Summary
혈 청 무료 조건에서 소 granulosa 셀의 장기적인 문화 모델을 설명 합니다. 이 모델에서는 다른 도금 밀도에 스 트로 겐 생산의 특성으로 다양 한 요인의 효과 연구 하는 연구원 소 granulosa 셀.
Abstract
난소 granulosa 셀 (GC)는 estradiol 합성의 주요 소스입니다. Preovulatory 황 호르몬 (LH) 서 지에 의해 유도 된 세포는 티크의 및, 특히, granulosa 셀 계층의 뿌리깊은 그들의 형태, 생리, 및 분자 특성 변경 및 황 체 호르몬 생성 신체를 형성 임신을 유지 하기 위한 책임이 있다는 luteum 셀 문화 모델 folliculo-luteal 변환에 관련 된 기본 규제 메커니즘 연구 필수 도구입니다. 제시 프로토콜 격리 절차 및 중간 소형 낭 (< 6 m m)에서 소 GC의 cryopreservation에 집중 한다. 이 기술로, GC의 거의 순수한 인구를 얻을 수 있습니다. Cryopreservation 절차는 크게 시간 세포 배양의 관리는 직접 기본 조직 (난소) 공급의 독립적인 작동을 지원 합니다. 이 프로토콜에서는 소 GC의 estradiol 액티브 상태를 모방 하는 혈 청 무료 셀 문화 모델을 설명 합니다. 성공적인 스테로이드 활성 세포 배양에 필수적인 중요 한 조건은 프로토콜에 걸쳐 설명 되어 있습니다. 그것은 그 세포의 도금 밀도 증가 유도 특정 응답 변경된 진 식 프로필과 호르몬 생산에 의해 표시 된 대로 설명 했다. 또한,이 모델은 GC 차별화에 대 한 추가 연구를 위한 기초 및 다른 응용 프로그램을 제공합니다.
Introduction
성공적인 배 란과 luteinization 정밀 하 게 조정 하 고 잘 조율 된 분자 변경 다른 체세포 follicular 셀 형식에 따라 달라 집니다. 이러한 개발 프로세스의 세부 정보는 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 때문에, 더 정화가 필요 합니다. Vivo에서 접근 정교 하 고 비용이 많이 드는 이며, 특히 folliculogenesis 동안 발생 하는 주소 특정 분자 메커니즘을 실패 합니다. 따라서, reductionistic 생체 외에서 모델 필요 또한, 세포질이 고 분자 세부 사항에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 다른 연구는 체 외 수정 기술1,2, 에서 3의 맥락에서 전체 낭의 문화를 설명합니다. 연구원은 차별화의 메커니즘에 관심이 있기 때문에, 많은 연구 follicular GC에 초점. 직접 oocyte와 관련 된 이러한 셀 스 트로 겐 생산의 주요 소스 이며, 따라서, folliculogenesis 및 luteinization4에 걸쳐 필수적인 역할.
셀 라인 GC의 다른 종에서 개발 되었습니다 불후 그러나 그들의 대부분은, 충분 한 스테로이드 호르몬 생산5표시 되지 않습니다. 지금까지, 하나의 셀 라인 GC 되었습니다 소의 설립6, 그러나이 선 여러 구절7후 steroidogenic 활동을 잃었다. 따라서,부터 steroidogenesis 그리고, 특히에서, estradiol 생산 GC 기능의 필수적인 기능입니다, 그리고 그것은 이러한 측면에서 1 차 셀 문화 모델을 공부 하는 것이 좋습니다. 이전 학문에서는, 그것은 상당한 estradiol 생산 세럼 무료 문화 조건8,9아래만 관찰 될 수 있는 시연 했다. 더욱, estradiol 종합의 선구자의 보충은 또 다른 필수 구성 요소, GC androstenedione10프로 변환할 수 있습니다 필요한 효소를 표현 하지 못하는. 또한, FSH 및 IGF-1 보충에서 체 외에서 의 시너지 효과 estradiol 합성11의 주요 효소 aromatase의 최적화 된 활동을 밝혔다. 현재 프로토콜에서 GC 문화 모델에 상당한 영향을 미칠 다른 중요 한 요인은 또한 설명 합니다. 특히, 셀 밀도 도금 실험12의 결과에 엄청난 영향을 있다. 또한, GC 생리학 문화에 크게 방해 하지 않는 소 GC의 cryopreservation 기술 수립 될 수 있습니다. 이 기술은 세포 문화 작품의 조직 개선 하 고 선호 도금 밀도 최적화 하기 위해 도움이 됩니다.
