Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

Summary

Réglementation de l’environnement de la chromatine est un processus essentiel nécessaire pour l’expression des gènes appropriés. Nous décrivons ici une méthode pour contrôler l’expression des gènes par le recrutement de modificateurs de la chromatine machines de façon gène-spécifique et réversible.

Abstract

Régulation de la compaction de la chromatine est un processus important qui régit l’expression des gènes chez les eucaryotes supérieurs. Bien que la compaction de la chromatine et la régulation de l’expression génique sont souvent perturbés dans de nombreuses maladies, une méthode spécifiques d’un locus, endogène et réversible pour étudier et contrôler ces mécanismes d’action a fait défaut. Pour résoudre ce problème, nous avons développé et caractérisé les nouvelles molécules bifonctionnelles régulation génique. Un composant de la molécule bifonctionnel se lie à un point d’ancrage de l’ADN-protéines afin qu’il sera recruté à un locus de l’allèle spécifique. L’autre composante engage les endogène machinerie modifiant la chromatine cellulaire, recrutement de ces protéines à un gène d’intérêt. Ces petites molécules, appelées modificateurs chimiques d’épigénétiques (CEMs), sont capables de contrôler l’expression des gènes et l’environnement de la chromatine de façon dose-dépendante et réversible. Nous détaillons ici, une approche CEM et sa demande visant à diminuer l’expression génique et l’acétylation des histones queue à un journaliste de la protéine fluorescente verte (GFP) situé sur le locus Oct4 dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). Nous caractérisons les devants CEM (CEM23) à l’aide de la microscopie de fluorescence, cytométrie en flux et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), suivie d’une PCR quantitative (qPCR). Bien que la puissance de ce système est démontrée au locus Oct4 , sur le plan conceptuel, la technologie CEM est modulaire et peut être appliquée dans d’autres types cellulaires et autres locus génomiques.

Introduction

La chromatine est composée d’ADN enroulé autour des octamère d’histones qui forment la particule nucleosome de noyau. Régulation de la compaction de la chromatine est un mécanisme essentiel pour bon ADN réparation, réplication et expression^1,2,3. Une façon dans lequel les cellules contrôlent le niveau de compactage est par le biais de l’ajout ou la suppression de diverses modifications de queue post-traductionnelles histone. Deux adaptations incluent l’acétylation lysine (1), qui est plus communément associée à l’activation de gènes, et la méthylation de la lysine (2), qui peut être associée à l’activation de gènes ou de répression, selon le contexte de l’acide aminé. L’ajout des marques acétylation et méthylation est catalysée par les histones acétyltransférases (chapeaux) et histone methyltransferases (HMTs), respectivement, alors que la suppression de la marque se faite par les histones désacétylases (HDAC) et histone déméthylases (HDMs ), respectivement de^4,5. Bien que l’existence de ces protéines est connu depuis des décennies, bon nombre de mécanismes de machines modifiant la chromatine comment fonctionne à réguler correctement l’expression génique reste à définir. Étant donné que le processus de réglementation de la chromatine sont dysrégulation dans plusieurs maladies humaines, nouvelles perspicacités mécanistes pourraient conduire à des applications thérapeutiques futures.

La chromatine essai in vivo avec (CiA) est une technique récemment décrite qui utilise un inducteur chimique de proximité (CIP) pour contrôler le recrutement de machines modifiant la chromatine à un locus spécifique⁶. Cette technologie a été utilisée pour étudier une liste croissante de la dynamique de la chromatine, y compris la modification des histones des protéines, des rénovateurs de la chromatine et facteurs de transcription^6,7,8,9. Axée sur le pic de la chromatine attacher des protéines exprimées de façon exogène a également été étendue au-delà de CiA pour moduler les loci génétiques non modifiés par usage avec une protéine associée à la cluster régulièrement entrecoupées court palindromique répète CRISPR-désactivée (dCas9) ^{10 , 11}. dans le système de la CiA, les mESCs ont été modifiés pour exprimer un gène rapporteur GFP au locus Oct4 , une zone fortement exprimée et strictement réglementé du génome mESC. Auparavant, ce système a été appliqué pour décrire le recrutement réversible et dose-dépendante de protéine de l’hétérochromatine exogène expresse 1 (HP1), une enzyme qui lie H3K9me3 et propage répressifs marques (par exemple, H3K9me3) et l’ADN ⁶de méthylation. Pour accomplir ce type de stratégie de recrutement, les mESCs sont infectés par un plasmide qui exprime une protéine liant le FK506 (FKBP) liée à un Gal4, qui est un point d’ancrage d’ADN-protéine qui se lie à un tableau de Gal4-liaison en amont du reporter GFP. Les cellules sont également infectés par un domaine de liaison FKBP-rapamycine (FRB) connecté à HP1. Lorsque les mESCs sont exposés à des concentrations nanomolaires faible du pic, la rapamycine, FRB tant FKBP, sont réunis au locus de la cible. Quelques jours après traitement de la rapamycine, l’expression du gène cible est réprimée, comme en témoigne la fluorescence microscopie et écoulement cytometry et l’acétylation des histones est diminuée, ce qui témoigne de la puce et le séquençage de bisulfite. Le développement et la validation de cette approche ont eu des avancées significatives dans le domaine de la recherche de la chromatine et la réglementation, un inconvénient est l’expression exogène nécessaire modification de la chromatine machines.

