Summary
망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
눈의 여러 가지 병 적인 조건에는 기능 또는 망막 안료 상피 (RPE)의 생존에 영향을. 이러한 망막 화 (RP) 및 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 일부 형태를 포함합니다. 세포 치료는 이미 인 간에 있는 예비 결과 격려와 함께 이러한 질병을 치료를 제안 하는 가장 유망한 치료 전략 중 하나 이다. 그러나,는 이식의 준비의 방법의 기능적 결과 비보에 상당한 영향을 있다. 실제로, 세포 현 탁 액으로 투입 하는 RPE 세포는 망막 조직으로 이식 하는 같은 셀 보다 덜 기능적 이다. 여기, 우리 엔지니어 RPE 조직과 vivo에서 이식에 대 한 준비를 간단 하 고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 RPE 세포 생물학 지원, 인간의 양수 막 (햄)에 시드 있습니다. 인공 건설 기계에 비해,이 지원 Bruch의 막 생 RPE 세포 연결 된 가까운 지하실 막의 이점이 있다. 그러나, 그것의 조작 쉽지 않다, 그리고 우리가 그것의 적절 한 경작에 대 한 몇 가지 전략 및 준비에 비보를 접목 개발.
Introduction
RPE 생존 및 대뇌는 그것은 밀접 하 게 관련 된1의 항상성 위해 결정적 이다.입니다. 여러 가지 병 적인 조건 변경의 기능 및 생존, RP 등 AMD.
RP는 RPE 세포 또는 두2,3, 대뇌의 기능에 영향을 주는 상속된 monogenic 돌연변이의 그룹입니다. 그것은 특히 RPE에 영향을 주는 돌연변이 세포 RP2의 5 %는 추정. AMD는 다른 조건이 RPE 레이어 변경 최고의 궁극적으로 중앙 시각 손실. AMD은 유전과 환경 요인의 복잡 한 상호 작용에 의해 발생 하 고 노인4,,56에 영향을 줍니다. 계획에 따르면 AMD 20207에 의해 전세계 196 백만 환자에 대 한 우려 됩니다. 이러한 장애에 대 한 효과적인 치료법 존재 하 고 제안 하는 전략 중 하나 죽은/작동 하지 않는 기존 RPE 세포8에 대 한 보상 하기 위해 새로운 RPE 세포의 이식입니다.
투입 될 최종 제품의 배합의 모드 기능 최고의 결과 보장 하기 위해 필수적 이다. 그들의 생존, 통합 및 기능9,10,,1112 에 관한 우려를 제기 하는 RPE 세포로는 셀 서 스 펜 션, 배달, 쉽고 간단 방법 임에도 불구 하 고 주입 , 13. 과학자는 지금 개발 하 고 더 복잡 한 공식 제공 설계 망막 조직9,13,14,,1516. 이러한 맥락에서 우리는 체 외에서 RPE 조직 이식9에 사용할 수 있는 생성 하는 원래 방법 개발.
인간 미 발달 줄기 (ES) 세포에서 파생 된 RPE 세포 은행이이 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 대안 RPE 세포 은행 (인간 유도 만능 줄기 세포, 기본 RPE 세포, 등) 다른 셀 소스에서 다른 방법으로 분화 하 고이 프로토콜에 대 한 적절 한 있습니다. 그것은 포함 하는 감독된 차별화 cytokines 그리고/또한 작은 분자17,18,19,20,,2122를 사용 하 여 프로토콜.
이식 하는 비 계에 설계 조직을 준비 한다. 지난 몇 년 동안, 다른 건설 기계는 폴리머 또는 생물 기원13,,2324의 매트릭스에 기반으로 개발 되었다. 여기, 생물 학적 기판 사용 햄, 하지만 denuded Bruch 막 같은 다른 기판에 구현 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 RPE 네이티브 환경에 더 관련 된 생물 비 계를 사용 하 여 이점이 있습니다.
