Summary
אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.
Abstract
מספר מצבים פתולוגיים של העין משפיע על הפונקציונליות ו/או ההישרדות של אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). אלה כוללים כמה צורות של רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD). טיפול בתאי הוא אחד אסטרטגיות טיפוליות המבטיחים ביותר המוצע כדי לרפא מחלות אלו, עם עידוד כבר תוצאות ראשוניות בבני אדם. עם זאת, שיטת ההכנה של השתל יש השפעה משמעותית על תוצאות תפקודי שלה בתוך vivo. אכן, תאי RPE הושתל כמו השעיה תא מתפקדים פחות מאשר אותם התאים המושתלים כמו רקמת רשתית. במסמך זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לשחזור מהנדס RPE רקמות, שלה לקראת ההשתלה ויוו . תאי RPE שמקורם בתאי גזע pluripotent האנושי הם נזרע על תמיכה ביולוגית, קרום מי השפיר אנושי (חזיר). לעומת פיגומים מלאכותי, תמיכה זו יש את היתרון של בעל קרום המרתף קרוב הממברנה של ברוך שבו תאי RPE אנדוגני מצורפות. עם זאת, מניפולציה שלה אינה קלה, פיתחנו מספר אסטרטגיות שלה culturing הנכונה והכנה הרכבה בתוך vivo.
Introduction
RPE חיונית הישרדות, הומאוסטזיס של photoreceptors אליו היא משויכת באופן הדוק1. מספר מצבים פתולוגיים לשנות פונקציונליות שלה ו/או הישרדות, כולל RP ו- AMD.
RP היא קבוצה של מוטציות monogenic בירושה המשפיעות על הפונקציות של photoreceptors או תאי RPE או שני2,3. ההערכה היא כי מוטציות המשפיעות באופן ספציפי את RPE תאים חשבון עבור 5% של RP2. AMD היא תנאי אחר שבו השכבה RPE היא שונה, אובדן ראייה בסופו של דבר מרכזי מוביל. AMD נגרמת על ידי פעולת הגומלין המורכבים בין גורמים גנטיים וסביבתיים, ומשפיעה על קשישים4,5,6. על פי התחזיות, AMD יהיה נוגע 196 מיליון חולים ברחבי העולם על ידי 20207. בהפרעות אלה, אין תרופה יעילה קיימת, באחת האסטרטגיות הציע השתלת תאי RPE חדשים כדי לפצות על המלח/מתפקד שישנו RPE תאים8.
המצב של ניסוח של המוצר הסופי כדי להיות הושתל חיונית כדי להבטיח את התוצאה הטובה ביותר תפקודית. תאי RPE להזריק לפי השעיה תא, למרות היותו שיטה קלה וישירה של משלוח, להעלות חששות לגבי שלהם הישרדות, אינטגרציה, פונקציונליות9,10,11,12 , 13. מדענים מפתחים יותר כעת ניסוחים מורכבים כדי לספק מהונדסים רקמת רשתית9,13,14,15,16. בהקשר זה, פיתחנו שיטה מקורית ליצירת במבחנה רקמות RPE שיכול לשמש עבור השתלת9.
בנקים תאי RPE שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים (ES) נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. עם זאת, חלופה RPE תא בנקים ממקורות שונים תא (תאי גזע pluripotent הנוצרות על-ידי האדם, תאי RPE העיקרי, וכו ') ו הבדיל בשיטה שונה מתאימים גם עבור פרוטוקול זה. היא כוללת התמיינות מכוונת פרוטוקולים בעזרת ציטוקינים ו/או מולקולות קטנות17,18,19,20,21,22.
כדי להיות מושתלים, להכין את רקמות מהונדסים על גרדום. בשנים האחרונות, פיגומים שונים פותחו בהתבסס על פולימר או על מטריצה של מקור ביולוגי13,23,24. כאן, המצע הביולוגי משמש החזיר, אבל מצעים אחרים, כמו ממברנות ברוך חשופה, ניתן ליישום. השיטה המתוארת במסמך זה יש את היתרון של שימוש לפיגום הביולוגי שהוא רלוונטי יותר לסביבה הטבעית RPE.
