Summary
Vi beskriver en metode for å ingeniør en netthinnen vev består av netthinnens pigment epitelceller avledet fra menneskelige pluripotent stamceller kulturperler på menneskelig amniotic membraner og sin forberedelse til pode i dyremodeller.
Abstract
Flere pathological betingelser i øyet påvirker funksjonaliteten og/eller overlevelse av netthinnens pigment epitel (RPE). Disse inkluderer noen former for retinitis pigmentosa (RP) og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Cellen terapi er en av de mest lovende strategiene foreslått å kurere disse sykdommer, med allerede oppmuntrende foreløpige resultater hos mennesker. Metode for utarbeidelse av graftet har imidlertid en betydelig innvirkning på sin funksjonelle resultater i vivo. RPE celler podet som en celle suspensjon er faktisk mindre funksjonell enn de samme cellene transplantert som en netthinnen vev. Her beskriver vi en enkel og reproduserbar metode for utvikling RPE vev og sin forberedelse for en i vivo implantasjon. RPE celler avledet fra menneskelige pluripotent stamceller er seeded på en biologisk støtte, menneskelige amniotic membranen (hAM). Sammenlignet med kunstig stillaser, har denne støtten fordelen av å ha en kjeller membran som er nær Bruchs membran hvor endogene RPE celler er festet. Men dens manipulasjon er ikke lett, og vi utviklet flere strategier for sin riktig dyrking og forberedelse til pode i vivo.
Introduction
RPE er avgjørende for overlevelse og homeostase av de fotoreseptorer som det er tett forbundet1. Flere pathological betingelser endre sin funksjonalitet eller overlevelse, inkludert RP og AMD.
RP er en gruppe av arvede monogenic mutasjoner som påvirker funksjonene til fotoreseptorer eller RPE celler eller begge2,3. Det anslås at mutasjoner som påvirker spesielt RPE celler utgjør 5% av RP2. AMD er en tilstand der RPE laget endres, ledende til slutt til sentrale synstap. AMD er forårsaket av komplekse samspillet av genetiske og miljømessige faktorer og påvirker de eldre4,5,6. Ifølge anslag, vil AMD være en bekymring for 196 millioner pasienter over hele verden av 20207. For disse lidelsene, ingen effektiv kur finnes, og en av strategiene foreslått er transplantasjon av nye RPE celler for å kompensere for død/nonfunctional forhåndseksisterende RPE celler8.
Modus for utformingen av det endelige produktet å bli podet er avgjørende for å sikre de beste funksjonelle resultatene. RPE cellene injisert som en celle suspensjon tross en enkel og grei metode for levering, heve bekymringer om deres overlevelse, integrering og funksjonaliteten9,10,11,12 , 13. forskere nå utvikler mer komplekse formuleringer å levere konstruert netthinnen vev,9,,13,,14,,15,,16. I denne sammenhengen utviklet vi en opprinnelige metoden for å generere i vitro RPE vev som kan brukes for transplantasjon9.
RPE cellen banker avledet fra menneskelig embryonic stem (ES) celler brukes i denne protokollen. Men alternativ RPE celle banker fra ulike celle kilder (menneskeskapte pluripotent stamceller, primære RPE celler, etc.) og differensiert med en annen metode passer også for denne protokollen. Det inkluderer rettet differensiering protokoller bruker cytokiner og/eller små molekyler17,18,19,20,21,22.
For å være transplantert, bør utviklet vevet være forberedt på et stillas. I de siste årene, ble ulike stillaser utviklet basert på en polymer eller en matrise av biologiske opphavet13,23,24. Her biologiske underlaget brukes er skinke, men andre underlag, som avdekt Bruch membraner, kan implementeres. Metoden beskrevet her har fordelen av benytter en biologisk skafottet som er mer relevant for RPE eget miljø.