인간의 ES 세포 유래 RPE 세포 완전히 조약돌 단층으로 구성 하기 위해서는 적어도 4 주 동안 교양. 그 단계에서 얻은 상피 기능적 이며9편광. 마지막으로,이 조직 쉽게 주름로 그것을 한번 더 강성과 탄성 주입 절차 동안 그것을 보호 하기 위해 하이드로 겔 캐리어의 얇은 층에 포함 됩니다. 이 제품은 다음 접목까지 4 ° C에 저장 됩니다.
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Protocol
이 프로토콜에 사용 되는 모든 인간의 재료 유럽 연합 규정에 따라 사용 되었다. 이 연구에 사용 된 인간의 ES 세포 라인 독특한 배아에서 파생 되었다. 부부는 배아를 기증 했다 완벽 하 게 통보 했다 고 익명 기부에 대 한 그들의 동의 주었다. 임상 등급 인간 ES 세포 라인이이 배아에서 파생 된, 틀, 자격, 되었고 제대로 문서화로 슬 린 셀 (영국)에 의해. 햄 (APHP, Hôpital 세인트루이스) 병원 지침에 따르면 태 반 기증에 대 한 동의 서명 하는 어머니에 제왕 절 동안 무 균 조건 하에서 조달 했다.
1입니다. 문화 미디어 및 시 약의 준비
-
RPE 세포 배양 매체의 준비
- RPE 세포 배양 매체를 준비 하려면 추가 4% 혈 청 대체 (20 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한), 희석 1000 x 2-mercaptoethanol (500 mL의 최종 볼륨에 대 한 500 µ L), 및 1 %Eagle′s 최소 필수 매체 (MEM) 비 본질적인 아미노산 솔루션 (최종 5 mL 500 mL의 볼륨)를 수정된이 글 Dulbecco의 매체 (DMEM) 높은 포도 당 (475 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한).
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전송/보존 매체의 준비
- 전송/보존 매체를 준비 하려면 CO2페니실린-스 (5 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한)의 1%를 추가-독립 매체 (495 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한) 4 ° c.에 그것을 유지 하 고
-
물의 Resuspension thermolysin 효소의
- Thermolysin의 재고 솔루션의 준비
- Thermolysin의 재고 솔루션을 준비, 실내 온도-20 ° C에 저장 된 thermolysin 분말을 녹여.
- 효소 활동 변수 배치에서 배치 될 수 있습니다, 사용할 수 일괄 처리의 thermolysin 가루와 함께 제공 된 분석의 인증서에 따라이 작업을 계산 합니다. 분할은 "활동 중립 Protease 계산 = ANPC" (분석의 인증서에 표시 된) 181 (이 티로신의 분자량)에 의해. 결과 얻은 제공 된 thermolysin 분말 (U/유리병)의 총 효소 활동에 해당 합니다.
- 총 효소 활동 (U/유리병) 200 (U/mL)로 나눈 값에 해당 하는 물의 볼륨을 추가 하 여 200 U/mL에서 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 위쪽 및 아래쪽에 추가 된 물 pipetting으로 효소를 분해. 소용돌이 30 s 및 확인에 대 한 솔루션 여부 분말 완전히 일시 중지 되었습니다. 더 많은 pipetting 전체 해산에 대 한 필요할 수 있습니다.
- 약 수 재고 솔루션-20 ° c.에 그것을 저장 하 고
- Thermolysin의 작업 솔루션의 준비
참고: thermolysin 솔루션 햄 치료 당일에 준비 되어야 한다.- 해 동 thermolysin-20 ° c.에 저장 된 200 U/mL에서의 주식 aliquots 1 U/mL의 마지막 효소 활동을 얻기 위하여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 재고 솔루션 200 x 희석. 1-4 햄 패치 치료 40 mL를 준비 합니다.