Pour rendre la technologie basée sur le recrutement de seulement des enzymes endogènes physiologiquement pertinents et faire un système plus modulaire, nous avons conçu et caractérisé les nouvelles molécules bifonctionnelles, appelés CEMs (Figure 1)¹². Une des composantes des CEMs comprennent FK506 qui, semblable à la rapamycine, lie étroitement et spécifiquement à FKBP. Ainsi, la SCE est encore recrutés au locus Oct4 dans les mESCs CiA. L’autre composante de la SCE est une fraction qui lie endogène machines modifiant la chromatine. Dans une étude pilote, nous avons testé les CEMs qui contiennent des inhibiteurs d’HDAC. Alors que le concept d’employer un inhibiteur pour recruter des HDACs semble contre-intuitif, l’inhibiteur est néanmoins capable de recruter activité HDAC pour le gène d’intérêt. Ceci est accompli en (1) redirigeant le HDAC au locus, libérant l’enzyme et augmentant la densité des HDACs non inhibés dans la région et l’inhibition d’HDAC (2) maintien au locus, mais recrutement complexes répressives qui se lient à l’HDAC inhibés, ou (3) une combinaison des deux. Dans une étude précédente, nous avons montré que la SCE était capables de réprimer avec succès le reporter GFP de façon dose - et dépendant du temps, ainsi que d’une manière qui a été rapidement réversible (c.-à-d., dans les 24 heures)¹². Nous avons caractérisé la capacité de la technologie CEM présentée ici à l’expression de gène de contrôle à l’aide de la microscopie en fluorescence, cytométrie en flux et la capacité de contrôler l’environnement de la chromatine à l’aide de la puce-qPCR⁶. Nous décrivons ici une méthode pour l’utilisation et de caractériser les CEMs, qui faciliteront l’adaptation de ce système pour répondre à des questions liées à la biologie de la chromatine.

Protocol

1) la Culture de cellules ligne de production de Lentivirus

1. Croissance fraîche, passage bas (moins de passage 30) cellules humaines embryonnaires de rein (HEK) 293 t en haut-glucose Dulbecco modifiée Eagle de médias de base moyen (DMEM) additionné de 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 10 mM HEPES, 1 x des acides aminés non essentiels (NEAA), Pen / STREP, 2-mercaptoenthanol dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO₂. Fractionner les cellules tous les 3-5 jours et avant qu’ils deviennent > 95 % anastomosé.
2. Le passage des cellules HEK 293 t avec 18 x 10⁶ par plaque de 15 cm (une plaque de 15 cm pour chaque virus produite).
   1. Pour un format de 15 cm, aspirer les anciens médias, ajouter 10 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), aspirer le PBS et ajouter 3 mL de trypsine de 0,05 %. Incuber les cellules en trypsine pendant 8 min à 37 ° C, à bascule et en tapant les cellules au milieu de l’incubation.
      Remarque : L’objectif de cette étape est d’obtenir des cellules dans une suspension de cellules individuelles.
3. Lorsque les cellules ont atteint 60 à 80 % confluence le lendemain, effectuer une transfection polyéthylènimine (PEI) avec 13,5 µg le plasmide psPAX2, 4,5 µg du plasmide pMD2.G, 18 µg de vecteur lentiviral compatible livraison avec le gène d’intérêt (par exemple , FKBP-Gal4), 108 µL de PEI et 1,8 mL de médias de transfection.
   1. Doucement mélanger l’ADN, PEI et médias de transfection dans un tube conique de 15 mL, incuber les échantillons à la température ambiante pendant 15 minutes et ajouter goutte à goutte à la plaque de 15 cm.
      NOTE : Veuillez utiliser appropriée de sécurité mesure et suivre toutes les institutions et procédures de sécurité de laboratoire après cette étape, comme tous les réactifs contiendra un virus vivant.
4. Après 16 h de la transfection et l’incubation dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO₂, aspirer les médias et ajouter doucement les supports HEK 293 neufs (préchauffés dans un bain-marie à 37 ° C) pour les plaques de 15 cm. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO₂ pendant 48 h après que les médias changent. Le virus est alors prêt à être récolté.