Protocol
참고: 소 난소 상업 도살에서 얻은 했다. 도살 장 부산물의 컬렉션은 독일 법 윤리적인 승인이 필요 하지 않습니다.
1. 근무 조건 및 준비
- 무 균을 보장 하기 위해 모든 미디어를 수행 하 고 조직 준비 뿐만 아니라 모든 문화 층 류 벤치를 사용 하 여 특수 세포 문화 연구소에서 일 합니다.
- 버퍼링 하는 인산 염 (PBS, pH 7.4) 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스와 난소의 수송을 위한 0.5 µ g / µ L 암포 보충 x 1을 준비 합니다.
참고: 난소를 수신 하 고 GC 분리 사이 최대 기간은이 설정에서 2 h입니다.
2입니다. 격리 소 Granulosa 셀의
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격리 절차를 시작 하기 전에 모든 혈액은 표면에서 제거 하 난소 (와 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스, 0.5 µ g / µ L 암포) 1 x PBS에 여러 번 씻는 다. 비 커를 사용 하 여, 내부 난소, 1 x PBS, 그것을 채워 놓고 다시 PBS를 삭제 합니다.
- 난소는 모든 나머지 혈액에서 청소 될 때까지 3-4 x,이 세 단계를 반복 합니다.
- 가능한 오염 최소화를 70% 알코올로 흠뻑 실험실 지우기를 사용 하 여 하나의 난소를 닦아냅니다.
- 3 mL 주사기와 18 G 바늘 중간 소형 낭 puncturing 의해 GC 발음 (< 통치자로 측정 6 m m), 고 한 50 mL 원심 분리기 튜브에 소 낭 모양 액체 풀.
참고: 주사기, 축 축 하 게 (와 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스, 0.5 µ g / µ L 암포) 1 x PBS의 작은 금액을 소요. 이 적은 양의 소 낭 모양 액체를 수집 하는 데 도움이 하 고 셀 주사기 안에 집착 하지 않도록 합니다. - 여러 낭 puncturing 후 주사기와 바늘 1 x PBS와 함께 중간 청소 린스.
3입니다. 셀의 cryopreservation
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Trypan 푸른 얼룩을 사용 하 고는 hemocytometer 아래 셀.
- 실행 가능한 세포의 수를 계산 하는 0.25 %trypan 블루 솔루션의 1.5 µ L 튜브 준비.
참고: 살아있는 세포 유지 됩니다 흠 없는 trypan 블루 파란색 표시는 죽은 세포의 셀 벽에만 액세스할 수 있기 때문에. - Trypan 블루 솔루션 granulosa 셀 서 스 펜 션의 15 µ L을 추가 하 고 부드럽게 그들을 믹스.
- hemocytometer의 두 약 실 전부에 있는 혼합물을 놓습니다. 생활의 수를 계산 (예:, 흠 없는) 셀 챔버 당 하나의 큰 광장에.
참고: 일부 혈액 세포를 볼 수 있습니다, 하지만 그들은 구분할 수 있습니다 그들의 매우 작은 크기. - 일반 지침;에 따라 두 챔버의 의미와 살아있는 세포의 수를 계산 살아있는 세포의 비율 난소 사이 다를 수 있습니다 있지만 6013를 초과 한다.
- 실행 가능한 세포의 수를 계산 하는 0.25 %trypan 블루 솔루션의 1.5 µ L 튜브 준비.
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추가 분석에 대 한 참조로 갓 격리 granulosa 셀 풀에서 샘플을 가져가 라.