- Thermolysin 솔루션을 사용 하 여 0.2 µ m 필터 사전 통해 필터링.
- Thermolysin의 재고 솔루션의 준비
-
젤라틴의 물의 Resuspension
- 20% 젤라틴 솔루션 및 블록의 준비
참고: 20% 젤라틴 솔루션 및 블록 수 있습니다 준비까지 사용 하기 전에 1 주.- CO2를 따뜻한-42 ° c (최대 1 h) 30 분 물 욕조에 독립 매체. 50 mL 튜브에 추가의 40 mL에 젤라틴의 10 g CO2예 열-독립 매체 및 소용돌이 솔루션.
- 42 ° c.에 30-60 분 젤라틴 해산 소용돌이 균질 솔루션을 각 10 분.
- 일단 해결책은 균질, 4 6 cm 문화 요리 20% 젤라틴 솔루션의 4 mL를 추가 합니다. 거품을 하지 마십시오. 요리를 보호 하기 위해 플라스틱 파라핀 영화를 추가 하 고 4 ° c.에 강화 하기 위해 솔루션을 수
- 8% 젤라틴 용액의 준비
참고: 8% 젤라틴 솔루션 사용 하기 전에 날 준비 그리고 4 ° c.에 저장- CO2를 따뜻한-42 ° C (최대 1 h) 30 분 동안에 독립 매체. 50 mL 튜브에 추가의 46 ml 젤라틴 4 g CO2예 열-독립 매체 및 소용돌이 솔루션.
- 42 ° c.에 30-60 분 젤라틴 해산 플라스틱 파라핀 영화 튜브를 보호 하 고 계속 물 욕조에 37 ° C에서 같은 날 사용 하는 경우를 추가 하거나 나중에 사용 하는 경우 4 ° C에서 그것을 저장 합니다.
- 20% 젤라틴 솔루션 및 블록의 준비
2. Thermolysin 치료 인간 양수 막의
-
인간의 양수 막 세척
- 햄 작은 조각 (약 30 x 30 mm) PBS에 4 ° C에서 이미 나일론 비 계에 고정 또는 고정으로 제공 했습니다. 제공 하는 경우 30 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 막 해 동 냉동.
- 세포 막 세척:
- PBS의 80 mL를 포함 하는 250 mL 병에서 1-4 막 장소. 많은 병을 사용 하 여 필요에 따라.
- 5 분 동안 고속에 판 통에 각 병을 흔들어 다음 PBS를 삭제 합니다. PBS와 반복의 80 mL를 추가 합니다.
-
Thermolysin 치료
- 포함 하는 막 병 당 thermolysin (1 U/mL)의 작업 솔루션의 40 mL를 추가 (1-4 막 병; 당 한 번에 최대 3 병).
- 450 rpm 그리고 소용돌이에 5 분 동안 병을 흔들어 30 그들 s. 1 x 반복.
- Thermolysin 솔루션을 삭제 하 고 PBS의 80 mL를 추가 합니다.
- 450 rpm에서 5 분 동안 병을 흔들어. PBS를 삭제 하 고 PBS의 80 mL를 추가 합니다. 3 배를 반복 합니다.
3. 문화 삽입에 인간의 양수 막의 고정
- 햄 하나, 하나를 제거 하 긴 살 균 겸 자 (그는 병의 바닥을 도달할 수 있다)를 사용 하 고 각 햄 PBS의 10 mL를 포함 하는 10 cm 문화 접시에 전송.
- 10 mL PBS의 포함 된 새로운 10 cm 문화 접시, 아래로 나일론 막의 한을 놓습니다. 2 나일론에 멤브레인을 해결 하는 데 사용 되는 4 개의 클립을 분리 합니다.
- 나일론 및 막 사이 문화 삽입의 작은 링을 삽입 합니다.
- 막 작은 반지를 완전히 덮는 다는 것을 확인 하십시오. 막 위에 문화 삽입의 두 번째 부분을 클립. 햄의 지하실 막 문화 삽입 내부 직면 하고있다. 마지막 두 클립을 분리 합니다.
