Summary
Presenteren wij gebruik van 2-foton microscopie te plaatsen van een micropipet binnen de urine ruimte Bowman in muizen, 2 fundamentele technieken van renale fysiologie combineren. Gebruik van 2-foton microscopie overwint kritische beperkingen van conventionele microscopie voor micropuncture renale fysiologie studies.
Abstract
Renale micropuncture en renale 2-photon imaging zijn baanbrekende technieken in de Fysiologie van de nier. Echter micropuncture wordt beperkt door de afhankelijkheid van conventionele microscopie tot oppervlakte Nefron functies, en 2-foton studies zijn beperkt in die zin dat interventies kunnen slechts worden beoordeeld op het orgel, in plaats van het Nefron niveau. Met name zijn micropuncture studies van de glomeruli van muizen aangevochten door de schaarste van de glomeruli van de oppervlakte in muizen. Om deze beperking te oefenen studies van aspirate vanuit de Bowman ruimte in fysiologische muismodellen, ontwikkelden we 2-foton glomerulaire micropuncture. We presenteren een nieuwe chirurgische voorbereiding waarmee laterale toegang tot de nier met behoud van de vereiste verticale imaging kolom voor 2-foton microscopie. Beheer van ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran wordt gebruikt voor het renderen van de renale therapieën, en derhalve de glomeruli zichtbaar voor 2-photon imaging. Een quantum dot beklede pipet wordt vervolgens ingevoerd onder stereotactische begeleiding naar een glomerulus geselecteerd uit de diverse waarnaar veel kunnen worden gevisualiseerd in de imaging-venster. In dit protocol bieden wij de details van de voorbereiding, materialen en methoden die nodig zijn om de procedure uit te voeren. Deze techniek faciliteert voorheen onmogelijk fysiologische studie van de nier, inclusief herstel van het filtraat van Bowman ruimte en alle segmenten van het Nefron binnen de imaging diepte, ongeveer 100 µm onder de renale capsule. Druk, last en stroom kunnen alles worden gemeten met de geïntroduceerde pipet. Wij bieden hier, representatieve gegevens van vloeibare chromatografie/massaspectrometrie uitgevoerd op aspirate van Bowman ruimte. Wij verwachten dat deze techniek te hebben de brede toepasbaarheid bij renale fysiologische onderzoek.
Introduction
Het doel van deze procedure is voor routine micropuncture toegang tot Bowman ruimte en andere glomerulaire structuren in muizen. Micropuncture voor de renale fysiologie studies zijn beperkt tot 1-foton microscopie, die kan alleen afbeelding binnen een paar microns van het oppervlak van de nieren, en die biedt beperkte precisie in de z-dimensie. Omdat muizen hebben enkele oppervlakte glomeruli, het is niet altijd mogelijk om te zoeken van een oppervlak glomerulus door 1-foton microscopie, dus meeste micropuncture studies zijn uitgevoerd in München-Wistar ratten, die talrijker oppervlakte glomeruli hebben. Daarom hebben de voordelen van het werken in muismodellen beperkt gebleven in micropuncture studies,1,,2,3. Recente vooruitgang in de imaging technologieën, met inbegrip van micro-CT4,5, nanoparticle imaging6, en imaging massaspectrometrie7 hebben sterk verbeterd met het bereik van de modaliteiten die van toepassing zijn aan glomerulaire fysiologie, maar Er blijft geen substituut voor de unieke mogelijkheid om te interveniëren en genieten van dat micropuncture biedt. Dus de uitbreiding van het gebruik van micropuncture met behulp van de technieken die hier gepresenteerd wordt verwacht om roman renale fysiologie studies, in het bijzonder, evaluatie van de inhoud van de renale filtraat (d.w.z., metabolomica) en elementaire fysiologie van transgene muizen, zoals metingen van het filtraat druk en opladen, eerder uitgevoerd alleen bij ratten.
Bij deze techniek kan gebruik van 2-foton microscopie Visualisatie en micropipet toegang tot renale structuren tot ongeveer 100 µm onder de renale capsule. Meerdere (5 – 10) glomeruli zijn dus toegankelijk voor micropuncture in elke muis nier dusver beeld. Hoewel deze techniek enkele kenmerken met conventionele renale micropuncture deelt, het was ontworpen DOVO en uitgebreide aanpassingen sinds de conventionele techniek zijn vereist. In dit protocol wij tonen aspiratie van vocht vanuit de Bowman ruimte en voorbeeld Showresultaten van latere analyse met de Spectrometrie van de massa (nanoproteomics)8,9,10,11. Stroomafwaarts gebruik van massaspectrometrie vereist een gespecialiseerde monster voorbereiding werkstroom, die ook hier blijkt.
