Summary
التصاق دينامية للخلايا المناعية لجدار الوعاء شرطا لصاروخ موجه القناة الهضمية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة وظيفية في المختبر لتحليل تأثير الأجسام المضادة-إنتغرين أو المستقطبات أو غيرها من العوامل على التصاق الخلية الحيوية للخلايا البشرية باستخدام الشعيرات الدموية المغلفة أدريسين.
Abstract
صاروخ موجه القناة الهضمية للخلايا المناعية مهم للآلية المرضية لأمراض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين). التصاق الخلية إنتغرين-تعتمد على أن أدريسينس خطوة حاسمة في هذه العملية، ووضعت استراتيجيات علاجية تتداخل مع الالتصاق بنجاح. جسم إنتغرين مكافحة--α4β7، فيدوليزوماب، ويستخدم للمعالجة السريرية لداء كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC) ومركبات أخرى من المحتمل أن تتبع.
تفاصيل الإجراء التصاق وآليات عمل الأجسام المضادة-إنتغرين لا تزال غير واضحة في ما يخص العديد من التقنيات المتاحة محدودة بسبب للبحوث الفنية في هذا المجال.
نقدم هنا، مقايسة التصاق ديناميكي للتحليل الوظيفي لالتصاق الخلايا البشرية تحت ظروف التدفق وأثر العلاجات المضادة-إنتغرين في إطار بنك التنمية بين الأمريكتين. أنه يستند إلى التروية للخلايا البشرية الأولية من خلال الشعيرات الدموية الزجاج سامسونج أدريسين المغلفة بالتحليل المجهري في الوقت الحقيقي. يقدم مجموعة متنوعة من الفرص المتاحة لإدخال تحسينات وتعديلات المقايسة ويحمل إمكانات للاكتشافات الميكانيكية وتطبيقات متعدية الجنسيات.
Introduction
الحركة خلية محكم تنظيم عملية لا غنى عنها للتنمية ووظيفة الكائنات الحية متعددة الخلايا، ولكن أيضا تورط في الآلية المرضية للعديد من الأمراض1. في الآونة الأخيرة، اكتسبت عملية استضافة أكثر من الخلايا المناعية من مجرى الدم إلى الأنسجة المحيطة اهتماما متزايداً، نظراً لأنها تسهم في تجديد وتوسيع نطاق من الخلايا المسببة للأمراض في أنسجة ملتهبة في وساطة مناعي الأمراض2 ،3. على وجه الخصوص، أظهرت صاروخ موجه إلى أهمية متعدية الجنسيات في أمراض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين). فيدوليزوماب جسم إنتغرين العلاجية المضادة-α4β7 التدخل في توجيه القناة الهضمية وقد أظهرت فعاليتها في تجارب سريرية كبيرة4،5 وقد استخدمت بنجاح في العالم الحقيقي الممارسة السريرية6،7 , 8-مركبات أخرى من المحتمل أن تتبع9،10. وبالمثل، يستخدم جسم إنتغرين العلاجية المضادة-α4، ناتاليزوماب، لعلاج التصلب المتعدد (MS)11.
ومع ذلك، فهمنا الوظيفية العملية صاروخ موجه بصورة عامة وآلية العمل لهذه الأجسام المضادة العلاجية خاصة لا تزال محدودة. ومن الثابت أن صاروخ موجه تتألف من العديد من الخطوات بما في ذلك الربط الخلية والمتداول مع التصاق الخلايا اللاحقة أدت إلى توقيف شركة تليها عبر الهجرة غشائي12،13. تحييد الأجسام المضادة المشار إليها أعلاه إينتيجرينس على سطح الخلية منع التفاعل مع أدريسينس في البطانة جدار الوعاء الدموي. هذا ويعتقد أن تعيق التصاق الخلية الثابت14،15. حتى الآن، لقد بدأنا فقط لفهم أهمية التفاضلية إينتيجرينس محددة لصاروخ موجه من خلية لخلية متميزة مجموعات فرعية. وعلاوة على ذلك، خلية آثار الأجسام المضادة-إنتغرين على مختلف المجموعات الفرعية والجمعيات الاستجابة للجرعة معروفة إلى حد كبير مما أدى إلى الكثير من الأسئلة المفتوحة في مجال العلاجات صاروخ موجه والمضادة الالتصاق الغريزي في بنك التنمية بين الأمريكتين.