- 잘라, 멸 균가 위로, 문화 삽입 필요한 경우 외부 막의 초과. 12-잘 접시에 문화 삽입에서 고정 막 전송 집게를 사용 하 여 PBS를 더하고 37 ° C, 5% CO2인큐베이터에 접시를 저장.
- 다른 멤브레인과 (3.2 3.5 단계)에서 이러한 작업을 반복 합니다.
4. 해빙 및 인간 양수 내 세포 막에 망막 안료 상피 세포의 시드
-
망막 색소 상피 세포의 해빙
- RPE 세포 은행 극저온 유리병 당 1 백만 세포에서 액체 질소에서 고정입니다. 필요에 따라 많은 극저온 튜브를 녹여 (350000 세포 막 당 시드 있습니다).
- 극저온 유리병 당 RPE 매체의 3 mL를 포함 하는 15 mL 튜브를 준비 합니다. 일단 병 동 각 튜브를 셀을 전송 합니다. 다른 튜브에 대 한이 작업을 반복 합니다.
- 균질 (위쪽 및 아래쪽을 몇 번을 플라스틱 resuspend RPE 중간에 셀) 셀 솔루션의 10 µ L과 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. Trypan 블루의 10 µ L를 추가 합니다. 세 실에서이 솔루션의 장소 15 µ L 다음 가능한 셀 (파란색에서 색 하지) 4 X 목표 현미경의 수를 계산 합니다. 다른 튜브에 대 한이 작업을 반복 합니다.
- 한편, 원심에서 110 x g 5 분 삭제에 대 한 15 mL 튜브는 상쾌한 고 700000 셀/mL에서 셀 resuspend.
-
인간 양 막 세포 막으로 망막 색소 상피 세포의 시드
- 포함 하는 인큐베이터에서 막 12 잘 플레이트를 제거 합니다.
- PBS 발음 준비 단계 4.1.4 문화 삽입의 센터에에서 세포 현 탁 액의 500 µ L를 추가 합니다. (잘) 내 문화 삽입 외부 RPE 매체의 1 mL를 추가 합니다. 다른 막에 대 한 반복 합니다.
- 포함 하는 인큐베이터에서 막 12-잘 접시를 놓습니다.
5. 인간의 양수 내 세포 막에 망막 안료 상피 세포 배양의 유지 보수
- 중간 2 갱신 월요일과 금요일 때까지 적어도에 보통 주당 x 문화권의 일 30.
- 각 잘 문화 삽입 내외 매체를 발음 하 고 신선한 매체 (문화 삽입 외부 1 mL 및 내부 500 µ L)으로 갱신. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 접시를 놓습니다.
6. 망막 안료 상피 패치 이식에 대 한 준비
참고: 하루 30 문화에서 시작, 조직이 식을 위한 준비 이다.
- 따뜻한 물 목욕 30 분 동안 37 ° C에서 8% 젤라틴 솔루션 작성 찬 CO2와 vibratome의 내부 챔버-독립 매체 (4 ° C)에서.
-
장소는 vibratome로 20% 젤라틴 블록.
- 냉장고에서 20% 젤라틴의 블록을 포함 하는 6 cm 문화 접시를 가져가 라. 메스를 사용 하 여, 5 cm x 5 cm 블록을 잘라. Cyanoacrylate 접착제 또는 해당 지원 블록의 상단 측면을 붙여 넣습니다.
- 장소는 vibratome에 새로운 블레이드입니다.
- 면도날의 동일한 수준에 올 때까지 블록의 레벨을 조정 합니다.
- 신선한 CO2지원 주위 목욕을 채우기-4 ° c.에 독립 매체 Vibratome 블록 균일 하 게 잘라 때까지 중간 속도 사용 하 여, 매끄러운 표면에 지도 함께 블록을 잘라. 0 위치를 설정 합니다.