2) infection de la souris les cellules souches embryonnaires (mESC) avec Lentivirus

1. Croître le passage bas (moins de passage 35), exempte d’alimentation adaptée CiA mESCs médias base de DMEM haute-glucose additionné de 20 % ESC-grade FBS, 10 mM HEPES, inhibiteur de la leucémie x NEAA, le Pen/streptocoque, 2-mercaptoenthanol et 1/500 1 facteur (FRV) dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % CO₂.
   Remarque : Le FRV est obtenu à partir du surnageant des cellules COS FRV-productrices, qui sont recueillis dans le lot et congelés à-80 ° C.
   1. La croissance de cellules sur des plaques qui ont été préincubées pendant 1 à 3 h avec 0,1 % de gélatine dans 1 x PBS et ensuite lavés avec du PBS 1 x. Nourrir les cellules de tous les jours et les diviser chaque 2-3 d, en fonction de leur densité.
      Remarque : Morphologiquement, colonies de cellules souches embryonnaires (ES) doivent être petite, ronde et distincts les uns des autres.
2. Le passage des mESC vers un format de 12 puits plat (100 000 cellules/puits) 1D avant l’infection.
   1. Compter les cellules avec un hémocytomètre. Pour les cellules cultivées dans un format de 10 cm, aspirer les anciens médias, ajouter 5 mL de PBS 1 x, aspirer le PBS et ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine. Incuber les cellules en trypsine pendant 8 min à 37 ° C, à bascule et en tapant les cellules au milieu de l’incubation. L’objectif de cette étape est d’obtenir des cellules dans une suspension de cellules individuelles.
3. 48 h après avoir changé les médias de la 293T15-MC virale emballage des cellules de l’étape 1.4, retirer et transférer le surnageant dans un tube conique de 50 mL.
4. Centrifuger le surnageant à 300 x g pendant 5 min granuler les débris cellulaires.
5. Filtrer le surnageant à travers une membrane de 0,45 µm.
   Remarque : Assurez-vous d’utiliser des membranes d’acétate de cellulose exempte d’agent tensio-actif (SFCA), comme certains autres matériaux peut conserver le virus et réduire considérablement les rendements.
6. Concentrer le virus avec l’ultracentrifugation, en utilisant une centrifugeuse avec un rotor de SW32 et de le tourner à 20 000 tr/min (~ 72 000 x g) pendant 2,5 heures à 4 ° C.
7. Alors que le virus se concentre en vertu de l’ultracentrifugation, traiter les mESCs CiA dans la plaque de 12 puits avec supports ES neufs contenant 5 µg/mL de polybrene.
8. Lorsque la concentration de virus est terminée, soigneusement aspirer le surnageant et suspendre le culot de virus dans 100 µL de PBS 1 x (éviter les bulles d’excès).
9. Ajouter le virus et solution 1 PBS x à un tube à centrifuger de 1,5 mL. Vortex/secouer le tube à 300 x g (ou au réglage plus bas) à suspendre complètement le virus. Tournez en bas le tube dans une centrifugeuse de table Mini pour 5-10 s enlever les bulles.
10. Ajouter 30 µL du virus dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. Agiter la plaque et puis centrifuger la plaque à 1 000 x g pendant 20 min.
    Remarque : La quantité de virus ajouté peut varier selon le titre viral, qui est inversement proportionnelle à la taille de construction livraison.
    1. Par ailleurs, flash geler le virus à l’azote liquide et conserver à-80 ° C. Toutefois, le virus de congélation s’abaissera le titre viral.
11. Replacez la plaque de 12 puits dans l’incubateur à 37 ° C et changer les médias le lendemain matin (~ 16 h) plus tard avec les supports neufs ES (comme indiqué au point 2.1).
12. Après 48 h d’infection, sélectionnez les cellules qui ont intégré le plasmide viral en ajoutant l’antibiotique approprié (par exemple, 1,5 µg/mL de puromycine, 10 µg/mL de blasticidine, etc.). Modifier les médias tous les jours et laver les cellules avec du PBS 1 x si une majorité des cellules est flottant/morts. Garder les médias de sélection sur les cellules pour les 72-96 h dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO₂.

