Summary
Biz böbrek fizyolojisi 2 temel teknikleri birleştirerek farelerde, Bowman'ın idrar alanındaki bir micropipette yerleştirmek için 2-foton mikroskobu kullanımı mevcut. 2-foton mikroskobu kullanılması geleneksel mikroskopi micropuncture böbrek fizyolojisi çalışmaları için kritik sınırlamalar üstesinden gelir.
Abstract
Böbrek micropuncture ve böbrek 2-foton görüntüleme seminal böbrek fizyolojisi tekniklerdir. Ancak, micropuncture yüzey nefron özelliklerine geleneksel mikroskobu bağımlılığı ile sınırlıdır ve müdahaleler sadece organ, oldukça az nefron düzeyi tespit edilebilir 2-foton çalışmalar sınırlı bulunmaktadır. Özellikle, fareler glomeruli micropuncture çalışmaları farelerde yüzey glomeruli yetersizliği tarafından itiraz edildi. Fare fizyolojik modellerinde Bowman'ın uzaydan aspiratı çalışmaların elde etmek için bu sınırlama adrese 2-foton glomerular micropuncture geliştirdi. Biz 2-foton Mikroskopi için gerekli dikey görüntüleme sütun koruyarak böbrek yanal erişim sağlayan yeni bir cerrahi hazırlık mevcut. Yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate (FITC) İdaresi-dextran böbrek damarlara ve bu nedenle glomeruli 2-foton görüntüleme için görünür işlemek için kullanılır. Bir kuantum pipet nokta kaplı sonra birkaç birçok hangi görüntüleme penceresi içinde görüntülenmeyecektir seçildiği bir glomerulus stereotaksik rehberlik altında tanıttı. Bu protokol için hazırlık, malzeme ve Yöntemler yordamı gerçekleştirmek gerekli ayrıntıları sağlar. Bu teknik filtrate Bowman'ın uzaydan kurtarılması ve nefron görüntüleme derinliği sınırı, böbrek kapsülü altında yaklaşık 100 µm içinde tüm kesimlerini de dahil olmak üzere böbrek, daha önce olanaksız fizyolojik çalışma kolaylaştırır. Basınç, ücret ve akış tüm tanıtılan pipet kullanarak ölçülen. Burada, Sıvı Kromatograflar/Kütle spektrometresi aspiratı Bowman'ın uzaydan üzerinde gerçekleştirilen temsilcisi verileri sağlamak. Böbrek fizyolojik soruşturmada geniş uygulanabilirliği için bu teknik bekliyoruz.
Introduction
Bu yordamın amacı, Bowman'ın uzay ve glomerular dörtlüleri farelerde rutin micropuncture erişim sağlamaktır. Micropuncture çalışmalar için böbrek fizyolojisi 1-foton mikroskobu, hangi sadece böbrek yüzeyine birkaç mikron içinde görüntü ve hangi z-boyut sınırlı hassasiyet sunar sınırlı olmuştur. Çünkü fareler kaç yüzey glomeruli, her zaman bir yüzey glomerulus 1-foton mikroskobu tarafından bulmak mümkün değildir, bu nedenle en micropuncture çalışmaları daha çok yüzey glomeruli var Münih-Wistar fareler, gerçekleştirilen. Bu nedenle, fare modellerinde çalışmanın faydaları micropuncture çalışmalar1,2,3' te sınırlı sahip. Mikro-CT4,5, gibi teknolojiler, Imaging son gelişmeler6görüntüleme ve kütle spektrometresi7 Imaging nanopartikül oldukça gelişmiş yöntemleri glomerular fizyolojisine uygun dizi ama Hayır vekil için eşsiz kalır müdahale ve bu micropuncture örnek için yeteneği sağlar. Bu nedenle burada sunulan yöntemlerle micropuncture kullanımı genişletme roman böbrek fizyolojisi çalışmaları, özellikle böbrek filtrate (Örneğin, metabolomics) içerik ve temel fizyolojisi değerlendirme kolaylaştırmak için bekleniyor transgenik fareler gibi filtrate basınç ve ücret, daha önce sadece fareler gerçekleştirilmiş.