Protocol
Alle hierin beschreven procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Oregon Health & Science University.
1. instellingen voor demonstratie
- Een rechtop 2-foton microscoop, een 3-as fase-controller, de houder van een headstage/pipet en een 3-as controller gebruiken voor de headstage/pipet houder; alle vier van deze items zijn vereist.
Opmerking: Vele soortgelijke opstellingen zijn beschikbaar en volstaat zolang onafhankelijke kwantitatieve 3 assen controle van de pipet en Microscoop fase beschikbaar zijn, en de Microscoop voor in vivo rechtop imaging is ingesteld.
2. materialen nodig voordat u start van experimentele protocollen
- Gebruik de FITC-dextran, 2.000.000 Da, 5%-oplossing in normale zout of met fosfaat gebufferde zoutoplossing voor retroorbital injectie ter gelegenheid van de renale therapieën. Deze molecuulgewicht (MW) is geselecteerd omdat het blijft in de therapieën en worden niet gefilterd.
- Machine-trok borosilicaatglas micropipetten: Trek micropipetten naar 6 – 10 µm tip met lange-taper, gesloten uiteinde instellingen (bijvoorbeeld warmte = 610, snelheid = 150, tijd = 250 ms, lus) op een trekker van de micropipet. Schuine tot 45° en vlam-Pools licht.
- Quantum-dot coating van micropipetten: jas micropipet tips met quantumdots volgens het protocol van waarnaar wordt verwezen. 12
- Spacer/polysiloxaan nier ondersteuning. Gebruik polysiloxaan putty om een nier ondersteuning/spacer ambacht. Fashion een 1 x 1 cm2 door 5 mm dikke rechte hoek rhomboid (dat wil zeggen, een afgeknotte kubus) van polysiloxaan stopverf. Verwijder de middelste 70% van de polysiloxaan vanaf één rand en een cirkel bestaande uit ongeveer 70% van het midden van de rhomboid. Laat de polysiloxaan gedurende 24 uur drogen. Zie Figuur 1.
- Microinjector voorbereiding: een lengte van polyethyleen (PE)-50 slang en de micropipet-geladen micropipet houder Prefill met olie. Als massaspectrometrie is gepland, perfluorodecalin is nodig, anders minerale olie kan worden gebruikt. De microinjector instellen met een gasdichte Hamilton-type spuit en vul met perfluorodecalin. Dit zal worden aangesloten op de PE-50 buizen en Pipetteer houder.
- Plaats de pipet in de pipet houder en vooruit vullen de PE-50 buizen en Pipetteer en vervolgens sluit het proximale uiteinde van de PE-50 buizen naar de Hamilton olie gevulde spuit, het creëren van een hydraulisch systeem van Pipetteer syringe.
3. laterale Pipetteer toegang tot de nier onder een vloeistof Imaging kolom via een nieuwe chirurgische ingreep
Opmerking: De vergadering van de beeldvorming steunregeling en chirurgische prep is afgebeeld in Figuur 1. De procedure wordt uitgevoerd op C57BL/6 muizen met een gewicht van 20 tot 25 g.
- Weeg de muis.
- Anesthesie met 4% Isofluraan induceren en onderhouden met 1,5-2,5% Isofluraan in lucht/zuurstof mengsel. Bevestigen dat de muis is verdoofd door afwezigheid van reactie op een pijnlijke stimulus en respiratoire tarief.
- Smeren van de ogen en de positie van de dierlijke dwarskrachten op een basisplaat. Immobiliseren 4 ledematen met behulp van tape.
- Normale zout, 200 µL, subcutaan injecteren en plaats een rectale temperatuursonde. Controle temperatuur met behulp van een verwarming lamp tijdens chirurgie en een verwarming pad tijdens imaging.
- Verwijder alle haren op de linkerkant van de muis met behulp van een ontharende room.
- Zoek de milt, die standaard weergegeven onder de huid wordt, en zoek de linker nier op de dorsale en caudal kant van milt.
- Maak een incisie 0.5 cm op de huid en kleinere incisie op het buikvlies, net genoeg voor de nier om gemakkelijk erdoor.
