Summary
हम 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के उपयोग के लिए चूहों में बोमन मूत्र अंतरिक्ष के भीतर एक micropipette जगह है, गुर्दे शरीर क्रिया विज्ञान के 2 मूलभूत तकनीकों के संयोजन. 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग micropuncture गुर्दे फिजियोलॉजी अध्ययन के लिए पारंपरिक माइक्रोस्कोपी की महत्वपूर्ण सीमाओं पर काबू ।
Abstract
गुर्दे micropuncture और गुर्दे 2-फोटॉन इमेजिंग गुर्दे शरीर क्रिया विज्ञान में लाभदायक तकनीक हैं । हालांकि, micropuncture पारंपरिक माइक्रोस्कोपी पर निर्भरता nephron सुविधाओं की सतह के लिए सीमित है, और 2-फोटॉन अध्ययन में सीमित है कि हस्तक्षेप केवल अंग पर मूल्यांकन किया जा सकता है, बजाय nephron स्तर । विशेष रूप से चूहों के glomeruli के micropuncture अध्ययनों को चूहों में सतह glomeruli की धनाभाव से चुनौती दी गई है. इस सीमा का पता करने के लिए माउस शारीरिक मॉडल में है बोमन अंतरिक्ष से महाप्राण के अध्ययन का पीछा करने के लिए, हम 2 विकसित-फोटॉन glomerular micropuncture । हम 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक ऊर्ध्वाधर इमेजिंग कॉलम के संरक्षण, जबकि गुर्दे के लिए पार्श्व का उपयोग की अनुमति देता है कि एक उपंयास शल्य तैयारी प्रस्तुत करते हैं । उच्च आणविक भार fluorescein isothiocyanate (FITC) के प्रशासन-dextran गुर्दे vasculature और इसलिए 2-glomeruli इमेजिंग के लिए दिखाई फोटॉन प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक क्वांटम डॉट लेपित पिपेट तो स्टीरियोटैक्टिक मार्गदर्शन के तहत एक कई जो इमेजिंग विंडो के भीतर visualized किया जा सकता है कई से चयनित glomerulus के लिए शुरू की है । इस प्रोटोकॉल में, हम तैयारी, सामग्री, और प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक तरीकों का विवरण प्रदान करते हैं । इस तकनीक के पहले-असंभव शारीरिक अध्ययन की सुविधा, बोमन की अंतरिक्ष से निस्पंदन की वसूली सहित और इमेजिंग गहराई सीमा के भीतर nephron के सभी क्षेत्रों, गुर्दे कैप्सूल के बारे में १०० µm के नीचे. दबाव, चार्ज और प्रवाह सभी शुरू पिपेट का उपयोग कर मापा जा सकता है । यहां, हम तरल क्रोमैटोग्राफी/जन स्पेक्ट्रोमेट्री से प्रतिनिधि डेटा प्रदान करते है बोमन अंतरिक्ष से महाप्राण पर प्रदर्शन किया । हम इस तकनीक गुर्दे शारीरिक जांच में व्यापक प्रयोज्यता की उंमीद है ।
Introduction
इस प्रक्रिया का उद्देश्य है बोमन अंतरिक्ष और चूहों में अन्य glomerular संरचनाओं के लिए नियमित micropuncture पहुँच प्रदान करना है. गुर्दे शरीर क्रिया विज्ञान के लिए Micropuncture अध्ययन 1-फोटॉन माइक्रोस्कोपी करने के लिए सीमित किया गया है, जो केवल गुर्दे की सतह के कुछ माइक्रोन के भीतर छवि कर सकते हैं, और जो z-आयाम में सीमित परिशुद्धता प्रदान करता है. क्योंकि चूहों कुछ सतह glomeruli है, यह हमेशा संभव नहीं है एक सतह glomerulus द्वारा खोजने के लिए 1-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, इसलिए सबसे micropuncture अध्ययन किया गया है ंयूनिख-Wistar चूहों, जो और अधिक कई सतह glomeruli है. इसलिए, माउस मॉडल में काम करने का लाभ micropuncture अध्ययन1,2,3में सीमित किया गया है । इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में हाल ही में अग्रिमों, माइक्रो सीटी सहित4,5, nanoparticle इमेजिंग6, और इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री7 बहुत glomerular फिजियोलॉजी के लिए लागू मोडलों की सीमा को बढ़ाया है, लेकिन वहां अद्वितीय हस्तक्षेप करने की क्षमता और नमूना है कि micropuncture प्रदान करता है के लिए कोई विकल्प नहीं है । इसलिए micropuncture के उपयोग का विस्तार यहां प्रस्तुत तकनीकों का उपयोग करने के लिए उपंयास गुर्दे फिजियोलॉजी अध्ययन की सुविधा की उंमीद है, विशेष रूप से, गुर्दे निस्पंदन की सामग्री का मूल्यांकन (यानी, metabolomics) और बुनियादी शरीर क्रिया विज्ञान के ट्रांसजेनिक चूहों, ऐसे छानने का दबाव और आरोप की माप के रूप में, पहले ही चूहों में प्रदर्शन किया.