Bu teknikte, renal kapsül görselleştirme ve böbrek yapılarına kadar yaklaşık 100 µm micropipette erişim 2-foton mikroskobu kullanımına izin verir. Birden çok (5-10) glomeruli bu nedenle şu ana kadar yansıma her fare böbrek micropuncture erişilebilir. Her ne kadar bu teknik ile geleneksel böbrek micropuncture bazı özellikleri paylaşır, bu tasarlanmış de novo ve geleneksel teknik kapsamlı bazı değişiklikleri gereklidir. Bu iletişim kuralı biz sıvı aspirasyon Bowman'ın uzaydan göstermek ve kütle spektrometresi (nanoproteomics)8,9,10,11ile daha sonraki analiz sonuçlarını örnek göstermek. Ayrıca aşağıda gösterildiği bir özel örnek hazırlama iş akışı, kütle spektrometresi aşağı akım kullanılması gerekir.
Protocol
Burada açıklanan tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Kurulum gösteri için kullanılan
- Bir dik 2 fotonlu mikroskop, 3 eksenli sahne alanı denetleyicisi, bir headstage/pipet sahibi ve bir 3-eksen denetleyicisi için headstage/pipet tutucu dördü de bu öğeler gereklidir.
Not: Birçok benzer kurulumları mevcuttur ve pipet ve mikroskop sahne alanı'nın bağımsız nicel 3 eksenli kontrol bulunmaktadır, ve mikroskop vivo içinde dik görüntüleme için ayarlanmış olarak yeterli olacaktır.
2. Deneysel protokol başlamadan önce gerekli malzemeleri
- FITC-dextran, 2.000.000 Da, % 5 çözüm normal salin veya fosfat tamponlu tuz retroorbital enjeksiyon böbrek damarlara işaretlemek kullanın. Bu damarlara içinde kalır ve filtre değil çünkü bu molekül ağırlığı (MW) seçilir.
- Makine çekti borosilikat cam Mikropipetler: Çek Mikropipetler için 6-10 µm ucu uzun-konik, kapalı ucu ayarları kullanarak (Örneğin, ısı 610, hız = = 150, zaman ilmekledi 250 ms =) bir micropipette çektirmenin üzerinde. 45 ° eğim ve hafifçe alev-Lehçe.
- Mikropipetler kuantum nokta kaplama: kat başvurulan protokolüne göre kuantum noktalı micropipette ipuçları. 12
- Polysiloxane böbrek destek/spacer. Polysiloxane macun bir böbrek destek/spacer tekne için kullanın. 1 x 1 cm2 5 mm kalınlığında dik açı rhomboid (yani, kesilen bir küp) tarafından gelen moda polysiloxane macun. Orta %70 rhomboid merkezinin yaklaşık % 70 oluşan bir daire ve bir kenarından polysiloxane kaldırın. Polysiloxane 24 saat kurumasını sağlar. Bkz: Şekil 1.
- Microinjector hazırlık: Polietilen (PE)-50 boru ve micropipette micropipette yüklemeli holder uzunluğu ile petrol Prefill. Eğer kütle spektrometresi planlanmış, perfluorodecalin gereklidir, aksi takdirde madeni yağ kullanılabilir. Bir gaz geçirmez Hamilton-türü şırınga ve dolgu ile perfluorodecalin ile microinjector kadar ayarla. Bu PE-50 boru ve pipet sahibi bağlı olacaktır.
- Pipet pipet tutucuya yerleştirin ve ileri PE-50 boru ve pipet doldurun, sonra PE-yağ dolu Hamilton şırınga boru, hidrolik sistem pipet oluşturma şırınga 50 proksimal ucunu takın.
3. yanal pipet erişim böbrek aşağıda bir sıvı Sütun yeni bir cerrahi prosedür yoluyla görüntüleme
Not: Görüntüleme destek sistemi ve cerrahi hazırlık Meclisi Şekil 1' de gösterilen. Açıklanan yordamı 20 – 25 g ağırlığında C57BL/6 fareler üzerinde gerçekleştirilir.
- Fare tartın.
- %4 isoflurane kullanarak anestezi ikna etmek ve % 1.5-2.5 isoflurane hava/oksijen karışımı ile bakımını yapar. Fare yanıt acı uyarıcı ve solunum indirimli yokluğunda tarafından anestezi onaylayın.
- Gözlerini yağlamak ve hayvan yan cepheden bir baseplate üzerinde konumlandırın. Bant kullanarak 4 ekstremitelerde hareketsiz.
- Normal salin, 200 µL, subkutan enjekte ve rektal sıcaklık probu yerleştirin. Denetim sıcaklık Isıtma lambası cerrahi ve ısıtma yastığını sırasında sırasında Imaging'i kullanma.
- Depilatory krem kullanarak fare sol tarafındaki tüm saç kaldırmak.