ولذلك، تمس الحاجة إليها أدوات ملائمة للتصدي لهذه المسائل. حتى الآن تم تقييم تأثير الأجسام المضادة-إنتغرين على التفاعل أدريسين إنتغرين أساسا بتقييم تثبيط فعالية/ملزمة ملزمة مع التدفق الخلوي أو عن طريق التصاق ثابتة فحوصات16،17 ،18،19،20، وبالتالي مع تبسيط الظاهر وانحراف عن الحالة الفسيولوجية. كما أنشأنا مؤخرا مقايسة التصاق دينامية لدراسة التصاق إنتغرين-تعتمد على الخلايا البشرية إلى أدريسينس والآثار للأجسام المضادة-إنتغرين تحت إجهاد القص2. وفي وقت سابق ثبت مبدأ هذه التقنية مع الماوس الخلايا21،22. هنا، كان تكييفها وتطويرها لمعالجة المسائل المذكورة أعلاه متعدية الجنسيات، وفتح مجالات جديدة لأفضل فهم آليات العلاج مع إنتغرين مكافحة الأجسام المضادة في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء هذه الدراسات هو موضح في المقاطع التالية وفقا لموافقة لجنة الأخلاقيات فريدريش-ألكسندر جامعة ارلنجن نورنبيرغ.
1-إعداد الشعيرات الدموية
- الاتصال الشعيرات الدموية مستطيلة الأنبوب المطاط تمتد الأنابيب على جانب واحد مع مقص صغير وإدراج الشعرية (حوالي 0.5 سم) بعناية في الأنبوب. إغلاق الاتصال بين الشعرية وأنبوب مع الفيلم البارافين البلاستيك.
- معطف شعري مع 20 ميليلتر من أدريسين (المؤتلف Fc الوهم؛ 5 ميكروغرام/مل أدريسين، مثل مادكام-1، في المخزن المؤقت لطلاء (150 مم كلوريد الصوديوم + 1 مم حبيس)) أو الحل التحكم ايستب المناسبة باستخدام ماصة p20 (السائل سوف نقع نفسها إلى الشعرية). ثم ختم على الجانب غير متصل بالانبوب مع الفيلم البارافين البلاستيك واحتضانها لعلى الأقل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. استخدام شعري شغلها فقط مع المخزن المؤقت طلاء أو مع عنصر تحكم ايستب المناسبة كمراقبة سلبية.
- إزالة الفيلم البارافين البلاستيك من تلميح شعري، وإفراغ الطلاء بالسماح لامتصاص السائل من شعري في ورقة منشفة وكتلة الشعيرات الدموية على الأقل 1 ساعة مع 20 ميليلتر من عرقلة الحل (1 x برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 5%) عند 37 درجة مئوية. ختم الجانب فتح شعري مع الفيلم البارافين البلاستيك. لا تقم بإزالة الحل حظر قبل الشروع في الفحص المجهري.
2-الخلية العزل والعلاج والتحضير للفحص المجهري
ملاحظة: هذه الخطوات يمكن إجراء أثناء الاحتضان الفترات اللازمة لإعداد الشعرية.
- جمع 18 مل دم أنتيكواجولاتيد البشرية بالكامل مع مجموعة العقيم دم من الوريد المرفقي للعمل التطوعي الأشخاص (مثل بنك التنمية بين الأمريكتين المرضى و/أو ضوابط صحية) بعد موافقة خطية مستنيرة وفقا للوائح المحلية لجنة للأخلاقيات.
ملاحظة: يجب أن يكون تنفيذ هذه الخطوة فقط من الموظفين الطبيين المدربين وذوي الخبرة وفقا للوائح الوطنية و/أو المحلية. - ملء الدم في أنبوب 50 مل وتخفف من حجم 35 مل مع برنامج تلفزيوني 1 x. ثم تقوم عليها خليط الدم-برنامج تلفزيوني مع 10 مل من الكثافة المتوسطة التدرج.