इस तकनीक में, 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के प्रयोग से गुर्दे की कैप्सूल नीचे के बारे में १०० µm करने के लिए गुर्दा संरचनाओं के लिए दृश्य और micropipette का उपयोग की अनुमति देता है । एकाधिक (5-10) glomeruli इसलिए हर माउस गुर्दे इस प्रकार अब तक छवि में micropuncture के लिए सुलभ हैं । हालांकि यह तकनीक पारंपरिक गुर्दे micropuncture के साथ कुछ सुविधाओं के शेयरों, यह de नोवो और पारंपरिक तकनीक से व्यापक संशोधनों के डिजाइन किया गया है की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल में हम है बोमन अंतरिक्ष और शो मास स्पेक्ट्रोमेट्री (nanoproteomics)8,9,10,11के साथ बाद विश्लेषण के उदाहरण के परिणाम से द्रव की आकांक्षा का प्रदर्शन । जन स्पेक्ट्रोमेट्री के बहाव का उपयोग एक विशेष नमूना तैयारी कार्यप्रवाह है, जो भी यहां का प्रदर्शन किया है की आवश्यकता है ।
Protocol
सभी प्रक्रियाओं यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और ओरेगन स्वास्थ्य और विज्ञान विश्वविद्यालय के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया सेटअप
- एक ईमानदार 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप, एक 3-अक्ष चरण नियंत्रक, एक headstage/पिपेट धारक का उपयोग करें, और headstage/पिपेट धारक के लिए एक 3-अक्ष नियंत्रक; इन मदों की सभी चार आवश्यक हैं ।
नोट: कई समान setups उपलब्ध है और स्वतंत्र मात्रात्मक 3 के रूप में लंबे समय के रूप में पर्याप्त होगा पिपेट और माइक्रोस्कोप मंच के अक्ष नियंत्रण उपलब्ध हैं, और माइक्रोस्कोप के लिए स्थापित है vivo ईमानदार इमेजिंग में ।
2. आवश्यक सामग्री प्रायोगिक प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले
- गुर्दे vasculature को चिह्नित करने के लिए retroorbital इंजेक्शन के लिए सामान्य खारा या फॉस्फेट-FITC खारा में 5% समाधान-dextran, २,०००,००० दा, का उपयोग करें । इस आणविक वजन (मेगावाट) चुना जाता है क्योंकि यह vasculature में रहता है और फिल्टर नहीं है ।
- मशीन खींच लिया borosilicate ग्लास micropipettes: micropipettes 6 करने के लिए खींचो-10 µm टिप लंबी शंकु का उपयोग कर, बंद टिप सेटिंग्स (जैसे, हीट = ६१०, वेग = १५०, समय = २५० ms,) एक micropipette खींचने पर looped. बेवल से ४५ ° और लौ-पॉलिश हल्के से ।
- क्वांटम-micropipettes के कोटिंग डॉट: कोट micropipette संदर्भित प्रोटोकॉल के अनुसार क्वांटम डॉट्स के साथ युक्तियां । 12
- Polysiloxane गुर्दे का समर्थन/ एक गुर्दा समर्थन/स्पेसर शिल्प के लिए polysiloxane पुटी का प्रयोग करें । फैशन एक 1 एक्स 1 सेमी2 द्वारा 5 मिमी मोटी सही कोण rhomboid (यानी, एक छोटा घन) polysiloxane पुटी से । एक किनारे से polysiloxane के बीच ७०% निकालें और एक सर्कल rhomboid के केंद्र के बारे में ७०% शामिल । polysiloxane 24 एच के लिए शुष्क करने की अनुमति दें । चित्र 1देखें ।
- Microinjector तैयारी: पॉलीथीन की लंबाई (पीई) भरना-५० टयूबिंग और तेल के साथ micropipette भरी micropipette धारक । यदि मास स्पेक्ट्रोमेट्री की योजना है, perfluorodecalin आवश्यक है, अन्यथा खनिज तेल का उपयोग किया जा सकता है । एक गैस तंग हैमिल्टन प्रकार सिरिंज के साथ microinjector सेट और perfluorodecalin के साथ भरें । यह पीई-५० टयूबिंग और पिपेट धारक से जुड़ा होगा ।
- पिपेट धारक में पिपेट प्लेस और आगे पीई-५० टयूबिंग और पिपेट भरने के लिए, तो पीई के समीपस्थ अंत-५० टयूबिंग तेल से भरा हैमिल्टन सिरिंज, पिपेट से सिरिंज के लिए एक हाइड्रोलिक प्रणाली बनाने संलग्न ।
3. पार्श्व पिपेट एक उपंयास शल्य प्रक्रिया के माध्यम से एक द्रव इमेजिंग कॉलम के नीचे गुर्दे के लिए उपयोग
नोट: इमेजिंग समर्थन प्रणाली और शल्य चिकित्सा तैयारी की विधानसभा चित्रा 1में दिखाया गया है । C57BL/6 20-25 जी वजन चूहों पर किया जाता है वर्णित प्रक्रिया ।
- माउस तौलना ।
- 4% isoflurane का उपयोग कर संज्ञाहरण के लिए प्रेरित और हवा में 1.5-2.5% isoflurane के साथ बनाए रखने/ पुष्टि करें कि माउस दर्दनाक उत्तेजना और कम श्वसन दर की प्रतिक्रिया के अभाव से anesthetized है ।
- आंखें चिकना और एक baseplate पर जानवर पार्श्व स्थिति । टेप का उपयोग कर 4 अतिवादी मैटीरियल ।
- सामान्य खारा, २०० µ एल इंजेक्शन, चमड़े के नीचे और एक गुदा तापमान जांच जगह है । नियंत्रण तापमान सर्जरी के दौरान एक हीटिंग लैंप का उपयोग कर और इमेजिंग के दौरान एक हीटिंग पैड ।
- एक लोमनाशक क्रीम का उपयोग कर माउस के बाईं ओर सभी बाल निकालें ।
- तिल्ली का पता लगाएँ, जो त्वचा के नीचे दिखाई दे रहा है, और तिल्ली के पृष्ठीय और caudal ओर बाईं गुर्दे का पता लगाने.