ES האדם הנגזרות תא תאי RPE מתורבתים לפחות 4 שבועות על מנת להיות מאורגן באופן מלא כמו טפט המרוצף. בשלב זה, האפיתל שהושג הוא פונקציונלי, מקוטב9. לבסוף, ככל רקמה זו מתקמט בקלות, זה מוטבע בשכבה דקה של נשאית הידרוג לתת לזה עוד קשיחות ואלסטיות וכדי להגן עליו במהלך ההליך הזרקה. מוצר זה מאוחסן אז ב 4 ° C עד הרכבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל החומרים האנושי בשימוש פרוטוקול זה שימשו על פי תקנות האיחוד האירופאי. הקו תא ES האדם השתמשו במחקר זה היה נגזר של העובר ייחודי. השניים מי תרם העובר נמסר באופן מלא, נתנו את הסכמתם לקבלת תרומה אנונימית. קו תא קליני-כיתה ES האדם היה נגזר מן העובר הזה, הפקידה, מוסמך, מתועדים כהלכה על ידי רוזאלין תאים (בריטניה). ירכי היו רכש בתנאים סטריליים במהלך ניתוח קיסרי של אמהות חתמו על הסכמה מדעת לתרומה השליה לפי הקווים המנחים של בית החולים (APHP, Hôpital סנט לואיס).
1. הכנת ריאגנטים ומדיה תרבות
-
הכנה של המדיום התרבות תאי RPE
- כדי להכין המדיום התרבות תאי RPE, להוסיף סרום 4% תחליף (20 מ"ל עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ ל), 1,000 x מדולל מרקפטואתנול (500 µL עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ ל) ו 1% Eagle′s המינימום חיוני בינוני (מאמ) חומצות אמינו שאינן הכרחיות פתרון (5 מ"ל הסופי נפח של 500 מ ל) הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) גלוקוז גבוהות (475 מ עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ ל).
-
הכנה של המדיום תחבורה/שימור
- כדי להכין אמצעי תחבורה/שימור, להוסיף 1% של פניצילין-סטרפטומיצין (5 מ"ל עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ"ל) CO2-עצמאית בינוני (495 mL עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ"ל) ולשמור אותו ב 4 º C.
-
Resuspension של האנזים thermolysin
- הכנת פתרון מניות של thermolysin
- כדי להכין פתרון מניות של thermolysin, להפשיר את האבקה thermolysin, שהיה מאוחסן ב-20 ° C, בטמפרטורת החדר.
- הפעילות האנזימטית מתרחשת עשויה להיות משתנה האצווה כדי אצווה, לחשב בהתבסס על האישור של ניתוח סיפק את האבקה thermolysin של אצווה כדי לשמש את הפעילות הזו. לחלק "פעילות Neutral פרוטאז פרוטאז מחושב = ANPC" (המצוין באישור של אנליזה) על ידי 181 (שהוא משקל מולקולרי של טירוזין). התוצאות המתקבלות מקביל הפעילות האנזימטית מתרחשת הכולל של האבקה שסופקו thermolysin (U/מבחנה).
- להכין פתרון מניות ב- 200 U/mL על-ידי הוספת נפח המים המקביל סך הפעילות האנזימטית מתרחשת (U/מבחנה) מחולק 200 (U/mL).
- להמיס את האנזים על-ידי pipetting המים שנוספה למעלה ולמטה. מערבולת הפתרון עבור 30 s ולבדוק האם האבקה לחלוטין הושעה. Pipetting יותר יהיה צורך פירוק מלא.
- Aliquot הפתרון מניות ואחסן אותו ב-20 ° C.
- הכנת הפתרון עובד של thermolysin
הערה: הפתרון thermolysin צריך להיות מוכן ביום של הטיפול החזיר.- להפשיר את aliquots מלאי של thermolysin-200 U/mL המאוחסנים ב-20 ° C. לדלל את הפתרון מניות 200 ב- x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על מנת לקבל פעילות אנזימטי הסופי של 1 U/mL. להכין 40 מ ל לטיפול תיקוני חזיר 1 – 4.
