Summary
Wir beschreiben eine Methode um eine netzhautgewebe bestehend aus retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gezüchtet auf menschliche amniotic Membranen und deren Vorbereitung für die Verpflanzung in Tiermodellen zu konstruieren.
Abstract
Mehreren pathologische Zuständen des Auges beeinträchtigen die Funktionalität bzw. das Überleben des retinalen Pigmentepithels (RPE). Dazu gehören einige Formen der Retinitis Pigmentosa (RP) und Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD). Zelltherapie ist eines der vielversprechendsten therapeutischen Strategien vorgeschlagen, diese Krankheiten bereits ermutigende Zwischenstand beim Menschen zu heilen. Die Methode der Zubereitung des Transplantats hat jedoch erhebliche Auswirkungen auf die funktionellen Ergebnisse in Vivo. RPE-Zellen als eine Zellsuspension gepfropft sind nämlich weniger funktional als die gleichen Zellen als eine netzhautgewebe transplantiert. Hier beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Methode, Ingenieur RPE Gewebe und deren Vorbereitung für eine Implantation in Vivo . RPE Zellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen sind auf eine biologische Unterstützung, die menschlichen amniotic Membrane (Schinken) ausgesät. Im Vergleich zu künstlichen Gerüste, hat diese Unterstützung den Vorteil, dass eine Basalmembran, die in der Nähe der Bruch-Membran ist wo endogene RPE-Zellen verbunden sind. Jedoch seine Manipulation ist nicht einfach, und wir mehrere Strategien für seine ordnungsgemäße Kultivierung und Vorbereitung für die Verpflanzung in Vivoentwickelt.
Introduction
RPE ist entscheidend für das Überleben und die Homöostase der Photorezeptoren mit denen sie eng verbunden1ist. Verschiedene pathologische Zustände verändern seine Funktionalität und/oder überleben, darunter RP und AMD.
RP ist eine Gruppe von geerbten monogenen Mutationen, die die Funktionen der Photorezeptoren oder RPE-Zellen oder beide2,3betreffen. Es wird geschätzt, dass Mutationen, die betreffen speziell die RPE Zellen machen 5 % der RP2. AMD ist eine weitere Bedingung wo die RPE-Schicht verändert ist, führende letztlich zu zentralen Sehverlust. AMD wird durch das komplexe Zusammenspiel von genetischen und umweltbedingten Faktoren verursacht und wirkt sich auf die ältere4,5,6. Prognosen zufolge wird AMD eine Sorge um 196 Millionen Patienten weltweit durch 20207sein. Bei diesen Erkrankungen keine wirksame Heilung gibt, und eine der vorgeschlagenen Strategien ist die Transplantation von neuen RPE-Zellen um Toten/nicht funktionsfähige vorbestehenden RPE Zellen8zu kompensieren.
Die Formulierung des Endproduktes, veredelt werden ist wichtig, um die besten funktionellen Ergebnisse sicherzustellen. RPE-Zellen als eine Zellsuspension, trotz des Seins eine einfach Art der Lieferung, injiziert Bedenken bezüglich deren Überleben, Integration und Funktionalität9,10,11,12 , 13. Wissenschaftler entwickeln jetzt mehr komplexe Rezepturen liefern entwickelt netzhautgewebe9,13,14,15,16. In diesem Zusammenhang entwickelten wir eine originelle Methode zur in-vitro- RPE Gewebe zu generieren, die für die Transplantation9verwendet werden könnten.
RPE zellbanken abgeleitet von menschlichen embryonalen Stammzellen (ES) sind in diesem Protokoll verwendet. Jedoch Alternative RPE Zellen Banken aus verschiedenen Zelle Quellen (Human-induzierte pluripotente Stammzellen, primäre RPE-Zellen usw.)und differenziert mit einer anderen Methode eignen sich auch für dieses Protokoll. Freuen Sie sich auf gezielte Differenzierung Protokolle mit Zytokinen und/oder kleine Moleküle17,18,19,20,21,22.
Um transplantiert werden, sollte das technische Gewebe auf einem Gerüst vorbereitet werden. In den letzten Jahren wurden verschiedene Gerüste basierend auf ein Polymer oder eine Matrix von biologischen Ursprungs13,23,24entwickelt. Hier, die biologische Substrat verwendet ist der Schinken, aber andere Substrate wie entblößt Bruch Membranen umgesetzt werden könnte. Die hier beschriebene Methode hat den Vorteil der Verwendung einer biologischen Gerüst, das für die RPE nativen Umgebung relevant ist.
