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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/58216
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 1,2
1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

Summary

Les auteurs décrivent une méthode pour un tissu rétinien composé de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivés des cellules souches pluripotentes humaines cultivées sur le dessus des membranes amniotiques humaines et de sa préparation pour les greffes dans des modèles animaux de l’ingénieur.

Abstract

Plusieurs pathologies de le œil sur la fonctionnalité et/ou la survie de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE). Il s’agit de certaines formes de rétinite pigmentaire (RP) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). La thérapie cellulaire est l’un des plus prometteurs stratégies thérapeutiques proposées pour soigner ces maladies, avec déjà encourageant les résultats préliminaires chez l’humain. Toutefois, la méthode de préparation de la prothèse a une incidence importante sur ses résultats fonctionnels in vivo. En effet, les cellules RPE greffés comme une suspension cellulaire sont moins fonctionnels que les mêmes cellules transplantées comme un tissu rétinien. Ici, nous décrivons une méthode simple et reproductible pour ingénieur RPE tissu et sa préparation pour une implantation in vivo . Les cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines RPE sont ensemencées sur un support biologique, la membrane amniotique humain (jambon). Par rapport aux échafaudages artificiels, ce support a l’avantage d’avoir une membrane basale qui se trouve à proximité de la membrane de Bruch où des cellules RPE endogènes sont attachés. Cependant, sa manipulation n’est pas facile, et nous avons mis au point plusieurs stratégies pour sa mise en culture appropriée et préparation à la greffe in vivo.

Introduction

RPE est crucial pour la survie et l’homéostasie des photorécepteurs avec lequel il est étroitement associé à1. Plusieurs conditions pathologiques modifient ses fonctionnalités et/ou de la survie, y compris les RP et AMD.

RP est un groupe de mutations de monogéniques héréditaires qui affectent les fonctions des photorécepteurs ou cellules RPE ou les deux2,3. On estime que les mutations qui affectent spécifiquement le RPE cellules représentent 5 % de RP2. La DMLA est une autre condition où la couche RPE est altérée, perte de la vision en fin de compte à central principal. AMD est causée par les interactions complexes entre des facteurs génétiques et environnementaux et affecte les personnes âgées4,5,6. Selon les projections, AMD sera un sujet de préoccupation pour les patients 196 millions dans le monde en 2020,7. Pour ces troubles, aucun remède efficace n’existe, et l’une des stratégies proposées est la transplantation des nouvelles cellules RPE afin de compenser les morts/non-fonctionnel préexistante RPE cellules8.

Le mode de formulation du produit final doivent être greffés est essentiel pour assurer les meilleurs résultats fonctionnels. Les cellules RPE injectés sous forme de suspension cellulaire, en dépit d’être une méthode simple et directe de la livraison, soulèvent des préoccupations au sujet de leur survie, l’intégration et la fonctionnalité9,10,11,12 , 13. les scientifiques développent plus des formules complexes pour livrer engineered tissu rétinien9,13,14,15,16. Dans ce contexte, nous avons développé une méthode originale pour produire in vitro RPE des tissus qui pourraient être utilisés pour transplantation9.

Les banques de cellules RPE dérivés de cellules souches embryonnaires humaines (ES) sont utilisés dans le présent protocole. Cependant, alternative RPE de cellules provenant de sources différentes cellules (cellules souches pluripotentes induites par l’homme, les cellules primaires de RPE, etc.), les banques et différenciées avec une méthode différente sont également appropriés pour ce protocole. Il comprend la différenciation dirigée de protocoles à l’aide de cytokines et/ou petites molécules17,18,19,20,21,22.

Pour être transplantés, l’ingénierie tissulaire doit être préparé sur un échafaud. En quelques années, les échafaudages différents reposent sur un polymère ou sur une matrice d’origine biologique13,23,24. Ici, le substrat biologique utilisé est le jambon, mais les autres substrats, comme les membranes dénudées de Bruch, pourraient être mises en œuvre. La méthode décrite ici a l’avantage d’utiliser un échafaudage biologique qui concerne davantage l’environnement natif de RPE.