- לסנן את הפתרון thermolysin דרך מסנן 0.2 µm לכהן להשתמש.
- הכנת פתרון מניות של thermolysin
-
Resuspension של ג'לטין
- הכנה של 20% ג'לטין הפתרון של רחוב
הערה: 20% ג'לטין הפתרון של רחוב עשוי להיות מוכנים למעלה 1 שבוע לפני השימוש.- לחמם את CO2-בינוניים עצמאיים עד 42 ° C באמבט מים למשך 30 דקות (עד 1 h). בשפופרת 50 מ ל, להוסיף 10 גר' ג'לטין עד 40 מ"ל של חימם CO2-בינונית עצמאית, מערבולת הפתרון.
- להמיס את הג'לטין 30 – 60 דקות ב 42 º C. מערבולת כל 10 דקות כדי homogenize את הפתרון.
- לאחר הפתרון הוא הומוגני, להוסיף 4 מ"ל של הפתרון הג'לטין 20% ארבע המנות תרבות 6 ס מ. להימנע בועות. להוסיף סרט פרפין פלסטיק כדי להגן על המנות, ולאפשר את הפתרון שבמהלכו ב 4 º C.
- הכנה של 8% ג'לטין פתרון
הערה: הפתרון 8% ג'לטין עשוי להיות להכין יום לפני השימוש ומאוחסנים ב 4 º C.- לחמם את CO2-בינוניים עצמאיים עד 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (עד 1 h). בשפופרת 50 מ ל, להוסיף 4 גר' ג'לטין עד 46 מ"ל של חימם CO2-בינונית עצמאית, מערבולת הפתרון.
- להמיס את הג'לטין 30 – 60 דקות ב 42 º C. להוסיף סרט פרפין פלסטיק להגן על הצינור ולשמור אותו באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C אם הוא רוצה לשמש באותו היום, או לשמור אותם ב 4 ° C אם זה לשימוש מאוחר יותר.
- הכנה של 20% ג'לטין הפתרון של רחוב
2. Thermolysin טיפול של קרום מי השפיר אנושי
-
שטיפת קרום מי השפיר אנושי
- יש ירכי שסופק כמו חתיכות קטנות (כ 30 מ"מ x 30 מ"מ) קבוע לפיגום ניילון, גם כבר ב 4 ° C ב- PBS או קפוא. אם סופק קפוא, להפשיר את הקרומים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך 30 דקות.
- לשטוף את הממברנות:
- מקום 1 – 4 ממברנות בבקבוק 250 מ ל המכילה 80 מ ל- PBS. השתמש בקבוקים רבים כנדרש.
- לנער את כל בקבוק ב שייקר צלחת במהירות גבוהה למשך 5 דקות ולאחר מכן למחוק את PBS. מוסיפים 80 מ של PBS, אני חוזר.
-
טיפול Thermolysin
- להוסיף 40 מ של הפתרון עובד של thermolysin (1 U/mL) עבור כל בקבוק המכיל את הממברנות (1-4 ממברנות לכל הבקבוקים; עד 3 בקבוקים בכל פעם).
- לנער את הבקבוקים עבור 5 דקות ב 450 rpm ולאחר מכן מערבולת אותם 30 ס חזור על 1 x.
- לבטל את הפתרון thermolysin ולהוסיף 80 מ ל- PBS.
- לנער את הבקבוקים עבור 5 דקות ב 450 סל ד. למחוק את PBS ולהוסיף 80 מ ל- PBS. חזור על 3 x.
3. קיבוע של קרום מי השפיר אנושי על הוספה תרבות
- להשתמש מלקחיים זמן סטרילי (זה יכול להגיע לתחתית הבקבוק) כדי להסיר את ירכי, אחד אחד, ולהעביר כל חזיר לצלחת תרבות 10 ס מ המכיל 10 מ"ל ל- PBS.