- त्वचा पर एक ०.५ सेमी चीरा बनाने के लिए और बस के माध्यम से आसानी से पुश करने के लिए गुर्दे के लिए पर्याप्त है, पर छोटे चीरा ।
- कोमल दबाव के साथ गुर्दे को बाहर निकालना । गुर्दा स्थिरता गुर्दे के आसपास polysiloxane के साथ बनाया फार्म प्लेस और cyanoacrylate चिपकने के साथ ठीक । रेखा की किडनी को स्पेसर के साथ इस तरह कि पार्श्व-गुर्दे की सबसे सतह के बारे में 1 मिमी द्वारा स्थिरता से परे फैली हुई है ।
- गोंद के साथ स्थिरता के रूप में एक सिर थाली फिक्स और बेस प्लेट पर बढ़ते सलाखों के लिए सिर थाली माउंट ।
- 1% agarose समाधान के साथ गुर्दे आसपास के polysiloxane समर्थन में अच्छी तरह से भरें और शीर्ष पर 10 मिमी coverslip जगह है और जब तक agarose फर्म है पकड़ो । सील coverslip गोंद के साथ सिर थाली और दंत सीमेंट के साथ coverslip के आसपास एक अंगूठी बनाने के लिए ।
- सुई FITC-dextran (२,०००,००० दा, 5% समाधान, 100-150 µ एल) रेट्रो-कक्षीय और जल्दी से 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप चरण के लिए माउस और निर्धारण प्लेट चाल, संज्ञाहरण को बनाए रखने और पर्याप्त अपशिष्ट गैस माइक्रोस्कोपी मंच पर सफाई सुनिश्चित करने.
4. एक उपयुक्त Glomerulus और बोमन अंतरिक्ष के लिए पिपेट का उपयोग का चयन
-
परिभाषाएँ:
- स्क्रीन पर बाएं-दाएं के रूप में X को परिभाषित करें और बाएं-दाएं माइक्रोस्कोप का सामना करना
- मंच नियंत्रक से एसएक्स (स्टेज एक्स) पढ़ें
- पिपेट डायल नियंत्रक पर पिपेट X के रूप में पिक्स परिभाषित करें
- परिभाषित अप के रूप में वाई स्क्रीन पर नीचे और माइक्रोस्कोप की ओर आगे और वापस की ओर 2-फोटॉन सेटअप
- छत की ओर के रूप में जेड को परिभाषित, फर्श की ओर नीचे, और उद्देश्य z स्थिति के साथ मंच पर मापा ।
- परिभाषित एस (ओ) Z चरण के रूप में (वास्तव में उद्देश्य) ऊंचाई ।
-
गुर्दे की सतह का पता लगाएं, आंख में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) फिल्टर सेटिंग्स का उपयोग कर पहचाने जाने योग्य । FITC-Dextran के इंजेक्शन के कारण vasculature चमकीले हरे रंग के हो जाएंगे ।
- एक उपयुक्त glomerulus की पहचान करें । आंख का उपयोग कर गुर्दे की सतह की पहचान करने के बाद, 2-फोटॉन (गैर स्कैनिंग मोड) और इमेजिंग विंडो का पता लगाने के लिए स्विच । micropuncture के लिए अनुकूल विशेषताएं निम्नलिखित हैं: coverslip के नीचे खड़ी दूरी > 30 µm (प्रवेश के दौरान पिपेट और coverslip के बीच टकराव को रोकने के लिए) और पार्श्व गुर्दा कैप्सूल से पार्श्व दूरी glomerulus करने के लिए < 400 µm (इस दूरी से परे पिपेट के विचलन एक मिस की संभावना बढ़ सकता है) ।
- पंचर बिंदु के लिए पार्श्व और ऊर्ध्वाधर दूरी रिकॉर्ड, पिपेट के लिए सीधे गुर्दे कैप्सूल पर एक बिंदु glomerulus की ओर ।
- पानी कॉलम में उद्देश्य फोकल प्वाइंट उठाएं, एक्स और वाई चरण अपरिवर्तित निर्देशांक, बस के बारे में एक सेंटीमीटर की दूरी रखते हुए ।
- पानी के कॉलम में पिपेट टिप ड्राइव और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) उत्तेजना पर बारी । x और y आयामों में पिपेट टिप के अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति के बिंदु पर ले जाएं, यह उद्देश्य का केंद्र होगा । आंख में पिपेट ढूंढना इस सटीक स्थिति के बिना मुश्किल है । क्योंकि क्वांटम डॉट्स fluoresce में ही (इस मामले में, लाल) तरंग दैर्ध्य उत्तेजना तरंग दैर्ध्य की परवाह किए बिना, DAPI उत्तेजना लाल प्रतिदीप्ति जो कसकर टिप पर केंद्रित है, चित्रा 2में सचित्र पैदा करता है ।
- लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के लिए उत्तेजना सेटिंग बदलें और आंख में पिपेट कल्पना है, तो ठीक यह आंख देखने में केंद्र ।
- 2-फोटॉन के लिए स्विच और 2 के तहत पिपेट-फोटॉन, यह ठीक छवि के केंद्र में रखने लगता है । यह पंजीकरण की स्थिति है ।
- पिपेट की एक छवि सहेजें ।
- चरण और micropipette नियंत्रक निर्देशांक पंजीकृत करें ।
नोट: पूरक. html फ़ाइल का उपयोग करें, जो जावास्क्रिप्ट कोड का उपयोग कर गणना निष्पादित करेगा, (सिस्टम पर लाभप्रद जो स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर स्थापित नहीं है) या एक स्प्रेडशीट चरण और पिपेट निर्देशांक के बीच ऑफसेट की गणना करने के लिए और करने के लिए पिपेट नियंत्रक के लिए लक्ष्य निर्देशांक परिकलित करें. - पिपेट को x अक्ष में, z और y को समान रखते हुए जल स्तंभ से निकालें ।
- पिपेट z को लक्ष् glomerulus z पर ले जाएं (यानी, पिपेट को coverslip के नीचे z दिशा में नीचे की ओर ले जाएं)
- पिपेट y लक्ष्य glomerulus y समंवय करने के लिए ले जाएं ।
- लक्ष्य glomerulus Z करने के लिए 2-फोटॉन लाइव दृश्य ले जाएँ और फिर गुर्दे के किनारे करने के लिए और एसएक्स ध्यान दें.