- Deri altında görünür, dalak, bulun ve sol böbrek ve dalak dorsal ve kaudal tarafında bulun.
- Cilt üzerinde 0,5 cm kesi ve karın zarını üzerinde küçük kesi yapmak için böbrek kolayca itmeye yetecek kadar.
- Hafif basınç böbrekle A'ya. Polysiloxane böbrek ve düzeltme siyanoakrilat yapıştırıcı ile çevresinde yapılan böbrek sabitleyici formu yerleştirin. Öyle ki böbrek lateral en yüzey sabitleyici yaklaşık 1 mm tarafından genişletir böbrek rondela ile sıraya girin.
- Sabitleyici formu baş plakasına yapıştırıcı ile düzeltmek ve barlar taban plakası montaj için baş plaka monte.
- % 1'özel çözüm böbrekle çevreleyen polysiloxane destek kuyuda doldurun ve 10 mm coverslip üstüne koyun ve özel firma olana tutun. Coverslip yapıştırıcı ile baş plaka mühür ve diş çimento ile coverslip çevresinde bir halka oluşturmak.
- Retro-orbitally FITC-dextran (2.000.000 Da, % 5 çözüm, 100-150 µL) enjekte ve fare ve fiksasyon plaka 2 fotonlu mikroskop sahne alanı'na hızlı, anestezi ve yeterli sağlanması mikroskop sahne alanı'nda atma gaz atık Bakımı hareket eder.
4. uygun Glomerulus ve Bowman'ın alan erişimleri pipet yelpazesi
-
Tanımları:
- X-sol üstünde belgili tanımlık perde ve sol-sağ mikroskop karşılıklı olarak tanımlamak
- Sahne alanı denetleyicisinden SX (sahne X) okuyun
- PX pipet X tanımlamak, denetleyicisi pipet üzerinde arama
- Yukarı-aşağı üstünde belgili tanımlık perde ve ileri doğru mikroskop ve geri 2-foton kurulum doğru olarak Y tanımlayın
- Z gibi kadar tavana doğru aşağı yere doğru tanımlamak ve sahne alanı'ndaki amaç Z konumu ile ölçülür.
- S (O) Z sahne (gerçekten amaç) yükseklik tanımlayın.
-
Böbrek, göz içinde yeşil flüoresan protein (GFP) filtre ayarlarını kullanarak tanımlanabilir yüzeyine bulmak. FITC Dextran enjeksiyon nedeniyle damarlara parlak yeşil olacak.
- Uygun bir glomerulus tanımlayın. Vizörün kullanarak böbrek yüzeyine belirlenmesi sonra 2-foton (sigara tarama modu) için geçiş ve görüntüleme penceresi keşfedin. Micropuncture için olumlu özellikleri şunlardır: coverslip altındaki dikey mesafe > 30 µm (erişim sırasında pipet ile coverslip arasındaki çarpışma önlemek için) ve lateral glomerulus yanal böbrek kapsülü mesafe < 400 µm (Bu mesafe pipet sapmasını bir Bayan olasılığını artırabilir).
- Kayıt lateral ve ponksiyon dikey uzaklık glomerulus pipet tarafı için doğrudan renal kapsül üzerinde bir nokta nokta.
- Objektif odak noktası x tutmak su sütuna yükseltmek ve y sahne alanı koordinatlarına değiştirmeden, hemen bir santimetre uzaklıkta.
- Pipet Ucu su sütunu sürücü ve 4', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) uyarma açın. Hareket x ve y pipet ucu maksimal floresans noktasına boyutları, bu amacın merkezi olacaktır. Pipet vizörün içinde bu kesin prepositioning olmadan zor olur. Çünkü kuantum nokta (Bu durumda, kırmızı) aynı dalga boyu uyarma dalga boyu ne olursa olsun, belli, DAPI uyarma Şekil 2' de gösterildiği ucuna sıkıca odaklanmış kırmızı floresans üretir.
- Kırmızı floresan protein (RFP) uyarma ayarını değiştirmek ve göz pipet görselleştirmek, o zaman tam olarak o oküler görünümünde Merkez.
- 2-foton için geçiş ve pipet 2-foton, tam görüntü ortasına yerleştirerek altında bulabilirsiniz. Bu kayıt konumdur.
- Pipet görüntüsünü kaydedin.
- Sahne ve micropipette denetleyicisi koordinatlarını kaydedin.