ES cellules dérivées RPE des cellules humaines sont cultivées pendant au moins 4 semaines afin d’être entièrement organisé comme une monocouche de pavés. À ce stade, l’épithélium obtenu est fonctionnel et polarisé9. Enfin, comme ce tissu rides facilement, il est enchâssé dans une fine couche d’un transporteur d’hydrogel pour lui donner plus de rigidité et d’élasticité et de le protéger pendant la procédure d’injection. Ce produit est ensuite stocké à 4 ° C jusqu’au greffage.

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Protocol

Tous les matériaux humains utilisés dans le présent protocole ont été utilisés conformément à la réglementation de l’Union européenne. La lignée de cellules ES humaine utilisée dans cette étude a été dérivée d’un embryon unique. Le couple qui avait fait don de l’embryon a été pleinement informé et ont donné leur consentement pour un don anonyme. Une lignée de cellules ES humaine cliniques de qualité a été dérivée de cet embryon, s’est inclinée, qualifiée et correctement documentée par les cellules Roslin (UK). Jambons ont été achetés dans des conditions stériles pendant une césarienne chez les mères qui ont signé un consentement éclairé pour le don de placenta selon les directives de l’hôpital (APHP, Hôpital Saint Louis).

1. préparation des milieux de Culture et réactifs

  1. Préparation de la milieu de culture cellulaire RPE
    1. Pour préparer le milieu de culture cellulaire RPE, ajouter le substitut de sérum de 4 % (20 mL pour un volume final de 500 mL) et 1 000 x dilué 2-mercaptoéthanol (500 µL pour un volume final de 500 mL) solution à 1 % Eagle′s milieu essentiel minimum (MEM) des acides aminés non essentiels (5 mL pour une finale volume de 500 mL) de glycémie élevé moyen (DMEM) de l’aigle modifié de Dulbecco (475 mL pour un volume final de 500 mL).
  2. Préparation du milieu transport/conservation
    1. Pour préparer le milieu de transport/conservation, ajouter 1 % de pénicilline-streptomycine (5 mL pour un volume final de 500 mL) de CO2-média indépendant (495 mL pour un volume final de 500 mL) et le conserver à 4 ° C.
  3. Remise en suspension de l’enzyme de la thermolysine
    1. Préparation d’une solution mère de la thermolysine
      1. Pour préparer une solution de la thermolysine, décongeler la thermolysine poudre, qui a été stockée à-20 ° C, température ambiante.
      2. Que l’activité enzymatique peut être variable d’un lot à l’autre, calculer cette activité basée sur le certificat d’analyse fournie avec la poudre de la thermolysine du lot à utiliser. Diviser le « activité protéase neutre calculé = ANPC » (indiqué dans le certificat d’analyse) par 181 (qui est le poids moléculaire de tyrosine). Le résultat obtenu correspond à l’activité enzymatique totale de la poudre de la thermolysine fourni (U/flacon).
      3. Préparer une solution à 200 U/mL en ajoutant du volume d’eau correspondant à l’activité enzymatique totale (U/flacon) divisée par 200 (U/mL).
      4. Dissoudre l’enzyme en pipettant également, l’eau qui a été ajoutée en haut et en bas. Vortex la solution pour 30 s et vérifier si la poudre a été complètement suspendue. Pipetage plus peut-être être nécessaire pour une dissolution complète.
      5. Partie aliquote de la solution mère et conserver à-20 ° C.
    2. Préparation d’une solution de travail de la thermolysine
      NOTE : La thermolysine solution doit être établie le jour du traitement jambon.
      1. Décongeler les aliquotes de stock de la thermolysine 200 U/ml à-20 ° C. Diluer la solution mère de x 200 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) afin d’obtenir une activité enzymatique finale de 1 U/mL. Préparation de 40 mL pour traiter les taches de jambon 1 – 4.
      2. Filtrer la solution thermolysine grâce à un avant filtre 0,2 µm.
  4. Remise en suspension de gélatine
    1. Préparation de la solution de gélatine 20 % et le bloc
      Remarque : La solution de gélatine 20 % et le bloc peuvent être préparés jusqu'à 1 semaine avant utilisation.
      1. Réchauffer le CO2-média indépendant à 42 ° C au bain-marie pendant 30 min (jusqu'à 1 h). Dans un tube de 50 mL, ajouter 10 g de gélatine à 40 mL de réchauffé CO2-média indépendant et vortex la solution.
      2. Dissoudre la gélatine pendant 30 à 60 min à 42 ° C. Vortex chaque 10 min pour homogénéiser la solution.
      3. Une fois que la solution est homogène, ajouter 4 mL de la solution de gélatine 20 % à quatre récipients de culture de 6 cm. Éviter les bulles. Ajouter un film de paraffine en plastique pour protéger les plats et laissez agir la solution à se solidifier à 4 ° C.
    2. Préparation de la solution de gélatine 8 %
      Remarque : La solution de 8 % de gélatine peut préparer la veille de l’utilisation et stockée à 4 ° C.
      1. Réchauffer le CO2-média indépendant à 42 ° C pendant 30 min (jusqu'à 1 h). Dans un tube de 50 mL, ajoutez 4 g de gélatine à 46 mL de réchauffé CO2-média indépendant et vortex la solution.
      2. Dissoudre la gélatine pendant 30 à 60 min à 42 ° C. Ajouter un film de paraffine en plastique pour protéger le tube et le garder dans un bain-marie à 37 ° C si il doit être utilisé le jour même, ou conserver à 4 ° C si il doit être utilisé plus tard.