- पंजीकरण एसएक्स से ऑफसेट का उपयोग कर गुर्दा एज पिक्सल की गणना ।
- पिपेट की ओर मंच ले जाएं (एसएक्स बढ़ाएं) ऐसी है कि गुर्दे के किनारे दूर स्क्रीन के बाईं ओर है, लेकिन अभी भी दिखाई ।
- ऊपर की गणना की गई किडनी एज पिक्सल से कम के बारे में १०० µm को जल्दी पिपेट एडवांस ।
- पिपेट टिप का पता लगाएँ, पिपेट धीरे आगे बढ़. लाल लाभ बढ़ाएँ और लाल पिक्सेल हिस्टोग्राम देखें (पिक्सेल वितरण पिपेट विंडो में imaged है पहले, क्वांटम डॉट्स और ऑफ-टारगेट प्रतिदीप्ति की चरम चमक के कारण) ।
- जी 2-फोटॉन इमेजिंग के तहत गुर्दे की बढ़त के लिए अग्रिम ।
नोट: गुर्दे कैप्सूल में प्रवेश करने से पहले, यह वाई और जेड आयामों में पिपेट अनुप्रेषित करने के लिए संभव है. हालांकि, यह पिपेट टिप भंग हो सकता है । पिपेट लक्ष्य से बाहर है, तो एक और अधिक रूढ़िवादी उपाय, एक्स आयाम में 2 सेमी, अनुप्रेषित करने के लिए वापस लेने के लिए है, और फिर गुर्दे की बढ़त के लिए एक्स आयाम में वापसी । पिपेट ऊतक के भीतर है एक बार, एक्स के अलावा अन्य किसी भी धुरी में आंदोलन पिपेट फ्लेक्स जो महान अनुभव का उपयोग करने के लिए की आवश्यकता होती है, और अक्सर टूटना करने के लिए सुराग की ओर जाता है. - X अक्ष में पिपेट को धीरे से glom लक्ष्य पिक्सेल में ड्राइव करें, एसएक्स पर नज़र रखते हुए । (यह glomerulus को वापस जाने के लिए अगर यह सब पर micropipette की प्रविष्टि पर स्थानांतरित कर दिया है देखने के लिए उपयोगी है) ।
- जब आप सही स्थान में हैं, तो एक z-स्टैक के साथ दस्तावेज़ स्थिति ।
नोट: जगह में micropipette के साथ, दवाओं, प्रोटीन, या फ्लोरोसेंट अनुरेखकों इंजेक्शन किया जा सकता है, द्रव बाद में विश्लेषण के लिए aspirated हो सकता है, या दबाव या एक और इलेक्ट्रोड के सापेक्ष चार्ज मापा जा सकता है.
5. बोमन अंतरिक्ष से द्रव की आकांक्षा
- micropump सेट करने के लिए 2 मिनट से अधिक perfluorodecalin के १०० nL इंजेक्षन करने के लिए पिपेट की प्रत्यक्षता सुनिश्चित करने और प्रवेश के दौरान पिपेट plugging से निराधार कम । पिपेट स्थिति सुनिश्चित करने के लिए छवि ।
- अतिरिक्त निस्पंदन के लिए 4-6 मिनट रुको ।
- micropump को ५० nL/min तक की दर पर ३०० nL तक महाप्राण करने के लिए सेट करें ।
नोट: glomerular आकृति विज्ञान में परिवर्तन इस दर के साथ स्वीकार्य नहीं हैं, यह सुझाव है कि आकांक्षा के दौरान अंतरिक्ष के लिए तरल पदार्थ के वितरण की दर में परिवर्तन नहीं करता है । के रूप में पारंपरिक micropuncture में कोई तेल ब्लॉक के रूप में, इस मात्रा की वसूली, जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए आवश्यक है, इंजेक्शन perflourodecalin और संभवतः ट्यूबलर द्रव के कुछ शामिल हो सकते हैं । जैसे आयन-संवेदी इलेक्ट्रोड माप प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी, पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया, और अन्य संवेदनशील अंतिमबिंदु के रूप में परख के लिए, निम्न वॉल्यूम का उपयोग किया जा सकता है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री समापन बिंदु नहीं है, तो खनिज तेल और मानक micropuncture तकनीक aspirated मात्रा भंडारण करने से पहले मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । - छवि एक बार फिर ।
- पिपेट को वापस लेने और नमूने की रक्षा, TRIS बफर जोड़ने और पर भंडारण-८० ° विश्लेषण से पहले ।
- isoflurane या अन्य अनुमोदित विधि के ओवरडोज़ का उपयोग करके माउस को Euthanize.