Not: hesaplamalar ve sahne ve pipet koordinatları arasında uzaklığı hesaplamak için JavaScript kodu, (yüklü elektronik yazılım erişimi olmayan sistemlerde avantajlı) veya bir elektronik tablo kullanma-ecek idam etmek tamamlayıcı .html dosyasını kullanın hedefin koordinatlarını pipet denetleyicisi için hesaplayın. - Pipet su sütunu aynı koruma z ve y x eksenindeki kaldırın.
- Pipet Z hedef glomerulus Z (Yani, taşı aşağı pipet coverslip aşağıda Z yönünde) taşımak
- Pipet Y hedef glomerulus Y koordinatı için hareket.
- 2-foton canlı görüntü hedef glomerulus Z ve sonra böbrek kenarına taşıyın ve SX unutmayın.
- Böbrek kenar PX SX kaydından kullanarak hesaplayın.
- Böbrek kenarına kadar ama hala görünür ekranın solunda öyle ki sahne alanı pipet (artış SX) doğru hareket ederler.
- Pipet hızlı bir şekilde yaklaşık 100 µm PX yukarıda hesaplanan böbrek kenar daha az ilerlemek.
- Yavaş ilerleyen pipet pipet ucu bulun. Kırmızı kazancı artırmak ve kırmızı piksel çubuk grafik (pipet kuantum noktaları ve hedef kapalı floresans aşırı parlaklığını nedeniyle penceredeki yansıma önce piksel dağıtım vardiya) dikkat et.
- Böbrek kenar canlı 2-foton görüntüleme altında ilerlemek.
Not: renal kapsül girmeden önce Y ve Z boyutlarındaki pipet yönlendirmek mümkündür. Ancak, bu pipet ucu kesilebilir. Pipet hedeften uzak ise X boyutu en fazla 2 cm, Yönlendirme ve X boyutu sonra karşılığında böbrek kenarına çekilmek daha muhafazakar bir ölçü olur. Pipet doku içinde olduğunda, herhangi bir eksen X dışında hareket yapmak için büyük deneyim gerektiren pipet fleksiyon yol kullanımı ve sık sık kopmalara yol açar. - Pipet X ekseni glom hedef PX, SX üzerinde bir göz tutmak için yavaş sür. (Zaman zaman bunu hiç micropipette ekleme kaymıştır görmek için glomerulus dönmek yararlıdır).
- Ne zaman doğru konuma, bir z-deste ile belge konumu vardır.
Not: ile micropipette yerde, uyuşturucu, proteinler veya floresan izleyiciler enjekte, daha sonraki analizler için sıvı Aspire veya basınç veya ücretten başka bir elektrot göre ölçülen.
5. Bowman'ın uzaydan gelen sıvı aspirasyon
- 100 enjekte etmek micropump ayarla nL perfluorodecalin 2 dk, pipet açıklık sağlamak ve girişi sırasında pipet takmayı semptomlarıdır azaltmak için. Pipet pozisyon sağlamak için reimage.
- 4-6 dakika ek filtrasyon için bekleyin.
- Micropump 300 kadar Aspire ayarla nL ilâ 50 nL/dk hızında.
Not: Glomerular morfoloji değişimler bu oranı ile aspirasyon sırasında sıvı teslim alana oranını değiştirmez düşündüren gözlenir değil. Hiçbir petrol blok olduğu gibi konvansiyonel micropuncture gibi bu birimi, kütle spektrometresi için gerekli bazı enjekte perflourodecalin ve muhtemelen borulu sıvı içerebilir. İyon duyarlı elektrot ölçümleri floresans spektroskopisi, polimeraz zincir reaksiyonu ve diğer hassas bitiş noktaları gibi deneyleri için düşük miktarlar kullanılabilir. Kütle spektrometresi bitiş noktası yoksa, mineral yağ ve standart micropuncture teknikleri emişli birimin depolama önce ölçmek için kullanılabilir. - Görüntü bir kez daha.
- Pipet geri çekilin ve TRIS arabellek ekleme ve-80 ° analiz önce depolama örnek korumak.
- Aşırı dozda isoflurane veya diğer onaylanmış yöntemi kullanarak fare ötenazi.