3) traitement et préparation s chimique modificateurs épigénétique (CEM)

1. Suspendre le CEM en poudre dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration stock de 1 mM et une concentration de travail de 100 µM.
2. Après que les cellules ont subi la sélection pour les 72-96 h, diviser les mESCs en un format de 12 puits avec 100 000 cellules/puits. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C pendant 24 h. avec 5 % de CO₂ par la suite, préparer une solution de médias de 100 nM CEM avec médias ES. Ce support permet de nourrir le mESC CiA avec 1 mL/ainsi. Pour servir en tant que contrôle, gardez un puits des cellules sans aucun ajoutés CEMs.
   1. Changer les médias en aspirant les anciens médias et en ajoutant 1 mL/bien des médias fraîchement préparée de ES exempt de CEM ou de CEM contenant toutes les 24 h pour la durée de l’expérience.

4) analyse de l’Expression par microscopie et cytométrie en flux

1. Après 48 heures de traitement CEM, image les cellules sans traitement de CEM et les cellules traitées avec 100 nM CEM à l’aide d’un microscope à fluorescence. Prenez des images représentatives à l’aide de phase ou fond clair pour enregistrer la morphologie mESC grossissement X 20 ; les cellules doivent ont formé des colonies rondes, avec peu de cellules différencié. Sous la manche de fluorescence FITC, image les deux conditions de la cellule.
2. Isoler le contrôle et les cellules traitées au CEM pour cytométrie en aspirant les médias, laver les cellules avec 1 mL de solution 1 PBS x, aspirer le PBS et l’ajout de 0,25 mL de 0,25 % de trypsine avec EDTA pour 8-10 min.
3. Confirmer que les cellules ne sont plus en grosses touffes en examinant au microscope. Utiliser un grossissement de X 20. Si les cellules ne semblent pas être dans une suspension de cellules individuelles, Pipetez doucement verticalement avec une pipette de P1000 pour trypsinize pleinement les cellules.
4. Étancher la trypsine avec 1 mL de supports neufs et remettre en suspension les cellules à haute vitesse avec une pipette sérologique (ou à l’aide d’une pipette P1000 et pointe) jusqu'à ce que les cellules sont en suspension monocellulaire.
5. Tournez en bas des cellules à 300 g pendant 5 min. aspirer le surnageant. Laver avec du PBS 1 x et recentrifuge les cellules. Aspirer le surnageant de PBS.
6. Resuspendre le culot dans 200 mL de tampon de FACS (l’acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA] de 1 mM, 1 x PBS et 0,2 % d’albumine sérique bovine [BSA]).
   1. Le volume total de FACS tampon sera tributaire de combien de cellules est présents, mais la concentration doit être de 1 000-3 000 cellules / µL. compter le nombre de cellules dans 3 échantillons et la concentration des cellules en moyenne. Ajouter plus de FACS tampon si nécessaire.
7. Effectuer l’écoulement cytometry sur > 50 000 cellules avec les cellules en suspension, gardant les cellules sur la glace lorsqu’ils ne sont pas analysés. Utiliser un filtre de 530/40 (FITC, AF488, GFP, etc.) pour enregistrer les modifications dans l’expression. Déterminer la tension fluorescente appropriée à l’aide d’un échantillon de cellules témoins non traités et régler la tension de faire le pic fluorescent dans le milieu du spectre d’intensité enregistrée. Rouler les échantillons à une vitesse de gaine d’environ 5 000 cellules/s.
8. Exporter les données et analysez les fichiers FCS sur un programme de cytométrie de flux (p. ex., FlowJo) en bloquant tout d’abord sur nuages de points avant vs côté nuages de points pour des cellules vivantes, puis sur nuages de points avant hauteur vs zone pour maillots de corps. Puis, visualiser les données de canal GFP sur un histogramme pour déterminer l’expression de la GFP relative dans la cible et de contrôler les populations.