2. thermolysine traitement des Membranes amniotiques humaines

  1. Lavage de la membrane amniotique humain
    1. Ont fourni en petits morceaux (environ 30 x 30 mm) fixé à un échafaudage en nylon, soit déjà à 4 ° C dans du PBS ou congelés de jambons. Si fourni congelés, décongeler les membranes à 37 ° C dans un incubateur pendant 30 min.
    2. Lavez les membranes :
      1. Placer 1 – 4 membranes dans un flacon de 250 mL contenant 80 mL de PBS. Utiliser des bouteilles autant que nécessaire.
      2. Agiter chaque bouteille dans un agitateur de plaque à haute vitesse pendant 5 min, puis jetez le PBS. Ajouter 80 mL de PBS et répéter.
  2. Traitement de la thermolysine
    1. Ajouter 40 mL de la solution de travail de la thermolysine (1 U/mL) par bouteille contenant les membranes (1 – 4 membranes par bouteilles ; maximum de 3 bouteilles à la fois).
    2. Agiter les flacons pendant 5 min à 450 tr/min, puis vortex eux pendant 30 s. Répéter 1 x.
    3. Jeter la solution thermolysine et ajouter 80 mL de PBS.
    4. Agiter les flacons pendant 5 min à 450 tr/min. Jeter les PBS et ajouter 80 mL de PBS. Répéter 3 x.

3. fixation des Membranes amniotiques humaines sur un Insert de Culture

  1. Utilisez une pince longue stérile (qui peut atteindre le fond de la bouteille) pour supprimer les jambons un et de transférer chaque jambon dans un plat de culture de 10 cm contenant 10 mL de PBS.
  2. Dans un nouveau 10 cm boîte de Petri contenant 10 mL de PBS, un lieu des membranes avec le nylon face vers le bas. Deux des quatre clips qui sont utilisés pour fixer la membrane au nylon détacher.
  3. Insérez l’anneau plus petit de l’insert de culture entre le nylon et la membrane.
  4. S’assurer que la membrane couvre le plus petit anneau complètement. Couper la deuxième partie de l’insert de culture sur le dessus de la membrane. La membrane basale du jambon est vers le haut à l’intérieur de l’insert de culture. Détachez les deux derniers clips.
  5. Coupé avec des ciseaux stériles, l’excédent de membrane en dehors de l’insert de culture si nécessaire. Avec une pincette, transférer la membrane fixée dans l’insert de culture à une plaque de 12 puits, ajoutez les PBS et stocker la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
  6. Répéter ces opérations (de l’étape 3.2 à 3.5) avec les autres membranes.