Not: Filtrate glomerular kılcal filtrasyon tarafından boşluk girer. Tek-nefron glomerular filtrasyon (SNGFR) farelerde Starling kuvvetleri ancak SNGFR, yöneten ve Bowman'ın uzayda negatif hidrostatik basınç bu nedenle SNGFR artırabilir 8 – 14 nL/dk.3 arasında bildirilmektedir. Bu bileşiklerin kütle spektrometresi (aşağıya bakın); ile müdahale standart micropuncture yöntemleri borulu abluka petrol ve ancak tarafsız basınç ile borulu sıvı örnekleme için kullanın Bu nedenle, bu teknikte erken proksimal tübül patent kalır. Ayrıca, aspirasyon zaman bilinmeyen bir olumlu filtrate hacmi ama Bowman'ın alanı içerir. Bu nedenle, sıvı aspirasyon oranı SNGFR aşabilir.
Not: burada açıklanan deneylerde hedefi daha büyük bir elde edildi glomerular filtrate nanoproteomic teknikleri ile kütle spektrometresi analiz için her zamanki örneği daha. Kütle spektrometresi kullanımı petrol bloklar ile madeni yağ ya da balmumu (sinyal: gürültü kütle spektrometresi azaltmak organik moleküllerin karmaşık karışımlar) kullanımını önleyen perfluorodecalin micropipette ve şırıngayı doldurmak için kullanılır. Perflourodecalin borulu akışını engellemek için bilinmemektedir ama biyolojik olarak hareketsiz ve kütle spektrometresi ile müdahale değil.
Representative Results
Bu yordam 2-foton görüntüleme ve Şekil 1' de gösterildiği erişim için böbrek benzersiz bir cerrahi hazırlık gerektirir. Burada gösterilen bu hazırlık birkaç yoğunluk değişiklikleri için yanal erişim için sadece yatay (x tahrik pipet ile aynı anda 2-foton Mikroskopi için en iyi-olası optik böbrekle yukarıda amacı ile dikey görüntüleme sütun sağlar ) boyut. Kısmi ekstrüzyon böbrek böbrek Transpediküler üzerinde aşırı gerilim engeller ve vasküler akışını korur ve özel böbrek destek inşaatı iki hedefleri, görüntüleme ve erişim sağlar. İkinci Bu yordamdaki pipet pipet ve sahne koordinat sistemlerinin kayıt gerektiren böbrek 3 boyutlu, içinde hassas konumlandırma bir mücadeledir. Bu işlem için kritik adım 2 fotonlu mikroskop altında DAPI-uyarma su sütunundaki benekli pipet gösteren Şekil 2de gösterilmiştir. Su sütunu girme ve pipet Bu böbrek girmeden önce sahne alanı'nın koordinatlarını kayıt pipet hedef Bowman'ın alanı içinde hassas stereotaksik konumlandırma etkinleştirmek için önemlidir. Pipet görüntüleme su sütunu sağdan girer. DAPI uyarma, Açık kırmızı kuantum nokta kaplı pipet parlak kırmızı-turuncu fluoresces ile dikkatli bir şekilde amacı orta altında konumlandırılmış olması. Uyarma ışın hedefi merkezinden geçerken, pipet serbestçe mercek içinde görünür olacak sağlanması maksimum floresans noktaya taşınmış olabilir.
Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5' te gösterildiği gibi uygun pipet çekerek ve glomerulus seçimi bu iletişim kuralı, başarısı için kritik. Şekil 3Aiçinde sıvı sütununda yordamı pipet kayıt bölümü sırasında yansıma düzgün çekti, kırmızı-floresan kuantum nokta kaplı cam micropipette görülebilir. 6 mikron genişliğinde yolgösterendir. Şekil 3B', kötü çekti pipet 12 µm ipucu ile gösterilir. Bu pipet renal kapsül 12 µm çapı ve düzensiz ipucu yüzey (Not bur eğimi üstündeki) nedeniyle damar travma neden olmadan aşamıyor. Şekil 3 c ve 3D' de, en iyi konumlandırma yerine hedef glomerulus Imaging önemini gösterilir. Şekil 3 c içinde resimli güzel, yüzey yakınındaki glomerulus olumlu görüntüleme (nedeniyle yüzey konumunu, renal kapsül aşağıda 20 µm) gösterir ama yüzeye çok yakın olduğu için bu yordam tarafından erişim için uygun olmaz ve Pipet coverslip vurmaz. Şekil 3D, en iyi şekilde konumlandırılmış glomeruli gösterilir. Her iki glomeruli (ölçek çubukları olan tüm 50 µm) göstermek için kullanılan farklı ölçek unutmayın. Bu glomeruli derinlik tarafından neden kırılma nedeniyle daha az keskin görünür; Bu görüntü 70 µm renal kapsül altına alınmıştır. Yanal böbrek kenar 250 µm sağa, bu glomeruli her ikisi de erişilebilir hale getirmek olduğunu. Bir erişim işlemi sırasında görüntüleme hedef glomerulus Şekil 4gibi sıkıca odaklanmış ve tam olarak pipet Bowman'ın uzayda konumunu gözlemlemek için Dedektif izin her ikinci resim alma kullanılır.