- Diepte van de nier met zachte druk. Plaats nier stabilisator vorm gemaakt met polysiloxaan rond de nieren en de moeilijke situatie met Cyanoacrylaat lijm. Line-up de nier met de spacer zodanig dat het meest laterale oppervlak van de nier buiten de stabilisator door ongeveer 1 mm doorloopt.
- Herstellen van een hoofd bord aan de stabilisator formulier met lijm en monteer de hoofd plaat te monteren bars op de grondplaat.
- Vul de put in de polysiloxaan steun rondom de nier met 1% agarose oplossing en plaats van de 10 mm dekglaasje aan op bovenkant ingedrukt totdat agarose stevig is. Zegel van dekglaasje aan aan de hoofd plaat met lijm en maak een ring rond het dekglaasje aan met tandheelkundige cement.
- Injecteer FITC-dextran (2.000.000 Da, 5%-oplossing, 100 – 150 µL) retro-orbitally en snel de muis en fixatie plaat naar de fase 2-foton microscoop, behoud van anesthesie en zorgen voor adequate afval gas opruiming in het werkgebied van de Microscoop.
4. de selectie van een geschikte Glomerulus en Pipetteer toegang tot de ruimte van Bowman
-
Definities:
- Define X als links-rechts op het scherm en links-rechts geconfronteerd met de Microscoop
- Lees SX (fase X) van de fase-controller
- Define PX als Pipetteer X, bellen op de pipet controller
- Y als omhoog / omlaag op het scherm en vooruit naar de Microscoop en terug naar de 2-foton-instellingen definiëren
- Definiëren Z zo omhoog naar het plafond, naar beneden naar de vloer, en gemeten op het podium met de doelstelling Z-positie.
- S (O) Z definiëren als de hoogte van de etappe (echt de doelstelling).
-
Het oppervlak van de nier, identificeerbaar met behulp van de instellingen van het filter van de groen fluorescente proteïne (GFP) in het oculair vinden. Vanwege de injectie van FITC-Dextran niet de therapieën helder groen.
- Het identificeren van een geschikte glomerulus. Na de identificatie van het oppervlak van de nier met behulp van het oculair, ga naar 2-foton (niet-scannen-modus) en het imaging venster verkennen. Gunstige kenmerken voor micropuncture zijn de volgende: verticale afstand onder het dekglaasje aan > 30 µm (ter voorkoming van botsing tussen de pipet en dekglaasje aan tijdens toegang) en zijdelingse afstand van de laterale nier capsule tot de glomerulus < 400 µm (buiten deze afstand de afwijking van de pipet kan verhogen kans op een miss).
- Record laterale en verticale afstand tot de punctie punt, een punt op de renale capsule rechtstreeks naar de pipet-kant van de glomerulus.
- Verhogen van het objectieve focal point in de waterkolom, houden de x en y-coördinaten fase ongewijzigd, een afstand van slechts ongeveer een centimeter.
- Het uiteinde van de pipet in de waterkolom drijven en zet 4', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) excitatie. Verplaats de pipet in de x- en y afmetingen tot het punt van maximale fluorescentie van de tip, zal dit het centrum van de doelstelling. Het vinden van de pipet in het oculair is moeilijk zonder deze precieze prepositioning. Omdat quantumdots bij de (in dit geval, rode) dezelfde golflengte ongeacht excitatie golflengte lichten, produceert de DAPI excitatie rode fluorescentie die strak is gericht op de tip, geïllustreerd in Figuur 2.
- De excitatie instellen op rode fluorescente proteïne (RFP) en visualiseren van de pipet in het oculair, dan precies in de oogbeschadigingen en/of weergave centrum.
- Ga naar 2-foton en vinden de pipet onder 2-foton, precies in het midden van de afbeelding plaatst. Dit is het standpunt van de registratie.
- Sla een afbeelding van de pipet.
- De fase en de coördinaten van de controller micropipet registreren.
Opmerking: Gebruik het aanvullende .html-bestand, dat zal het uitvoeren van berekeningen met behulp van JavaScript-code, (voordelige op systemen die niet geïnstalleerde spreadsheetsoftware hoeven) of een werkblad voor het berekenen van de offset tussen fase en Pipetteer coördinaten en te Bereken de coördinaten van het doel voor de pipet controller. - Verwijder de pipet uit de waterkolom in de x-as, z en y hetzelfde houden.