Menschlichen ES Zellen gewonnenen RPE-Zellen sind für mindestens 4 Wochen kultiviert, um voll und ganz als ein Kopfsteinpflaster Monolage organisiert werden. In diesem Stadium das Epithel erhalten ist funktional und9polarisiert. Da dieses Gewebe leicht Falten, wird sie schließlich in einer dünnen Schicht aus einem Hydrogel-Träger, mehr Steifigkeit und Elastizität zu geben und zu schützen während der Injektion eingebettet. Dieses Produkt wird dann bei 4 ° C bis Pfropfung gespeichert.
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Protocol
Alle Menschen in diesem Protokoll verwendete Materialien wurden nach Verordnungen der Europäischen Union verwendet. Die menschliche ES-Zell-Linie, die in dieser Studie verwendeten stammt aus einem einzigartigen Embryo. Das Paar, das den Embryo gespendet hatte wurde umfassend informiert und gaben ihre Zustimmung für eine anonyme Spende. Eine klinische Grade menschliche ES Zelllinie wurde abgeleitet von diesem Embryo, überhöht, qualifiziert und ordnungsgemäß dokumentiert von Roslin Zellen (UK). Schinken wurden unter sterilen Bedingungen bei einem Kaiserschnitt bei Müttern beschafft, die eine informierte Einwilligung für Plazenta Spende nach krankenhausrichtlinien (APHP, Hôpital Saint Louis) unterzeichnet.
1. Vorbereitung der Kultur, Medien und Reagenzien
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Vorbereitung der RPE Zellkulturmedium
- Um die RPE Zellkulturmedium vorzubereiten, fügen Sie 4 % Serum Ersatz (20 mL für ein Finales Volumen von 500 mL), 1.000 x verdünnt 2-Mercaptoethanol (500 µL für ein Finales Volumen von 500 mL) und 1 % Eagle′s minimale wesentliche Medium (MEM) nicht-essentiellen Aminosäuren Lösung (5 mL für eine endgültige Volumen von 500 mL) in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) hohe Glukose (475 mL für ein Finales Volumen von 500 mL).
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Vorbereitung des Mediums Transport/Erhaltung
- Zur Vorbereitung der Transport/Erhaltung Medium hinzufügen 1 % von Penicillin-Streptomycin (5 mL für ein Finales Volumen von 500 mL), CO2-unabhängiges Medium (495 mL für ein Finales Volumen von 500 mL) und halten Sie es bei 4 ° C.
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Wiederfreisetzung des Enzyms thermolysin
- Vorbereitung der Stammlösung von thermolysin
- Um eine Stammlösung von Thermolysin vorzubereiten, tauen Sie die Thermolysin Pulver, das bei-20 ° C, bei Raumtemperatur gelagert wurde.
- Die enzymatische Aktivität von Charge zu Charge Variable sein mag, berechnen Sie diese Aktivität basierend auf die Bescheinigung über die Analyse zur Verfügung gestellt mit dem Thermolysin Pulver des Batches verwendet werden. Teilen der "neutrale Protease Aktivität berechnet = ANPC" (dargestellt durch das Certificate of Analysis) von 181 (das Molekulargewicht von Tyrosin). Das erzielte Ergebnis entspricht die enzymatische Gesamtaktivität des mitgelieferten Thermolysin Pulvers (U/Vial).
- Bereiten Sie eine Stammlösung bei 200 U/mL, indem man das Volumen des Wassers, die enzymatische Aktivität (U/Vial) geteilt durch 200 (U/mL) entspricht.
- Lösen Sie das Enzym durch pipettieren das Wasser, das oben und unten hinzugefügt wurde. Wirbel die Lösung für 30 s und überprüfen ob das Pulver komplett gesperrt wurde. Mehr pipettieren kann für eine volle Auflösung erforderlich.
- Aliquoten Vorratslösung und bei-20 ° c Lagern
- Vorbereitung der eine funktionierende Lösung von thermolysin
Hinweis: Die Thermolysin-Lösung muss am Tag der Schinken Behandlung vorbereitet werden.- Tauen Sie das Lager Aliquote von Thermolysin bei 200 U/mL bei-20 ° c gelagert Verdünnen Sie Stammlösung 200 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), um eine endgültige enzymatische Aktivität von 1 U/mL zu erhalten. Bereiten Sie 40 mL, 1 – 4 Schinken Flecken zu behandeln.