Şekil 4 tipik bir böbrek giriş ve sonuç, bir pipet ucu Bowman'ın alanında göstermektedir. Şekil 4A, pipet ucu Bowman'ın uzayda dik sayısı yığınıyla z bir ortalama yoğunluk projeksiyon gösterir. Kırmızı pipet ucu spektral artifakı (floresan yuvarlak top) ucu konik kısmındaki düzenlenmiş kuantum nokta son derece parlak floresans nedeniyle olduğunu unutmayın. Şekil 4B', z-yığın veri birimi projeksiyon Bowman'ın uzayda başka bir pipet gösterir. Pipet iletişim kuralında tanımlandığı gibi İpucu geçici belirgin oluşturma girişindeki seyahat yönde Bowman's kapsül sürükledi unutmayın.
Şekil 5' te, çok büyük bir açılış ile bir pipet kanama neden böbrek kapsülü kırdı başarısız bir yordam sonuçları gösterilir. Pipet çok kör; renal kapsül geçmek için çalışılıyor, kırılma oluştu kadar kapsül pipet ucu öncesinde itildi. Bu görüntüde, renal kapsül FITC-floresan yeşil subcaspular, kanama tarafından geliştirilmiş, görülüyor. FITC sinyal kan basınç altında pipet lümen girilen gösteren pipet içinde kendisi, görünür. Oku birçok kırmızı kan hücreleri FITC dextran kusurları doldurarak olarak pipet lümen içinde görünür işaret eder.
Şekil 6 Bowman'ın uzay aspiratı, fare idrar protein 17 (MUP17) elde edilen bir temsilcisi kitle spektrum gösteriyor. Son olarak, Tablo 1 her 3 fareler birinden 6 dakika boyunca toplanan aspiratı nano kütle spektrometresi kullanılarak tanımlanan proteinler listeleme başarılı aspirasyon işlemleri, örnek sonuçlarını gösterir. Her durumda, pipet Bowman'ın uzaydan çekildi ve hiçbir FITC floresans Bowman'ın alanı veya aspiratı kirlenme plazma ile eksikliği gösteren pipet lümen içinde gözlenen görüntüsü. 17 protein, düşük moleküler ağırlıklı, öncelikle protein başına 2 benzersiz peptidler en az üzerinden tespit edilmiştir. Spektral sayıları düşük, glomerular filtrate proteinin önceki tahminler ile tutarlı ve filtre uygulanmış proteinler, D vitamini bağlayıcı protein (VTDB), gibi bilinen albumin (ALBU) ve büyük idrar protein 17 (MUP17) mevcut.
Şekil 1: böbrek özel destek ve immobilizasyon yanal erişim için kısmi ekstrüzyon. Sol tarafta, görüntüleme sütun ve böbrek destek parçaları ile komple montaj merkezi da gösterilir. Sağ tarafta, böbrek hazırlık önce (üstte) gösterilir ve sonra (aşağıda) uygulama desteği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: tamamlandı böbrek Prep'te pipet kayıt adımı Protokolü'nün. Burada, DAPI uyarma micropipette su sütunu 2 foton mikroskop içinde konumlandırmak için kullanılıyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: enjeksiyon FITC-dextran micropuncture için uygun ve uygun olmayan glomeruli gösteren, sonra Pipetler ve böbrek Imaging. A. 6 µm ipucu ile iyi çekti bir pipet. B. bir kaba kenarlı, künt ipucu. C. bu glomerulus iyi tanımlanmış, ama micropuncture için coverslip için çok yakın. Ö. Uygun glomeruli konumlandırılmış. Ölçek barlar vardır tüm 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: başarılı pipet geçit 2 farklı yordamlardan yerleştirme Bowman'ın uzay görünümlerinde