- De pipet Z verplaatst naar het doel glomerulus Z (dat wil zeggen, verplaatst de pipet omlaag in de Z-richting onder het dekglaasje aan)
- Verplaats de pipet Y naar de doelgroep glomerulus Y-coördinaat.
- De 2-foton live view te verplaatsen naar de doelgroep glomerulus Z en vervolgens naar de rand van de nier en noteer de SX.
- Bereken de nier rand PX met behulp van de offset aan vanaf de registratie SX.
- Verplaats het podium richting de Pipet (toename de SX) zodanig dat de rand van de nier ver naar de linkerkant van het scherm, maar nog steeds zichtbaar.
- De pipet snel vooruitgaan naar minder dan de rand van de nier PX berekend boven ongeveer 100 µm.
- Zoek de pipet tip, bevordering van de pipet langzaam. De rode winst verhogen en Bekijk het rode pixel histogram (de pixel distributie verschuivingen voordat de Pipet is beeld in het venster, als gevolg van de extreme helderheid van quantumdots en af-target fluorescentie).
- Vooraf aan de rand van de nieren onder live 2-photon imaging.
Opmerking: Voorafgaand aan het invoeren van de renale capsule, is het mogelijk om de pipet in de Y- en Z-afmetingen. Echter, dit kan breken het uiteinde van de pipet. Een meer conservatieve maatregel, is als de pipet uitgeschakeld target is, te trekken in de X-dimensie tot 2 cm, omleiding en dan terugkeer in de X-dimensie aan de rand van de nier. Zodra de pipet binnen het weefsel is, verkeer in elke willekeurige as dan X leidt tot Pipetteer flexie waarvoor belevenis te maken gebruik van, en vaak leidt tot breuk. - De pipet in de X-as langzaam rijden naar het doel van de glom PX, een oogje op de SX. (Het is handig om af en toe terug te keren naar de glomerulus te zien als het helemaal is verschoven op de invoeging van de micropipet).
- Wanneer u bent op de juiste locatie, document positie met een z-stack.
Opmerking: Met de micropipet op zijn plaats, drugs, eiwitten of fluorescerende traceurs kunnen worden geïnjecteerd, vloeistof kan worden aanzuiging voor latere analyse of druk of heffing ten opzichte van een andere elektrode kan worden gemeten.
5. de aspiratie van vocht vanuit de Bowman ruimte
- Instellen van de micropump te injecteren 100 nL van perfluorodecalin meer dan 2 min minimum te zorgen bij van de pipet verstorende van Pipetteer inpluggen tijdens het invoeren. PowerSchool zodat Pipetteer positie.
- Wacht 4 – 6 min voor extra filtratie.
- Instellen van de micropump tot maximaal 300 gecombineerd nL met een snelheid van maximaal 50 nL/min.
Opmerking: Veranderingen in de morfologie van de glomerulaire niet worden nageleefd met dit tempo doorgaan, suggereert dat het verandert niets aan het tarief van de levering van vloeistof naar de ruimte tijdens aspiratie. Aangezien er geen olie blok zoals in conventionele micropuncture, eventueel herstel van dit volume, nodig voor de Spectrometrie van de massa, enkele van de geïnjecteerde perflourodecalin en eventueel de tubulaire vloeistof. Voor testen zoals ion-gevoelige elektrode metingen Fluorescentiespectroscopie, de Kettingreactie van de polymerase, en andere gevoelige eindpunten, kunnen lagere volumes worden gebruikt. Als massaspectrometrie niet het eindpunt is, kunnen minerale olie en standaard micropuncture technieken worden gebruikt voor het meten van de aanzuiging volume vóór opslag. - Beeld nogmaals.
- Intrekken van de pipet en behouden van het monster, het toevoegen van TRIS buffer en opslaan bij-80 ° vóór de analyse.
- De muis met een overdosis van Isofluraan of een andere goedgekeurde methode euthanaseren.
Opmerking: Filtraat gaat de ruimte door filtratie van de glomerulaire capillairen. De single-Nefron glomerulaire filtratie snelheid (SNGFR) in muizen wordt gemeld tussen 8-14 nL/min.3 Starling krachten regelen SNGFR, echter, en negatieve hydrostatische druk in Bowman ruimte daarom kan SNGFR te verhogen. Standaard micropuncture methoden gebruiken buisvormige blokkade met olie en neutrale druk voor de tubulaire vloeistof bemonstering, maar deze verbindingen verstoren van de Spectrometrie van de massa (zie hieronder); bij deze techniek blijft daarom de vroege proximale zaadvormende patent. Verder, op het moment van aspiratie, Bowman ruimte bevat een onbekende, maar positieve hoeveelheid filtraat. Daarom mag de vloeistof aspiratie tarief SNGFR.