- أداء الكثافة المتدرجة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 800 x ز و 24 درجة مئوية دون الفرامل لفصل الخلايا.
- جمع خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) التي يسفط في طبقة الخلايا البيضاء الحق في أعلى طبقة متوسطة الانحدار الكثافة (طبقة وسطى واضحة). نقل ببمكس في أنبوب 50 مل طازجة، وملء يصل إلى 50 مل مع 1 x برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 x ز و 10 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية، ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني وفي وقت لاحق عد أرقام الخلية، مثلاً، باستخدام خلية نويباور عد الدائرة.
- اختياري: لدراسة انضمام المحببة تنفيذ الإجراء التالي. وإلا، تابع مع الخطوة 2.7 أو 2.8.
- جمع طبقة المحببات (الطبقة الأسفل بعد الكثافة المتدرجة تتضمن أيضا الكريات الحمراء الطرد المركزي). ريسوسبيند الخلايا في 40 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. قم بإضافة 8 مل من 6% ديكستران في برنامج تلفزيوني 1 x، تخلط بلطف وترك الرواسب الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: سوف تغرق الكريات الحمراء إلى الجزء السفلي من الأنبوب، بينما سيبقى المحببة في تعليق. - وبعد 30 دقيقة، جمع المادة طافية، نقل إلى أنبوب 50 مل الطازجة والطرد المركزي لمدة 6 دقيقة في 300 x ز و 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وفي الكريات الحمراء المتبقية عن طريق إضافة 5 مل من 0.2% كلوريد الصوديوم في ddH2O. إينكوباتي لمدة 1 دقيقة.
- إضافة 5 مل من 1.4% كلوريد الصوديوم في ddH2س واحتضانها لآخر دقيقة. إيقاف تحلل ناقص التوتر عن طريق إضافة 20 مل من 1 x PBS والطرد المركزي لدقيقة 6 في 300 x ز و 4 درجة مئوية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من 1 x PBS. ثم، حساب أرقام الخلية باستخدام خلية نويباور عد الدائرة.
- جمع طبقة المحببات (الطبقة الأسفل بعد الكثافة المتدرجة تتضمن أيضا الكريات الحمراء الطرد المركزي). ريسوسبيند الخلايا في 40 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. قم بإضافة 8 مل من 6% ديكستران في برنامج تلفزيوني 1 x، تخلط بلطف وترك الرواسب الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اختياري: لدراسة انضمام مجموعات فرعية ببمك، تنقية أنواع مختلفة من الخلايا أو مجموعات فرعية (مثل خلايا CD4+ و CD8+ تي الخلايا أو CD19+ ب الخلايا) استخدام ميكروبيدس وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة أو عن طريق تنشيط الأسفار الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). وإلا، تابع مع الخطوة 2.8.
- الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 300 x ز و 10 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية ووصمة عار الخلايا مع خلية تتبع صبغة (مثلاً، كفسي) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- وفي وقت لاحق، الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 300 x ز، وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند في برنامج تلفزيوني x 1، تحديد عدد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 300 x ز.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه خلية الملون في المقدار المناسب من المخزن المؤقت للالتصاق (150 مم كلوريد الصوديوم + 1 مم حبيس + 1 مم مجكل2 + 1 مم كاكل2) للحصول على تعليق 1.5 × 106 خلايا/مل. ثم إضافة المقدار المناسب من 100 مم2 من الحركة للحصول على تركيز نهائي من 1 مم.
ملاحظة: هذه الخلايا الآن جاهزة للفحص المجهري. - اختياري: علاج الخلايا مع السيتوكينات، تحييد الأجسام المضادة أو غيرها من المركبات. وإلا، تابع مع الخطوة 3.
- حذف الخطوة 2.10 وريسوسبيند بيليه خلية الملون من الخطوة 2.9 في المتوسط ربمي (مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين) للحصول على تركيز 1.5 × 106 خلايا/مل.
- "الماصة؛" 1 مل من هذا تعليق خلية في العديد من الآبار للوحة 48-جيدا كما أن هناك شروط يتم تحليلها. دائماً إعداد بئر واحدة مع الخلايا غير المعالجة أن perfused من خلال الشعرية غير مصقول كالمراقبة السلبية وبئر واحدة مع الخلايا غير المعالجة أن perfused من خلال الشعرية المغلفة أدريسين كمراقبة إيجابية.