açar. A. Z-orthogonal projeksiyonlar yığınıyla pipet ucu glomerular tutam abutting Bowman'ın uzayda gösterir. Ölçek çubuğu 50 µm. B. olduğunu Toplu oluşturma z-yığın benzer şekilde bir pipet glomerular tutam abutting Bowman'ın uzayda gösterir. Ölçek çubuğu var. 100 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: renal kapsül yırtılması ve pipet lümen kanama için önde gelen bir künt pipet nedeniyle başarısız bir yordam. Extravasated plazma ve kırmızı kan hücreleri (ok) FITC floresans pipet içinde görünür. Ok kırmızı kan hücreleri pipet lümen içinde görünür işaret eder. Ölçek çubuğu var. 50 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: nano Sıvı Kromatograflar/Kütle spektrometresi Analizi Bowman'ın uzay aspiratı elde edilen kitle spektrum büyük idrar protein 17 (MUP17), için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Protein | MW (kD) | Spektral saymak demek |
| ACTA_MOUSE | 42 | 2 |
| ACTB_MOUSE | 42 | 1 |
| CLPX_MOUSE | 69 | 2.5 |
| DHSA_MOUSE | 73 | 1 |
| FOLR2_MOUSE | 29 | 1 |
| GBLP_MOUSE | 35 | 1 |
| ALBU_MOUSE | 66 | 6,7 |
| HBA_MOUSE | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MOUSE | 110 | 1 |
| MUP17_MOUSE | 21 | 1 |
| PERI_MOUSE | 54 | 1 |
| RNAS4_MOUSE | 17 | 2 |
| SPTB1_MOUSE | 2 | 1 |
| VIME_MOUSE | 54 | 1 |
| VTDB_MOUSE | 53 | 1 |
Tablo 1: Bowman'ın uzay aspiratı 3 fare üzerinden tespit proteinler listesi.
Tamamlayıcı Video 1: Toplu oluşturma bir z-yığın bir pipet Bowman'ın uzayda konumlandırma pipet ucu kapiller tutam abutting alanındaki gösterir sonra satın aldı. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Discussion
Biz olmayan yüzey glomeruli 2-foton mikroskobu tarafından kolaylaştırdı farelerde Bowman'ın alanı erişmeye yönelik bir yöntem mevcut. Deneysel bir amaç için Bowman'ın uzaydan sıvı aspirasyon kolaylaştırmak amacıyla glomerular micropuncture, yüzey glomeruli adresli 1-foton mikroskobu farelerde, tarafından nadir bir anahtar sınırlaması gidermek üzere bu yordamı geliştirdiğimiz daha sonraki analiz. Geliştirme ve uygulama bu tekniğin altı kritik merdivenlerinde aittir. İlk olarak, yeni cerrahi hazırlık dikkatlice böylece görüntüleme su sütunu coverslip çalışmaz ve coverslip pipet hedefi böbrek alan üzerinde uzanır yapılmalıdır. İkinci olarak, micropuncture için kullanılan Cam Pipet kuantum nokta kullanarak gerçekleştirilir 2-foton mikroskobu görünür işlenmesi gerekir. Üçüncüsü, stereotaktik tekniği tam olarak böbrek yüzeyin 100 µm kadar üç boyutlu Bowman'ın uzayda bir pipet konumlandırmak için gereklidir. Bu nedenle, koordinat sistemleri pipet ve sahne hassasiyetle kayıt önemli adımlardır. Hedef glomerulus dördüncü, dikkatli seçimi için pipet böbrek destek yapısı ve görüntüleme sütun tarafından sıkışma olmadan erişilebilir olduğundan emin olmak gereklidir. Son olarak, satın alma yordamı takip etmek için dikkatli bir değerlendirme analitik adımlarına verilmelidir ve birim ve zamanlama Alım sıvı örneklerini analiz ve glomerular Fizyoloji eşlenmesi gereken.