- 그것은 완전히 건조 될 때까지 젤라틴의 블록 주위 매체 발음 그리고 포함 하는 37 ° c.에 인큐베이터에서 조직 12 잘 문화 접시
- 집게를 사용 하 여 신중 하 게 젤라틴 블록 위에 문화 삽입을 엽니다. 커트가 위, 막 (세포 배양 하지 했다 반지) 외부 세포를 포함 하지 않는의 모든 부분. 전체 잔여 중간 발음
- 멤브레인을 커버 하기 위해 37 ° C에 액체 8% 젤라틴 용액 1 mL를 추가 합니다. 초과 조심 스럽게 제거. 응고에 젤라틴을 허용 하도록 5-8 분을 기다립니다.
- 신선한 CO2추가-막 덮여 때까지 목욕 (4 ° C)에서 독립 매체.
- 절단, 블록 동작 하는 방법을 알고 남은 중간 속도-100 µ m의 위치에 vibratome와 함께. 섹션의 끝에, 조직의 방향을 유지 하기 위해 주의 해야 합니다.
- 메스, 잘라 섹션의 방향을 식별 하는 코너.
- 주걱으로 젤라틴에 포함 된 멤브레인을 수집 하 고 받는 사람 눈으로 접목까지 4 ° C에서 보존 매체 가득 6 잘 플레이트에 배치.
- 이식 시 수술 현미경 (쥐에 대 한 1-3, 비 인간 영장류에 대 한 10-15 m m2 ) 받는 사람 눈의 크기에 임 플 란 트의 크기를 조정 합니다.
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Representative Results
햄은 RPE 세포의 뿌리기 전에 제거 되어야 한다 상피 층 포함. 막의 효소 치료는 떨고 아래 thermolysin와 함께 수행 됩니다. 순서 대로 하지 아니 막 (상피는 1 개의 측에)의 극성을 잃고, 그것은 어떤 구성 (그림 1A) 공급자에 따라 다를 수는 지원에 고정. 이 단계에서 그것의 지원에 막의 접착을 확인 하 고 필요한 경우 클립을 추가. 문화 삽입에 고정 시 막에 있는 구멍을 만드는 피하기 위해 신중 하 게 작업 하 고 (그림 1B)을 향하도록 하는 지하실 멤브레인와 함께 그것의 극성을 유지 합니다. 세포는 세포 막에 씨를 뿌리고, 그들은 이러한 구멍에서 탈출 수 그리고 마지막 셀 농도 감소 될 것 이다. 구멍의 존재는 현미경 또는 문화 삽입 내부 PBS를 추가 PBS 누수 되는 경우를 확인 하 여 구상 될 수 있습니다. 어떤 막 구멍을 폐기 해야한다.
문화 삽입에 정착, 다음 단계 대조 현미경에 잔여 셀의 존재 계산 (그림 1C 및 1d) 이다. 고아 하 게, 몇 가지 죽은 세포는 막의 표면에 남아 있을 수 있습니다 하지만 그 세포 배양 매체 변경 되 면 삭제 될 것 이다 (그림 1C). 지하실 막의 섬유 셀 유지 하는 경우 더 높은 확대율 (그림 1D)에서 볼 수 있었다. 하지 하는 경우 thermolysin 가진 외피의 타이밍을 조정할 수 있습니다.
RPE 세포의 시드 다음 일에서 경우 셀 준수 확인 합니다. 사용 하는 현미경에 따라 명확 하 게 처음 몇 주 동안 셀을 참조 하는 것이 어려울 수 있습니다 하지만 셀을 준수 하지 않는 경우 셀 것입니다 볼 수 세포 배양 매체에서 떠. 일단 상피 형성 되 고 성숙 하기 시작, 그것을 보고 (그림 2A, 2B, 2 C) 현미경 쉽게 된다. 3 주에 셀 RPE (조약돌 조직)의 전형적인 완전 한 단층 상피를 형성합니다. 4 주 후, 상피는 이식 (그림 2D)에 대 한 준비를 위해 충분히 성숙. 그러나, 그것은 병 참 술 이유를 위해 더 많은 주에 대 한 문화에 보관 될 수 있습니다.