- 격리 된 GC의 세포 수에 따라 정해 적절 한 수의 셀 참조 샘플으로 RNA, DNA, 또는 단백질 준비.
참고: RNA 분리 및 유전자 발현의 후속 평가, 1 x 105 세포는 충분 한, 반면 다른 후속 분석 다른, 일반적으로 더 높은 셀 숫자를 해야 할 수도 있습니다. - 신선한 튜브에 참조 셀의 하나 또는 여러 개의 aliquots를 배치 하 고 실내 온도 셀 펠 렛을 얻기 위해 최대 속도 (12000 x g)에서 1 분 동안 원심. 폐기는 상쾌한.
- 즉시 충격-동결 샘플 액체 질소. -80 ° c.에 샘플 저장
- 격리 된 GC의 세포 수에 따라 정해 적절 한 수의 셀 참조 샘플으로 RNA, DNA, 또는 단백질 준비.
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Cryopreservation는 다음과 같이 수행 합니다.
- 80% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 사용 하 여 냉동 매체를 준비 합니다.
- 부드럽게 작은 GC를 위해서는 실내 온도와 500 x g3 분 동안 GC 원심.
- 상쾌한을 신중 하 게 제거 하 고 부드럽게 셀 resuspend 덩어리 아니 더 많은 셀까지 100 %FCS (예를 들어, 1 mL)에서 볼 수 있습니다.
- 셀 서 스 펜 션에 준비 된 냉동 매체의 1 볼륨 (예:, 1 mL)을 추가 하 고 극저온 유리병에 혼합물을 전송.
참고: 곳을 알아내는 보호 미디어의 최종 농도 90 %FCS 10 %DMSO 있을 것입니다. - 극저온 유리병 급속 동결을 방지 하는 전문된 (상용) 냉동 컨테이너에 배치 합니다. 샘플의 냉각 속도-1 ° C/분 이상 4 h-80 ° C 냉동 고로 전송 냉동 컨테이너를 넘지 말아야 한다.
- 긴 저장을 위해 (예를 들면, 액체 단계 질소 용기) 초 저온 용기에 극저온 튜브를 놓습니다.
참고: 프로토콜 수 있습니다 중지 여기는 cryopreservation 긴 저장 허용.
4. 세포 배양에 대 한 미디어와 문화 접시의 준비
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0.02% 콜라겐 R. 코트 세포 배양 배지
참고: 콜라겐 R 문화에서 GC의 향상 된 첨부 파일에 대 한 필수적인 것으로 알려져 있다.- 순화 된 물 세포 배양에 적합 한 0.02% 콜라겐 R 솔루션을 준비 합니다.
- 24-잘 접시에 잘 당 150 µ L를 추가 (= 2 cm2/잘) 그 문화권의 전체 표면 잘 덮여 콜라겐 R 솔루션을 확인 하십시오.
- 뚜껑을 열고 몇 시간 동안 건조 또는 층 류 두건에 하룻밤 솔루션을 보자.
- 배양 배지는 완전히 건조, 오염을 최소화 하기 위해 10-15 분 동안 UV 빛 들을 비추는.
- 필요한 경우 최대 2 개월까지 4 ° C에서 접시를 저장.
- 미디어와 문화 일 층 흐름 후드에 대 한 보충을 준비 합니다. GC의 성공적인 복구, 그들은 녹고 후 즉시 처리 해야 합니다.
-
다음 미디어를 준비 합니다.
- Α-최소한의 필수 매체 (α-MEM)와 2 mM L-글루타민, 0.084% 나트륨 중 탄산염, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL 나트륨 selenite, 5 µ g/mL 올려진다, 10 ng/mL 인슐린 1 m m 비 본질적인 아미노산을 보충 한다.
- 또한, 미디어 100 IU 페니실린과 0.1 mg/mL 스를 추가 합니다.