4. dégel et l’ensemencement des cellules l’épithélium pigmentaire rétinien sur des Membranes amniotiques humaines

  1. Décongélation des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien
    1. La Banque de cellules RPE est gelée à 1 million de cellules par flacon cryogénique dans l’azote liquide. Décongeler les fioles cryogéniques autant comme l’exige (350 000 cellules sont ensemencées par membrane).
    2. Préparer un tube de 15 mL contenant 3 mL de milieu RPE par flacon cryogénique. Une fois le flacon est décongelé, transférer les cellules dans chaque tube. Répétez cette opération pour les autres flacons.
    3. Homogénéiser (pipette de haut en bas plusieurs fois à remettre en suspension les cellules dans le milieu de la RPE) et prendre 10 µL de la solution de la cellule et le transférer dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 10 µL de bleu trypan. Place 15 µL de cette solution dans une chambre de comptage, puis comptez le nombre de cellules viables (ne pas colorée en bleu) sous un microscope avec un objectif 4 X. Répétez cette opération pour les autres flacons.
    4. En attendant, centrifuger les tubes de 15 mL à 110 x g pendant 5 min. jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules à 700 000 cellules/mL.
  2. Ensemencement des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien dans des membranes amniotiques humaines
    1. Retirez la plaque de 12 puits contenant les membranes de l’incubateur.
    2. Aspirer le PBS. Ajouter 500 µL de la suspension cellulaire établie à l’étape 4.1.4 dans le centre de l’insert de la culture. Ajouter 1 mL de milieu RPE à l’extérieur de l’insert de culture (à l’intérieur du puits). Répétez pour les autres membranes.
    3. Placer la plaque de 12 puits contenant les membranes dans l’incubateur.

5. entretien des Cultures de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien sur des Membranes amniotiques humaines

  1. Renouveler la moyenne 2 x par semaine, généralement le lundi et le vendredi, jusqu'à au moins 30 jours de la culture.
  2. Aspirez le milieu à l’intérieur et à l’extérieur de l’insert de culture pour chaque puits et la renouveler avec un milieu frais (1 mL en dehors de l’insert de culture et 500 µL à l’intérieur). Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.

6. préparation de la correction de l’épithélium pigmentaire rétinien destinés à la Transplantation

NOTE : À partir de 30 jours de la culture, le tissu est prêt pour la transplantation.

  1. Chaud la solution de 8 % de gélatine dans un bain d’eau à 37 ° C pendant 30 min. remplir la chambre interne de la vibratome avec froid CO2-média indépendant (à 4 ° C).
  2. Placez le bloc de gélatine 20 % dans le vibratome.
    1. Prendre la boîte de Petri de 6 cm contenant le bloc de gélatine 20 % dans le réfrigérateur. À l’aide d’un scalpel, découper un bloc de 5 cm x 5 cm. Collez le dessus du bloc au support avec une colle cyanoacrylate ou son équivalent.
    2. Placez une lame neuve dans le vibratome.
    3. Ajuster le niveau du bloc jusqu'à ce qu’il soit au même niveau de la lame de rasoir.
    4. Remplir la baignoire autour de la prise en charge de frais CO2-média indépendant à 4 ° C. Couper le bloc avec le vibratome avec une vitesse moyenne jusqu'à ce que le bloc est coupé uniformément, conduisant à une surface lisse. Définir la position 0.
    5. Aspirer le milieu autour du bloc de gélatine jusqu'à ce qu’il est complètement sec et ensuite prendre la plaque de culture de 12 puits contenant des tissus de l’incubateur à 37 ° C.
    6. À l’aide de pinces, ouvrir avec précaution l’insert de culture sur le dessus du bloc de gélatine. Couper avec des ciseaux, toutes les parties de la membrane qui ne contiennent pas de cellules (à l’extérieur de l’anneau où les cellules ne sont pas cultivées). Aspirez le milieu résiduel ensemble.
    7. Ajouter 1 mL de la solution de 8 % de gélatine liquide à 37 ° C afin de couvrir les membranes. Retirer délicatement l’excédent. Attendez 5 à 8 min pour permettre à la gélatine solidifier.
    8. Ajouter frais de CO2-média indépendant (à 4 ° C) au bain jusqu'à ce que la membrane est couverte.
    9. Coupe avec le vibratome à une position de-100 µm, avec une vitesse moyenne, étant conscient de la façon dont le bloc se comporte. À la fin de la section, veillez à conserver l’orientation du tissu.
    10. Avec un scalpel, couper un coin pour identifier l’orientation de la section.
    11. Recueillir la membrane intégrée dans de la gélatine avec une spatule et le placer dans une plaque de 6 puits remplie avec le support de conservation à 4 ° C, jusqu’au greffe dans le œil du destinataire.
    12. Au moment de la transplantation, ajuster la taille de l’implant à la taille de le œil destinataire sous un microscope chirurgical (1-3 pour les rats, 10 à 15 mm2 pour les primates non humains).

