Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/58216
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 1,2
1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

Summary

Beschrijven we een methode om ingenieur een retinale weefsel samengesteld van retinale pigment epitheliale cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen gekweekt op de top van menselijke vruchtwater membranen en de voorbereiding voor de transplantatie in diermodellen.

Abstract

Verscheidene pathologische condities van het oog van invloed op de functionaliteit en/of het voortbestaan van de retinale pigment epitheel (RPE). Het gaat hierbij om sommige vormen van retinitis pigmentosa (RP) en leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD). Celtherapie is een van de meest veelbelovende therapeutische strategieën voorgesteld om te genezen van deze ziekten, met al bemoedigende voorlopige resultaten bij de mens. Echter, de methode voor de bereiding van de prothese heeft een grote invloed op haar functionele uitkomsten in vivo. Inderdaad, RPE cellen als een celsuspensie geënt zijn minder functioneel dan dezelfde cellen getransplanteerd als retinale weefsel. Hierin beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode ingenieur RPE weefsel en de voorbereiding voor de implantatie van een in vivo . RPE cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen worden overgeënt op een biologische drager, het menselijke vruchtwater membraan (hAM). Deze steun heeft vergeleken met kunstmatige steigers, het voordeel van het hebben van een kelder membraan dat dicht bij de de Bruch membraan waar endogene RPE cellen zijn gekoppeld. Echter, de manipulatie is niet gemakkelijk, en we verschillende strategieën voor de juiste kweken en voorbereiding voor het enten van in vivoontwikkeld.

Introduction

RPE is van cruciaal belang voor de overleving en de homeostase van de researchdieren waarmee het strak gekoppeld1is. Verscheidene pathologische condities wijzigen zijn functionaliteit en/of overleving, met inbegrip van RP en AMD.

RP is een groep van erfelijke monogeen mutaties die invloed hebben op de functies van researchdieren of RPE cellen of beide2,3. Geschat wordt dat mutaties die van invloed zijn speciaal de RPE goed voor 5% van RP2cellen. AMD is een andere aandoening waar de RPE laag wordt gewijzigd, toonaangevende uiteindelijk tot centrale visie verlies. AMD wordt veroorzaakt door de complexe interacties tussen genetische en omgevingsfactoren en beïnvloedt de oudere4,5,6. Volgens de prognoses, zal AMD een zorg van 196 miljoen patiënten wereldwijd door 20207zijn. Voor deze stoornissen, geen doeltreffende behandeling bestaat, en een van de voorgestelde strategieën transplantatie van nieuwe RPE cellen ter compensatie van de doden/deactiveren bestaande RPE cellen8.

De wijze van formulering van het eindproduct te worden geënt is essentieel om ervoor te zorgen de beste functionele resultaten. RPE cellen geïnjecteerd als een celsuspensie, ondanks het feit dat een gemakkelijke en eenvoudige methode van levering, bezorgdheid met betrekking tot hun voortbestaan, integratie en functionaliteit9,10,11,12 , 13. wetenschappers ontwikkelen nu meer complexe formuleringen te leveren ontworpen retinale weefsel9,13,14,15,16. In dit verband ontwikkelden we een originele methode voor het genereren van in vitro RPE weefsel, dat kan worden gebruikt voor transplantatie9.

RPE celbanken afgeleid van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen worden in dit protocol gebruikt. Echter alternatief RPE cel banken uit andere cel bronnen (mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen, primaire RPE cellen, enz.) en gedifferentieerd met een andere methode zijn ook geschikt voor dit protocol. Het bevat gerichte differentiatie protocollen met behulp van cytokines en/of kleine moleculen17,18,19,20,21,22.

Om te worden getransplanteerd, moet de gemanipuleerde weefsel worden voorbereid op een steiger. In de afgelopen jaren, werden verschillende steigers ontwikkeld gebaseerd op een polymeer of op een matrix van biologische herkomst13,23,24. Hier, de biologische substraat gebruikt is de hAM, maar andere substraten, zoals kale Bruch membranen, kunnen worden uitgevoerd. De hierin beschreven methode heeft het voordeel van het gebruik van een biologische steiger die meer relevant is voor het RPE inheemse milieu.