Human ES celle-avledet RPE celler er kultivert i minst 4 uker for å være fullt organisert som en brosteinsbelagte monolayer. På det stadiet epitel innhentet fungerer og polarisert9. Til slutt, som dette vevet rynker lett, det er innebygd i et tynt lag av hydrogel bærer å gi det mer stivhet og elastisitet og beskytte det under innsetting prosedyren. Dette produktet lagres deretter på 4 ° C til pode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menneskelige materialer brukt i denne protokollen ble brukt i henhold til EUs regelverk. Human ES celle linjen som brukes i denne studien ble avledet fra en unik fosteret. De par som hadde donert fosteret var fullt informert og ga sitt samtykke for en anonym donasjon. En klinisk førsteklasses menneskelige ES cellen linje var avledet fra denne embryo, banked, kvalifisert og skikkelig dokumentert av Roslin celler (UK). Skinker ble tatt under sterile forhold under et keisersnitt i mødre som signert et samtykke for morkaken donasjon Ifølge sykehuset retningslinjer (APHP, Hôpital Saint Louis).
1. forberedelse av kultur medier og reagenser
-
Utarbeidelse av RPE celle kultur medium
- For å forberede RPE celle kultur medium, Legg 4% serum erstatning (20 mL for et siste volum 500 ml), 1000 x utvannet 2-mercaptoethanol (500 µL for et siste volum 500 ml) og 1% Eagle′s minimum viktig medium (MEM) ikke-essensielle aminosyrer løsning (5 mL for en siste volumet av 500 mL) til Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) høy glukose (475 mL for et siste volum 500 ml).
-
Utarbeidelse av transport/bevaring medium
- For å forberede transport/bevaring mediet, legger du til 1% av penicillin-streptomycin (5 mL for et siste volum 500 ml) CO2-uavhengig medium (495 mL for et siste volum 500 ml) og holde den på 4 ° C.
-
Rørets av thermolysin enzym
- Utarbeidelse av en lagerløsning av thermolysin
- For å forberede en lagerløsning av thermolysin, tine thermolysin pulver, som var lagret på 20 ° C, ved romtemperatur.
- Som den enzymatiske aktiviteten kan være variabel fra parti til parti, beregne denne aktiviteten basert på analysesertifikatet med thermolysin pulver av batchen skal brukes. Dele den "aktivitet nøytral Protease beregnet = ANPC" (angitt i sertifikat av analysen) av 181 (som tyrosins molekylvekt). Resultatet tilsvarer den totale enzymatiske aktiviteten av medfølgende thermolysin pulver (U/medisinglass).
- Forberede en lagerløsning på 200 U/mL ved å legge til volumet av vann tilsvarer den totale enzymatisk aktiviteten (U/medisinglass) delt på 200 (U/mL).
- Oppløse enzymet av pipettering vannet som ble lagt opp og ned. Vortex løsningen for 30 s og sjekk om pulveret er fullstendig deaktivert. Flere pipettering kan være nødvendig for en full oppløsning.
- Aliquot lager løsningen og lagre den på 20 ° C.
- Utarbeidelse av en fungerende løsning av thermolysin
Merk: Thermolysin løsningen må være forberedt på dagen av skinke behandling.- Tine de lager dele thermolysin på 200 U/mL lagret på 20 ° C. Fortynne lagerløsning 200 x fosfat-bufret saltvann (PBS) for å få en siste enzymatiske aktiviteten til 1 U/mL. Forberede 40 mL å behandle 1 – 4 skinke patcher.
- Filtrere thermolysin løsningen gjennom en 0,2 µm filteret før bruk.
- Utarbeidelse av en lagerløsning av thermolysin
-
Rørets av
- Utarbeidelse av 20% gelatin løsning og blokk
Merk: 20% gelatin løsningen og blokken kan tilberedes opp til 1 uke før bruk.- Varme CO2-uavhengig medium til 42 ° C i et vannbad i 30 min (opptil 1 h). I en 50 mL tube, legge 10 g av til 40 mL varmet CO2-uavhengig medium og vortex løsningen.
- Oppløse gelatin i 30-60 minutter på 42 ° C. Vortex hver 10 min til homogenize løsningen.