नोट: निस्पंदन glomerular केशिकाओं से निस्पंदन द्वारा अंतरिक्ष में प्रवेश करती है । चूहों में एकल-nephron glomerular निस्पंदन दर (SNGFR) के बीच रिपोर्ट की जाती है 8 – 14 nL/न्यूनतम3 सारिका बलों को नियंत्रित SNGFR, तथापि, और बोमन अंतरिक्ष में नकारात्मक हीड्रास्टाटिक दबाव इसलिए बढ़ सकता है SNGFR । मानक micropuncture तरीकों ट्यूबलर द्रव नमूना के लिए तेल और तटस्थ दबाव के साथ ट्यूबलर नाकाबंदी का उपयोग करें, लेकिन इन यौगिकों बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ हस्तक्षेप (नीचे देखें); इसलिए, इस तकनीक में जल्दी समीपस्थ tubule पेटेंट रहता है. इसके अलावा, आकांक्षा के समय में, बोमन अंतरिक्ष छानने का एक अज्ञात, लेकिन सकारात्मक मात्रा में शामिल है । इसलिए, द्रव आकांक्षा दर SNGFR से अधिक हो सकती है ।
नोट: प्रयोगों में यहाँ वर्णित, लक्ष्य nanoproteomic तकनीक द्वारा जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए glomerular छानने का एक सामान्य नमूना से एक बड़ा प्राप्त करने के लिए किया गया था. खनिज तेल या मोम के साथ तेल ब्लॉकों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री precludes उपयोग के बाद से (कार्बनिक अणुओं जो संकेत को कम करने के जटिल मिश्रण: मास स्पेक्ट्रोमेट्री में शोर) perfluorodecalin को micropipette और सिरिंज भरने के लिए प्रयोग किया जाता है । Perflourodecalin ट्यूबलर प्रवाह ब्लॉक करने के लिए ज्ञात नहीं है, लेकिन जैविक रूप से निष्क्रिय है और जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।
Representative Results
इस प्रक्रिया 2-फोटॉन इमेजिंग और उपयोग, जो चित्र 1में सचित्र है के लिए गुर्दे की एक अनूठी शल्य तैयारी की आवश्यकता है । यह यहां दिखाया तैयारी के लिए सबसे अच्छा संभव प्रकाशिकी के लिए कुछ घनत्व परिवर्तन के साथ गुर्दे के ऊपर उद्देश्य के साथ एक ऊर्ध्वाधर इमेजिंग कॉलम की अनुमति देता है 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी पिपेट के लिए पार्श्व का उपयोग के साथ, क्षैतिज में विशेष रूप से संचालित (x आयाम. गुर्दे की आंशिक बाहर निकालना गुर्दे pedicle पर अतिरिक्त तनाव को रोकता है और संवहनी प्रवाह को बरकरार रखता है, और एक कस्टम गुर्दा समर्थन के निर्माण इमेजिंग और उपयोग के दो उद्देश्यों को सक्षम बनाता है । इस प्रक्रिया में दूसरी चुनौती 3 आयामों में गुर्दे के भीतर पिपेट की सटीक स्थिति है, जो पिपेट और मंच समंवय प्रणाली के पंजीकरण की आवश्यकता है । इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण कदम चित्रा 2में सचित्र है, जो पिपेट के पानी के कॉलम में देखा जा रहा है पता चलता है 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत DAPI-उत्तेजना. पानी कॉलम में प्रवेश और चरण के उन करने के लिए पिपेट के निर्देशांक दर्ज करने से पहले गुर्दे के लक्ष्य है बोमन अंतरिक्ष के भीतर पिपेट की सटीक स्टीरियोटैक्टिक स्थिति सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण है । पिपेट सही से इमेजिंग पानी कॉलम में प्रवेश करती है । साथ DAPI उत्तेजना चालू, लाल क्वांटम डॉट लेपित पिपेट fluoresces चमकीले लाल-नारंगी, और यह ध्यान से उद्देश्य के बीच में तैनात किया जा सकता है । के रूप में उत्तेजना बीम उद्देश्य के केंद्र के माध्यम से गुजरता है, पिपेट स्वतंत्र रूप से अधिकतम प्रतिदीप्ति के मुद्दे पर ले जाया जा सकता है, यह सुनिश्चित करना है कि यह ऐपिस में दिखाई जाएगी ।
उचित पिपेट पुलिंग और glomerulus चयन इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं, के रूप में चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5में सचित्र । चित्र 3ए में, एक अच्छी तरह से खींच लिया, लाल फ्लोरोसेंट क्वांटम डॉट-लेपित ग्लास micropipette द्रव कॉलम में प्रक्रिया के पिपेट पंजीकरण भाग के दौरान imaged देखा जा सकता है । टिप चौड़ाई में 6 माइक्रोन है । चित्र 3 बीमें, एक खराब खींचा पिपेट 12 µm टिप के साथ दिखाया गया है । यह पिपेट 12 µm व्यास और अनियमित टिप सतह की वजह से संवहनी आघात के कारण के बिना गुर्दे कैप्सूल घुसना नहीं कर सकते (बेवल के शीर्ष पर ब्र नोट) । चित्रा 3 सी और 3 डीमें, लक्ष्य glomerulus की इमेजिंग के बजाय इष्टतम स्थिति के महत्व को दिखाया गया है । चित्र 3 सी में सचित्र सुंदर, सतह glomerulus अनुकूल इमेजिंग दर्शाता है (गुर्दे कैप्सूल के नीचे 20 µm पर इसकी सतह की स्थिति के कारण), लेकिन यह भी सतह के करीब है, क्योंकि यह प्रक्रिया द्वारा उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं होगा, और पिपेट coverslip मारा जाएगा । चित्रा 3 डीमें, इष्टतम तैनात glomeruli दिखाए जाते हैं । नोट दोनों glomeruli (स्केल पट्टियाँ सभी ५० µm) को समझाने के लिए उपयोग किया गया भिन्न स्केल है । ये glomeruli गहराई के कारण अपवर्तन के कारण कम तीक्ष्ण दिखाई देते हैं; यह छवि गुर्दे कैप्सूल के नीचे ७० µm पर ली गई थी । पार्श्व गुर्दा एज सही करने के लिए २५० µm है, इन दोनों glomeruli सुलभ बनाने । एक पहुंच प्रक्रिया के दौरान, इमेजिंग कसकर लक्ष्य glomerulus पर ध्यान केंद्रित है के रूप में 4 चित्रा, और हर दूसरी छवि अधिग्रहण किया जाता है, अंवेषक ठीक बोमन अंतरिक्ष में पिपेट की स्थिति का निरीक्षण करने की अनुमति ।