참고: 일단 예 열, 항생제 약 48 h에 대 한 안정적입니다. 따라서, aliquot 문화권 설정에 대 한 미디어 및 계획 된 미디어의 원하는 금액 교환 합니다. 미리 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에 미디어 aliquots만. 4 ° C에서 3 개월 이상 준비 된 미디어를 저장할 수 없습니다. - 교양된 소 GC에서 스테로이드 활동을 유도 하는 α-MEM 20 ng/mL 뿌리-자극 호르몬 (FSH)과 또한, 50 ng/mL R3 IGF-1, 그리고 2 µ M androstenedione 보충.
참고: 항상 이러한 구성 요소는 문화 또는 미디어 교환의 발병 직전 보충. 이 스테로이드 활동을 손상 시킬 수도 있는 FSH 및 IGF-1 재고 솔루션에 대 한 반복된 및 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오.
5. 세포 문화 작업
- 3-4 분 동안 37 ° C에 물 목욕에 신속 하 게 세포를 해 동 하 고 37 ° C (호르몬 보충) 없이 미리 따뜻하게 α-MEM에 세포 현 탁 액을 전송. 원심 분리, 10 mL의 최종 볼륨을 사용 하는 것이 좋습니다.
- 500 x g와 실내 온도에 3 분 동안 GC 원심 폐기는 상쾌한. 미리 예 열 하 고 보충 α-MEM을 추가 하 고 셀을 신중 하 게 resuspend.
- 500 µ L. 마지막 볼륨에서 1 x 105 또는 잘 당 1 x 106 세포의 조밀도에 씨 GC 조건 당 적어도 3 개의 문화 우물의 기술 복제를 포함합니다.
- 8 d 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에서 세포 배양 품 어.
- 미디어 교환 매일 수행 합니다. 스트레스를 줄이기 위해 고 신선한 미디어 셀의 적응을 쉽게 하기 위해 문화 미디어의 2/3만을 교체 합니다.
참고: GC 문화에 몇 일 후에 전형적인 구와 같은 표현 형을 형성 하 고 함께 클러스터 해 경향이 있다. 높은 세포 조밀도 문화에 더 큰 클러스터는 일반 밀도 GC 문화 (그림 1, 왼쪽 대 오른쪽 패널)에 비해 더 자주 발견 된다.
6. 이후 분석 교양된 Granulosa 셀의
- 스테로이드 호르몬 분석을 수행 하려면 미디어를 수집 하 고-20 ° c.에 그것을 동결합니다 적절 한 메서드를 사용 하 여 보낸된 미디어 [예: 방사 면역 검정 법 (RIA)]14에 estradiol과 progesterone 농도 분석.
- 다른 대상 분자 (RNA, DNA, 단백질, 등)의 후속 분석을 위해 공급 업체에서 권장 하는 대로 적절 한 lysing 에이전트와 문화 접시에 직접 세포를 lyse.
참고: 대부분의 격리 절차에 대 한 이건 여기, 프로토콜을 막을 수로 lysed 세포-20 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다. 긴 저장을 위해 셀-80 ° c.에 유지 되어야 한다 - 사본을 풍부를 확인 하려면 cDNA를 합성 하 고 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 기법15특정 성적을 측정 한다. 통계 평가 다른 세포 준비 (생물 복제)에서 유래 하는 다른 세포 배양의 적어도 3 개의 복제를 포함 해야 합니다.
Representative Results
GC 도금 1 x 105 셀/잘 표시 전형적인 구와 같은 모습으로 그들은 섬유 아 세포에 비해 세포 확장을 형성 (그림 1a 및 1c) 클러스터를 구축 하는 경향이 있다. 의해 도금 밀도 10 배 증가 1 x 106 셀/잘 형태를 변경 하지 않은 하지만 더 많은 셀 클러스터 (그림 1b 및 1 d, 화살표) 관찰 될 수 있다. 같이 이미 이전 게시, 문화 요리 콜라겐 코팅은 크게 셀13의 첨부 파일 개선.
초기 cryopreservation 갓 격리 된 샘플에서 직접 경작 하는 그에 비해 문화에 세포의 생리 적 특성을 상당히 변화 하지는 않았다. 이 때 냉동 또는 신선한 고립 된 수영장에서 파생 된 배양된 세포를 비교 유전자 차이가 없 여러 마커의 사본 풍부 (정량 측정)로 그림 2 에 표시 됩니다.