- Die Thermolysin-Lösung durch einen 0,2 µm-Filter vor der Verwendung gefiltert werden.
- Vorbereitung der Stammlösung von thermolysin
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Wiederfreisetzung Gelatine
- Vorbereitung von 20 % Gelatine-Lösung und block
Hinweis: 20 % Gelatine-Lösung und Block können bis 1 Woche vor dem Gebrauch vorbereitet werden.- Wärmen Sie die CO2-unabhängiges Medium auf 42 ° C in einem Wasserbad für 30 min (bis zu 1 h). In einem 50 mL-Tube, fügen Sie 10 g Gelatine, 40 mL erwärmt CO2-unabhängiges Medium und Wirbel die Lösung.
- Lösen Sie die Gelatine für 30 – 60 min bei 42 ° C. Vortex jede 10 min um die Lösung zu homogenisieren.
- Sobald die Lösung homogen ist, fügen Sie 4 mL der Gelatinelösung 20 % vier 6 cm-Kultur-Gerichte hinzu. Vermeiden Sie Luftblasen. Fügen Sie einen Kunststoff Paraffin-Film um die Gerichte zu schützen, und lassen Sie die Lösung bei 4 ° c zu festigen
- Vorbereitung von 8 % Gelatine-Lösung
Hinweis: Die 8 % Gelatine-Lösung kann der Tag vor Gebrauch zubereitet und bei 4 ° c gelagert- Wärmen Sie die CO2-unabhängiges Medium auf 42 ° C für 30 min (bis zu 1 h). In einem 50 mL-Tube hinzufügen 4 g Gelatine, 46 mL erwärmt CO2-unabhängiges Medium und Wirbel die Lösung.
- Lösen Sie die Gelatine für 30 – 60 min bei 42 ° C. Fügen Sie einen Kunststoff Paraffin-Film zum Schutz der Röhre und halten es in einem Wasserbad bei 37 ° C, wenn es am selben Tag verwendet werden, oder bei 4 ° C lagern Sie, wenn sie später verwendet werden soll.
- Vorbereitung von 20 % Gelatine-Lösung und block
2. Thermolysin Behandlung von menschlichen Amniotic Membranen
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Menschlichen amniotischen Membran-Waschanlagen
- Schinken in kleine Stücke (ca. 30 mm x 30 mm) fixiert in einem Nylon-Gerüst, entweder bereits bei 4 ° C mit PBS-Puffer oder gefroren im Lieferumfang enthalten sind. Sofern die Membranen bei 37 ° C in einem Inkubator für 30 min Auftauen gefroren,.
- Waschen Sie die Membranen:
- Platz 1 – 4 Membranen in eine 250 mL Flasche mit 80 mL PBS. Verwenden Sie so viele Flaschen wie erforderlich.
- Jede Flasche in einem Teller-Shaker mit hoher Geschwindigkeit für 5 min schütteln und dann die PBS zu verwerfen. 80 mL PBS und Wiederholung hinzugeben.
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Thermolysin Behandlung
- Fügen Sie 40 mL der Arbeitslösung von Thermolysin (1 U/mL) pro Flasche mit Membranen (1 – 4 Membranen pro Flaschen; bis zu 3 Flaschen zu einem Zeitpunkt).
- Schütteln Sie die Flasche für 5 min bei 450 u/min und dann Wirbel für 30 s. 1 X wiederholen.
- Verwerfen Sie Thermolysin Lösung zu und 80 mL PBS.
- Schütteln Sie die Flaschen für 5 min bei 450 Umdrehungen pro Minute. Verwerfen der PBS und 80 mL PBS. Wiederholen Sie 3 X.
(3) Fixierung der menschlichen Amniotic Membranen auf einem Kultur-Einsatz
- Verwenden Sie lange sterile Pinzette (das den Boden der Flasche erreichen kann), die Schinken eins nach dem anderen zu entfernen, und übertragen Sie jeder Schinken auf einem 10 cm Kulturschale mit 10 mL PBS.