- للعلاج بالأجسام المضادة-إنتغرين وإضافة المقدار المناسب من جسم (مثلاً، 10 ميكروغرام/مل فيدوليزوماب) إلى تعليق خلية. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية. للعلاج مع السيتوكينات، إضافة المقدار المناسب من المؤتلف سيتوكين (مثلاً، 10 نانوغرام/مل CXCL10) إلى تعليق خلية. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- بعد الحضانة، حصاد الخلايا من ريسوسبيندينج عدة مرات باستخدام ماصة p1000 من الخلايا. نقل الخلايا في أنبوب 2 مل وشطف جيدا مرة أخرى مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1 x وإضافة إلى أنبوب 2 مل. تحديد عدد الخلايا.
ملاحظة: قد تتطلب الحضانة للخلية ملتصقة السكان (مثلاً، وحيدات) تدابير إضافية (مثلاً.، المعاملة مع التربسين) لفصل الخلايا من اللوحة.
- خلايا جهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 س ز على 10 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في المقدار المناسب من المخزن المؤقت للانضمام الحصول على تعليق 1.5 × 106 خلايا/مل. ثم إضافة المقدار المناسب من 100 مم2 من الحركة للحصول على تركيز نهائي من 1 مم. عند تقشير مع المستقطبات لا تقم بإضافة الحركة2 إلى تعليق خلية. هذه الخلايا الآن جاهزة للفحص المجهري.
ملاحظة: حجم الحد الأدنى المستخدمة للمقايسة فيعتمد على المضخة والأنابيب المستخدمة. في هذه الدراسة، باستخدام مضخة تمعجية والانبوب المحدد في الجدول للمواد، كان حجم الحد أدنى 400 ميليلتر المطلوبة. إذا كان المطلوب وقابلة للتطبيق (تبعاً لنوع الخلية والغلة)، يمكن زيادة تركيز الخلية في التعليق لقياس التصاق أعلى في فترة أقصر من الوقت. - تعديل المحتملة: مقايسة التصاق ديناميكية قادرة على المنافسة
- تنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه مع السكان خلية مختلفة مقارنتها ببعضها البعض (مثلاً، تنظيمية وخلايا المستجيب تي معزولة عن طريق عزل حبة المغناطيسي اتباع إرشادات الشركة المصنعة وفقا للخطوة 2.7).
- وصمة عار كل السكان مع صبغة مختلفة (مثلاً، كفسي وفريد) كما هو موضح في الخطوات 2.8 – 2.9 لتكون قادرة على التمييز بين السكان الخلية أثناء الفحص المجهري.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الكريات خلية الملون في المقدار المناسب من المخزن المؤقت للالتصاق (150 مم كلوريد الصوديوم + + + 1 مم مجكل2 1 مم حبيس 1 مم كاكل2) للحصول على تعليق 1.5 × 106 خلايا/مل.
- تخلط كميات متساوية من تعليق خلية (مثلاً 500 ميليلتر من خلايا تي التنظيمية) و 500 ميليلتر من خلايا المستجيب T للحصول على نهائي مختلطة تركيز خلية 1.5 × 106 خلايا/مل. ثم إضافة المقدار المناسب من 100 مم2 من الحركة للحصول على تركيز نهائي من 1 مم. مثل هذا التعليق في وقت لاحق يمكن أن للمنافسة وتحليل عملية الالتصاق بيرفوسينج السكان خلية مختلفة عن طريق الشعرية نفسها.
3-يعيش تصوير الخلية للالتصاق ديناميكية
- تشغيل المجهر وحدد عامل التصفية المناسب أو بالليزر لإثارة الخلية تتبع dye(s) (مثلاً، 488 نانومتر الليزر كفسي) وهدف مناسب (مثلاً 40 س) واكتساب وضع تمكينية وقت الفاصل تصوير.