चित्रा 4 एक ठेठ गुर्दे की प्रविष्टि और परिणाम, है बोमन अंतरिक्ष के भीतर एक पिपेट टिप दिखाता है । चित्रा 4aमें, एक z-ओर्थोगोनल विचारों के साथ ढेर से एक मतलब तीव्रता प्रक्षेपण है बोमन अंतरिक्ष में पिपेट टिप दर्शाता है । ध्यान दें कि वहां लाल पिपेट टिप वर्णक्रमीय विरूपण साक्ष्य (प्रतिदीप्ति के दौर गेंद) क्वांटम बिंदु टिप के शंकु खंड पर व्यवस्था की अत्यंत उज्ज्वल प्रतिदीप्ति के कारण है । चित्रा 4Bमें, z-ढेर डेटा का एक खंड प्रक्षेपण बोमन अंतरिक्ष में एक और पिपेट दर्शाता है । ध्यान दें कि पिपेट प्रवेश पर यात्रा की दिशा में है बोमन कैप्सूल घसीटा, स्पष्ट युक्ति के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित के पीछे टेंट बनाने ।
चित्रा 5में, एक असफल प्रक्रिया के परिणाम में दिखाया गया है जिसमें एक बहुत-बड़ी खोलने के साथ एक पिपेट गुर्दे कैप्सूल पर टूट गया, के कारण खून बह रहा. पिपेट भी कुंद थी; गुर्दे कैप्सूल पारित करने का प्रयास करने पर, कैप्सूल पिपेट टिप के आगे धक्का दिया जब तक टूटना हुआ था. इस छवि में, गुर्दे कैप्सूल दिखाई देता है, subcaspular रक्तस्राव से बढ़ाकर, FITC-फ्लोरोसेंट हरी में. FITC संकेत पिपेट ही भीतर दिखाई दे रहा है, यह दर्शाता है कि दबाव के तहत रक्त पिपेट लुमेन में प्रवेश किया । तीर कई लाल रक्त FITC में दोष भरने के रूप में पिपेट लुमेन के भीतर दिखाई कोशिकाओं को अंक-dextran ।
चित्रा 6 एक प्रतिनिधि जन है बोमन अंतरिक्ष महाप्राण, माउस मूत्र प्रोटीन 17 (MUP17) से प्राप्त स्पेक्ट्रम को दर्शाया गया है । अंत में, 1 तालिका सफल आकांक्षा प्रक्रियाओं के उदाहरण के परिणाम को दर्शाता है, लिस्टिंग प्रोटीन महाप्राण पर नेनो जन स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर की पहचान 3 चूहों में से प्रत्येक से 6 मिनट से अधिक एकत्र । प्रत्येक मामले में, पिपेट के रूप में यह बोमन अंतरिक्ष से वापस ले लिया गया था, और कोई FITC प्रतिदीप्ति है बोमन अंतरिक्ष या पिपेट लुमेन, प्लाज्मा के साथ महाप्राण संदूषण की कमी का संकेत के भीतर मनाया गया था । 17 प्रोटीन, मुख्य रूप से कम आणविक वजन के, प्रोटीन प्रति 2 अद्वितीय पेप्टाइड्स की एक ंयूनतम से पहचान की गई । वर्णक्रमीय गिनती कम कर रहे हैं, glomerular निस्पंदन में प्रोटीन के पूर्व अनुमान के अनुरूप है, और विटामिन डी बाध्यकारी प्रोटीन (VTDB), एल्ब्युमिन (अलबू), और प्रमुख मूत्र प्रोटीन 17 (MUP17) के रूप में जाना जाता है फ़िल्टर्ड प्रोटीन, मौजूद हैं ।
चित्रा 1: कस्टम समर्थन और पार्श्व का उपयोग करने के लिए स्थिरीकरण के साथ गुर्दे की आंशिक बाहर निकालना । बाईं ओर, इमेजिंग कॉलम और गुर्दे के समर्थन के भागों में केंद्र में पूर्ण विधानसभा के साथ, दिखाया जाता है । सही पर, गुर्दे की तैयारी से पहले दिखाया गया है (ऊपर) और बाद (नीचे) समर्थन के आवेदन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: पिपेट पंजीकरण प्रोटोकॉल के कदम पर पूरा गुर्दा तैयारी । यहां, DAPI उत्तेजना 2 फोटॉन माइक्रोस्कोप के जल कॉलम के भीतर micropipette की स्थिति का इस्तेमाल किया जा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: पिपेट की इमेजिंग और FITC के इंजेक्शन के बाद गुर्दे-dextran, micropuncture के लिए उपयुक्त और अनुपयुक्त glomeruli का प्रदर्शन. a. एक अच्छी तरह से खींचा पिपेट 6 µm टिप के साथ । B. एक रफ-धार, कुंद टिप । C. यह glomerulus अच्छी तरह से परिभाषित है, लेकिन micropuncture के लिए coverslip के पास भी है । घ. मोटरयान तैनात glomeruli. स्केल बार्स सभी ५० µm हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: सफल पिपेट पारित होना है बोमन अंतरिक्ष में स्थान की ओर जाता है-2 अलग प्रक्रियाओं से विचार । ए जेड ओर्थोगोनल अनुमानों के साथ ढेर है बोमन अंतरिक्ष में पिपेट टिप glomerular गुच्छा abutting दर्शाता है । स्केल बार ५० µm. B. जेड से मात्रा प्रतिपादन-ढेर इसी तरह है बोमन अंतरिक्ष में एक पिपेट glomerular गुच्छा abutting दर्शाता है । स्केल बार १०० µm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 5: एक कुंद पिपेट के कारण एक असफल प्रक्रिया, गुर्दे कैप्सूल फाड़ और पिपेट लुमेन में खून बह रहा करने के लिए अग्रणी. extravasated प्लाज्मा से FITC प्रतिदीप्ति, और लाल रक्त कोशिकाओं (तीर) पिपेट के भीतर दिखाई दे रहे हैं । पिपेट लुमेन के भीतर दिखाई लाल रक्त कोशिकाओं को तीर अंक. स्केल बार ५० µm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 6: प्रमुख मूत्र 17 (MUP17), नेनो तरल क्रोमैटोग्राफी से प्राप्त के लिए जन स्पेक्ट्रम है बोमन अंतरिक्ष महाप्राण के जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| प्रोटीन | मेगावाट (केडी) | वर्णक्रमीय गणना मतलब |