- In der neuen 10 cm-Kulturschale mit 10 mL PBS Platz eins der Membranen mit Nylon nach unten. Lösen Sie zwei der vier Clips, die verwendet werden, um die Membran zu Nylon zu beheben.
- Setzen Sie den kleineren Ring der Kultur Einlage zwischen den Nylon und die Membran.
- Stellen Sie sicher, dass die Membran der kleineren Ring vollständig abdeckt. Den zweiten Teil des Kultur-Einsatzes auf die Membran-Clip. Die Basalmembran des Schinkens ist innerhalb der Kultur-Einsatz nach oben. Lösen Sie die letzten beiden Klipps.
- Mit steriler Schere, der Überschuss der Membran außerhalb der Kultur einfügen bei Bedarf geschnitten. Mit Pinzette, die Membran fest in der Kultur einfügen, um ein 12-Well-Platte übertragen PBS fügen Sie hinzu und speichern Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Wiederholen Sie diese Vorgänge (aus Schritt 3.2 bis 3.5) mit den anderen Membranen.
(4) Auftauen und Aussaat von retinalen Pigment Epithelzellen auf menschliche Amniotic Membranen
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Auftauen von retinalen Pigment Epithelzellen
- Die RPE Zellbank ist bei 1 Million Zellen pro kryogenen Vial in flüssigem Stickstoff eingefroren. So viele kryogene Fläschchen nach Bedarf Auftauen (350.000 Zellen sind pro Membran ausgesät).
- Bereiten Sie eine 15 mL Röhrchen mit 3 mL RPE Medium pro kryogenen Fläschchen. Einmal das Fläschchen aufgetaut ist, übertragen Sie die Zellen auf jedes Rohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die anderen Fläschchen.
- Homogenisieren (pipette nach oben und unten ein paar Mal zu Aufschwemmen der Zellen in der RPE-Medium) und 10 µL der Zelle Lösung nehmen und übertragen Sie es auf einem 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 10 µL Trypan blau. Platz 15 µL dieser Lösung in einer Zählkammer, dann zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen (nicht blau gefärbt) unter dem Mikroskop mit einer 4 X Objektiv. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die anderen Fläschchen.
- In der Zwischenzeit Zentrifugieren den 15 mL Röhrchen bei 110 X g für 5 min. verwerfen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen bei 700.000 Zellen/mL.
-
Aussaat von retinalen Pigment Epithelzellen in menschlichen amniotic Membranen
- Entfernen Sie die 12-Well-Platte mit den Membranen aus dem Inkubator.
- Aspirieren Sie die PBS. Fügen Sie 500 µL Zellsuspension in Schritt 4.1.4 in der Mitte des Kultur-Einsatzes vorbereitet. Fügen Sie 1 mL der RPE Medium außerhalb der Kultur einfügen (innerhalb des Brunnens). Wiederholen Sie für die anderen Membranen.
- Legen Sie die 12-Well-Platte mit den Membranen im Inkubator.
5. Wartung der retinalen Pigment Epithel Zellkulturen auf menschliche Amniotic Membranen
- Erneuern des Mediums 2 X pro Woche, in der Regel am Montag und Freitag, mindestens bis zum 30. Tag der Kultur.
- Das Medium innerhalb und außerhalb der Kultur-Einsatz für jedes gut abzusaugen und mit frischem Medium (1 mL außerhalb der Kultur einfügen und 500 µL innen) erneuern. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
6. Vorbereitung des retinalen Pigment Epithel Patches für die Transplantation
Hinweis: Ab 30. Tag der Kultur, ist das Gewebe für eine Transplantation bereit.
- Warmen 8 % Gelatine-Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. füllen die innere Kammer der Vibratome mit kalten CO2-unabhängiges Medium (bei 4 ° C).
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Platzieren Sie den 20 % Gelatine-Block in der Vibratome.
- Nehmen Sie der 6 cm Kulturschale mit dem Block 20 % Gelatine aus dem Kühlschrank. Mit einem Skalpell, schneiden Sie einen Block von 5 x 5 cm. Die Oberseite des Blocks an den Support mit Cyanacrylat-Klebstoff oder eines gleichwertigen Dokuments einfügen.
- Legen Sie ein neues Blatt in der Vibratome.
- Der Pegel des Blocks, bis es auf dem gleichen Niveau der Rasierklinge ist.