- ב- 10 ס מ תרבות תבשיל חדש המכיל 10 מ"ל ל- PBS, מקום אחד בקרום עם הניילון פונה כלפי מטה. ניתוק שני הקליפים ארבע המשמשים כדי לתקן את הממברנה כדי ניילון.
- הכנס את הטבעת קטנים יותר של תרבות הקדמי בין את הניילון הקרום.
- ודא כי הקרום מכסה לחלוטין את הטבעת קטנים יותר. קליפ החלק השני של תרבות הקדמי על גבי הקרום. קרום המרתף של הבשר המעושן פונה מעלה, בתוך תותב תרבות. לנתק את הקליפים שתי האחרונות.
- חותכים, עם מספריים סטרילי, עודף של הקרום החוצה תותב תרבות במידת הצורך. באמצעות מלקחיים, להעביר את הקרום קבוע את תותב תרבות על צלחת 12-ובכן, להוסיף PBS, ולאחסן את הצלחת באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2.
- חזור על פעולות אלה (מתוך שלב 3.2-3.5) עם אחרים בקרום.
4. מפשיר, זריעת תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על קרום מי השפיר אנושי
-
הפשרתו של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית
- הבנק תאי RPE מוקפא-1 מיליון תאים לכל מבחנה קריוגני בחנקן נוזלי. להפשיר כמה בקבוקונים קריוגני כנדרש (תאים 350,000 הם נזרע לכל ממברנה).
- הכן צינור 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של מדיום RPE לכל מבחנה ההקפאה. ברגע מופשר הוא המבחנה, להעביר כל שפופרת התאים. חזור על פעולה זו עבור הבקבוקונים אחרים.
- Homogenize (פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי resuspend תאי RPE המדיום), קח 10 µL של הפתרון תא, להעביר אותו צינור 1.5 מ ל. להוסיף 10 µL של trypan blue. מקום 15 µL של פתרון זה כדורים הספירה, אז לספור את מספר התאים קיימא (לא נצבעים בצבע כחול) תחת מיקרוסקופ עם יעד X 4. חזור על פעולה זו עבור הבקבוקונים אחרים.
- בינתיים, centrifuge הצינורות 15 מ"ל ב x 110 גרם במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend התאים-תאים למ"ל 700,000.
-
זריעה של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית לתוך קרום מי השפיר אנושי
- הסר את לוחית 12-ובכן המכיל את הממברנות של החממה.
- מחוק לגמרי מגניב. להוסיף 500 µL של התליה תא מוכן בשלב 4.1.4 במרכז תותב תרבות. להוסיף 1 מ"ל של מדיום RPE מחוץ הכנסת תרבות (בתוך הבאר). חזור על הממברנות אחרים.
- מקם את הצלחת 12-ובכן המכיל את הקרומים בחממה.
5. תחזוקה של תרביות תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית על קרום מי השפיר אנושי
- לחדש את המדיום 2 x בשבוע, בדרך כלל בימי שני ושישי, ולפחות עד ליום 30 של התרבות.
- האחות המדיום בתוך ומחוץ את תותב תרבות במשך כל וחידוש זה בינונית טרייה (1 מ"ל בחוץ תותב תרבות ו- 500 µL בפנים). מקם את הצלחת בחממה ב CO 37 ° C ו-5%2.
6. הכנה של התיקון אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת
הערה: החל ביום 30 של התרבות, הרקמה הוא מוכן השתלת.
- חם הפתרון 8% ג'לטין באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות למלא התא הפנימי של. vibratome עם CO קר2-בינוני עצמאית (ב 4 ° C).
-
למקם את הבלוק הג'לטין 20% vibratome.
- קח את הצלחת תרבות 6 ס מ המכיל את הבלוק של 20% ג'לטין מהמקרר. באמצעות אזמל, לגזור בלוק 5 ס מ x 5 ס מ. הדבק את הצד העליון של גוש לתמיכת עם דבק מגע, דבק או למקבילה שלה.
- מקום להב חדש vibratome.
- להתאים את רמת הרחוב עד שהיא באותה רמה של הלהב גילוח.