이식에서 이식의 준비는 그림 3에 설명 되어 있습니다. 20% 젤라틴 블록에 막의 apposition, 따라 모든 초과 세포 배양 매체 발음. 이 단계는 중요 한, 모든 나머지 매체는 RPE을 막 8% 젤라틴의 접착을 배제 수로. 실제로, 매체는 젤라틴의 층 사이 액체의 필름을 형성할 것 이다.
이식의 포함을 위해 사용 하는 젤라틴의 꽃 색인에 따라 다양 한 힘의 수 (즉, 품질 관리 테스트를 수행 하 고는 표준된 온도에서 젤의 강도 평가 공급 업체에서 제공 하 고 농도)입니다. 경우 사용 하는 젤라틴 충분히 엄밀한는 접목 하는 동안 disaggregates, 젤라틴 사용된 기준 더 높은 강도 가진 또 다른 것 바뀌어야 한다. 젤라틴의 농도 변경 수 있습니다 또한 수, 실험, 그것의 힘 및 탄력 조정에 따라.
그림 1: thermolysin 치료 및 문화에 정착 하기 전에 전후 햄의 대표 이미지 삽입. (A) 조직 은행에서 제공 하는 막의 대표 이미지. (B)에 문화 삽입 고정 막의 대표 이미지. (C) 낮은 확대율에서 thermolysin로 치료 하는 막의 대표 이미지. (D) 높은 확대에 thermolysin로 치료 하는 막의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: RPE 세포 시드 시 햄의 대표 이미지. (A) 뿌리기 전에 막의 대표 이미지. (B 와 C) 후 시드 3 주 막에 RPE 세포의 대표 이미지. 막 완전 하 게 평면 패널 C에서 볼 수 있습니다. 눈금 막대는 배율에 대 한 20 µ m, 100 µ m (C) =. (D) 30 일 후 시드, 해당 시간의 젤라틴에 그들을 포함 하는 막에 RPE 세포의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 젤라틴 영화 안에 햄에 RPE 세포 층을 포함 하는 설계 망막 조직 포함에 대 한 일련의 단계를 설명 하는 스키마. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 생물 학적 비 계 및 동물 모델에 이식에 대 한 준비에 RPE 세포의 문화에 대 한 메서드를 설명합니다. 프로토콜의 중요 한 단계 중 하나는 젤라틴으로 포함 될 때까지 절차를 따라 햄의 방향의 정비 이다. 실제로, 막의 네이티브 상피 제거 되 고 그것의 지하실 막 노출된9된다. RPE 세포 지하실 막이 위에 씨앗을 품고 있다. 젤라틴을 포함 하기 위한 준비, 시 정의 된 온도에서 모든 제품을 사용 하는 중요 한 됩니다. 실제로, 젤라틴은 4 ° C와 바디 온도 (37 ° C)9에서 액체에서 단단한 수 속성이 있습니다. 온도 존경 하지, 젤라틴 응고 수 있다 또는이 효과 적절 하지 단계에서 액 화.