5) analyse de la chromatine de chromatine immunoprécipitation (ChIP) suivi par qPCR

1. Diviser les mESCs en une plaque de 10 cm avec 3 millions de cellules et 10 mL de médias ES (une plaque de 10 cm pour chaque expérimentale ou contrôler la condition). Le lendemain, ajouter 10 mL de médias contenant du CEM ou sans CEM. Après 48 heures de traitement CEM, aspirer les anciens médias. Laver et aspirer les cellules avec 5 mL de solution 1 PBS x. Ensuite, se dissocient les cellules avec 0,25 % de trypsine et étancher la trypsine avec 10 mL de médias ES. Compter et isoler un échantillon de 10 millions de cellules par l’État.
2. Tournez en bas de chacun des échantillons de 10 millions de cellules à 300 g pendant 5 min.
3. Resuspendre chaque culot dans 10 mL de solution 1 PBS x et recentrifuge les cellules à 300 g pendant 5 min.
4. Resuspendre chaque culot dans 10 mL de tampon de CiA Fix (50 mM de pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM ethylene glycol-bis [ß-aminoéthyl éther]-N, N, N', N'-tétraacétique acide [EGTA] pH 8 et 100 mM de chlorure de sodium [NaCl]). Ajouter 1 mL de solution de formaldéhyde de 11 % et immédiatement inverser les échantillons 5 x - 10 x. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 10 min.
5. Ajouter 0,5 mL de glycine de 2,5 M. Inverser les échantillons immédiatement et incuber l’échantillon sur la glace pendant 5 min.
6. Centrifuger l’échantillon à 1 200 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant.
7. Resuspendre le culot dans 10 mL de CiA rinçage 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10 % de glycérol, 0,5 % Nonidet P-40 [NP40] et 0,25 % Triton X100). Incuber l’échantillon sur la glace pendant 10 min. il centrifuger à 1 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
8. Resuspendre le culot dans 10 mL de CiA rinçage 2 (10 mM tris [hydroxyméthyl] aminométhane [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM EGTA pH 8 et 200 mM NaCl). Centrifuger l’échantillon à 1 200 x g pendant 5 min à 4 ° C.
9. Doucement, ajouter 5 mL de CiA cisaillement tampon (0.1 % SDS, EDTA 1 mM et 10 mM Tris pH 8) le long des côtés du tube conique à laver tout sel sans perturber le culot. Centrifuger l’échantillon à 1 200 x g pendant 3 min à 4 ° C. Répétez l’étape de lavage.
10. Resuspendre le culot dans 90 µL de tampon de cisaillement de CiA et inhibiteurs de la protéase fraîches (utilisez un mélange de leupeptine, chymostatine et pepstatine A dissous ensemble à 10mg/mL chacun dans le DMSO pour faire un 1 000 x solution mère, faisant une concentration finale de 10 µg/mL). Ajouter 10 µL d’améliorant la sonication nanodroplets tout en gardant tout sur glace^13,14.
11. Transférer 100 µL de la solution dans un tube de verre et le capuchon du tube.
12. Laisser agir les échantillons pendant 3,5 min (déterminé basé sur la lignée cellulaire et le nombre de cellules). Pour éviter une surchauffe des échantillons, traiter les échantillons dans les temps de cycle 2-min-maximum, si le temps total de sonication est supérieure à 2 min.
    Remarque : L’ultrasonicator ciblé ici les fonctions utilisées à haute fréquence (500 kHz). Faire fonctionner la machine à une puissance acoustique de 55 w. La durée de la sonication devrait être prédéterminée par chaque laboratoire individuel.
13. Transférer chaque échantillon de chromatine aux ultrasons dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Faites tourner les tubes à 8 000 x g pendant 2 min à 4 ° C.
14. Pour analyser l’efficacité de cisaillement et afin de quantifier la quantité relative de la chromatine, suivre le protocole du fabricant kit puce.
    NOTE : Déterminer la concentration d’ADN par spectrophotométrie (p. ex., à l’aide d’un instrument de nanodrop ADN), et exécutez ~ 200 ng d’ADN sur un gel d’agarose de 1 % afin de vérifier que la chromatine est sonication à environ 200-500 basepairs (bp) dans la taille.
15. Pour effectuer l’immunoprécipitation et isoler la chromatine, suivre le protocole du fabricant kit puce.
    Remarque : Pour l’immunoprécipitation des échantillons avec des concentrations plus élevées de l’ADN, réchauffer le tampon d’élution à 37 ° C et éluer les échantillons 2 x 30 µL de tampon d’élution (filature pendant 1 min chaque fois).
16. Pour effectuer le qPCR, charger les réactifs dans une plaque 384 puits. Ajouter 5 µL de 2 x mélange principal de colorant cyanine asymétriques, 2,5 µM de chaque amorce, d’eau et 0,1 - 10 ng d’ADN de chaque réaction.
    1. Conception des amorces pour amplifier les amplicons bp 50-100 et les valeurs de CT sont normalisées à un gène de ménager, particules de type A intracisternale (IAP).
       Remarque : Outre les méthodes qPCR, consultez Protocole du fabricant de la trousse. Les amorces utilisées pour cibler le locus Oct4 était : CACATGAAGCAGCACGACTT (F) ; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. A l’amorce du contrôle la valeur utilisée pour cible IAP : ATTTCGCCTAGGACGTGTCA (F) ; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. Basé sur les amorces et le produit désiré, exécutez le qPCR avec 40 cycles d’une température de recuit de 60 ° C pendant 1 min.
       NOTE : Les données qui en résulte a été dosées en utilisant les delta-delta Ct des comparaisons entre les échantillons avec CiA:Oct4 normalisé sur IAP. Les résultats de la dernière analyse sont affichés moyennes des échantillons expérimentaux en triple, avec l’erreur représenté comme l’écart-type de la moyenne.