- Når løsningen er homogene, legge 4 mL av den 20% gelatin løsningen til fire 6 cm kultur retter. Unngå bobler. Legge til en plast parafin film for å beskytte retter og tillate løsningen å størkne på 4 ° C.
- Utarbeidelse av 8% gelatin løsning
Merk: 8% gelatin løsningen kan være forberedt dagen før bruk og lagret på 4 ° C.- Varme CO2-uavhengig medium til 42 ° C i 30 min (opptil 1 h). Legg i en 50 mL tube, 4 g av til 46 mL varmet CO2-uavhengig medium og vortex løsningen.
- Oppløse gelatin i 30-60 minutter på 42 ° C. Legg en plast parafin film å beskytte røret og oppbevare den i et vannbad på 37 ° C hvis det brukes samme dag eller lagre den på 4 ° C hvis den skal brukes senere.
- Utarbeidelse av 20% gelatin løsning og blokk
2. Thermolysin behandling av menneskelig Amniotic membraner
-
Menneskelige amniotic membran vask
- Har hAMs leveres som små biter (ca 30 x 30 mm) fast i en nylon skafottet, enten allerede i 4 ° C i PBS eller frosset. Hvis gitt frosset, tine membraner på 37 ° C i en inkubator for 30 min.
- Vask membraner:
- Sett 1 – 4 membraner i en 250 mL flaske inneholder 80 mL PBS. Bruke så mange flasker som kreves.
- Riste hver flaske i en plate shaker med høy hastighet i 5 min, og forkaste PBS. Legge til 80 mL PBS og gjenta.
-
Thermolysin behandling
- Legge til 40 mL arbeidsoppløsning av thermolysin (1 U/mL) per flaske inneholder membraner (1 – 4 membraner per flasker, opptil 3 flasker samtidig).
- Riste flasker for 5 min på 450 rpm og deretter vortex dem for 30 s. Gjenta 1 x.
- Forkaste thermolysin løsningen og legge 80 mL PBS.
- Riste flasker for 5 min på 450 rpm. Forkaste PBS og legge 80 mL PBS. Gjenta 3 x.
3. fiksering av menneskelig Amniotic membraner på en kultur setter
- Bruk lenge sterilt tang (som kan nå bunnen av flasken) fjerne hAMs enkeltvis, og overføre hver hAM til en 10 cm kultur parabol med 10 mL PBS.
- I en ny 10 cm kultur parabol med 10 mL PBS, plasserer du en av membraner med nylon vender ned. Koble to av fire klippene som brukes til å fastsette membranen til nylon.
- Sett inn den mindre ringen av kultur sette mellom nylon og membranen.
- Kontroller at membranen dekker mindre ringen helt. Klipp den andre delen av kultur sette over membranen. Kjelleren membran av skinke vender inne kultur innsatsen. Koble de to siste klippene.
- Klipp, med sterilt saks, overskytende av membran utenfor kultur innsatsen hvis nødvendig. Bruke pinsett, overføre membranen fast i kultur innsatsen til en 12-vel plate, Legg PBS, og lagre platen i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
- Gjenta disse operasjonene (fra trinn 3.2 til 3.5) med andre membraner.
4. tining og såing av netthinnens Pigment epitel celler på menneskelig Amniotic membraner
-
Tiner netthinnens pigment epitel celler
- Den RPE celle banken fryses på 1 million celler per kryogene ampullen i flytende nitrogen. Tine så mange kryogene ampuller som kreves (350 000 celler er seeding per membran).
- Forberede en 15 mL tube med 3 mL RPE medium per kryogene medisinglass. Når ampullen er tint opp, kan du overføre cellene til hver rør. Gjenta prosedyren for andre hetteglass.
- Homogenize (Pipetter opp og ned et par ganger til resuspend cellene i RPE medium) og tar 10 µL av cellen løsningen og overføre den til en 1,5 mL tube. Legge til 10 µL av trypan blå. Sted 15 µL av denne løsningen i en telling kammer, deretter antall levedyktige cellers (ikke farget i blått) under et mikroskop med en 4 X-målet. Gjenta prosedyren for andre hetteglass.