Menselijke ES cel-afgeleide RPE cellen worden gekweekt ten minste 4 weken om volledig worden georganiseerd als een geplaveide enkelgelaagde. In dat stadium, het epithelium verkregen is functioneel en gepolariseerde9. Ten slotte, zoals dit weefsel rimpels gemakkelijk, het is ingebed in een dunne laag van een hydrogel vervoerder te geven meer stevigheid en elasticiteit en te beveiligen tijdens de injectie-procedure. Dit product wordt vervolgens opgeslagen bij 4 ° C tot enten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle menselijke in dit protocol gebruikte materialen werden gebruikt overeenkomstig de bepalingen van de Europese Unie. De menselijke ES cellijn gebruikt in deze studie werd ontleend aan een unieke embryo. Het echtpaar had geschonken de embryo was volledig op de hoogte en gaf hun toestemming voor een anonieme donatie. Een menselijke ES cellijn van klinische-grade was afgeleid van dit embryo, dwarshelling, gekwalificeerd en goed gedocumenteerd door de cellen van de Roslin (UK). Hammen werden aangeschaft onder steriele omstandigheden tijdens een keizersnede in moeders die een geïnformeerde toestemming voor donatie van de placenta volgens richtlijnen van het ziekenhuis (APHP, Hôpital Saint Louis) ondertekend.

1. bereiding van de voedingsbodems en reagentia

  1. Voorbereiding van de voedingsbodem voor RPE cel
    1. Ter voorbereiding van het RPE cel kweekmedium, 4% serum plaatsvervanger (20 mL voor een eindvolume van 500 mL), 1000 x verdund 2-mercaptoethanol (500 µL voor een eindvolume van 500 mL) en 1% Eagle′s minimale essentiële medium (MEM) niet-essentiële aminozuren oplossing (5 mL voor een finale toevoegen volume van 500 mL) te hoge glucose (475 mL voor een eindvolume van 500 mL) van Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM).
  2. Voorbereiding van het vervoer/instandhouding medium
    1. Ter voorbereiding van het vervoer/instandhouding medium, voeg 1% van penicilline-streptomycine (5 mL voor een eindvolume van 500 mL) aan CO2-onafhankelijke medium (495 mL voor een eindvolume van 500 mL) en houd het bij 4 ° C.
  3. Resuspensie van het enzym thermolysin
    1. Voorbereiding van een stamoplossing van thermolysin
      1. Ontdooi ter voorbereiding van een stamoplossing van thermolysin, het poeder van de thermolysin, die is opgeslagen bij-20 ° C, bij kamertemperatuur.
      2. Zoals de enzymatische activiteit variabele van charges wellicht, bereken deze activiteit gebaseerd op het certificaat van analyse voorzien van het poeder van de thermolysin van de partij moet worden gebruikt. Verdeel de "activiteit neutrale Protease berekend ANPC =" (aangegeven in het Certificate of Analysis) door 181 (oftewel tyrosine van moleculair gewicht). Het resultaat komt overeen met de totale enzymatische activiteit van de meegeleverde thermolysin poeder (E/injectieflacon).
      3. Een stamoplossing bij 200 U/mL voor te bereiden door de hoeveelheid water die overeenkomt met de totale enzymatische activiteit (E/injectieflacon) gedeeld door 200 (U/mL) toe te voegen.
      4. Los het enzym waarbij het water dat op en neer werd toegevoegd. Vortex de oplossing voor 30 s en controleer of het poeder is volledig geschorst. Meer pipetteren kan nodig zijn voor een volledige ontbinding.
      5. Aliquot de stockoplossing en opslaan bij-20 ° C.
    2. Bereiding van de werkoplossing van thermolysin
      Opmerking: De thermolysin oplossing moet worden bereid op de dag van de behandeling van hAM.
      1. Ontdooi de voorraad hoeveelheden van thermolysin bij 200 U/mL opgeslagen bij-20 ° C. Verdun de stamoplossing 200 x in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met het oog op een definitieve enzymatische activiteit van 1 U/mL. 40 mL te behandelen 1 – 4 hAM patches voor te bereiden.
      2. Filtreer de oplossing van de thermolysin via een 0,2 µm filter voorafgaand aan gebruik.
  4. Resuspensie van gelatine
    1. Bereiding van de oplossing van de gelatine van de 20% en blok
      Opmerking: De 20% gelatine oplossing en blok wellicht bereid zijn omhoog te 1 week vóór gebruik.
      1. Warm de CO2-onafhankelijke medium tot 42 ° C in een bad van water gedurende 30 minuten (max. 1 h). In een tube van 50 mL, voeg toe 10 g van gelatine aan 40 mL opgewarmd CO2-onafhankelijke medium en vortex de oplossing.
      2. Los van de gelatine voor 30-60 min op 42 ° C. Vortex elke 10 min aan het homogeniseren van de oplossing.
      3. Zodra de oplossing is een homogeen, de 4 mL van de oplossing van de 20% gelatine aan vier 6 cm cultuur gerechten toevoegen. Vermijd bellen. Voeg van een kunststof paraffine film ter bescherming van de gerechten, en laat de oplossing om te stollen bij 4 ° C.
    2. Voorbereiding van 8% gelatine-oplossing
      Opmerking: De gelatine van de 8%-oplossing kan worden bereid van de dag vóór gebruik en opgeslagen bij 4 ° C.
      1. Warm de CO2-onafhankelijke medium tot 42 ° C gedurende 30 minuten (max. 1 h). In een tube van 50 mL, Voeg 4 gram gelatine aan 46 mL opgewarmd CO2-onafhankelijke medium en vortex de oplossing.
      2. Los van de gelatine voor 30-60 min op 42 ° C. Toevoegen van een kunststof paraffine film om te beveiligen de buis en in een waterbad bij 37 ° C als het moet dezelfde dag worden gebruikt, of het bij 4 ° C worden opgeslagen als het is om later gebruikt worden.