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Representative Results

Jambons contiennent une couche épithéliale qui doit être retirée avant l’ensemencement des cellules RPE. Un traitement enzymatique de la membrane est exécuté avec la thermolysine sous agitation. Afin de ne pas perdre la polarité de la membrane (l’épithélium est d’un seul côté), il est fixé sur un support dont la composition pourrait être différente selon le fournisseur (Figure 1 a). Vérifier l’adhérence de la membrane pour son soutien à cette étape et ajouter des clips si nécessaire. Au moment de la fixation dans le foyer de la culture, travailler avec soin pour éviter de faire des trous dans la membrane et garder sa polarité avec la membrane basale vers le haut (Figure 1 b). Lorsque les cellules sont ensemencées sur les membranes, ils pourraient échapper à ces trous et la concentration cellulaire finale sera réduite. La présence de trous peut être visualisée sous un microscope, ou en ajoutant des PBS à l’intérieur de l’insert de la culture et en vérifiant si PBS fuit. Toute membrane avec des trous doit être jeté.

Après la fixation sur l’insert de la culture, la présence de cellules résiduelles dans un microscope à contraste de phase est évaluée (Figures 1 et D 1). Classiquement, quelques cellules mortes pourraient rester sur la surface de la membrane, mais ces cellules seront éliminés lorsque le milieu de culture est modifié (Figure 1). Les fibres de la membrane basale pourraient être vu à un grossissement plus élevé (Figure 1), si aucune cellule ne reste. Si ce n’est pas le cas, le moment de l’incubation avec la thermolysine pourrait être ajusté.

Dans les jours qui suivent l’ensemencement des cellules RPE, vérifier si les cellules adhèrent. Selon le microscope utilisé, il pourrait être difficile de voir clairement les cellules pendant les premières semaines, mais si les cellules n’adhèrent pas, ne seront vus cellules circulent dans le milieu de culture cellulaire. Une fois que l’épithélium est formé et commence à mûrir, il devient plus facile de le voir sous un microscope (Figures 2 a, 2 bet 2C). Après 3 semaines, les cellules forment un épithélium monocouche complète typique de RPE (organisation pavées). Après 4 semaines, l’épithélium est suffisamment mature pour sa préparation pour l’implantation (Figure 2D). Toutefois, il pourrait être maintenue en culture pendant plusieurs semaines pour des raisons logistiques.

La préparation de la prothèse pour l’implantation est décrite à la Figure 3. Après apposition de la membrane vers le bloc de 20 % de gélatine, aspirez tout le milieu de culture cellulaire excessive. Cette étape est importante, comme n’importe quel support restant pourrait empêcher l’adhérence de la gélatine de 8 % à la RPE et la membrane. En effet, le milieu formera une couche de liquide entre les couches de gélatine.

La gélatine utilisée pour l’intégration de l’implant peut être d’une force variable, selon son index de Bloom (c.-à-d., un test de contrôle de la qualité, effectués et fournis par des fournisseurs, qui évalue la résistance d’un gel à une température standard et (concentration). Si la gélatine utilisée n’est pas assez rigide et ventile pendant le greffage, la référence de la gélatine utilisée devrait être changée à l’autre avec une plus grande résistance. La concentration de la gélatine pourrait également être modifiée, basée sur l’expérimentation, pour ajuster sa force et son élasticité.