그림 3 정상 대 높은 밀도에서 교양 소 GC에서 스테로이드 호르몬 분석 (RIA로 측정)의 대표적인 결과 보여준다. Estradiol 농도 호르몬 생산 경향이 높은 반면 정상 밀도 문화에 비해 고밀도 문화에 크게 감소 됩니다.
높은- 대 정상 밀도 문화에서 (정량에 의해 측정 되는) 몇몇 유전자의 비교 분석 (그림 4) 상당한 효과를 밝혔다. CYP19A1, estradiol 생 합성 aromatase FSHR, 생식 샘 자극 호르몬 수용 체의 주요 효소를 인코딩 했다 크게 다운-규제. 대조적으로, RGS2 및 VNN2 유전자는 상당한 업 레 귤 레이 션 보였다. 이러한 결과 명확 하 게 밀도 도금 하는 세포를 증가 시켜 세포 분화의 특정 프로세스 유도 된다 건의 한다.
그림 1: 정상 (왼쪽된 패널)과 높은 세포 밀도 (오른쪽 패널)에서 소 granulosa 셀 교양. 1 x 105 셀/잘의 밀도에서 경작 하는(및 c) 셀 표시 전형적인 구와 같은 표현 형. (b 와 d) 정상적인 밀도 (왼쪽된 패널)에서 세포에 비해 더 자주 큰 셀 클러스터 (화살표)를 형성 하는 경향이 높은 도금 밀도 (1 x 106 셀/잘)에서 경작 하는 GC 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: cryopreservation 그리고 격리 후 직접 경작 하는 세포의 비교. 셀 잘 당 1 x 105 세포의 밀도에 교양 있었다. 몇 가지 마커 성적 유전자 발현 평가 되었다 고 배양된 세포 또는 초기 cryopreservation 없이 차이 밝혀. boxplot 보여줍니다 n 의 중앙값 = 3. 양측 스튜던트 t-테스트, p-값이 포함 되어 있습니다. 이 그림은 Baufeld 및 Vanselow16에서 재생 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 스테로이드 호르몬 농도 granulosa 셀 다른 도금 밀도에서 경작에. Estradiol (e 2) 농도 감소 크게 GC 높은 세포 조밀도에 교양 있었다 때 황 체 호르몬 (P4) 농도 경향이 높은 반면. 호르몬 농도 DNA 콘텐츠를 다른 핸드폰 번호에 대 한 표준화에 대 한 수정 되었습니다. 평균 및 SEM을 n = 3이 표시 됩니다. p > 0.05, 양측 스튜던트 t-테스트. 이 그림은 Baufeld 그 외 여러분 에서 재현 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: granulosa 셀에 기능 키 성적표의 풍부한 경작는 정상적인 대 에서 높은 도금 밀도. 8 d에 대 한 혈 청 자유로운 조건에서 배양 소 GC 몇몇 선택 된 마커 유전자의 특정 규정을 밝혔다. boxplot 표시 n 의 중앙값 = 3 개별 복제. p < 0.05, 양측 스튜던트 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
제시 셀 문화 모델 granulosa 셀 차별화 시험관을 분석 하는 도구를 제공 합니다. 여러 연구 결과 혈 청 무료 재배 경작된 소 GC 또는 다른 종8,9의 GC에서 스테로이드 활동을 유지 하기 위해 필수 보여주었다. 또한 기질 (예를 들어, 콜라겐 R)13의 구성 요소와 문화 접시 코팅, 크게 향상의 셀 첨부 파일. 또 다른 중요 한 기능은 장기 문화 기간입니다. 최근에, 그것은 장기 문화는 충분 한 steroidogenic 활동과 granulosa 셀 정체성 마커17의 균형된 식을 얻기 위해 필요한 증명 되었습니다. 그것은 GC 물리적 스트레스 로부터 격리 절차 동안 복구 시간을 필요로 나타납니다.