2. Thermolysin behandeling van menselijke vruchtwater membranen

  1. Menselijke vruchtwater membraan wassen
    1. Hebben hammen geleverd als kleine stukjes (ongeveer 30 x 30 mm) vast in een nylon steiger, hetzij reeds bij 4 ° C in PBS of bevroren. Indien bevroren, ontdooien de membranen bij 37 ° C in een incubator voor 30 min.
    2. Wassen van de membranen:
      1. Plaats 1 – 4 membranen in een fles van 250 mL met 80 mL PBS. Gebruik zoveel flessen zoals vereist.
      2. Elke fles schudden in een shaker van de plaat op een hoge snelheid gedurende 5 minuten, dan negeren de PBS. Voeg 80 mL PBS en herhaal.
  2. Thermolysin behandeling
    1. Voeg 40 mL van de werkoplossing voor thermolysin (1 U/mL) per fles met de membranen (1 – 4 membranen per flessen; maximaal 3 flessen tegelijk).
    2. Schud de flessen gedurende 5 minuten op 450 rpm en vervolgens vortex hen voor 30 s. Herhaal 1 x.
    3. Negeren van de thermolysin oplossing en voeg 80 mL PBS.
    4. Schud de flessen gedurende 5 minuten op 450 rpm. Negeren van de PBS en voeg 80 mL PBS. Herhaal 3 x.

3. fixatie van menselijke vruchtwater membranen op een cultuur invoegen

  1. Gebruik lang steriel pincet (die kan oplopen tot de bodem van de fles) te verwijderen van de hammen één voor één, en elke hAM overbrengen in een 10 cm cultuur schotel met 10 mL PBS.
  2. Plaats een van de membranen in een nieuwe 10 cm cultuur schotel met 10 mL PBS, met de nylon naar beneden. Twee van de vier clips die worden gebruikt voor het repareren van het membraan te nylon loskoppelen.
  3. Plaats de kleinere ring van de cultuur-invoegen tussen de nylon en het membraan.
  4. Zorg ervoor dat het membraan heeft betrekking op de kleinere ring volledig. Clip van het tweede deel van de cultuur invoegen op de top van het membraan. De membraan van de kelder van de hAM ligt binnen de cultuur invoegen boven. Loskoppelen van de laatste twee clips.
  5. Snijd, met een steriele schaar, de overmaat van membraan buiten de cultuur invoegen indien nodig. PBS met pincet, overdracht van het membraan vast in de cultuur invoegen naar een 12-well plaat, toevoegen, en opslaan van de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  6. Herhaal deze operaties (uit stap 3.2 tot en met 3.5) met de andere membranen.