Opmerking: In de experimenten die hier worden beschreven, het doel was om een grotere dan de gebruikelijke monster van het glomerulaire filtraat door nanoproteomic technieken p.a. massaspectrometrie. Omdat gebruik van spectrometrie van de massa zich verzet tegen het gebruik van olie blokken met minerale olie of wax (complexe mengsels van organische moleculen die signaal: ruis in massaspectrometrie) wordt perfluorodecalin gebruikt voor het vullen van de micropipet en de spuit. Perflourodecalin niet bekend is bij het blokkeren van buisvormige stroom, maar is biologisch inert en interfereert niet met massaspectrometrie.
Representative Results
Deze procedure moet een unieke chirurgische voorbereiding van de nier voor 2-foton beeldvorming en toegang, die wordt geïllustreerd in Figuur 1. Deze voorbereiding hier afgebeeld staat een verticale imaging kolom met het doel boven de nier met enkele dichtheid aanpassingen voor de best mogelijke optica voor 2-foton microscopie gelijktijdig met laterale toegang voor de pipet, uitsluitend in de horizontale (x gereden ) dimensie. Gedeeltelijke extrusie van de nier voorkomt dat overmatige spanning op de renale stam en vasculaire stroom behoudt, en bouw van een aangepaste nier-ondersteuning kan de twee doelstellingen van beeldvorming en toegang. De tweede uitdaging in deze procedure is nauwkeurige positionering van de pipet binnen de nier in 3 dimensies, waarvoor registratie van de pipet en fase coördinatenstelsels. De kritieke stap voor dit proces wordt geïllustreerd in Figuur 2, waarin de pipet wordt bevlekt in de waterkolom van de 2-foton microscoop onder DAPI-excitatie. Invoeren van de waterkolom en registreren de coördinaten van de pipet op die van de fase voorafgaand aan het invoeren van de nieren zijn essentieel om precieze stereotactische positionering van de pipet binnen de doelgroep Bowman ruimte. De pipet treedt de imaging waterkolom vanaf de rechterkant. De rode quantum dot beklede pipet fel licht in het rood-oranje met DAPI excitatie ingeschakeld, en het zorgvuldig kan worden geplaatst onder het midden van het doel. Als de lichtbundel excitatie passeert in het midden van het doel, kan de pipet vrijelijk worden verplaatst naar de punt van maximale fluorescentie, ervoor te zorgen dat het zichtbaar in de ooglens zijn zal.
Juiste Pipetteer trekken en glomerulus selectie zijn cruciaal voor het succes van dit protocol, zoals geïllustreerd in Figuur 3, Figuur 4, , Figuur 5. In figuur 3A, kan een goed getrokken, rood-fluorescerende quantum dot-gecoat glas micropipet beeld in de vloeistof kolom tijdens het pipet registratie gedeelte van de procedure worden gezien. De tip is 6 micron in breedte. In figuur 3B, wordt een slecht-trok pipet met 12 µm tip weergegeven. Deze pipet niet kan doordringen de renale capsule zonder vasculaire trauma als gevolg van de 12 µm diameter en onregelmatige tip oppervlak (Let op de bur aan de bovenkant van de schuine kant). In Figuur 3 c en 3D, wordt het belang van optimale positionering in plaats van de glomerulus doel imaging aangegeven. De prachtige, in de buurt van het oppervlak glomerulus geïllustreerd in Figuur 3 c toont gunstige imaging (als gevolg van haar oppervlakte positie op 20 µm onder de renale capsule) maar zou niet geschikt voor toegang door deze procedure omdat het te dicht aan de oppervlakte, en de pipet zou raken het dekglaasje aan. In figuur 3D, optimaal gepositioneerde glomeruli staan. Opmerking de andere schaal gebruikt om te illustreren beide glomeruli (schaal bars zijn alle 50 µm). Deze glomeruli weergegeven minder scherp door breking veroorzaakt door diepte; Dit beeld werd genomen op 70 µm onder de renale capsule. De laterale nier rand is 250 µm naar rechts, beide van deze glomeruli toegankelijk te maken. Tijdens een toegangsprocedure, imaging is strak gericht op de doelgroep glomerulus zoals in Figuur 4en elke seconde Beeldacquisitie wordt gebruikt, waardoor de onderzoeker precies acht positionering van de pipet in Bowman ruimte te nemen.