Figure 1
Figure 1 : insérer des images représentatives du jambon avant et après le traitement de la thermolysine et la fixation sur une culture. (A) image représentative d’une membrane fournie par une banque de tissus. (B) image représentative d’une membrane fixée sur un insert de culture. (C) image représentative d’une membrane traitée avec la thermolysine à un faible grossissement. (D) l’image représentative d’une membrane traitée avec la thermolysine à un fort grossissement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : images représentatives du jambon à ensemencer les cellules RPE. (A) image représentative de la membrane avant de semer. ()B et C) des images représentatives des cellules RPE sur membranes à 3 semaines après l’ensemencement. La membrane ne peut pas être complètement plane comme on le voit dans le groupe C. Echelle = 100 µm (C), 20 µm pour le grossissement. (D) l’image représentative des cellules RPE sur une membrane à 30 jours après l’ensemencement, correspondant au moment de leur incorporation dans de la gélatine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : schéma décrivant les étapes séquentielles d’inscription du tissu rétinien machiné contenant la couche de cellules RPE sur le jambon à l’intérieur d’un film de gélatine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous avons décrit une méthode pour la culture des cellules RPE sur un échafaudage biologique et sa préparation pour l’implantation dans des modèles animaux. Une des étapes critiques du protocole est le maintien de l’orientation du jambon tout au long de la procédure jusqu'à ce que son inclusion dans la gélatine. En effet, l’épithélium native de la membrane est enlevé et sa membrane basale devient exposé9. Les cellules RPE doivent être semées sur le dessus de cette membrane basale. Lors de la préparation pour l’incorporation de la gélatine, il est essentiel de travailler avec tous les produits à la température définie. En effet, gélatine a la propriété d’être rigide à 4 ° C et liquide à la température (37 ° C) de corps9. Si la température n’est pas respectée, la gélatine peut solidifier ou liquéfier à une étape où cet effet n’est pas souhaité.

Plusieurs échafaudages biologiques ont été proposés, comme les membranes de Descemet25 ou jambons26. En particulier, jambons, une césarienne27, ont été démontrés pour être bien toléré dans l’espace sous-rétinienne, provoquant une inflammation limitée et en réduisant la néovascularisation choroïdienne26. La membrane soutient avec succès la culture humaine RPE cellules9,28. En outre, ces membranes ont également une longue histoire en cliniques29, ce qui les rend bons candidats pour un échafaudage pour la thérapie cellulaire RPE. Autres supports biologiques pourraient être facilement mis en œuvre avec ce protocole. Les échafaudages synthétiques basés de polymère sont déjà rigides et n’ayez pas une gélatine incorporation avant implantation13,30,31,32,33. Autres systèmes d’implantation ont été récemment développés pour la livraison sous-rétinienne dans le œil humain d’une monocouche RPE dérivées de CSEh sur un échafaud polyester rigide34 ou sur un substrat synthétique Parylène conçu pour imiter la membrane de Bruch35 . Bien que ces stratégies soient prometteurs, nous croyons que les échafaudages biologiques pourraient fournir la meilleure plate-forme pour l’ingénierie tissulaire RPE.

Dans le présent protocole, les cellules ensemencées de RPE proviennent de cellules ES humaines en utilisant une méthode de différenciation spontanée. Cependant, différents types de cellules RPE pouvaient être utilisés, soit différenciés de cellules souches humaines pluripotentes induites ou de cellules primaires de RPE de cadavres ou même d’un RPE cellule ligne19,36,37, 38. En outre, si l’utilisation de cellules souches pluripotentes, plusieurs protocoles ont été élaborés au cours des années pour obtenir des cellules RPE basée sur une différenciation spontanée ou à l’aide de petites molécules pour orienter la différenciation18,22. Cellules RPE provenant de ces protocoles différents de différenciation pourraient servir également avec cette méthode pour l’ingénierie tissulaire.