- I mellomtiden sentrifuge 15 mL rørene på 110 x g for 5 min. Forkast nedbryting og resuspend cellene på 700.000 celler/mL.
-
Såing av netthinnens pigment epitel celler i menneskelig amniotic membraner
- Fjerne 12-vel platen inneholder membraner settefiskanlegg.
- Sug opp PBS. Legg til 500 µL av cellen suspensjon i trinn 4.1.4 i midten av kultur sette. Legg 1 mL av RPE medium utenfor kultur innsatsen (innenfor brønnen). Gjenta for andre membraner.
- Plass 12-vel platen inneholder membraner i inkubator.
5. vedlikehold av netthinnens Pigment epitel cellekulturer på menneskelig Amniotic membraner
- Fornye mediet 2 x per uke, vanligvis på mandag og fredag, før minst dag 30 av kulturen.
- Sug opp mediet i og utenfor kultur innsatsen for hver brønn og fornye den med ferske medium (1 mL utenfor kultur innsatsen og 500 µL inne). Plass platen i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2.
6. forberedelse av netthinnens Pigment epitel oppdateringen for transplantasjon
Merk: Starter på dag 30 av kultur, er vevet klar for transplantasjon.
- Varm 8% gelatin løsningen i et vannbad ved 37 ° C i 30 min. fylle det indre kammeret i vibratome med kaldt CO2-uavhengig medium (på 4 ° C).
-
Plass 20% gelatin blokken i vibratome.
- Ta 6 cm kultur parabolen inneholder blokken av 20% fra kjøleskapet. Bruker en skalpell, klippe ut en 5 cm x 5 cm blokk. Lim inn oversiden av blokken støtte med cyanoacrylate lim eller tilsvarende.
- Plass et nytt blad i vibratome.
- Justere nivået på blokken før det er på samme nivå av razor blad.
- Badet rundt støtte fylles med fersk CO2-uavhengig medium på 4 ° C. Skjær Blokken med vibratome bruker en middels hastighet til blokken er kuttet jevnt, fører til en glatt overflate. Angi plasseringen 0.
- Sug opp mediet rundt blokken av før det er helt tørt, og deretter ta 12-vel kultur plate inneholder vev settefiskanlegg på 37 ° C.
- Ved hjelp av pinsett, nøye åpne kultur innsatsen på toppen av gelatin blokken. Klipp, med saks, alle deler av membraner som ikke inneholder celler (utenfor ringen der cellene ikke ble kultivert). Sug opp hele gjenværende medium.
- Legge 1 mL av flytende 8% gelatin løsning på 37 ° C for å dekke membraner. Nøye fjerne overflødig. Vent 5-8 min å tillate gelatin å stivne.
- Legge fersk CO2-uavhengig medium (på 4 ° C) til badet til membranen dekkes.
- Klipp, med vibratome på en posisjon på-100 µm, med en middels hastighet, gjenværende oppmerksom på virkemåten på blokken. På slutten av avsnittet, være nøye med å opprettholde retningen av vev.
- Med en skalpell, kuttet et hjørne for å identifisere retningen for avsnittet.
- Samle membranen innebygd i gelatin med en slikkepott, og plassere den i en 6-vel plate fylt med bevaring middels på 4 ° C, inntil pode det inn i mottakeren øyet.
- På tidspunktet for transplantasjon, justere størrelsen på protesen størrelsen på mottakerens øyet under kirurgisk mikroskop (1 – 3 for rotter, 10-15 mm2 for ikke-menneskelige primater).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skinker inneholder en epiteliale lag som skal fjernes før Såing av RPE celler. En enzymatisk behandling av membranen utføres med thermolysin under risting. For ikke å ikke miste polariteten til membranen (epitel er på en side), det er løst på en støtte som komposisjon kan være forskjellig avhengig av leverandøren (figur 1A). Sjekk vedheft av membranen til sin støtte på dette trinnet og legge til utklipp om nødvendig. Ved fiksering i sette inn kultur, arbeid forsiktig for å unngå å lage hull i membranen og holde polaritet med kjelleren membranen vendt opp (figur 1B). Når cellene er seeded på membraner, de kunne flykte fra disse hullene og siste celle konsentrasjonen reduseres. Tilstedeværelsen av hullene kan visualiseres under mikroskop eller ved å legge PBS inne kultur innsatsen og sjekke hvis PBS lekker. Noen membran med hull skal kasseres.