몇 가지 생물 학적 건설 기계 제안 되었습니다, 멧의 막25 또는 햄26처럼. 특히, 햄, 제왕 절 개27, 했다 시연 subretinal 공간에 잘 용납 될 제한 된 염증을 일으키는 원인이 되 고 안 neovascularization26감소. 멤브레인은 성공적으로 인간의 RPE 세포9,28의 문화를 지원합니다. 또한,이 막에 있는 또한 오랜 역사 클리닉29, 그들 RPE 세포 치료에 대 한 비 계에 대 한 좋은 후보 만들기. 다른 생물 지원이 프로토콜 쉽게 구현 될 수 있습니다. 폴리머 기반 가상 건설 기계는 이미 엄밀한 고 이식13,30,31,,3233이전 포함 하는 젤라틴을 필요 하지 않을 수도. 이식에 대 한 다른 시스템 개발 되었으며, 최근에 hESC 파생 RPE 단층 합성 파 릴 렌 기질 Bruch의 막35 모방 하도록 설계 또는 단단한 폴 리 에스테 비 계34 에 인간의 눈에 subretinal 납품 . 이러한 전략은 비록 유망한, 우리는 생물 학적 건설 기계 RPE 조직 공학 위한 최상의 플랫폼을 제공할 수 있습니다 믿습니다.
이 프로토콜에서 시드 RPE 세포 자발적인 차별화 방법을 사용 하 여 인간의 ES 세포에서 파생 되었다. 그러나, RPE 세포의 다른 종류를 사용할 수, 하나는 RPE 세포 선19,,3637, 또는 시신에서 얻은 기본 RPE 세포 또는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 38. 또한, 만능 줄기 세포를 사용 하 여 여러 프로토콜 RPE 세포 자발적 분화에 따라 또는 작은 분자를 사용 하 여 차별화18,22가이드를 지난 몇 년 동안 개발 되었다. 이러한 다른 차별화 프로토콜에서 얻은 RPE 세포 조직 공학이 방법으로도 사용 될 수 있습니다.
이 방법의 한도 4 ° c.에서 포함 된 조직의 안정성 수술 사이트에 선적의 앞에 단지 젤라틴에 포함 하는 그것은 engraftment까지이 온도에서 유지 되어야 합니다. 그런 맥락에서 수술 48 시간 내에서 수행 되어야 합니다.
이 메서드는 병원에 쉽게 옮겨질 수 있었다. 젤라틴에 포함 된 RPE 조직 CO2에서 4 ° C에서 보존-독립 매체. 이 매체 필요한 경우, 사후 부검 및 인간으로 이식에 사용 되는 각 막의 보존에 대 한 미국 식품의 약 청 (FDA)에 의해 이미 승인 된 다른 사람으로 대체 수 있습니다. 우리는 성공적으로 이식 설치류 모델9, 개념 증명 연구에 대 한이 전략의 효율성을 증명 하 고 우리가 현재 임상 시험에 대 한 그것을 구현 하기 전에 비 인간 영장류에서 수술 접근 유효성 검사는 RP는 RPE에 영향을 미치는 특정 형태의 환자를 치료 하.
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Disclosures
올리비에 Goureau 중인 인간 만능 줄기 세포에서 망막 세포의 생성에 관련 된 특허에 발명자 이다. 다른 저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 여기 설명 하는 방법 설정 하는 동안 그들의 입력에 대 한 제롬 Larghero와 발레리 Vanneaux (Hôpital 세인트 루이스, 파리, 프랑스)에 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 ANR에서 교부 금에 의해 지원 되었다 [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation 부 라 검색 Médicale [바이오 공학 프로그램-DBS20140930777] LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 올리비에 Goureau와 크리스텔 Monville에서. 그것은 NeurATRIS는 변환 연구 인프라 (Investissements d'Avenir) 신경 과학 [ANR-11-INBS-0011] 및 INGESTEM, 국가 인프라 (Investissements d'Avenir)에 biotherapies에 대 한 만능 기술에 의해 지원 되었다 고 차별화 된 줄기 세포 [ANR-11-INBS-000] 크리스텔 Monville에. 카림 벤 M'Barek DIM Stempole 및 LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 장학금에 의해 지원 되었다. 줄기 협회 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM)에서 지 원하는 희귀 질환에 대 한 Biotherapies 연구소의 일부입니다-Téléthon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250 mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1x (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100x) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
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