncture slutpunkter, som flammen fotometri, ion-følsomme elektrode målinger eller målinger af tryk, volumen eller afgift. Derudover mener vi, denne teknik vil være åbne over for nye analytiske slutpunkter herunder polymerase kædereaktion (måske efter reverse transkription for miRNA) og metabolomics nedstrøms af massespektrometri. De særlige ændringer ansat til at lette massespektrometri fortjener yderligere diskussion, og de indfører nogle begrænsninger. Først, selv om massespektrometri er meget følsomme, lavt proteinindhold og volumen af micropuncture prøver gengiver analyse af protein under det dynamiske område af konventionelle proteom udforskning, og derfor forenklet nanoproteomics blev nødvendige. 8 , 13 det andet for at optimere protein udbytte for tidlige assays, vi besluttet, at 200-300 nL af aspirat var nødvendige, men de novo filtratet erhvervelse af diskenheden kræver måske så længe som 20 minutter af aspiration hvis musen GFR er kun 8-14 nL /min3. Tojo og Endou bevist at langvarig aspiration ændrer albumin indholdet af tidlige proksimale tubulus væske14, valgt vi Aspirér over 6 minutter; men dette betyder, at vores aspiration sats overstiger filtratet indstrømning sats. Brugere af denne procedure opfordres til at overveje fysiologi af glomerulær filtration i deres eksperimentel system i at designe deres arbejdsproces. Massespektrometri, en følsom teknik, vil blive overvældet af signalet fra en indført petroleum destillat såsom mineralsk olie, som er almindeligt anvendt i micropuncture til at omfatte det hydrauliske system for aspiration og isolere segmenter af nephron. Derfor, vi kunne ikke bruge mineralsk olie til dette formål, eller dets andre fælles bruger, kvantificering af mængden af nanoliter udvalg prøver. I stedet, vi fylder systemet med perfluorodecalin, som er biologisk inaktivt, ikke forstyrrer massespektrometri og har positiv optiske egenskaber. Vi mener de begrænsninger af perfluorodecalin overvindes og arbejder på yderligere tekniske nyskabelser, som vi forventer vil muliggøre måling af sample volumen og blokaden af de rørformede segment.
De fleste micropuncture undersøgelser har været udført i München-Wistar rotter, som viser øget antal overflade glomeruli, men denne meget begrænset fysiologisk undersøgelse af rørformede transport og andre renal fysiologi på grund af tabet af grundlæggende værktøj af molecular biology, Transgene mus2,3. Fordi det letter mikropipette adgang til Bowmans plads i mus, afbøder den roman teknik derfor disse kritiske begrænsninger. Vi vedtog denne teknik for at få adgang til renal filtratet for proteom undersøgelser med høj følsomhed massespektrometri, kendt som nanoproteomics9. Der er dog sandsynligvis yderligere programmer. For eksempel, har renal fysiologisk undersøgelse af filtrerede protein været stærkt hjulpet af brug af fluorescerende sporstoffer med 2-foton mikroskopi15,16,17. Tilsætning af micropuncture til 2-foton mikroskopi giver mulighed for at udføre single-nephron fysiologisk undersøgelse med fluorescerende molekyler, så nærliggende, ikke-indsprøjtning nephrons til at tjene som kontrol. Det er håbet, at denne klar forklaring af de nødvendige foranstaltninger vil give bred vedtagelsen i labs allerede udstyret til 2-foton mikroskopi og/eller micropuncture. Selv om det er kompleks, vi nu har udført denne procedure mange gange og de justeringer, der præsenteres heri udgør en stabil platform for fysiologisk opdagelse.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
NIDDK K08 DK090754 til MPH. NIGMS P41 GM103493 RDS. Dette materiale er resultatet af arbejde (af MPH), der blev støttet med midler og brug af faciliteterne på Portland veteraner anliggender Medical Center. Oplysningerne repræsenterer ikke synspunkter US Department of veterananliggender eller de Forenede Staters regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| 3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
| 3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
| Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
| PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Microinjector | WPI | UMP-3 | |
| Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
| Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| 30 G needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
| Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |
References
- Schnermann, J. Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).
- Lorenz, J. N. Micropuncture of the kidney: a primer on techniques. Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).
- Vallon, V. Micropuncturing the nephron. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
- Gimenez, Y., et al. 3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. Scientific Reports. 6, 29936 (2016).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
- Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling. Methods in Molecular Biology. , (2017).
- Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications. Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).
- Clair, G., et al. Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples. Scientific Reports. 6, 39223 (2016).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).
- Andrasfalvy, B. K., et al. Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology. Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), (2016).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
- Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).
- Salmon, A. H., et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).