- إزالة الفيلم البارافين البلاستيك من تلميح شعري والاتصال شعري مع قطعة قصيرة من الأنابيب (حوالي 5 سم طول) بالتمدد الأنابيب على جانب واحد مع مقص صغير وعناية إدراج الشعرية (حوالي 0.5 سم) في الأنبوب. إغلاق الاتصال بين الشعرية وأنبوب مع الفيلم البارافين البلاستيك.
- جبل شعري على علبة تثبيت (مثل غطاء من صفيحة 6-جيدا مع مستطيلة قص-مهلة أقصر قليلاً من طول شعري) ووضع الشعرية الثابتة على حامل علبة المجهر، حيث شعري في التركيز وعلى استعداد للفحص المجهري.
- إدراج أنابيب المطاط في الشق المقابل مضخة تمعجية ووضع النهاية غير مرفقة بشعري في أنبوب العينة وفقا التي تحتوي على تعليق خلية. إدراج أنبوب قصير على الجانب الآخر شعري في أنبوب 15 مل لجمع من خلال التدفق.
- اسمحوا ملء الأنبوب بمعدل تدفق 500 ميليلتر في الدقيقة الواحدة حتى تعليق خلية يصل تقريبا الشعرية. التعبئة الشعرية مع معدل تدفق من 100 ميليلتر/دقيقة.
ملاحظة: يملأ سريعة شعري يضمن توزيع عادية من تعليق خلية داخل شعري. - عندما يتم تعبئة شعري مع تعليق خلية، ضبط معدل التدفق إلى 10 ميليلتر/دقيقة.
ملاحظة: قد تختلف معدلات تدفق هذه، عندما تستخدم الشعيرات الدموية من حجم مختلف أو المضخات المتمعجة مختلفة. في هذه الدراسة، كان الأمثل معدل تدفق 10 ميليلتر/دقيقة للمضخة والشعيرات الدموية لتقليد في فيفو تدفق الدم. - التقاط الصور الوقت الفاصل بين الخلايا تتحرك ببطء من خلال شعري على طول أدريسين-المغلفة داخل الجدار كل 2 ثانية لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: الفواصل وإجمالي الوقت قد تختلف تبعاً لنوع الخلية والمسألة التي يتعين معالجتها. - قبل تجاهل الشعرية، شاشة شعري كله عن طريق قطعة العين المجهر للتأكد من أن المقطع يظهر في شريط الفيديو هو الممثل. إذا لزم الأمر، إجراء تسجيل ثاني.
- مجاناً الأنبوب من المضخة والسماح للسوائل المتبقية تشغيل مرة أخرى في أنبوب 2 مل، ثم افصل الشعرية وأنابيب من علبة التثبيت وتواصل مع الشعرية القادمة.
4-التقييم وخلية العد
- افتح التسلسل الزمني الفاصل مع البرامج المناسبة وتصدير الصور الثلاث الأولى ("بداية") والصور الثلاث الأخيرة ("إنهاء") كملفات Tiff.
- فتح ثلاث صور "بداية" في إيماجيج، تحويل إلى 32 بت ('الصورة | نوع | 32 بت ') ودمج الصور (' صورة | لون | دمج قنوات؛ تعيين ألوان الأحمر والأخضر والأزرق للصور المختلفة). تحويل صورة مركبة إلى RGB (' صورة | تيبيرجب ') وحفظه كملف Tiff. كرر مع الصور "نهاية".
ملاحظة: في فحوصات التصاق ديناميكية قادرة على المنافسة مع خلايا ملطخة بألوان مختلفة، أولاً تقسيم قنوات الصور لتحليل التصاق السكان خلية مختلفة كل على حدة. - عد الخلايا البيضاء تظهر في مركب "بداية" و "نهاية" واطرح عدد الخلايا البيضاء في "بداية" من الخلايا البيضاء في "نهاية".