Une des limites de cette méthode est la stabilité du tissu embarqué à 4 ° C. Tel qu’il est inclus dans de la gélatine juste avant l’envoi vers le site de la chirurgie, il doit être maintenu à cette température jusqu'à la prise de greffe. Dans ce contexte, les interventions chirurgicales doivent être effectuées sous 48 h.

Cette méthode pourrait être facilement transférée vers la clinique. Le tissu RPE incorporé dans de la gélatine est conservé à 4 ° C dans le CO2-média indépendant. Ce milieu pourrait être substitué, le cas échéant, avec d’autres déjà approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) pour la conservation des cornées obtenus post-mortem et qui sont utilisés pour des transplantations d’organes en êtres humains. Nous avons démontré avec succès l’efficacité de cette stratégie à la transplantation dans une étude de validation dans les modèles de rongeurs9, et nous sommes actuellement valider l’approche chirurgicale chez les primates non humains avant de l’implémenter pour un essai clinique pour traiter les patients avec des formes spécifiques de RP qui affectent la RPE.

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Disclosures

Olivier Goureau est l’inventeur en attente de brevets liés à la génération des cellules rétiniennes de cellules souches pluripotentes humaines. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs aimeraient remercier Jérôme Larghero et Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, France) pour leur contribution au cours de la mise en place de la méthode décrite ici.

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’ANR [GPiPS : ANR-2010-RFCS005 ; SightREPAIR : ANR-16-CE17-008-02], la Fondation pour la Recherche Médicale [programme de Bio-ingénierie - DBS20140930777] et de LABEX revivre [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau et Christelle Monville. Il a été pris en charge par NeurATRIS, une infrastructure de recherche translationnelle (Investissements d’avenir) pour les biothérapies en Neurosciences [ANR-11-INBS-0011] et INGESTEM, l’infrastructure nationale (Investissements d’avenir) ingénierie pour pluripotentes et cellules souches différenciées [ANR-11-INBS-000] à Christelle Monville. Karim Ben M'Barek a bénéficié de bourses de recherche de Stempole DIM et LABEX revivre [ANR-10-LABX-73]. J’ai-tige fait partie de l’Institut de biothérapies des maladies rares, prises en charge par l’Association Française contre les Myopathies (AFM)-Téléthon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile biosafety cabinet TechGen International Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration Vacuubrand BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator Thermo Electron Corporation BVC 21 NT
200 µL pipette: P200 Gilson F144565
1 mL pipette: P1000 Gilson F144566
Pipet aid Drummond 75001
+4 °C refrigerator Liebherr Not applicable
Vibratome Leica VT1000S
Fine scissors WPI 501758
Forceps (x2) WPI 555227F
Water bath Grant subaqua pro SUB6
Precision balance Sartorius CP225D
Centrifuge Eppendorff 5804
Microscope Olympus SC30
Horizontal Rocking Shaker IKA-WERKE IKA MTS 214D
Vortex VWR LAB DANCER S40
Disposable Scalpel WPI 500351
plastic paraffin film VWR PM992
0.200 µm single use syringe filter SARTORIUS 16532
Syringe without needle 50 mL Dutscher 50012
Bottles 250 mL Dutscher 28024
15 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352097
50 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352098
culture insert Scaffdex C00001N
60 mm cell culture disches: B6 Dutscher 353004
12 well cell culture plate Corning 3512
6-well culture plates Corning 3506
Razor blades Ted Pella, Inc 121-9
Cyanoacrylate glue Castorama 3178040670105
PBS 1x (500 mL) Sigma D8537
Thermolysine Roche 5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) Invitrogen 12618-013
MEM-NEAA (100x) Invitrogen 11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350-010
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122
CO2-independent medium GIBCO 18045-054
Gelatin MERCK 104078
human amniotic membrane Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) Not applicable

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References

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Biologie du développement numéro 139 pluripotentes proviennent de cellules différentiation thérapie cellulaire l’épithélium pigmentaire rétinien dystrophies rétiniennes la dégénérescence maculaire liée à l’âge
Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines
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Ben M'Barek, K., Habeler, W., Plancheron, A., Jarraya, M., Goureau, O., Monville, C. Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (139), e58216, doi:10.3791/58216 (2018).

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