Alev fotometri, iyon duyarlı elektrot ölçümleri veya basınç, birim veya şarj ölçümleri gibi geleneksel micropuncture bitiş noktaları da dahil olmak üzere birçok analiz için uzatılabilir bir satın alma yordamı dizayn ettik. Ayrıca, bu teknik polimeraz zincir reaksiyonu (Belki de ters transkripsiyon miRNA için takip) ve kütle spektrometresi, aşağı metabolomics da dahil olmak üzere yeni analitik bitiş noktaları için mükellef olacağına inanıyoruz. Kütle spektrometresi kolaylaştırmak için istihdam özel değişiklikler ek tartışma hak ve bazı sınırlamalar empoze. İlk olarak, kütle spektrometresi son derece hassas olmasına rağmen düşük protein içeriği ve micropuncture örnekleri hacmi işler geleneksel proteomik keşif dinamik alan aşağıda protein analizi ve bu nedenle Basitleştirilmiş nanoproteomics vardı gerekli. 8 , 13 ikinci olarak, protein verim erken deneyleri için en iyi duruma getirmek için biz 200-300 nL aspiratı ve gerekli, ama GFR yalnızca 8-14 nL faredir de novo filtrate edinme bu birimin belki sürece aspirasyon 20 dakika gerektirecektir tespit /Min3. Tojo ve Endou uzun süreli aspirasyon erken proksimal tübül sıvı14albümin içeriğini değiştirir gösterildiği 6 dakika boyunca Aspire seçildi; Ancak bu bizim aspirasyon oranı filtrate giriş akımı hızı aşıyor anlamına gelir. Bu yordamı kullanıcılarının kendi iş akışı tasarlama kendi deneysel sisteminde glomerular filtrasyon fizyolojisi düşünmeye teşvik edilmektedir. Kütle spektrometresi, hassas bir teknik, mineral yağ, micropuncture aspirasyon için hidrolik sistemi oluşturan ve nefron parçalarını ayırmak için yaygın olarak kullanılır gibi bir tanıtılan petrol öz sinyalini tarafından boğulmuş. Bu nedenle, biz bu amaç için mineral yağ kullanılamadı veya onun diğer ortak kullanımı, miktar nanoliter aralığı örnekleri hacmi. Bunun yerine sistem hangi biyolojik olarak hareketsiz, kütle spektrometresi rahatsız etmez ve olumlu optik özellikleri olan perfluorodecalin ile doldurun. İnanıyoruz perfluorodecalin tarafından uygulanan sınırlamaları yenilebilir ve beklediğimiz numune hacmi ölçüm ve borulu segmentin abluka sağlayacak ek teknik yenilikler üzerinde çalışıyoruz.
Yüzey glomeruli artan sayıda, ama bu büyük ölçüde sınırlı fizyolojik çalışma borulu taşıma ve diğer böbrek fizyolojisi temel kaybı nedeniyle göstermek Münih-Wistar sıçanlarda en micropuncture çalışmaları gerçekleştirilmiş Aracı moleküler biyoloji, transgenik fareler2,3. Çünkü bu, Bowman'ın uzay farelerde micropipette erişimi kolaylaştırır, roman tekniği bu nedenle kritik bu sınırlamaların etkisini azaltır. Böbrek filtrate nanoproteomics9olarak bilinen yüksek-duyarlı kütle spektrometresi kullanılarak proteomik etütler erişmek için bu teknik edindik. Ancak, büyük olasılıkla ek uygulamalar vardır. Örneğin, filtre uygulanmış protein renal fizyolojik çalışma büyük ölçüde floresan izleyiciler kullanımı ile 2-foton mikroskobu15,16,17ile destekli. Micropuncture 2-foton Mikroskopi için eklenmesi tek-nefron fizyolojik çalışma izin denetimleri hizmet etmek komşu, Sigara enjekte ın floresan molekülleri ile gerçekleştirme imkanı sunuyor. Gerekli adımları net bu açıklama zaten 2-foton mikroskobu ve/veya micropuncture için donatılmış laboratuvarlarında yaygın bir şekilde kabul sağlayacak umulmaktadır. Bu karmaşık olmasına rağmen biz şimdi birçok kez bu yordamı gerçekleştirdiyseniz ve burada sunulan ayrıntılandırmaları fizyolojik keşif için istikrarlı bir platform temsil eder.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
NIDDK K08 DK090754 Mil. NIGMS P41 GM103493 RDSiçin için. Bu malzeme (mil tarafından) büyük kaynaklar ile desteklenen çalışmanın sonucu ve Portland gazileri işleri Tıp Merkezi tesislerinin kullanımı olduğunu. İçeriği US Department of Veterans Affairs veya Amerika Birleşik Devletleri hükümetinin görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| 3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
| 3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
| Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
| PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Microinjector | WPI | UMP-3 | |
| Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
| Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| 30 G needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
| Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |
References
- Schnermann, J. Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).
- Lorenz, J. N. Micropuncture of the kidney: a primer on techniques. Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).
- Vallon, V. Micropuncturing the nephron. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
- Gimenez, Y., et al. 3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. Scientific Reports. 6, 29936 (2016).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
- Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling. Methods in Molecular Biology. , (2017).
- Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications. Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).
- Clair, G., et al. Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples. Scientific Reports. 6, 39223 (2016).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).
- Andrasfalvy, B. K., et al. Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology. Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), (2016).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
- Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).
- Salmon, A. H., et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).