Figuur 4 illustreert een typische renale ingang en het resultaat, een pipet tip binnen Bowman ruimte. In figuur 4Atoont een gemiddelde intensiteit projectie van een z-stack met orthogonale uitzicht het uiteinde van de pipet in Bowman ruimte. Merk op dat er rode pipette uiteinde spectrale artefact (ronde bal van fluorescentie) als gevolg van extreem helder fluorescentie van de quantumdots gerangschikt op de conische sectie van de tip. In figuur 4Btoont een volume projectie van z-stack gegevens een ander Pipetteer in Bowman ruimte. Merk op dat de pipet Bowman van capsule in de richting van de reis bij binnenkomst maken duidelijk achter de tip tenting gesleept zoals beschreven in het protocol.
In Figuur 5staan de resultaten van een mislukte procedure waarin een pipet met een te grote opening brak op de renale capsule, veroorzaakt bloeden. De pipet was te bot; op probeert te geven van de renale capsule, werd de capsule voorafgaand aan het uiteinde van de pipet geduwd tot breuk is opgetreden. In dit beeld is de renale capsule zichtbaar verbeterd door subcaspular bloeden, in het FITC-belichting fluorescerende groen. FITC signaal is zichtbaar binnen de pipet zelf, waarin wordt aangegeven dat bloed onder druk ingevoerd de pipet lumen. De pijl wijst naar de vele rode bloedcellen zichtbaar binnen de pipet lumen als vulling van de gebreken in de FITC-Dextraan.
Figuur 6 toont een representatieve massaspectrum verkregen Bowman ruimte aspirate, muis urine eiwitten 17 (MUP17). Ten slotte toont de tabel 1 voorbeeld resultaten van succesvolle aspiratie procedures, aanbieding eiwitten geïdentificeerd met behulp van de Spectrometrie van de massa van de nanoschaal op aspirate verzameld van meer dan 6 minuten uit elk van de 3 muizen. In elk geval was de pipet beeld zoals het Bowman ruimte was onttrokken, en geen FITC-fluorescentie werd waargenomen binnen Bowman ruimte of de pipet lumen, gebrek aan aspirate besmetting met plasma aangeeft. 17 eiwitten, vooral met laag molecuulgewicht, werden geïdentificeerd met een minimum van 2 unieke peptiden per eiwit. Spectrale graven zijn laag, in overeenstemming met eerdere schattingen van eiwitten in het glomerulaire filtraat, en bekend van gefilterde eiwitten, zoals vitamine D bindend-proteïne (VTDB), albumine (ALBU) en grote urine eiwitten 17 (MUP17) zijn aanwezig.
Figuur 1: gedeeltelijke extrusie van de nier met aangepaste ondersteuning en immobilisatie voor zijdelingse toegang. Aan de linkerkant, worden de delen van de beeldvorming kolom en nier steun weergegeven, met de volledige vergadering in Midden. Aan de rechterkant, de voorbereiding van de nier wordt weergegeven vóór (boven) en na (zie hieronder) toepassing van de steun. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: nier prep bij Pipetteer registratie stap van protocol voltooid. Hier, wordt DAPI excitatie gebruikt om de positie van de micropipet binnen de waterkolom van de 2 foton microscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Imaging van pipetten en de nier na injectie van FITC-dextran, demonstreren van geschikte en ongeschikte glomeruli voor micropuncture. A. een goed getrokken pipet met 6 µm tip. B. een ruwe-edged, botte tip. C. deze glomerulus is duidelijk omschreven, maar ook dicht bij het dekglaasje aan voor micropuncture. D. Voldoende gepositioneerd glomeruli. Schaal bars zijn alle 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: succesvolle Pipetteer passage