- למלא את האמבטיה סביב התמיכה CO טריים2-בינוני עצמאית ב 4 º C. חותכים את גוש עם vibratome באמצעות במהירות בינונית עד לבלוק חותכים בצורה אחידה, המוביל משטח חלק. להגדיר את המיקום 0.
- האחות המדיום מסביב לבלוק של ג'לטין עד שהכל יבש לחלוטין, ולאחר מכן לקחת את הצלחת. ובכן 12 תרבות המכיל הרקמות מן החממה ב 37 º C.
- בזהירות באמצעות מלקחיים, פתח את תותב תרבות מעל הרחוב ג'לטין. חותכים, עם המספריים, כל חלקי ממברנות שאינן מכילות תאים (מחוץ לזירה שבה התאים היו לא תרבותי). האחות המדיום שיורית כולו.
- להוסיף 1 מ"ל של הפתרון 8% ג'לטין נוזלי ב 37 ° C על מנת לכסות את הקרומים. הסר בזהירות את העודפים. המתן 5-8 דקות כדי לאפשר הג'לטין לגבש.
- להוסיף CO טריים2-בינוני עצמאית (ב 4 ° C) לאמבטיה עד מכוסה הקרום.
- חותכים, עם vibratome במיקום של-100 מיקרומטר, עם מהירות בינונית, שנותרו על אופן הפעולה של הרחוב. בסוף המקטע, יש להקפיד לשמור על הכיוון של הרקמה.
- עם איזמל, לחתוך פינה כדי לזהות את הכיוון של המקטע.
- לאסוף את הקרום נעוץ ג'לטין עם מרית ולמקם אותו בצלחת 6-ובכן מלא עם המדיום שימור ב 4 מעלות צלזיוס, עד הרכבה זה לתוך העין הנמען.
- בזמנו של השתלת, להתאים את גודל השתל בהתאם לגודל העין הנמען תחת מיקרוסקופ כירורגי (3-1 על חולדות, 10 – 15 מ מ2 קופים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ירכי מכילים שכבת האפיתל יש להסיר לפני זריעת תאי RPE. טיפול אנזימטי של הקרום מבוצע עם thermolysin תחת רועדת. על מנת לא כדי לא לאבד את הקוטביות של הקרום (האפיתל היא מצד אחד), הוא קבוע על תמיכה הרכב אשר יכול להיות שונה, תלוי הספק (איור 1 א'). בדוק את הידבקות של הקרום לתמיכה שלה בשלב זה ולהוסיף קליפים במידת הצורך. בזמנו של קיבוע תותב תרבות, לעבוד בזהירות כדי להימנע לעשות חורים הקרום ולשמור את הקוטביות שלה עם קרום המרתף פונה כלפי מעלה (איור 1B). כאשר תאים הם נזרע על הממברנות, הם יכולים לברוח מן החורים האלה, הריכוז הסופי תא יקטן. יכול להיות דמיינו הנוכחות של חורים תחת מיקרוסקופ או על-ידי הוספת PBS פנימה תותב תרבות ובדיקת אם PBS דולף. צריך להיות מושלך כל קרום עם חורים.
בעקבות הקיבעון על הוספה תרבות, הנוכחות של תאים שיורית במיקרוסקופ ניגוד שלב הוא הערכה (דמויות 1C ו ד 1). באופן קלאסי, תאים מתים כמה יוכל להשאר על המשטח של הקרום, אבל התאים האלה יעלמו כאשר המדיום התרבות משתנה (איור 1C). הסיבים של קרום המרתף שאפשר לראות בהגדלה גדולה יותר (איור 1D) אם אין תאים נשארים. אם זה לא המקרה, עשוי להיות מותאם לעיתוי הדגירה עם thermolysin.