Etter fiksering på kultur innsatsen er tilstedeværelsen av gjenværende celler i en fase kontrast mikroskop evaluerte (tall 1 c og 1 D). Klassisk, noen døde celler kan forblir på overflaten av membranen, men disse cellene vil bli eliminert når kultur medium endres (figur 1 c). Fiber av kjelleren membranen kan sees på en høyere forstørrelse (figur 1 d) hvis ingen celler forblir. Hvis det ikke er tilfelle, kan tidspunktet for inkubering med thermolysin justeres.
I dagene etter såing av RPE celler, sjekk hvis cellene følge. Avhengig av mikroskopet brukes, kan det være vanskelig å se klart cellene i løpet av de første ukene, men hvis cellene ikke holder seg, cellene vil bli sett flyter rundt i celle kultur medium. Når epitel dannes og begynner å modnes, blir det lettere å se det under et mikroskop (tall 2A, 2Bog 2 C). På 3 uker danner cellene en komplett monolayer epitel typisk for RPE (brosteinsbelagte organisasjon). Etter 4 uker er epitel nok modne for sin forberedelse for implantasjon (figur 2D). Imidlertid kan det holdes i kultur for uker for logistisk grunner.
Utarbeidelse av graftet for implantasjon er beskrevet i Figur 3. Sug opp alle overflødig celle kultur medium på apposition av membranen til 20% gelatin blokken. Dette trinnet er viktig, som alle gjenværende medium kan utelukke vedheft av 8% gelatin i RPE og membranen. Faktisk vil mediet danne en film av væske mellom lagene i gelatin.
Gelatin brukes for innebygging av implantatet kan være en varierende styrke, avhengig av Bloom indeksen (dvs.en kvalitetskontroll test, utført og gitt av leverandører, som vurderer styrken av en gel på en standardisert temperatur og konsentrasjon). Hvis gelatin brukes ikke stivt nok og disaggregates under den pode, bør gelatin brukes referansen endres til en annen med en høyere styrke. Konsentrasjonen av gelatin kan også endres, basert på eksperimentering, justere sin styrke og elastisitet.
Figur 1: representant bilder av hAM før og etter thermolysin behandling og fiksering på en kultur sett. (A) representativt bilde av en membran levert av en vev bank. (B) representativt bilde av en membran fast på en kultur setter. (C) representativt bilde av en membran behandlet med thermolysin på en lav forstørrelse. (D) representativt bilde av en membran behandlet med thermolysin på en høy forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant bilder av hAM på seeding RPE cellene. (A) representativt bilde av membranen før såing. (B og C) representant bilder av RPE celler i membraner i 3 uker etter seeding. Membranen kan ikke være helt ut som i panelet C. Skala bar = 100 µm (C), 20 µm for forstørrelsen. (D) representativt bilde RPE cellene i en membran for 30 dager etter såing, tilsvarer da bygge dem inn i gelatin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: plan som beskriver de sekvensielle trinnene for inkludering av konstruert netthinnen vev som inneholder RPE celle laget på hAM i en gelatin film. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskrev en metode for kultur RPE celler på en biologisk stillaset og sin forberedelse til implantering i dyremodeller. En av de avgjørende skritt av protokollen er vedlikehold av retningen på hAM hele prosedyren til inkludering i gelatin. Faktisk innfødt epitel i membranen er fjernet og dens kjelleren membranen blir eksponert9. RPE cellene må være seeded på denne kjelleren membranen. Ved forberedelse til gelatin innebygging, er det avgjørende å jobbe med alle produkter på definerte temperaturen. Faktisk har gelatin egenskapen å være stiv 4 ° C og væske kroppen temperatur (37 ° C)9. Hvis temperaturen ikke er respektert, kan gelatin stivne eller flytende i et trinn der denne effekten ikke er ønskelig.