ملاحظة: يمثل الفرق المنضمة حديثا أن عدد الخلايا في الفاصل الزمني 3 دقيقة. في الصورة المركبة، والخلايا التي انتقلت مرئية في الألوان المحددة التي تم تعيينها إلى الإطار كل منها نظراً لأنها تعريب في بقعة أخرى في الإطار السابق والتالي. للخلايا التي تكون ملتصقة، الإشارات الحمراء والخضراء والزرقاء في نفس التداخل البقعة إلى اللون الأبيض. - لرؤية النتائج أفضل، ترجمة شريط فيديو من التسلسل الزمني الفاصل، مثلاً، باستخدام إيماجيج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الطريقة التي عرضت في هذه المخطوطة تقييم تهدف إلى محاكاة عملية التصاق الخلايا البشرية على الحائط بطانية في فيفو قدر الإمكان إلى وظيفيا التصاق الخلايا ودور الأجسام المضادة للتدخل. ولذلك، سامسونج الشعيرات الدموية المغلفة مع أدريسينس و perfused مع الخلايا البشرية المسمى فلوريسسينتلي من الاهتمام باستخدام مضخة التروية. ويمكن ملاحظة استخدام الخلايا الحية التصوير التصاق الخلايا البشرية أدريسينس في الوقت الحقيقي (الشكل 1).
هذا الأسلوب مناسبة خاصة توضيح آليات العلاجات المضادة الالتصاق في بنك التنمية بين الأمريكتين. كما هو مبين في الشكل 2 ألف، نضح من الشعيرات الدموية المغلفة مع المتكاملة-1 VCAM-1 مادكام-1 والوهم Fc ايستب مع ببمكس البشرية يؤدي إلى التصاق ملحوظ، عندما يكون أحد أدريسينس الثلاث الحالية. وفي المقابل، الانضمام إلى الشعيرات الدموية المغلفة ايستب الحد الأدنى. تثبيط التفاعلات أدريسين إنتغرين عادة باستخدام الأجسام المضادة لتحييد يؤدي إلى انخفاض ملحوظ للالتصاق الدينامية التي تغيب، عند إضافة ايستب مراقبة الأجسام المضادة (أسمبلي يتضح في الشكل 2B، المجمعة البيانات الكمية في الشكل 2).
وبالمثل، يمكن أن يحقق أثر المستقطبات على التحوير إنتغرين-تقارب في هذا النظام بما قبل الاحتضان مع هذه الببتيدات في المختبر. كما يتضح من البيانات الممثلة في الشكل 3، معاملة CD4+ خلايا تي البشرية مع CCL2 أو CXCL10 يؤدي إلى زيادة الانضمام إلى مادكام-1 مقارنة مع الخلايا البشرية غير المعالجة.
رقم 1: التمثيل التخطيطي لسير العمل. إعداد أدريسين المغلفة سامسونج الشعيرات الدموية والخلايا البشرية المسمى فلوريسسينتلي (يسار) ويعقب التروية للخلايا عن طريق شعري باستخدام مضخة تمعجية (الأوسط) والوقت الفاصل بين الفحص المجهري (يمين). تعديل بإذن من المرجع23. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: دينامية انضمام الطرفية البشرية الدم الخلايا وحيدات النوى (ببمكس) من مراقبة الجهات المانحة إلى أدريسينس مختلفة- (أ) عدد من المنضمة حديثا ببمكس إلى الشعيرات الدموية المغلفة مع أدريسينس محددة أو مراقبة ايستب Fc (n = 6). (ب) صور الممثل للالتصاق دينامية في المتكاملة-1 مغلف الشعيرات الدموية perfused غير المعالجة (NT) ببمكس أو الخلايا المحتضنة مع 10 ميكروغرام/مل CD18 مكافحة جسم أو مفتش ميكروغرام/مل 10 ايستب عنصر التحكم. بداية: دمج الصور الثلاث الأولى في التسلسل 3 دقيقة؛ نهاية: دمج الصور الثلاث الأخيرة للتسلسل 3 دقيقة؛ يصور المنضمة الخلايا البيضاء. يتم الإشارة إلى أرقامها، فضلا عن الفرق (أي الخلايا المنضمة حديثا). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) أثر إنتغرين مكافحة الأجسام المضادة (بعضها يستخدم بتركيز 10 ميكروغرام/مل) على انضمام ديناميكي. اليسار: عدد من حديثا الخلايا المنضمة إلى الشعيرات الدموية المغلفة مع المتكاملة-1 و perfused بدون علاج، التعامل مع CD18 مكافحة أو مفتش ايستب تحكم تعامل الخلايا؛ الأوسط: عدد من حديثا الخلايا المنضمة إلى الشعيرات الدموية المغلفة مع VCAM-1 و perfused بدون علاج، يعامل ناتاليزوماب أو مفتش ايستب الخلايا المعالجة بالمراقبة؛ حق: عدد من حديثا الخلايا المنضمة إلى الشعيرات الدموية المغلفة مع مادكام-1 و perfused بدون علاج، تعامل فيدوليزوماب أو مفتش ايستب تحكم تعامل الخلايا (n = 5 – 6). أشرطة تبين الوسائل مع الخطأ المعياري للوسط (SEM). اختبار إحصائية أجريت مع أحادي الاتجاه ANOVA تليها التجارب المقارنة "متعددة" كولس نيومان (* p < 0.05؛ * * ف < 0.01). تعديل بإذن من المرجع23. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تشيموكيني بوساطة الالتصاق الحيوي للبشرية CD4 الخلايا+ ر إلى مادكام-1. الصور من التصاق دينامية ممثل الاعتداء في الشعيرات الدموية perfused غير المعالجة (NT) CD4 1 المغلفة مادكام+ تي الخلايا أو الخلايا المحتضنة مع 10 نانوغرام/مل rhCXCL10 أو 100 نانوغرام/مل rhCCL2. بداية: دمج الصور الثلاث الأولى في التسلسل 3 دقيقة؛ نهاية: دمج الصور الثلاث الأخيرة للتسلسل 3 دقيقة؛ يصور المنضمة الخلايا البيضاء. يتم الإشارة إلى أرقامها، فضلا عن الفرق (أي الخلايا المنضمة حديثا). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. بريينكوبيشن مع المستقطبات يؤدي إلى زيادة التصاق دينامية، يفترض أنه بسبب تعديل إنتغرين-تقارب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
سوبليمينتاريفيديوس: أفلام من ثلاث دقائق تسلسل الصور من مادكام-1 مغلف الشعيرات الدموية perfused مع المسمى فلوريسسينتلي ببمكس. (أ) الشعرية perfused مع الخلايا غير المعالجة. (ب) الشعرية perfused مع الخلايا تعامل مع 10 ميكروغرام/مل فيدوليزوماب. الشعرية (ج) perfused مع الخلايا تعامل مع 10 ميكروغرام/مل البشرية مفتش ايستب التحكم. يتم الإشارة إلى تدفق الخلية من أسفل إلى أعلى، المنضمة حديثا الخلايا بالأسهم البيضاء. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول أعلاه توضح تقنية مفيدة لدراسة دينامية التصاق الخلايا المناعية البشرية إلى يغاندس بطانية. من خلال تباين يغاندس المغلفة، أنواع الخلايا perfused أو مجموعات فرعية، والحضانة مع محفزات إضافية أو الأجسام المضادة لتحييد مختلفة، فقد تقريبا التطبيقات المحتملة غير محدود. ولذلك، قد يكون من المفيد الرد على كل الأسئلة الأساسية للبحوث الأساسية، فضلا عن الاستعلامات متعدية الجنسيات التي قد تساعد على تطوير وتحسين العلاج السريري بالأدوية التي تتداخل مع عملية الالتصاق فحوصات التصاق دينامية هذه.
وقد ثبت مؤخرا فائدة الفحص للتحقيق في آثار سريرية العلاجات المضادة الالتصاق. وعلاوة على ذلك، تظهر السكان خلية مختلفة التعبير عن مختلف أنواع وكميات من إينتيجرينس مستويات ثابتة للالتصاق دينامية أدريسينس الخاصة بكل منها، دعم صحة المقايسة23.