4. ontdooien en zaaien van retinale Pigment epitheel cellen in menselijke vruchtwater membranen

  1. Ontdooien van retinale pigment epitheel cellen
    1. De bank van de cel RPE is bevroren op 1 miljoen cellen per cryogene flacon in vloeibare stikstof. Ontdooien zoveel cryogene flesjes zoals vereist (350.000 cellen worden overgeënt per membraan).
    2. Bereiden een tube van 15 mL met RPE medium per cryogene flacon 3 mL. Zodra de flacon is ontdooid, overdracht van de cellen aan elke buis. Herhaal deze bewerking voor de andere flesjes.
    3. Meng (Pipetteer omhoog en omlaag een paar keer naar resuspendeer de cellen in het medium RPE) en neem 10 µL van de cel-oplossing en overbrengen naar een 1,5 mL-buis. Voeg 10 µL van trypan blauw. Plaats 15 µL van deze oplossing in een tellen kamer, dan tellen het aantal levensvatbare cellen (niet gekleurd in blauw) onder een microscoop met een 4 X doelstelling. Herhaal deze bewerking voor de andere flesjes.
    4. In de tussentijd Centrifugeer de 15 mL tubes bij 110 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de cellen bij 700.000 cellen/mL.
  2. Zaaien van retinale pigment epitheel cellen in menselijke vruchtwater membranen
    1. Verwijder de 12-well plaat met de membranen van de incubator.
    2. De PBS gecombineerd. Voeg 500 µL van de celsuspensie bereid in stap 4.1.4 in het midden van de cultuur invoegen. Voeg vervolgens 1 mL van RPE medium buiten de cultuur invoegen (binnen de put). Herhaal voor de andere membranen.
    3. Plaats de plaat van de 12-well met de membranen in de incubator.

5. onderhoud van retinale Pigment epitheel celculturen op menselijke vruchtwater membranen

  1. Vernieuwen van het medium 2 x per week, meestal op maandag en vrijdag, tot ten minste 30 dag van de cultuur.
  2. Het medium binnen en buiten de cultuur invoegen voor elk putje gecombineerd en verlengen met verse medium (1 mL buiten de cultuur invoegen en 500 µL binnen). Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.

6. bereiding van de retinale Pigment epitheel Patch voor transplantatie

Opmerking: Vanaf dag 30 van de cultuur, is het weefsel klaar voor transplantatie.

  1. Warm de gelatine van de 8%-oplossing in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 min. vullen de interne kamer van de vibratome met koude CO2-onafhankelijke medium (bij 4 ° C).
  2. Plaats het 20% gelatine blok in de vibratome.
    1. Neem de 6 cm cultuur schotel met het blok van 20% gelatine uit de koelkast. Met behulp van een scalpel, gesneden uit een blok van 5 x 5 cm. Hiermee plakt u de bovenzijde van het blok aan de steun met Cyanoacrylaat lijm of het equivalent daarvan.
    2. Plaats een nieuw mes in de vibratome.
    3. Pas het niveau van het blok totdat het op het zelfde niveau van het scheermesje.
    4. Het bad rond de steun te vullen met verse CO2-onafhankelijke medium bij 4 ° C. Snij het blok met de vibratome met behulp van een medium snelheid, totdat het blok wordt gelijkmatig gesneden, wat leidt tot een glad oppervlak. Stel de positie 0.
    5. Het medium rond het blok van gelatine gecombineerd totdat het helemaal droog is, en neem vervolgens de plaat van de 12-well cultuur met de weefsels van de incubator bij 37 ° C.
    6. Open de cultuur invoegen op de top van de gelatine blok met pincet, zorgvuldig. Knippen, met de schaar, alle delen van de membranen die bevatten geen cellen (buiten de ring waar cellen niet werden gekweekt). Het hele resterende medium gecombineerd.
    7. Voeg 1 mL van de vloeibare oplossing van 8% gelatine bij 37 ° C ter dekking van de membranen. Verwijder zorgvuldig de overmaat. Wacht 5 – 8 min zodat de gelatine te stollen.
    8. Toevoegen van verse CO2-onafhankelijke medium (bij 4 ° C) om het bad totdat het membraan is gedekt.
    9. Knippen, met de vibratome op een positie van-100 µm, met een gemiddelde snelheid, resterende hoogte van hoe het blok zich gedraagt. Aan het einde van de sectie, voorzichtig om de oriëntatie van het weefsel.
    10. Met een scalpel, slaat een hoek om de richting van de sectie.
    11. Verzamelen van het membraan ingebed in gelatine met een spatel en plaats deze in een 6-well bord gevuld met het behoud medium bij 4 ° C, tot het in de ontvangende oog te enten.
    12. Op het tijdstip van de transplantatie, de grootte van het implantaat naar de grootte van het ontvangende oog onder een chirurgische Microscoop (1-3 voor ratten, 10 à 15 mm2 voor niet-menselijke primaten) aanpassen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hammen bevatten een epitheliale laag die moet worden verwijderd voordat het zaaien van RPE cellen. Een enzymatische behandeling van het membraan wordt uitgevoerd met de thermolysin onder het schudden. Om niet te niet verliezen de polariteit van het membraan (het epitheel is aan de ene kant), het is gefixeerd op een drager welke samenstelling afhankelijk van de provider (figuur 1A afwijken kan). Controleer de hechting van het membraan te zijn steun bij deze stap en clips toevoegen indien nodig. Op het moment van de vastlegging in de cultuur invoegen, werk zorgvuldig om te voorkomen dat het maken van gaten in het membraan en houd de polariteit met het membraan van de kelder naar boven (figuur 1B). Wanneer cellen worden overgeënt op de membranen, ze kon ontsnappen aan deze gaten en de laatste cel concentratie zal worden verminderd. De aanwezigheid van gaten kon worden gevisualiseerd onder een microscoop of door toevoeging van PBS binnen de cultuur invoegen en controle als PBS lekt. Een membraan met gaten moet worden weggegooid.