Flere biologiske stillasene er foreslått, som Descemets membraner25 eller hAMs26. Spesielt ble skinker, fra et keisersnitt27, vist for å være godt tolerert i feltet subretinal, forårsaker begrenset betennelse og redusere choroidal neovascularization26. Membranen støtter vellykket kulturen av menneskelig RPE celler9,28. Videre har disse membranene også en lang historie i klinikker29, noe som gjør dem velegnet for en stillas for RPE cellen terapi. Andre biologiske støtter kunne implementeres enkelt med denne protokollen. Syntetisk stillaser basert på polymer er allerede stiv og kan ikke trenger en gelatin innebygging før implantasjon13,30,31,32,33. Andre systemer for implantasjon er nylig utviklet for subretinal levering i det menneskelige øyet av en hESC-avledet RPE monolayer på en rigid polyester stillaset34 eller en syntetisk parylene substrat designet for å etterligne Bruchs membran35 . Selv om disse strategiene er lovende, tror vi at biologiske stillaser kan gi den beste plattformen for RPE vev engineering.
I denne protokollen, var seeded RPE celler avledet fra human ES celler med en spontan differensiering metode. Men ulike typer RPE celler kan brukes, enten differensiert fra menneskelige indusert pluripotent stamceller eller primære RPE celler Hentet fra levningene eller fra en RPE celle linje19,36,37, 38. Dessuten, hvis bruker pluripotent stamceller, flere protokoller ble utviklet i de siste årene å få RPE cellene basert på en spontan differensiering eller bruke små molekyler for å veilede differensiering18,22. RPE celler fra disse forskjellige differensiering protokollene kan også brukes med denne metoden for tissue engineering.
En grense på denne metoden er stabilitet av innebygde vev på 4 ° C. Det er inkludert i gelatin like før forsendelsen til området kirurgi, må det opprettholdes ved denne temperaturen til engraftment. I den sammenhengen skal operasjoner utføres innen 48 timer.
Denne metoden kan enkelt overføres til klinikken. RPE vevet i gelatin er konservert ved 4 ° C i CO2-uavhengig medium. Dette mediet kan erstattes, om nødvendig med andre allerede godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for bevaring av hornhinner evaluering og som brukes for transplantasjoner i mennesker. Vi vist effektiviteten av denne strategien for transplantasjon i en proof-of-concept studie i gnager modeller9og vi er for tiden validere kirurgisk tilnærming i ikke-menneskelige primater før det implementeres for en klinisk studie å behandle pasienter med bestemte former for RP påvirker RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Olivier Goureau venter oppfinner på patenter relatert til generasjon av netthinnen celler fra menneskelige pluripotent stamceller. Andre forfattere ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Jérôme Larghero og Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, Frankrike) for innspill deres under oppbyggingen av metoden beskrevet her.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Recherche Médicale [Bio-engineering program - DBS20140930777] og LABEX GJENOPPLIVE [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau og Christelle Monville. Det ble støttet av NeurATRIS, en translasjonsforskning infrastruktur (Investissements d'Avenir) for biotherapies i nevrovitenskap [ANR-11-INBS-0011] og INGESTEM, den nasjonale infrastrukturen (Investissements d'Avenir) engineering for pluripotent og differensiert stamceller [ANR-11-INBS-000] til Christelle Monville. Karim Ben M'Barek ble støttet av stipend fra DIM Stempole og LABEX GJENOPPLIVE [ANR-10-LABX-73]. -Stammen er en del av Biotherapies Institutt for sjeldne sykdommer støttes av Association Française contre les Myopathies (AFM)-Téléthon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250 mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1x (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100x) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