وعلى العموم، انتهاء البروتوكول يحتاج إلى حوالي 6 ساعات من العمل وتحديات التقنية المتوسطة. حالما تبدأ طلاء شعري، مسألة حاسمة بالنسبة لتجنب الجفاف. وهذا يتطلب معالجة دقيقة من الشعيرات الدموية، وختم دقيقة خلال الخطوات الحضانة عند تبادل الحلول. علاوة على ذلك، الشروع في عملية التروية يستلزم توخي بعض الحذر. نظراً لحجم القتلى الأنابيب، ليس مجديا لملء الأنبوب كله مع معدل التدفق نضح النهائي. من ناحية أخرى، تغيير معدل التدفق بعد شطف شعري بسرعة عالية ينطوي على خطر انقطاع تدفق مما يؤدي إلى إمكانية انضمام جامدة تحد من صلاحية فيما يتعلق بانضمام ديناميكي. ولذلك، التحول في الوقت المناسب إلى معدل التدفق النهائي ضروري. وينبغي اختيار معدل التدفق النهائي يتوقف على حجم المضخة والأنابيب الشعرية المستخدمة. لمحاكاة تدفق الدم البشري في الأوردة بطانية عالية كقدر ممكن، تدفق حجم 0.1 إلى 5 مم/s يوصي24،25.
ملحوظة قد تزيد صعوبة المقايسة، عندما يتم تطبيق التعديلات. على سبيل المثال، قد تتطلب تحليل لمجموعات فرعية محددة T الخلية مطالبين باستراتيجيات الاستقطاب أو تنقية26. أيضا، بما في ذلك خطوات تفعيل الربط والمتداول وخلية12 صاروخ موجه إلى التجربة ستزيد من الصعوبة، نظراً لأنه قد يكون من الضروري معطف مزيج من يغاندس إلى داخل الشعيرات الدموية أو علاج (ما قبل) perfused السكان خلية مع الكيماوي-أو السيتوكينات على حساب المتداول تعتمد على سيليكتين والمستحثه chemokine خلية التنشيط وانتغرين تقارب التحوير27. ومع ذلك، قد تكون هذه خاصة للاهتمام أسئلة للبحث في المستقبل، لا سيما وأن أسلوب عرض يسمح لمعالجة مثل هذا تفاعل متطورة من جزيئات مختلفة مع الخلايا البشرية ويغاندس وظيفيا. تحليل تنافسي التصاق دينامية عدة السكان خلية ملطخة بشكل مختلف في نفس شعري كما هو مذكور أعلاه، قد إضافة مستوى آخر من التعقيد. وعلاوة على ذلك، ثبت أيضا أنه يمكن استخدام خلايا بطانية في نظم فلويديك بدلاً من يغاندس المؤتلف28.
على الرغم من أنها تحليل وظيفي، يقتصر الأسلوب الحد الشبكات المعقدة في فيفو إلى مجموعة مختارة من جزيئات المتورطين في المختبر. وهذا يعني أن آثار العوامل الإضافية غير معروف أو غير متوقعة قد تغفل أو يعتبر غير كاف. ومع ذلك، هذا مشكلة متكررة في البحوث البشرية، نظراً للاعتبارات الأخلاقية غالباً ما تمنع آليا في فيفو التحقيقات29.
أخذت معا، يعرض هذا البروتوكول مقايسة وظيفية لتحليل إنتغرين-تعتمد على ديناميكية الالتصاق ومكافحة إنتغرين العلاجات في أمراض التهاب الأمعاء. بينما المبدأ الأساسي تماما على التوالي إلى الأمام، وليس من الصعب جداً إجراء، فإنه يمكن منمق وتعديل في ما يخص عدة ولديه القدرة على الإجابة على الأسئلة متعدية الجنسيات فيما يتعلق بالعلاج المضادة الالتصاق في بنك التنمية بين الأمريكتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
خلفهم خدم كمستشار بنتاكس، جولياني، MSD، أبفيي، يانسن، تأكيدا وبورنغير. خلفهم و S.Z. تلقي دعم البحوث من تأكيدا وروش.
Acknowledgments
وأيده البحث CN، IA، ومعاملة الدولة الأكثر رعاية وسهير مركز إينتيرديسسيبليناري للبحوث السريرية (إيزكف) والبرنامج الهمة من جامعة ارلنجن-نورمبرغ، فريتز-بندر-ستيفتونغ كرون الألمانية، آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ و التهاب القولون مؤسسة (دككف)، "سدر مجموعة البحوث السريرية" للالماني البحوث مجلس (DFG)، البرنامج الموضوع DFG الحجمية و "المبادرة الميدانية المستجدة" و DFG التعاونية أبحاث مراكز 643، 796 و 1181.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