- Füllen Sie das Bad um die Unterstützung mit frischen CO2-unabhängiges Medium bei 4 ° C. Schneiden Sie den Block mit der Vibratome mit mittlerer Geschwindigkeit, bis der Block gleichmäßig geschnitten wird, führt zu einer glatten Oberfläche. Legen Sie die Position 0.
- Aspirieren Sie das Medium um den Block von Gelatine, bis es vollständig trocken ist, und nehmen Sie dann die 12-Well Kultur-Platte mit den Geweben aus dem Inkubator bei 37 ° C.
- Mit Pinzette, öffnen Sie vorsichtig die Kultur einfügen auf die Gelatine-Block. Schneiden Sie mit der Schere aus, alle Teile der Membranen, die Zellen (außerhalb des Ringes, wo Zellen nicht gezüchtet wurden) nicht enthalten sind. Aspirieren Sie das gesamte restliche Medium.
- Fügen Sie 1 mL liquid 8 % Gelatine-Lösung bei 37 ° C, um die Membranen zu decken. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige. Warten Sie 5 – 8 min um die Gelatine zu erstarren lassen.
- Fügen Sie frisches CO2-unabhängiges Medium (bei 4 ° C) in die Badewanne bis die Membran bedeckt ist.
- Mit der Vibratome an einer Position von-100 µm, mit einer mittleren Geschwindigkeit, Bewusstsein wie verhält sich der Block geschnitten. Am Ende des Abschnitts achten Sie darauf, die Orientierung des Gewebes zu erhalten.
- Schneiden Sie mit einem Skalpell eine Ecke um die Ausrichtung des Abschnitts zu identifizieren.
- Sammeln Sie die Membran mit einem Spatel in Gelatine eingebettet und legen Sie sie in eine 6-Well-Platte, gefüllt mit dem Naturschutz-Medium bei 4 ° C, bis es in den Augen der Empfänger Pfropfen.
- Zum Zeitpunkt der Transplantation passen Sie die Größe des Implantats auf die Größe des Empfängers Auges unter einem Operationsmikroskop (1 – 3 für Ratten, 10 – 15 mm2 für nicht-menschliche Primaten).
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Representative Results
Schinken enthalten eine Epithelschicht, die entfernt werden sollten, bevor die Aussaat von RPE-Zellen. Eine enzymatische Behandlung der Membran erfolgt mit dem Thermolysin unter schütteln. In der Reihenfolge nicht, nicht verlieren die Polarität der Membran (das Epithel ist auf einer Seite), es ist fixiert auf einem Träger, welche Zusammensetzung je nach Anbieter (Abbildung 1A) unterscheiden könnte. Überprüfen Sie die Adhäsion der Membran um seine Unterstützung bei diesem Schritt und fügen Sie Clips hinzu, wenn nötig. Zum Zeitpunkt der Fixierung in der Kultur einzufügen arbeiten Sie sorgfältig um zu verhindern, dass Löcher in der Membran und seine Polarität mit der Basalmembran nach oben (Abb. 1 b). Wenn Zellen auf den Membranen ausgesät werden, sie könnten diese Löcher entfliehen und die endgültige Zellkonzentration reduziert werden. Das Vorhandensein von Löchern kann visualisiert werden, unter dem Mikroskop oder durch Hinzufügen von PBS innerhalb der Kultur einfügen und prüfen, ob PBS undicht ist. Eine Membran mit Löchern sollten entsorgt werden.
Nach der Fixierung auf die Kultur einfügen ist das Vorhandensein der verbleibenden Zellen im Phasenkontrast-Mikroskop ausgewertet (Zahlen 1 und 1 D). Klassisch, ein paar tote Zellen auf der Oberfläche der Membran bleiben könnte, aber diese Zellen beseitigt werden, wenn das Kulturmedium geändert wird (Abbildung 1). Die Fasern der Basalmembran könnte bei einer höheren Vergrößerung (Abbildung 1) gesehen werden, wenn keine Zellen bleiben. Wenn das nicht der Fall ist, könnte das Timing der Inkubation mit Thermolysin angepasst werden.