Na de fixatie op de cultuur invoegen is de aanwezigheid van residuele cellen in een fase contrast Microscoop beoordeeld (cijfers 1 c en 1 D). Klassiek, een paar dode cellen kon blijven op het oppervlak van het membraan, maar deze cellen zal worden uitgeschakeld wanneer het kweekmedium wordt gewijzigd (Figuur 1 c). De vezels van het membraan van de kelder kunnen bij een hogere vergroting (Figuur 1 d) worden gezien als geen cellen blijven. Als dat niet het geval, kan de timing van de incubatie met thermolysin worden aangepast.

In de dagen na het zaaien van de cellen RPE, controleren als de cellen zich te houden. Afhankelijk van de Microscoop gebruikt, het kan moeilijk zijn om de cellen duidelijk te zien tijdens de eerste paar weken, maar als de cellen niet aanhangen, cellen zal worden gezien in het kweekmedium cel rondzweven. Zodra het epithelium wordt gevormd en begint te rijpen, is het makkelijker om te zien onder een microscoop (cijfers 2A, 2Ben 2 C). 3 weken vormen de cellen een volledige monolayer epitheel typisch voor RPE (geplaveide organisatie). Na 4 weken is het epithelium genoeg rijp voor de voorbereiding van de innesteling (figuur 2D). Echter, het kan worden bewaard in cultuur meer weken om logistieke redenen.

De voorbereiding van de prothese voor de implantatie is beschreven in Figuur 3. Bij de bijstelling van het membraan naar de 20% gelatine blok, gecombineerd alle het overtollige cel kweekmedium. Deze stap is belangrijk, aangezien elk resterende medium kon beletsel voor de hechting van de 8% gelatine aan de RPE en het membraan. Inderdaad, het medium zal het vormen van een film van vloeistof tussen de lagen van gelatine.

De gelatine wordt gebruikt voor het insluiten van het implantaat kan worden van een verschillende sterkte, afhankelijk van de Bloom-index (dat wil zeggen, een kwaliteitscontrole-test, uitgevoerd en geleverd door leveranciers, die resulteert in de kracht van een gel bij een gestandaardiseerde temperatuur en concentratie). Als de gebruikte gelatine niet stijf genoeg is en disaggregates tijdens de enting, worden de gebruikte gelatine verwijzing naar een andere met een hogere sterkte gewijzigd. De concentratie van gelatine kan ook worden gewijzigd, op basis van experimenten, om zijn kracht en elasticiteit.