FSH, IGF-1, androstenedione 알려져 있습니다에서 aromatase 활동을 유도 하기 위해 미디어 보충 교양 GC. 특히, androstenedione와 보완은 절대적으로 필요한, GC로 필요 전조 estradiol 합성 합니다. 이것은 계속 이전11,18 에 게시 하 고, 따라서 하지 추가 조사는 현재 연구 중. 그러나, FSH, IGF-1, 그리고 androstenedione 농도의 적응은 다른 실험 설정에 대 한 필요할 수 있습니다.
여기에 설명 된 cryopreservation 기술을 더 난소와 다양 한 공급에서 독립 함으로써 조직 배양 실험 기구를 개선 하기 위해 도울 수 있다. 이전 테스트에 따르면 cryopreservation GC 형 또는 스테로이드 생산 문화에 미치지 않는다. 또한, 경작된 한 세포에 표식 증명서의 풍부는 이전 cryopreservation16에 들어서는 그 갓 고립 된 세포에서 준비 하는 샘플을 비교 하는 중요 한 차이점이 공개 하지 않았다.
현재 GC 문화 모델에 대 한 중요 한 매개 변수는 밀도 도금 하는 셀입니다. 대표 결과같이 생리 및 분자 특성의 놀라운 변화를 유도 도금 밀도 증가. 몇몇 유전자는 LH 자극 vivo에서4,19에 의해 유도 되는 변화를 닮은 특정 방식으로 통제 된다. 한 증가 셀 밀도 교양된 소 GC 차별화와 같은 프로세스를 구동할 수 있다 사실 꼼꼼하게 복제 사이 충돌 하는 결과 피하기 위해이 GC 모델 체 외에 간주 있다. 따라서, 다른 연구 결과와 모순 된 결과 다른 셀 밀도를 관찰 수 있습니다 그리고 더 면밀 하 게 조사 해야 합니다.
설명 된 문화 모델 LH에 응답 하지 않는 것을 여기 공개 LHCGR 수용 체의 성적으로는 검출 한계. 따라서, 모두 LH 서 지의 시뮬레이션 vivo에서 상황 차별화13유도를 하지 못했습니다. 그럼에도 불구 하 고, estradiol-액티브 GC 주 문화에서를 공부 하는 유용한 도구를 제공 하는이 모델, 현재 존재 하는 특히 더로 기능 소 GC 라인.
스테로이드 생산 또는 GC 차별화의 규제 메커니즘을 해명 하는 데 도움이 현재 GC 문화 모델에서 다른 치료 프로토콜을 테스트할 수 있습니다. 개발 프로세스에 관련 된 추가, 단일 요소를 개별적으로 분석할 수 있습니다. 따라서,이 문화 모델은 많은 다른 응용 프로그램에 대 한 기반을 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 베로니카 Schreiter 그녀의 우수한 기술 지원과 설립된 cryopreservation 기술과 세포 문화 모델의 도움이 수정. 또한, 우리는 이후 분석에 그들의 우수한 기술 지원에 대 한 마 렌 앤 더 스와 Swanhild Rodewald 감사 드리고.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/mL) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| amphotericin (250 µg/mL) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| 3 mL syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
| 18 G needle | Roth | C724.1 | |
| fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| cryo-preservation vials (2 mL) | TPP Faust | TPP 89020 | |
| CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
| culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
| collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
| α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
| transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
| insulin (10 mg/mL) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
| NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/mL, diluted in 0.9 % NaCl |
| LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA |
| androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |
References
- Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro. Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).
- Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture. Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Christenson, L. K., et al. Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes. Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).
- Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. Ovarian granulosa cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).
- Bernath, V. A., et al. Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).
- Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors. Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).
- Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics. Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).
- Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media. Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).
- Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited. Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).
- Silva, J. M., Price, C. A. Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro. Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).
- Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells. Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).
- Schneider, F., Brüssow, K. P. Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts. Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).
- Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).
- Yenuganti, V. R., Vanselow, J. Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions. Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).
- Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells. Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).
- Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period. Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).