בימים הבאים של זריעה של תאי RPE, לבדוק אם התאים ולהתבטא. בהתאם המיקרוסקופ משמש, זה יכול להיות קשה לראות בבירור את התאים במהלך השבועות הראשונים, אבל אם התאים אינן מתיישבות, תאים ייראו שצף המדיום התרבות תאים. ברגע האפיתל נוצר מתחילה להבשיל, הוא הופך להיות קל יותר לראות את זה תחת מיקרוסקופ (דמויות 2A, 2Bו- 2 C). ב- 3 שבועות, התאים יוצרים של אפיתל חד שכבתי מלא אופייני RPE (ארגון המרוצף). לאחר 4 שבועות, האפיתל היא בוגרת מספיק עבור שלה לקראת ההשתלה (איור דו-ממדי). עם זאת, זה יכול להישמר בתרבות לעוד שבועות מסיבות לוגיסטיות.
הכנת השתל להשתלה מתואר באיור3. על תמורה של קרום כדי לחסום את הג'לטין 20%, תשאף כל המדיום התרבות תאים עודף. שלב זה חשוב, כמו בכל מדיום הנותרים יכול למנוע את הידבקות של הג'לטין 8% ועד RPE את הקרום. אכן, המדיום יהוו סרט של נוזל בין השכבות של ג'לטין.
הג'לטין משמש את ההטמעה של השתל יכול להיות בעלי כוח משתנות, בהתאם המדד בלום שלה (כלומר, מבחן בקרת איכות, ולא שסופקו על-ידי הספקים, שתוצאתו הכוח של ג'ל בטמפרטורה סטנדרטית, ריכוז). אם הג'לטין משמש אינו מספיק קשיח disaggregates במהלך משתילים, צריך לשנות ההפניה ג'לטין בשימוש עוד אחד עם חוזק גבוה יותר. הריכוז של ג'לטין יכול גם לשנות, מבוסס על ניסויים, כדי להתאים את עוצמתה ואת גמישותו.
איור 1: הוספת תמונות נציג של הבשר לפני ואחרי טיפול thermolysin של קיבעון על תרבות. (א) תמונה ייצוגית של קרום שסופק על-ידי בנק רקמות. (B) תמונה ייצוגית של קרום קבועים על הוספה של תרבות. (ג) תמונה ייצוגית של קרום שטופלו thermolysin בהגדלה נמוכה. (ד) נציג תמונה של קרום שטופלו thermolysin בהגדלה גדולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: להחליפן בתמונות של הבשר על זריעת תאי RPE- (א) תמונת הנציגה של הקרום לפני זריעה. (B ו- C) להחליפן בתמונות של תאי RPE על ממברנות-3 שבועות לאחר זריעה. הקרום לא ייתכן מישורי לחלוטין כפי שניתן לראות בלוח C. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (C), 20 מיקרומטר עבור ההגדלה. (ד) תמונת הנציגה של תאי RPE על קרום 30 יום לאחר זריעה, התואם את השעה הטמעתם בג'לטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תכנית המתארת את השלבים רציפים עבור ההכללה של רקמת רשתית מהונדסים המכיל את שכבת תאים RPE חזיר בתוך סרט ג'לטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו תיאר שיטה התרבות של תאי RPE וביום לפיגום הביולוגי שלה לקראת ההשתלה במודלים של בעלי חיים. אחד השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הוא שמירה על הכיוון של הבשר לאורך כל ההליך עד ההכללה שלו לתוך הג'לטין. אכן, האפיתל מקורית של הקרום יוסר ולא קרום המרתף שלו הופך להיות חשוף9. תאי RPE חייב להיות נזרע על גבי קרום המרתף הזה. על הכנה להטבעת ג'לטין, חשוב לעבוד עם כל המוצרים בטמפרטורה מוגדרת. אכן, ג'לטין יש את המאפיין להיות נוקשה 4 ° C, נוזלי גוף טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס)9. אם הטמפרטורה לא מכובד, הג'לטין יכול לחזק או לנוזל-שלב שבו אפקט זה אינו רצוי.