Representative Results

Nous avons récemment développé CEMs et a démontré que cette technologie peut être appliquée pour réguler l’expression des gènes et l’environnement de la chromatine dans un locus de journaliste de manière dose-dépendante et réversible. Dans la Figure 1, un modèle du plomb CEM, CEM23, est montré. Machines d’HDAC est recruté au locus du journaliste par l’inhibiteur d’HDAC qui, dans ce cas, est le journaliste GFP inséré au locus Oct4 .

Nous avons cherché à caractériser le système SCE au locus Oct4 dans CiA mESCs. Parce que les cellules expriment GFP, il était possible de visualiser rapidement l’expression de la journaliste avec la microscopie de fluorescence. Les cellules ont été imagées après 48 heures de traitement avec 100 nM des CEM23, ainsi que de cellules non traitées. Les images de phase montrent mESCs sain, qui est important parce qu’il est malsain ou différenciée mESCs indiquerait une répression de GFP non spécifiques. Les images de fluorescence montrent une expression de la GFP lumineuse dans les cellules de contrôle et une expression réduite de la GFP dans mESCs traités avec CEM23. Images représentatives sont affichés dans la Figure 2.

Afin de quantifier les changements dans l’expression de la GFP, cytométrie en flux a été utilisée. Encore une fois, les CiA mESCs ont été traités avec 100 nM des CEM23 pendant 48 heures. Experimental cellules traitées avec des cellules CEM23 et de contrôle ont été préparés pour la cytométrie en flux, à l’aide de > 100 000 cellules par exemple. Régulièrement, nous avons observé un > 30 % diminue dans les cellules exprimant le GFP parmi ceux traités par SCE. Un histogramme représentant est illustré à la Figure 3.

Une fois que la diminution d’expression de gène induite par le CEM GFP a été en évidence, nous avons testé des changements dans l’environnement de la chromatine à l’aide de la puce. Un facteur important pour la préparation des échantillons pour la puce est l’étendue de la sonication de chromatine. Pour avoir les échantillons comme cohérente et cisaillé correctement que possible, 10 millions de cellules ont été sonication pendant 3,5 minutes afin d’obtenir la chromatine entre 200 et 500 bp en taille (Figure 4). Parce que nous l’hypothèse que les CEMs répressives étaient liant à et recruter des protéines HDAC et répressives complexes à la journaliste, nous avons testé des modifications dans l’acétylation des histones queue. L’acétylation des histones 3 Lysine 27 (H3K27ac) se trouve généralement sur le site d’initiation transcriptionnelle (TSS) de gènes. Nous avons effectué des copeaux avec un anticorps pour H3K27ac et puis effectué un qPCR avec amorces en amont et en aval du TSS. Les résultats montrent qu’un traitement de 48 h avec 100 nM de CEM23 diminue le niveau de H3K27ac du locus cible comparativement aux cellules témoins non traités avec CEMs (p < 0,01, de l’étudiant à deux t-test avec trois biologiques réplique, Figure 5).