leidt tot plaatsing in Bowman ruimte-weergaven van 2 verschillende procedures. A. Z-stack met orthogonale projecties blijkt pipette uiteinde in Bowman ruimte de glomerulaire tuft aangrenzende. De bar van de schaal is 50 µm. B. Volume rendering van z-stack toont ook een pipet in de Bowman ruimte de glomerulaire tuft aangrenzende. De bar van de schaal is 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: een mislukte procedure als gevolg van een botte Pipet, scheuren van de renale capsule en leiden tot bloeden in de pipet lumen. FITC fluorescentie van extravasated plasma, en rode bloedcellen (pijl) zijn zichtbaar in de pipet. Pijl wijst naar de rode bloedcellen zichtbaar binnen de pipet lumen. De bar van de schaal is 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: de massaspectrum voor grote urine eiwitten 17 (MUP17), verkregen uit nanoschaal vloeibare chromatografie/massa spectrometrie analyse van Bowman ruimte aspirate. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Eiwit | MW (kD) | Spectrale graaf betekenen |
| ACTA_MOUSE | 42 | 2 |
| ACTB_MOUSE | 42 | 1 |
| CLPX_MOUSE | 69 | 2.5 |
| DHSA_MOUSE | 73 | 1 |
| FOLR2_MOUSE | 29 | 1 |
| GBLP_MOUSE | 35 | 1 |
| ALBU_MOUSE | 66 | 6.7 |
| HBA_MOUSE | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MOUSE | 110 | 1 |
| MUP17_MOUSE | 21 | 1 |
| PERI_MOUSE | 54 | 1 |
| RNAS4_MOUSE | 17 | 2 |
| SPTB1_MOUSE | 2 | 1 |
| VIME_MOUSE | 54 | 1 |
| VTDB_MOUSE | 53 | 1 |
Tabel 1: Lijst van eiwitten geïdentificeerd in Bowman ruimte aspirate van 3 muizen.
Aanvullende Video 1: een weergave van het volume van een z-stack na plaatsing van een pipet in de Bowman ruimte het uiteinde van de pipet binnen de ruimte demonstreert, de capillaire tuft aangrenzende verworven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Presenteren we een methode voor toegang tot Bowman ruimte voor niet-oppervlakte glomeruli in muizen, vergemakkelijkt door 2-foton microscopie. We ontwikkelden deze procedure om een belangrijke beperking van glomerulaire micropuncture, de zeldzaamheid van oppervlakte glomeruli adresseerbare door 1-foton microscopie in muizen, teneinde een experimentele doelstelling, aspiratie van vocht vanuit de Bowman ruimte voor latere analyse. Ontwikkeling en praktijk van deze techniek is gebaseerd op zes cruciale stappen. Ten eerste, de nieuwe chirurgische voorbereiding moet zorgvuldig plaatsvinden zodat de imaging waterkolom wordt niet uitgevoerd uit het dekglaasje aan en het dekglaasje aan strekt zich uit over het gebied van nieren die het doelwit van de pipet. Ten tweede, de glazen pipet gebruikt voor micropuncture moet prijselementen zichtbaar voor 2-foton microscopie, die worden verricht met behulp van quantumdots. Derde, stereotactische techniek is vereist voor het juist positioneren een pipet in Bowman de ruimte in drie dimensies, tot 100 µm onder het oppervlak van de nier. Daarom zijn registreren de coördinaat systemen van de pipet en het podium met precisie kritische stappen. Vierde, zorgvuldige selectie van de glomerulus doelstelling is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat deze toegankelijk is voor de pipet zonder impingement door de nier ondersteunende structuur en imaging kolom. Ten slotte, zorgvuldig moet worden overwogen de analytische stappen de overname procedure te volgen, en volume en timing van de verwerving van vloeibare monsters gepaard moeten gaan met de analyse en aan glomerulaire fysiologie.