פיגומים ביולוגי מספר הוצעו, כמו של Descemet ממברנות25 או ירכי26. בפרט, חמס, מן קיסרי27, היו הפגינו להיות נסבל היטב בחלל subretinal, גורם לדלקת מוגבלת והפחתת neovascularization כורוידאלית26. הקרום תומך בהצלחה את התרבות של האדם RPE תאים9,28. יתר על כן, ממברנות אלה יש גם היסטוריה ארוכה מרפאות29, שהופך אותם מועמדים טובים גרדום. לטיפול תאי RPE. תומך ביולוגיים אחרים יכול להיות מיושם בקלות עם פרוטוקול זה. פיגומים סינטטי המבוסס על פולימר כבר נוקשה, ייתכן שלא תזדקק ג'לטין הטבעה לפני ההשתלה13,30,31,32,33. מערכות אחרות להשתלה פותחו לאחרונה למסירה subretinal העין האנושית של נגזר hESC RPE טפט של לגרדום פוליאסטר נוקשה34 או על מצע parylene סינתטי כחיקוי ממברנה של ברוך35 . למרות אסטרטגיות אלו מבטיחים, אנו מאמינים כי פיגומים הביולוגי עשוי לספק הפלטפורמה הטובה ביותר RPE הנדסת רקמות.
ב פרוטוקול זה, תאי RPE הזריעה נגזר תאים ES אנושיים באמצעות שיטה בידול ספונטנית. עם זאת, סוגים שונים של תאי RPE יכול לשמש, גם הבדיל מתאי גזע pluripotent המושרה אנושי או מתאי RPE העיקרי שהושג גופות או אפילו של RPE תא קו19,36,37, 38. יתר על כן, אם באמצעות תאי גזע pluripotent, מספר פרוטוקולים פותחו במהלך השנים האחרונות כדי להשיג תאי RPE המבוססת על הבחנה ספונטנית או באמצעות מולקולות קטנות כדי להדריך את הבידול18,22. תאי RPE המתקבל פרוטוקולים שונים בידול אלה ניתן להשתמש גם בשיטה זו עבור הנדסת רקמות.
מגבלה אחת של שיטה זו היא היציבות של הרקמה מוטבעים ב 4 º C. כפי נכלל בתוך ג'לטין לפני המשלוח באתר הניתוח, זה חייב להיות נשמר בטמפרטורה זו עד engraftment. בהקשר זה, הניתוחים צריכה להתבצע בתוך 48 שעות.
שיטה זו יכולה לעבור בקלות אל המרפאה. הרקמה RPE נעוץ ג'לטין כולו ב 4 ° C CO2-בינוני עצמאית. יכול להיות שהוחלפו בינוני, במידת הצורך, עם אחרים כבר אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לשימור לקרנית שהושג פוסט-מורטם, אשר משמשים עבור השתלות לתוך בני אדם. בהצלחה להדגים את היעילות של אסטרטגיה זו עבור השתלת במחקר הוכחה הרעיון לתוך מודלים מכרסמים9, אנחנו כרגע באימות הגישה הכירורגית בקופים לפני יישום זה עבור ניסוי קליני לטיפול בחולים עם צורות מסוימות של RP המשפיעים על RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אוליבייה Goureau הוא הממציא על ממתינים פטנטים הקשורים הדור של תאים ברשתית מתאי גזע pluripotent אנושי. המחברים האחרים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות ג'רום Larghero, ואלרי Vanneaux (Hôpital סנט לואיס, פריז, צרפת) לקבל את התשומה שלהם במהלך את ההגדרה של השיטה המתוארת כאן.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Médicale רשרש [תכנית הנדסת ביו - DBS20140930777] ומן LABEX להחיות [ANR-10-LABX-73] אוליבייה Goureau, קריסטל Monville. זה נתמך על ידי NeurATRIS, המחקר translational תשתית (Investissements d'Avenir) עבור biotherapies מדעי המח [ANR-11-INBS-0011], INGESTEM, התשתית הלאומית (Investissements d'Avenir) הנדסה pluripotent ו הבדיל בתאי גזע [ANR-11-INBS-000] כדי קריסטל Monville. כרים בן M'Barek נתמכה על ידי מלגות Stempole דים ו LABEX להחיות [ANR-10-LABX-73]. גזע הוא חלק של המכון Biotherapies מחלות נדירות נתמך על ידי les חדר מרווח וחדיש האגודה הצרפתית Myopathies (AFM)-Téléthon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250 mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1x (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100x) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