| ACTA_MOUSE | ४२ | 2 |
| ACTB_MOUSE | ४२ | 1 |
| CLPX_MOUSE | ६९ | २.५ |
| DHSA_MOUSE | ७३ | 1 |
| FOLR2_MOUSE | 29 | 1 |
| GBLP_MOUSE | ३५ | 1 |
| ALBU_MOUSE | ६६ | ६.७ |
| HBA_MOUSE | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MOUSE | ११० | 1 |
| MUP17_MOUSE | 21 | 1 |
| PERI_MOUSE | ५४ | 1 |
| RNAS4_MOUSE | 17 | 2 |
| SPTB1_MOUSE | 2 | 1 |
| VIME_MOUSE | ५४ | 1 |
| VTDB_MOUSE | ५३ | 1 |
तालिका 1:3 चूहों से बोमन अंतरिक्ष महाप्राण में पहचान की प्रोटीन की सूची.
पूरक वीडियो 1: एक जेड से एक मात्रा प्रतिपादन-है बोमन अंतरिक्ष में एक पिपेट स्थिति के बाद अधिग्रहीत ढेर अंतरिक्ष के भीतर पिपेट टिप, abutting केशिका गुच्छा दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।
Discussion
हम चूहों में गैर सतह glomeruli के बोमन अंतरिक्ष का उपयोग करने के लिए एक विधि पेश करते हैं, 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सुविधा. हम इस प्रक्रिया को विकसित करने के लिए glomerular micropuncture की एक प्रमुख सीमा का पता, सतह glomeruli के दुर्लभ वस्तु 1-चूहों में फोटॉन माइक्रोस्कोपी, क्रम में एक प्रयोगात्मक उद्देश्य की सुविधा के लिए, है बोमन अंतरिक्ष से द्रव की आकांक्षा बाद में विश्लेषण । विकास और इस तकनीक का अभ्यास छह महत्वपूर्ण कदम पर टिकी हुई है । सबसे पहले, उपंयास शल्य तैयारी सावधानी से किया जाना चाहिए ताकि इमेजिंग पानी स्तंभ बंद coverslip और coverslip गुर्दे के क्षेत्र में फैली हुई है जो पिपेट का लक्ष्य है पर नहीं चलता है । दूसरा, कांच micropuncture के लिए इस्तेमाल पिपेट 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, जो क्वांटम डॉट्स का उपयोग कर पूरा किया जाता है के लिए दृश्यमान होना चाहिए । तीसरे, स्टीरियोटैक्टिक तकनीक को ठीक तीन आयामों में है बोमन अंतरिक्ष में एक पिपेट की स्थिति के लिए आवश्यक है, ऊपर १०० µm गुर्दे की सतह के नीचे । इसलिए, पिपेट और परिशुद्धता के साथ मंच के समंवय प्रणालियों पंजीकरण महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । चौथा, सावधान लक्ष्य glomerulus के चयन यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि यह गुर्दे की सहायता संरचना और इमेजिंग कॉलम द्वारा भिडंत के बिना पिपेट के लिए सुलभ है । अंत में, सावधान विचार विश्लेषणात्मक कदम के लिए अधिग्रहण की प्रक्रिया का पालन करने के लिए दिया जाना चाहिए, और मात्रा और तरल पदार्थ के नमूने के अधिग्रहण के समय विश्लेषण और glomerular फिजियोलॉजी के लिए मिलान किया जाना चाहिए ।
हम एक अधिग्रहण प्रक्रिया है कि पारंपरिक micropuncture अंतिमबिंदु, जैसे लौ photometry, आयन के प्रति संवेदनशील इलेक्ट्रोड माप, या दबाव, मात्रा या शुल्क की माप सहित कई विश्लेषण करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है बनाया है । इसके अतिरिक्त, हमें विश्वास है कि इस तकनीक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया सहित विश्लेषणात्मक अंतिमबिंदु के लिए उत्तरदायी होगा (शायद miRNA के लिए रिवर्स प्रतिलेखन के बाद) और जन स्पेक्ट्रोमेट्री के metabolomics बहाव. विशेष को जन स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा के लिए कार्यरत संशोधनों अतिरिक्त चर्चा के लायक है, और वे कुछ सीमाएं लागू । सबसे पहले, हालांकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री अति संवेदनशील है, कम प्रोटीन सामग्री और micropuncture नमूनों की मात्रा पारंपरिक proteomic अंवेषण के गतिशील रेंज के नीचे प्रोटीन का विश्लेषण प्रदान करता है, और इसलिए सरलीकृत nanoproteomics थे आवश्यक. 8 , 13 दूसरा, जल्दी परख के लिए प्रोटीन उपज का अनुकूलन, हम निर्धारित किया है कि महाप्राण के 200-300 nL आवश्यक था, लेकिन de नोवो इस खंड के अधिग्रहण की आवश्यकता होती है शायद के रूप में आकांक्षा के 20 मिनट के रूप में लंबे समय के रूप में अगर माउस GFR केवल 8-14 है nL लैंडलाइंस3. के रूप में तोजो और Endou का प्रदर्शन किया है कि लंबे समय तक आकांक्षा जल्दी समीपस्थ tubule द्रव14की एल्ब्युमिन सामग्री बदल, हम 6 मिनट से अधिक महाप्राण के लिए चुने गए; लेकिन इसका मतलब यह है कि हमारी आकांक्षा दर निस्पंदन प्रवाह की दर से अधिक है । इस प्रक्रिया के उपयोगकर्ताओं को उनके कार्यप्रवाह डिजाइनिंग में उनके प्रायोगिक प्रणाली में glomerular निस्पंदन के फिजियोलॉजी पर विचार करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एक संवेदनशील तकनीक, खनिज तेल, जो सामांयतः micropuncture में प्रयोग किया