Figure 1 : SCE se lie à la CiA:Oct4 locus par le biais de recrutement visant les mécanismes épigénétiques endogène FKBP et sangle. Le modèle du système SCE montre Gal4-FKBP comme l’ancre de l’ADN-protéine. La portion FK506 du CEM se lie à la FKBP et l’inhibiteur d’HDAC recrute des protéines HDAC endogènes pour réprimer les GFP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 2 : Images de fluorescence des cellules de tige embryonnaires souris (mESCs) avec un CiA:Oct4 Reporter GFP-. Images de microscopie de fluorescence montrent une diminution de l’expression de la GFP par traitement de CEM. Le panneau supérieur montre phase et images fluorescentes de mESCs cultivé avec des médias non traitées. Le panneau inférieur montre phase et fluorescentes de la mESCs traités avec 100 nM des CEM23 pendant 48 heures. Les images adaptés avec autorisation d’ACS biologie synthétique¹². Droit d’auteur (2018) American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 3 : Analyse en cytométrie en flux quantitates une expression réduite de GFP dans mESCs CEM23 traitement. mESCs sans CEM23 (bleu) ont été comparés avec les mESCs traités avec 100 nM des CEM23 pendant 48 heures (rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 4 : Sonication de chromatine est uniforme, et un frottis est visible entre 200 et 500 BP. Pour effectuer la puce-qPCR, la chromatine de mESCs était sonication. Chaque échantillon était composé de cellules environ 10 millions, qui ont été soniquées pendant 3,5 minutes, des échantillons de la chromatine de même cisaillé entre 200 et 500 PB. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 5 : CEM23 traitement entraîne une diminution de H3K27ac au locus CiA. Puce-qPCR a été effectuée pour tester des changements dans l’environnement de la chromatine. Après un traitement de 48 h avec 100 nM de CEM23, une diminution de H3K27ac a été observée à CiA:Oct4 (**p < 0,01, de l’étudiant à deux t-test avec trois réplicats biologiques. Les barres d’erreur représentent l’écart-type). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Discussion

Ici, nous avons décrit le système développé récemment de SCE appliqué pour réguler l’expression des gènes et l’environnement de la chromatine à un gène spécifique de manière dose-dépendante. Nous fournissons une méthode précise pour étudier la dynamique impliquée dans la régulation de l’expression des gènes par le recrutement sélectif des protéines régulatrices spécifiques de chromatine endogène. Il s’agit d’une technologie hautement modulaire qui peut être appliquée pour étudier comment les différentes protéines et la chromatine-modificateurs de complexes travaillent de concert pour réguler correctement l’environnement de la chromatine, aussi bien quant à étudier comment ces processus sont dysrégulation, avec la avantage d’atteindre la spécificité de gène.

Ici, trois façons ont été démontrés pour visualiser les changements dans l’expression de structure et gène de la chromatine avec les nouvelles technologies. Après perturbation des loci ciblées spécifiques avec CEMs, modifications en temps réel à l’expression des gènes pourraient être analysées par microscopie de fluorescence. Ensuite, les changements dans les niveaux d’expression de gène pouvaient être mesurés plus quantitativement par cytométrie de flux à des points de terminaison définis. Enfin, les modifications post-traductionnelles marques épigénétiques sur la chromatine ont été examinées par la puce ; plus précisément, dans ce cas, H3K27ac. Nous n’ai pas tester recrutement HDAC avec puce-qPCR en raison de la diversité des HDACs qui agissent de concert pour un seul locus. Il est probable qu’une population hétérogène des enzymes HDAC a été recrutée et il serait donc, techniquement difficile de les tester tous par puce. Dans une œuvre précédemment publiée, nous avons démontré que le recrutement direct de HDAC3 par une fusion de GAL4 causé une activité similaire sur la modification de la chromatine et de l’expression génique par puce¹². Si un journaliste non fluorescent est être modulé, changements dans l’expression des gènes peuvent également être mesurés par (1) l’analyse de l’expression RNA avec le qPCR de transcriptase inverse ou expression de la protéine (2) avec western blot ou cytométrie en imagerie et tenue avec Anticorps secondaires fluorescents.

En ce qui concerne les techniques actuelles axées sur les CIP comme la CiA system¹², cette technologie CEM a l’avantage de recruter des modulateurs épigénétiques endogènes du gène cible. Redirection de la machinerie de la cellule crée un moyen plus physiologiquement pertinent permettant de moduler l’expression. Exogène exprimant des enzymes maîtres, comme les chapeaux et les facteurs de transcription, peut entraîner des effets secondaires de leur augmentation de l’expression, en particulier en ne soient ne pas activement recrutés au locus du gène.