We ontwierpen een overname procedure die kan worden uitgebreid tot veel analyses, met inbegrip van traditionele micropuncture eindpunten, zoals vlam fotometrie, ion-gevoelige elektrode metingen of metingen van druk, volume of lading. Bovendien zijn wij van mening dat deze techniek zal worden vatbaar voor nieuwe analytische eindpunten met inbegrip van de polymerase-kettingreactie (misschien na omgekeerde transcriptie voor miRNA) en metabolomica stroomafwaarts van de Spectrometrie van de massa. De speciale wijzigingen tewerkgesteld te vergemakkelijken van massaspectrometrie verdienen extra discussie, en zij sommige beperkingen opleggen. Eerst, hoewel massaspectrometrie hoogst-gevoelig is, de lage eiwitgehalte en het volume van micropuncture monsters maakt analyse van eiwit onder het dynamische bereik van conventionele proteomic exploratie, en daarom vereenvoudigde nanoproteomics waren nodig. 8 , 13 in de tweede plaats voor het optimaliseren van eiwit opbrengst voor vroege testen, we vastgesteld dat 200-300 nL van aspirate noodzakelijk was, maar DOVO filtraat verwerving van dit volume misschien zo lang als 20 minuten van aspiratie vereisen zou wanneer de muis GFR alleen 8-14 nL /min3. Zoals Tojo en Endou aangetoond dat langdurige aspiratie de inhoud van de albumine van vroege proximale zaadvormende vloeistof14 verandert, wij gekozen om gecombineerd meer dan 6 minuten; Dit betekent echter dat onze aspiratie tarief hoger is dan het filtraat instroom tarief. Gebruikers van deze procedure worden aangemoedigd om te overwegen de Fysiologie van de glomerulaire filtratie in hun experimenteel systeem bij het ontwerpen van hun workflow. De Spectrometrie van de massa, een gevoelige techniek, zou worden overweldigd door het signaal van een ingevoerde aardoliedistillaat zoals minerale olie, die vaak in micropuncture gebruikt wordt om te omvatten van het hydraulisch systeem voor aspiratie en isoleren van de segmenten van het Nefron. Dus, we geen gebruik konden maken van minerale olie voor dit doel, of zijn andere gemeenschappelijke gebruik, kwantificering van hoeveelheid nanoliter bereik monsters. In plaats daarvan vullen we het systeem met perfluorodecalin die biologisch inert, massaspectrometrie niet verstoort en gunstige optische kenmerken heeft. Wij geloven dat de beperkingen opgelegd door de perfluorodecalin zijn niet onoverkomelijk en werken aan extra technische innovaties die wij verwachten volumemeting monster en blokkade van de tubulaire segment zal toestaan.
Meeste micropuncture studies zijn uitgevoerd in München-Wistar ratten, waaruit verhoogde aantallen oppervlakte glomeruli, maar deze sterk beperkte fysiologische studie van buisvormige vervoer en andere renale fysiologie wegens het verlies van de fundamentele hulpmiddel van de moleculaire biologie, transgene muizen2,3. Omdat het vergemakkelijkt de micropipet toegang tot de Bowman ruimte in muizen, vermindert de nieuwe techniek daarom deze kritische beperkingen. We hebben deze techniek om toegang van renale filtraat voor proteomic studies met ultragevoelige massaspectrometrie, bekend als de nanoproteomics9te aangenomen. Er zijn echter waarschijnlijk extra toepassingen. Bijvoorbeeld, heeft renale fysiologische studie van gefilterde eiwit sterk geholpen door gebruik van TL traceurs met 2-foton microscopie15,16,17. Toevoeging van micropuncture aan 2-foton microscopie biedt de mogelijkheid van het uitvoeren van single-Nefron fysiologische studie met fluorescerende moleculen, zodat naburige, niet-ingespoten nephrons om te dienen als besturingselementen. Gehoopt wordt dat dit duidelijke uitleg van de noodzakelijke stappen zal toestaan dat brede goedkeuring in laboratoria die reeds uitgerust voor 2-foton microscopie en/of micropuncture. Hoewel het complex, wij hebben deze procedure nu uitgevoerd vele malen en de verfijningen gepresenteerd hierin vertegenwoordigen een stabiel platform voor fysiologische ontdekking.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
NIDDK K08 DK090754 naar NIGMS MPH. P41 GM103493 naar RDS. Dit materiaal is het resultaat van werk (door MPH) die werd gesteund met middelen en het gebruik van faciliteiten in het Portland veteranen zaken Medical Center. De inhoud vertegenwoordigen niet de mening van het Amerikaanse Department of Veterans Affairs of de regering van de Verenigde Staten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| 3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
| 3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
| Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
| PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Microinjector | WPI | UMP-3 | |
| Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
| Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| 30 G needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
| Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |
References
- Schnermann, J. Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).
- Lorenz, J. N. Micropuncture of the kidney: a primer on techniques. Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).
- Vallon, V. Micropuncturing the nephron. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
- Gimenez, Y., et al. 3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. Scientific Reports. 6, 29936 (2016).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
- Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling. Methods in Molecular Biology. , (2017).
- Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications. Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).
- Clair, G., et al. Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples. Scientific Reports. 6, 39223 (2016).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).
- Andrasfalvy, B. K., et al. Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology. Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), (2016).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
- Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).
- Salmon, A. H., et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).