जाता है आकांक्षा और nephron के क्षेत्रों को अलग करने के लिए हाइड्रोलिक प्रणाली शामिल करने के रूप में एक शुरू की पेट्रोलियम आसुत से संकेत से अभिभूत हो जाएगा । इसलिए, हम इस प्रयोजन के लिए खनिज तेल का उपयोग नहीं, या इसके अंय आम उपयोग करते हैं, nanoliter रेंज के नमूनों की मात्रा का ठहराव सकता है । इसके बजाय हम perfluorodecalin जो जैविक रूप से निष्क्रिय है के साथ प्रणाली को भरने, जन स्पेक्ट्रोमेट्री परेशान नहीं करता है, और अनुकूल ऑप्टिकल विशेषताओं है । हमारा मानना है कि perfluorodecalin द्वारा लगाई गई सीमाएं दुर्गम हैं और अतिरिक्त तकनीकी नवाचारों पर काम कर रहे हैं जो हमें उम्मीद है कि नमूना मात्रा और ट्यूबलर खंड की नाकेबंदी का माप होगा ।
सबसे micropuncture अध्ययन ंयूनिख-Wistar चूहों, जो सतह glomeruli की संख्या में वृद्धि का प्रदर्शन में प्रदर्शन किया गया है, लेकिन यह बहुत सीमित ट्यूबलर परिवहन और अंय गुर्दे फिजियोलॉजी के शारीरिक अध्ययन क्योंकि मौलिक के नुकसान की आण्विक जीवविज्ञान के उपकरण, ट्रांसजेनिक2चूहों,3। क्योंकि यह चूहों में बोमन अंतरिक्ष के लिए micropipette पहुंच की सुविधा, उपंयास तकनीक इसलिए इन महत्वपूर्ण सीमाओं का शमन । हम nanoproteomics9के रूप में जाना उच्च संवेदनशीलता जन स्पेक्ट्रोमेट्री, का उपयोग कर proteomic अध्ययन के लिए गुर्दे निस्पंदन उपयोग करने के क्रम में इस तकनीक को अपनाया । हालांकि, संभव है कि अतिरिक्त अनुप्रयोग हैं । उदाहरण के लिए, फ़िल्टर किए गए प्रोटीन के गुर्दे शारीरिक अध्ययन बहुत 2 के साथ फ्लोरोसेंट अनुरेखक के उपयोग से सहायता प्राप्त किया गया है-फोटॉन माइक्रोस्कोपी15,16,17. micropuncture के अलावा 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट अणुओं के साथ एकल-nephron शारीरिक अध्ययन प्रदर्शन की संभावना प्रदान करता है, पड़ोसी की अनुमति, गैर इंजेक्शन बिगडते नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए । यह आशा व्यक्त की है कि आवश्यक कदम के इस स्पष्ट विवरण पहले से ही 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी और/micropuncture के लिए सुसज्जित प्रयोगशालाओं में व्यापक गोद लेने की अनुमति देगा । हालांकि यह जटिल है, हम अब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है कई बार और शोधन प्रस्तुत यहां शारीरिक खोज के लिए एक स्थिर मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
NIDDK K08 DK090754 से मील प्रति घंटे तक. NIGMS P41 GM103493 को आरडीएस. इस सामग्री के काम का परिणाम है (मील प्रति घंटा) जो संसाधनों और पोर्टलैंड दिग्गजों मामलों चिकित्सा केंद्र में सुविधाओं के उपयोग के साथ समर्थित किया गया था । सामग्री के दिग्गजों मामलों या संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार के अमेरिकी विभाग के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| 3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
| 3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
| Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
| PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Microinjector | WPI | UMP-3 | |
| Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
| Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| 30 G needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
| Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |
References
- Schnermann, J. Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).
- Lorenz, J. N. Micropuncture of the kidney: a primer on techniques. Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).
- Vallon, V. Micropuncturing the nephron. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
- Gimenez, Y., et al. 3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. Scientific Reports. 6, 29936 (2016).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
- Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling. Methods in Molecular Biology. , (2017).
- Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications. Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).
- Clair, G., et al. Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples. Scientific Reports. 6, 39223 (2016).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).
- Andrasfalvy, B. K., et al. Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology. Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), (2016).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
- Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).
- Salmon, A. H., et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).