Bien que cet article présente les fonctionnalités de ce nouveau système avec CEMs composés d’inhibiteurs d’HDAC, plusieurs autres inhibiteurs ou des recruteurs de protéine peuvent être synthétisés à la place de l’inhibiteur d’HDAC. Pour obtenir l’activation de gènes, chapeau inhibiteur - ou HDMT axée sur l’inhibiteur de la SCE peut être synthétisé. Pour réprimer et puis surexpriment le gène même, il est possible de traiter les cellules avec un CEM répressif, lavez-les avec supports réguliers et puis ajoutez un activateur CEM. Cela permettrait d’un système propre à étudier la dynamique de recrutement complexes répressifs et activation à la même région génomique. Lors de la conception des futurs CEMs, plusieurs caractéristiques doivent être examinées, y compris la perméabilité cellulaire, inhibiteur de la puissance, structure et cinétique inhibitrice. La longueur de l’éditeur de liens entre FK506 et la portion de recruteur influeront sur la perméabilité de la SCE, ainsi que la position de la protéine recrutée. Lorsqu’on compare deux CEMs qui diffèrent seulement dans la longueur de l’éditeur de liens, le CEM avec l’éditeur de liens plus court a été plus efficace¹². Alors qu’il n’a pas été testé directement ici, l’efficacité plus élevée est le résultat d’une plus grande perméabilité de la cellule. Il est également important de choisir des inhibiteurs avec des structures chimiques susceptibles de modification sans perturber la partie qui se lie au site actif de la cible. La puissance et la spécificité ont également été examinés en sélectionnant des inhibiteurs avec une puissance élevée et une spécificité pour une classe donnée de protéines. La cinétique d’inhibition peut-être influencer l’efficacité des CEMs. SSCE composé des inhibiteurs de la lente marche taux ont tendance à être moins efficace.

Une seule contrainte de la technologie actuelle de la CEM est l’exigence d’un tableau de Gal4-liaison sur le locus du gène cible. Pour recruter SSCE dans une région autre que le locus Oct4 CiA , aucune des centaines de machiné Gal4 lignes activatrice en amont de séquence (UAS) disponibles à la communauté scientifique peut être utilisé. Le régime sera plus modulaire consiste en incorporant un Cas9 désactivé (dCas9) avec enzyme épigénétique chimique recrutement^10,11,15. Cette protéine nucléase-morts du système CRISPR-Cas9 sera toujours recrutée à n’importe quelle région du génome à laquelle vise un ARN guide (gRNA), mais il ne coupe pas l’ADN. À l’aide d’une fusion dCas9-FKBP, la composante FKBP recrutera les CEMs où le dCas9 est recruté, qui augmente considérablement la facilité et la flexibilité des gènes cibles potentiels. Imaginez utiliser cette technologie pour cibler les gènes concernés-maladie comme un potentiel thérapeutique ou un moyen par lequel réversible dans le temps et étudier les mécanismes de la maladie au niveau de la chromatine.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013CV
NEAA	Gibco	11140-050
HEPES (for tissue culture)	Corning	25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol)	Gibco	21985-023
FBS	Atlantic Biologicals	S11550	Individual lots tested for quality
Covaris tubes	ThermoScientific	C4008-632R
Covaris caps	ThermoScientific	C4008-2A
PEI (polyethylenimine)	Polysciences	23966-1
Transfection media (Opti-mem)	Gibco	31985070
Virus centrifuge tubes	Beckman Coulter	344058
Virus filter membrane	Corning	431220
Polybrene	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
0.25 % Trypsin	Gibco	25200-056	with EDTA
0.05 % Trypsin	Gibco	25400-054	with EDTA
Puromycin	InvivoGen	ant-pr
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)	Roche	4913914001
H3K27ac antibody	Abcam	ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit	Active Motif	53040
Sonicator	Covaris	E110
Ultracentrifuge	Optima	XPN-80
SW-32 centrifuge rotor	Beckman Coulter	14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
BSA	Fisher	BP9700
EGTA	Sigma	E3889
EDTA	Fisher	S311-100
NaCl	Fisher	S271-1
Glycerol	Fisher	G33-1
Tris	Fisher	BP152
NP40	Roche	11754599001
Triton	MP Biomedicals	807426
Glycine	Fisher	BP381-500
TE buffer	Fisher	BP2474-1
HEPES (for ChIP)	Fisher	BP310-100
Gelatin	Sigma	G1890
Flow cytometer, Attune NxT	Thermo Fisher	A24858
FKBP-Gal4 plasmid	Addgene	44245
psPAX2 plasmid	Addgene	12260
pMD2.G plasmid	Addgene	12259
Nanodroplets	MegaShear	N/A
DNA Nanodrop	Thermo Fisher	ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin)	Calbiochem/EMD	108975
Protease Inhibitors (Chymostatin)	Calbiochem/EMD	230790
Protease Inhibitors (Pepstatin)	Calbiochem/EMD	516481
CiA:Oct4 mESC	The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells	The kind gift of J. Wysocka