Überprüfen Sie in den Tagen nach der Aussaat von RPE-Zellen, ob die Zellen zu halten. Je nach dem Mikroskop verwendet es könnte schwierig sein, deutlich zu sehen, die Zellen in den ersten paar Wochen, aber wenn die Zellen sich nicht halten, Zellen zu sehen sein Umlauf in der Zellkulturmedium. Sobald das Epithel bildet sich und beginnt zu Reifen, wird es einfacher, zu sehen unter dem Mikroskop (Figuren 2A, 2 bund 2 C). Nach 3 Wochen bilden die Zellen eine komplette Monolage Epithel typisch für RPE (Kopfsteinpflaster Organisation). Nach 4 Wochen ist das Epithel genug reif für die Vorbereitung zur Implantation (Abb. 2D). Es konnte jedoch für mehrere Wochen aus logistischen Gründen in Kultur gehalten werden.
Die Herstellung der Prothese für eine Implantation ist in Abbildung 3beschrieben. Aspirieren Sie auf der Membran, die 20 % Gelatine Block Apposition alle überschüssige Zellkulturmedium. Dieser Schritt ist wichtig, da alle verbleibenden Medium die Adhäsion der 8 % Gelatine RPE und die Membran ausschließen könnte. In der Tat wird das Medium bilden einen Film von Flüssigkeit zwischen den Schichten von Gelatine.
Die Gelatine verwendet für die Einbettung des Implantats kann von unterschiedlicher Stärke, je nach seiner Blüte Index (d. h.eine Qualitätskontrolle-Test durchgeführt und zur Verfügung gestellt von Lieferanten, die wertet die Stärke eines Gels bei einer standardisierten Temperatur und (Konzentration). Wenn die Gelatine verwendet nicht steif genug wird, und während die Pfropfung disaggregiert, sollten die verwendeten Gelatine-Verweis auf ein anderes mit einer höheren Festigkeit geändert werden. Die Konzentration der Gelatine kann auch geändert werden, basierend auf Experimente, um seine Festigkeit und Elastizität anzupassen.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder des Schinkens vor und nach dem Thermolysin Behandlung und Fixierung auf eine Kultur einfügen. (A) repräsentatives Bild einer Membran von einer Gewebebank geliefert. (B) repräsentatives Bild einer Membran fixiert auf eine Kultur einfügen. (C) repräsentatives Bild einer Membran mit Thermolysin an einer niedrigen Vergrößerung behandelt. (D) repräsentatives Bild einer Membran mit Thermolysin bei hoher Vergrößerung behandelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder des Schinkens nach Aussaat der RPE Zellen. (A) repräsentatives Bild der Membran vor der Aussaat. ()B und C) repräsentative Bilder von RPE-Zellen auf Membranen in 3 Wochen nach Aussaat. Die Membran kann nicht vollkommen planar wie im Bedienfeld " C" zu sehen sein. Maßstabsleiste = 100 µm (C), 20 µm für die Vergrößerung. (D) repräsentatives Bild von der RPE-Zellen auf eine Membran 30 Tage nach Aussaat, entsprechend dem Zeitpunkt der Einbettung in Gelatine. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Schema der aufeinander folgenden Schritten für die Aufnahme des veränderter retinalen Gewebes mit der RPE Zellschicht auf den Schinken in einer Gelatine-Film beschreiben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir beschrieb eine Methode für die Kultur der RPE-Zellen auf eine biologische Gerüst und deren Vorbereitung für die Implantation in Tiermodellen. Einer der kritischen Schritte des Protokolls ist die Wartung der Orientierung des Schinkens entlang des Verfahrens bis zu seiner Aufnahme in Gelatine. In der Tat, das native Epithel der Membran entfernt, und die Basalmembran wird ausgesetzt9. Die RPE-Zellen müssen auf diese Basalmembran ausgesät werden. Bei der Vorbereitung für die Einbettung von Gelatine ist es wichtig, mit den Produkten bei definierter Temperatur zu arbeiten. In der Tat, Gelatine hat die Eigenschaft, bei 4 ° C und Flüssigkeit im Körper Temperatur (37 ° C)9starr sein. Wenn die Temperatur nicht eingehalten wird, könnte die Gelatine festigen oder Verflüssigen in einem Schritt, wenn dieser Effekt nicht gewünscht wird.