Figure 1
Figuur 1: representatieve beelden van de hAM vóór en na de thermolysin behandeling en fixatie op een cultuur invoegen. (A) representatieve afbeelding van een membraan kopen van een weefselbank. (B) representatieve afbeelding van een membraan gefixeerd op het invoegen van een cultuur. (C) representatief beeld van een membraan behandeld met thermolysin bij een lage vergroting. (D) de representatieve afbeelding van een membraan behandeld met thermolysin bij een hoge vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: representatieve beelden van de hAM op het zaaien van de cellen RPE. (A) representatieve foto van het membraan vóór het zaaien. (B en C) representatieve beelden van RPE cellen op membranen op 3 weken na het zaaien. Het membraan is mogelijk niet volledig vlakke zoals gezien in deelvenster C. Schaal bar = 100 µm (C), 20 µm voor de vergroting. (D) representatief beeld van de RPE cellen op een membraan op 30 dagen na het zaaien, overeenkomt met de tijd voor hen te embedding in gelatine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: regeling met een beschrijving van de opeenvolgende stappen voor de opneming van de gemanipuleerde retinale weefsel bevattende de cellaag RPE op de hAM in een gelatine film. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We beschreven een methode voor de cultuur van RPE cellen op een biologische steiger en de voorbereiding voor de implantatie in diermodellen. Een van de essentiële stappen van het protocol is het onderhoud van de oriëntatie van de hAM langs de procedure tot haar opneming in gelatine. Inderdaad, de inheemse epitheel van het membraan is verwijderd en haar kelder membraan wordt blootgesteld9. De RPE-cellen moeten worden ontpit op de top van dit membraan kelder. Bij de voorbereiding voor het insluiten van gelatine, is het van cruciaal belang om te werken met alle producten op de gedefinieerde temperatuur. Inderdaad, gelatine heeft de eigenschap om te rigide bij 4 ° C en vloeistof op lichaam temperatuur (37 ° C)9. Als de temperatuur niet wordt nageleefd, kan de gelatine stollen of vloeibaar bij een stap waar dit effect niet gewenst is.

Verschillende biologische steigers hebben voorgesteld, zoals Descemet van membranen25 of hammen26. In het bijzonder, werden hammen, van een keizersnede27, gedemonstreerd worden goed verdragen in de subretinal ruimte, die een beperkte ontsteking en vermindering van de choroidal neovascularization26. Het membraan ondersteunt met succes de cultuur van menselijke RPE cellen9,28. Bovendien hebben deze membranen ook een lange geschiedenis in klinieken29, waardoor ze goede kandidaten voor een steiger voor RPE celtherapie. Andere biologische ondersteunt konden eenvoudig worden geïmplementeerd met dit protocol. Synthetische steigers op basis van polymeer zijn al rigide en wellicht niet een gelatine die vóór implantatie13,30,31,32,33te embedding. Andere systemen voor implantatie zijn onlangs ontwikkeld voor de subretinal levering in het menselijk oog van een hESC-afgeleide RPE enkelgelaagde op een rigide polyester steiger34 of op een substraat van de synthetische parylene ontworpen na te bootsen Bruch van membraan35 . Hoewel deze strategieën veelbelovend zijn, geloven we dat biologische steigers het beste platform voor RPE weefselengineering bieden kunnen.

In dit protocol, waren de geplaatste RPE-cellen afgeleid van menselijke ES-cellen met een spontane differentiatie-methode. Echter, verschillende soorten RPE cellen kunnen worden gebruikt, hetzij uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen of uit primaire RPE cellen verkregen uit kadavers of zelfs uit een RPE cel lijn19,36,,37, gedifferentieerde 38. Bovendien, als met behulp van pluripotente stamcellen, verschillende protocollen werden ontwikkeld in de afgelopen jaren te verkrijgen RPE cellen op basis van een spontane differentiatie of met behulp van kleine moleculen bij de differentiatie18,22. RPE cellen verkregen van deze protocollen verschillende differentiatie kunnen ook worden gebruikt met deze methode voor weefselengineering.

Een beperking van deze methode is de stabiliteit van het ingesloten weefsel bij 4 ° C. Het is opgenomen in gelatine net voor de verzending naar de chirurgie-site, moet op deze temperatuur worden gehouden tot de engraftment. In die context moeten de operaties binnen 48 uur worden uitgevoerd.