Verschiedene biologische Gerüste sind vorgeschlagen worden, wie Descemets Membranen25 oder Schinken26. Insbesondere wurden Schinken, aus einem Kaiserschnitt27, demonstrierte in den subretinalen Raum gut vertragen werden begrenzte Entzündung und Verringerung der choroidale Neovaskularisation26. Die Membran unterstützt erfolgreich die Kultur der menschlichen RPE Zellen9,28. Darüber hinaus haben diese Membranen auch eine lange Geschichte in Kliniken29, so dass sie gute Kandidaten für ein Gerüst für die RPE-Therapie. Andere biologische stützen könnte leicht mit diesem Protokoll implementiert werden. Synthetische Gerüste auf Polymer Basis sind bereits starr und möglicherweise keine Gelatine Einbettung vor Implantation13,30,31,32,33. Andere Systeme für die Implantation wurden vor kurzem für die Subretinale Lieferung in das menschliche Auge eine hESC gewonnenen RPE Monolage auf einem starren Gerüst aus Polyester34 oder auf einem synthetischen Parylene-Substrat entwickelt, um Bruch Membran35 imitieren entwickelt . Obwohl diese Strategien vielversprechend sind, glauben wir, dass biologische Gerüste die beste Plattform für RPE Gewebetechnik liefern könnte.
In diesem Protokoll wurden ausgesät RPE-Zellen von humanen ES-Zellen mit einer spontanen Differenzierung Methode abgeleitet. Allerdings könnte verschiedene Arten von RPE-Zellen verwendet werden, entweder differenziert aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen oder primäre RPE-Zellen aus Kadavern oder sogar von einer RPE Zelle Zeile19,36,37, 38. Darüber hinaus entstanden wenn pluripotente Stammzellen zu verwenden, mehrere Protokolle in den vergangenen Jahren, RPE-Zellen basierend auf eine spontane Differenzierung oder mit kleine Moleküle, die Differenzierung18,22führen zu erhalten. Diese Differenzierung der verschiedenen Protokolle gewonnene RPE-Zellen könnten auch mit dieser Methode für das Tissue Engineering verwendet werden.
Eine Grenze dieser Methode ist die Stabilität des eingebetteten Gewebes bei 4 ° C. Da es in Gelatine kurz vor der Sendung auf die Chirurgie-Website enthalten ist, muss er bis das Engraftment auf dieser Temperatur gehalten werden. In diesem Zusammenhang sollte die Operationen innerhalb von 48 Stunden durchgeführt werden.
Diese Methode könnte leicht in die Klinik übertragen werden. Die RPE-Gewebe in Gelatine eingebettet wird bei 4 ° C in der CO2eingespart-unabhängiges Medium. Dieses Medium könnte ersetzt werden, bei Bedarf mit anderen bereits genehmigt von der US Food and Drug Administration (FDA) für die Erhaltung der Hornhaut erhalten Post-Mortem- und die für Transplantationen in den Menschen verwendet werden. Wir erfolgreich demonstriert die Effizienz dieser Strategie für eine Transplantation in einer Proof-of-Concept-Studie über Nager-Modelle9, und wir sind derzeit das chirurgische Vorgehen bei nichtmenschlichen Primaten vor der Durchführung einer klinischen Prüfung überprüfen zur Behandlung von Patienten mit bestimmten Formen der RP beeinflussen die RPE.
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Disclosures
Olivier Goureau ist der Erfinder auf angemeldete Patente im Zusammenhang mit der Erzeugung von netzhautzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen. Die anderen Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Jérôme Larghero und Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, Frankreich) während der Einrichtung des hier beschriebenen Verfahrens für ihre Beiträge danken.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], der Fondation Pour la Recherche Médicale [Bioengineering Programm - DBS20140930777] und von LABEX WIEDERZUBELEBEN [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau und Christelle Monville. Es wurde von NeurATRIS, eine translationale Forschungsinfrastruktur (Investissements Avenir) für Biotherapies in Neurowissenschaften [ANR-11-INBS-0011] und INGESTEM, die nationale Infrastruktur (Investissements Avenir) engineering für pluripotente unterstützt und differenzierten Stammzellen [ANR-11-INBS-000], Christelle Monville. Karim Ben M'Barek wurde durch Stipendien aus DIM Stempole und LABEX WIEDERZUBELEBEN [ANR-10-LABX-73] unterstützt. -Stem ist Teil des Instituts für seltene Krankheiten, die von der Association Française Contre Les Myopathien (AFM) unterstützt Biotherapies-Téléthon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250 mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1x (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100x) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