Deze methode kan gemakkelijk worden overgebracht naar de kliniek. Het weefsel van de RPE ingebed in gelatine wordt bewaard bij 4 ° C in de CO2-onafhankelijke medium. Dit medium kan worden vervangen, indien nodig, met anderen reeds goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor de instandhouding van hoornvlies verkregen na het slachten en die worden gebruikt voor transplantaties in de mens. Wij succesvol gebleken de doeltreffendheid van deze strategie voor transplantatie in een bewijs-van-concept studie naar knaagdieren modellen9, en we zijn momenteel de chirurgische benadering in niet-menselijke primaten valideren voordat u het implementeert voor een klinische proef voor de behandeling van patiënten met specifieke vormen van RP beïnvloeden de RPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Olivier Goureau is de uitvinder op in afwachting van de octrooien met betrekking tot de generatie van netvlies cellen van menselijke pluripotente stamcellen. De andere auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedank Jérôme Larghero en Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Parijs, Frankrijk) voor hun inbreng tijdens het opzetten van de hier beschreven methode.

Dit werk werd gesteund door subsidies van de ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], de Fondation pour la Recherche Médicale [Bio-ingenieurswetenschappen programma - DBS20140930777] en van LABEX blazen [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau en Christelle Monville. Het werd gesteund door NeurATRIS, een translationeel onderzoeksinfrastructuur (Investissements d'Avenir) voor biotherapies in de neurowetenschappen [ANR-11-INBS-0011] en INGESTEM, de nationale infrastructuur (Investissements d'Avenir) engineering voor pluripotente en gedifferentieerde stamcellen [ANR-11-INBS-000] te Christelle Monville. Karim Ben M'Barek werd gesteund door beurzen van DIM Stempole en LABEX blazen [ANR-10-LABX-73]. -Stam maakt deel uit van het Biotherapies Instituut voor zeldzameziekten ondersteund door de Association Française contre les myopathieën (AFM)-Téléthon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile biosafety cabinet TechGen International Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration Vacuubrand BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator Thermo Electron Corporation BVC 21 NT
200 µL pipette: P200 Gilson F144565
1 mL pipette: P1000 Gilson F144566
Pipet aid Drummond 75001
+4 °C refrigerator Liebherr Not applicable
Vibratome Leica VT1000S
Fine scissors WPI 501758
Forceps (x2) WPI 555227F
Water bath Grant subaqua pro SUB6
Precision balance Sartorius CP225D
Centrifuge Eppendorff 5804
Microscope Olympus SC30
Horizontal Rocking Shaker IKA-WERKE IKA MTS 214D
Vortex VWR LAB DANCER S40
Disposable Scalpel WPI 500351
plastic paraffin film VWR PM992
0.200 µm single use syringe filter SARTORIUS 16532
Syringe without needle 50 mL Dutscher 50012
Bottles 250 mL Dutscher 28024
15 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352097
50 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352098
culture insert Scaffdex C00001N
60 mm cell culture disches: B6 Dutscher 353004
12 well cell culture plate Corning 3512
6-well culture plates Corning 3506
Razor blades Ted Pella, Inc 121-9
Cyanoacrylate glue Castorama 3178040670105
PBS 1x (500 mL) Sigma D8537
Thermolysine Roche 5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) Invitrogen 12618-013
MEM-NEAA (100x) Invitrogen 11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350-010
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122
CO2-independent medium GIBCO 18045-054
Gelatin MERCK 104078
human amniotic membrane Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) Not applicable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  4. Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
  5. Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
  6. Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
  7. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
  8. Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
  9. Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  10. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  11. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  12. Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
  13. Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
  14. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
  17. Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
  18. Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
  19. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  20. Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
  21. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  22. Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
  23. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  24. Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
  25. Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
  26. Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
  27. Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
  28. Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
  29. Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
  30. Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
  31. Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
  32. Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
  33. Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
  34. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  35. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  36. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
  37. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  38. Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 139 pluripotente stammen cellen differentiatie celtherapie retinale pigment epitheel retinale dystrophie leeftijdsgebonden Macula degeneratie
Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ben M'Barek, K., Habeler, W.,… More

Ben M'Barek, K., Habeler, W., Plancheron, A., Jarraya, M., Goureau, O., Monville, C. Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (139), e58216, doi:10.3791/58216 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter