Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

Published: September 20, 2018 doi: 10.3791/58222
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4
1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

Summary

רגולציה של הסביבה כרומטין הוא תהליך חיוני הדרוש עבור ביטוי נאות גנים. כאן, אנו מתארים שיטה לפיקוח על ביטוי גנים דרך הגיוס של שינוי כרומטין מכונות באופן ספציפי ג'ין הפיך.

Abstract

רגולציה של דחיסת כרומטין הוא תהליך חשוב השולט ביטוי גנים פרוקריוטים גבוה יותר. למרות דחיסת כרומטין, הכונה ביטוי נפוץ שיבשו למחלות רבות, יש שהיה חסר שיטה ספציפית לוקוס אנדוגני, הפיך ללמוד ולשלוט מנגנונים אלה של פעולה. כדי לטפל בבעיה זו, יש שפותחה ואנו מאופיין מולקולות bifunctional מווסת הגן הרומן. מרכיב אחד של המולקולה bifunctional מאגד לעוגן חלבון-דנ א. כך זה להיות מגויס של לוקוס אלל ספציפי. הרכיב השני עוסק אנדוגני הסלולר שינוי כרומטין מכונות, מגייס חלבונים אלה אל הגן עניין. אלו מולקולות קטנות, שנקרא מכפילי epigenetic כימי (CEMs), מסוגלים לשלוט ביטוי גנים וסביבה כרומטין באופן תלוי מינון והפיך. כאן, אנו מפרטים בגישה צ'ם ויישומו כדי להקטין את ביטוי גנים והיסטון acetylation זנב-עיתונאי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הממוקמת על לוקוס Oct4 של תאי גזע עובריים בעכבר (mESCs). אנו מאפיינים את ההפניה צ'ם (CEM23) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, cytometry זרימה immunoprecipitation כרומטין (צ'יפ), ואחריו תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR). בעוד כוחה של מערכת זו הוא הפגין-מיקומה Oct4 , מבחינה מושגית, הטכנולוגיה צ'ם מודולרית, ניתן להחיל סוגי תאים אחרים ו אחרים לוקוסים גנומית.

Introduction

כרומטין מורכב DNA סביב חלבונים octamer היסטון בצורת חלקיקים נוקלאוזום את הליבה. רגולציה של דחיסת כרומטין הוא מנגנון חיוני עבור נאות DNA תיקון, שכפול, ביטוי1,2,3. דרך אחת שבה תאים לשלוט על רמת דחיסה היא דרך הוספה או הסרה של שינויים הזנב היסטון post-translational שונים. שני שינויים אלה כוללים acetylation (1) ליזין, אשר מזוהה בדרך כלל עם הפעלת גנים, מתילציה (2) ליזין, אשר ניתן לשייך הפעלת גנים או דיכוי, בהתאם להקשר חומצת אמינו. התוספת של הסימנים acetylation, מתילציה היא מזורז על ידי היסטון acetyltransferases (כובעים) היסטון methyltransferases (HMTs), בהתאמה, ואילו הסרת הסימן נעשית על ידי היסטון deacetylases (HDACs) והיסטון demethylases (HDMs ), בהתאמה4,5. למרות קיומו של חלבונים אלה ידוע כבר עשרות שנים, מנגנונים רבים של מכונות איך שינוי כרומטין להסדיר כראוי ביטוי גנים עדיין מוגדר. מאז תהליכים רגולטוריים כרומטין dysregulated מחלות אנושיות רבות, תובנות חדשות מכניסטית עלול להוביל יישומים טיפוליים בעתיד.

כרומטין ויוו וזמינותו (CiA) היא טכניקה תיאר לאחרונה המשתמשת משרן כימי של קירבה (CIP) לשליטה שינוי כרומטין מכונות גיוס לוקוס ספציפי6. טכנולוגיה זו שימש ללמוד רשימת המתרחב של דינמיקה כרומטין, לרבות שינוי היסטון חלבונים, remodelers כרומטין שעתוק גורמים6,7,8,9. כרומטין מבוסס-CIP tethering של חלבונים exogenously ביטוי גם הוארך מעבר-CiA כדי לווסת את הלא-לאחרונה אתרים המקודדים גנטי על ידי שימוש עם שהפעלתם בוטלה מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר CRISPR-הקשורים חלבון (dCas9) 10 , 11. במערכת ה-CiA, mESCs שונו כדי לבטא גן כתב GFP-מיקומה Oct4 , אזור מאוד ביטוי ומוסדרת בקפדנות של הגנום mESC. בעבר, מערכת זו הוחל כדי לתאר את גיוס למינון והפיך הטרוכרומטין exogenously ביטוי חלבון 1 (HP1), אנזים זה נקשר H3K9me3 ומפיץ דכאניים סימני (למשל, H3K9me3) ו- DNA מתילציה6. כדי להשיג סוג זה של אסטרטגיית הגיוס, mESCs נגועים פלסמיד המבטאת של FK506 מחייב חלבון (FKBP) מקושר של Gal4, אשר עוגן DNA-חלבון הנקשרת מערך Gal4 מחייב במעלה הזרם של הכתב GFP. התאים נגועים גם עם תחום FKBP-rapamycin-איגוד (FRB) מחובר HP1. כאשר mESCs נחשפים nanomolar נמוך ריכוזי CIP, נכנסים ביחד rapamycin, הן FRB והן FKBP, על מיקומה היעד. בתוך ימים של טיפול rapamycin, ביטוי של הגן היעד מודחק, כפי שמעידים cytometry מיקרוסקופ וזרימה פלורסצנטיות, acetylation היסטון הוא ירד, המוצג על ידי שבב ורצף ביסולפאט. בזמן פיתוח, אימות של גישה זו כבר התקדמות משמעותית בתחום של מחקר כרומטין ורגולציה, חסרון אחד הוא הביטוי אקסוגני נדרש שינוי כרומטין מכונות.

כדי להפוך את הטכנולוגיה מבוסס על גיוס של רק אנזימים אנדוגניים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מערכת מודולרית יותר, אנו תוכנן, אפיינו את הרומן מולקולות bifunctional, הנקרא CEMs (איור 1)12. מרכיב אחד של CEMs כולל FK506 אשר, בדומה rapamycin, נקשר בחוזקה, במיוחד כדי FKBP. לכן, עדיין גייס את CEMs על מיקומה Oct4 ב mESCs ה-CiA. המרכיב השני של CEMs הוא moiety המאגד מכונות שינוי כרומטין אנדוגני. במחקר פיילוט, בדקנו CEMs מכילות מעכבי HDAC. בעוד הרעיון של שימוש מעכב לגייס HDACs נראה פזיזה, המדכא הוא בכל זאת מסוגל לגייס HDAC פעילות הגן עניין. מטרה זו מושגת על ידי (1) ניתוב מחדש את HDAC כדי מיקומה, שחרור האנזים, הגדלת הצפיפות של האו ם עכבות HDACs באזור, (2) שמירה על עיכוב HDAC על מיקומה, אך גיוס מתחמים דכאניים לאגד HDACs מאופק, או (3) שילוב של שניהם. במחקר הקודם, הראינו כי CEMs הצליחו להדחיק בהצלחה הכתב GFP באופן במינון ותלוי זמן, כמו גם באופן זה היה הפיך במהירות (קרי, תוך 24 שעות)12. אנחנו מאופיין ביכולת של הטכנולוגיה צ'ם המובאים כאן כדי בקרת ביטוי גנים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, cytometry זרימה, ואת היכולת לשלוט על הסביבה כרומטין באמצעות שבב-qPCR6. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות ואפיון של CEMs, אשר יקל את העיבוד של מערכת זו כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לביולוגיה כרומטין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) תרבית שורה תאים לייצור Lentivirus

  1. לגדול טריים, מעבר נמוך (פחות מעבר 30) 293T תאי כליה עובריים אנושית (HEK) ב- Dulbecco גבוהה-גלוקוז המתואמת של הנשר של מדיה בסיס בינוני (DMEM) בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 10 מ מ HEPES, 1 x חומצות אמינו שאינן הכרחיות (NEAA), עט / חיידק 2-mercaptoenthanol בתוך חממה 37 ° C עם 5% CO2. לפצל את התאים d כל 3-5, לפני שהם הופכים > 95% confluent.
  2. המעבר 293T HEK תאים עם 18 x 106 לכל צלחת 15 ס מ (אחד לוח 15 ס מ עבור כל וירוס המיוצר).
    1. עבור תבנית בגודל 15 ס מ, וארוקן את המדיה הישנה, להוסיף 10 מ ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), וארוקן את PBS, ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין 0.05%. דגירה התאים טריפסין 8 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, נדנדה וטפיחות התאים באמצע הדגירה.
      הערה: המטרה של שלב זה היא להשיג את התאים להשעיה תא בודד.
  3. כאשר התאים הגיעו 60-80% confluency ביום המחרת, לבצע של תרביות תאים polyethylenimine (פיי) עם 13.5 µg של פלסמיד psPAX2 את, µg 4.5 של פלסמיד pMD2.G, µg 18 של וקטור lentiviral תואמי משלוח עם הגן עניין (קרי , FKBP-Gal4), 108 µL של פיי, ו- 1.8 מ של תרביות תאים מדיה.
    1. בעדינות לערבב את ה-DNA, פיי ומדיה תרביות תאים צינור חרוטי 15-mL, דגירה המדגם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולהוסיף אותו dropwise הצלחת 15 ס מ.
      הערה: אנא השתמש המתאים בטיחות מודד ובצע כל מוסדי, נהלי בטיחות מעבדה לאחר שלב זה, כמו כל ריאגנטים יכיל וירוס חי.
  4. לאחר ה' 16 של תרביות תאים, דגירה ב חממה 37 ° C עם 5% CO2, תשאף התקשורת ולהוסיף בעדינות טריים מדיה HEK 293 (prewarmed באמבט מים 37 ° C) הלוחות 15 ס מ. דגירה התאים חממה 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות לאחר שינוי בתקשורת. הוירוס אז הוא מוכן להיות נקצרו.

2) זיהום בתאי גזע עובריים בעכבר (mESC) עם Lentivirus

  1. לגדול מעבר נמוך (פחות פסקה 35), נטול מזין mESCs CiA מותאם בתקשורת בסיס גבוה-גלוקוז DMEM בתוספת 20% FBS ESC-כיתה, 10 מ מ HEPES, 1 x NEAA, עט/סטרפ, 2-mercaptoenthanol, שבערך מעכב לוקמיה גורם (LIF) חממה 37 ° C עם 5% CO2.
    הערה: LIF המתקבל את תגובת שיקוע של תאים מייצרי COS LIF, אשר נאסף אצווה ו קפוא ב-80 מעלות צלזיוס.
    1. לגדל תאים על צלחות preincubated עבור h 1-3 עם 0.1% ג'לטין ב- 1 x PBS, ולא לאחר מכן שטוף 1 x PBS. להאכיל את התאים מדי יום, לפצל אותם d כל 2-3, בהתאם צפיפות שלהם.
      הערה: מורפולוגית, מושבות בתאי גזע עובריים (ES) צריך להיות קטן, עגול, נפרדים אחד מהשני.
  2. המעבר mESC לפורמט 12-ובכן צלחת (100,000 התאים היטב) ד 1 לפני זיהום.
    1. לספור את התאים עם hemocytometer. עבור תאים גדל בתבנית ס מ-10, וארוקן את המדיה הישנה, הוסף 5 מ של 1 x PBS, וארוקן את PBS וכיצד להוסיף 1 מ"ל של טריפסין 0.25%. דגירה התאים טריפסין 8 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, נדנדה וטפיחות התאים באמצע הדגירה. המטרה של שלב זה היא להשיג את התאים להשעיה תא בודד.
  3. 48 שעות לאחר החלפת המדיה מן 293T15-ס"מ ויראלי אריזה תאים מהשלב 1.4, להסיר ולהעביר את תגובת שיקוע צינור חרוטי 50-mL.
  4. Centrifuge את תגובת שיקוע ב x 300 גרם במשך 5 דקות כדי הצניפה שאריות תאים.
  5. לסנן את תגובת שיקוע דרך קרום 0.45-מיקרומטר.
    הערה: הקפד להשתמש ממברנות אצטט תאית ללא חומרים פעילי שטח (SFCA), כפי כמה חומרים אחרים יכולים לשמור על וירוס, להפחית באופן משמעותי את התשואות.
  6. לרכז את הוירוס עם ultracentrifugation, באמצעות צנטריפוגה עם הרוטור SW32, ולסובב את זה ב- 20,000 סל ד (x ~ 72,000$ g) עבור h 2.5-4 מעלות צלזיוס.
  7. בעוד הווירוס מרכזת תחת ultracentrifugation, פנקו את mESCs ה-CiA בצלחת 12-ובכן עם המדיה ES טריים המכילה 5 µg/mL של polybrene.
  8. כאשר סיים הריכוז וירוס, וארוקן את תגובת שיקוע ובזהירות להשעות בגדר וירוס ב 100 µL ל- PBS 1 x (להימנע בועות עודף).
  9. הוסף את הווירוס, 1 x PBS צינור 1.5-mL microfuge. מערבולת/שייק הצינור 300 x g (או -הנמוכה ביותר) להשעות באופן מלא את הנגיף. ספין דרך צינור ומפרידה פלטת שולחן מיני במשך 5-10 s כדי להסיר את הבועות.
  10. להוסיף 30 µL של הווירוס כל טוב של צלחת 12-. טוב. מערבולת את הצלחת, ואז centrifuge את הצלחת ב x 1000 g למשך 20 דקות.
    הערה: הסכום של וירוס נוסף יכולים להיות מגוונים בהתאם כייל נוגדנים ויראלי, אשר קשורה הפוך לגודל המבנה משלוח.
    1. לחלופין, פלאש להקפיא את הוירוס עם חנקן נוזלי ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס. עם זאת, מקפיא את הווירוס יהיה נמוך כייל את נגיפי.
  11. למקם את הצלחת 12-ובכן בחזרה בחממה 37 ° C, לשנות את המדיה למחרת בבוקר (~ 16 h) מאוחר יותר עם מדיה ES טריים (כפי שמתואר בשלב 2.1).
  12. לאחר 48 שעות של זיהום, בחר עבור תאים משולבים של פלסמיד ויראלי על-ידי הוספת האנטיביוטיקה המתאימה (קרי, µg/mL 1.5 של puromycin, µg/mL 10 של blasticidin, וכו '). לשנות את המדיה היומי ולשטוף את התאים עם PBS 1 x אם רוב התאים מתים צפים /. זכור התקשורת הנבחר על התאים עבור h 72-96 חממה 37 ° C עם 5% CO2.

3) מכפילי Epigenetic כימי (CEM) s הכנה וטיפול

  1. להשעות את צ'ם אבקת לתוך דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ריכוז מניות של 1 מ מ, ריכוז העבודה של 100 מיקרומטר.
  2. לאחר התאים עברו הבחירה עבור h 72-96, לפצל את mESCs תבנית 12-ובכן עם 100,000 תאים/טוב. דגירה התאים חממה 37 ° C עם 5% CO2 עבור 24h. לאחר מכן, להכין פתרון המדיה של 100 ננומטר צ'ם עם ES מדיה. השתמש מדיה זו כדי להאכיל את mESC ה-CiA עם 1 מ"ל/טוב. לשמש פקד, שמור טוב של תאים ללא כל CEMs נוספת.
    1. לשנות התקשורת על-ידי כ רפה בעברית המדיה הישנה והוספת 1 מ"ל/טוב של מדיה המכילים צ'ם או ES נטולת צ'ם הטרי כל 24 שעות ביממה למשך כל ניסוי.

4) ניתוח של הביטוי על ידי מיקרוסקופ Cytometry זרימה

  1. לאחר 48 שעות של טיפול צ'ם, תמונה התאים ללא טיפול צ'ם והתאים שטופלו 100 ננומטר צ'ם באמצעות מיקרוסקופ זריחה. נציג תמונות באמצעות שלב או brightfield, כדי להקליט את המורפולוגיה mESC בהגדלה X 20; התאים צריך הקימו מושבות עגולים, עם כמה תאים. תחת בערוץ זריחה FITC, תמונה שני התנאים התא.
  2. לבודד את הפקד ועל תאים שטופלו צ'ם עבור cytometry זרימה על ידי כ רפה בעברית התקשורת, שטיפת התאים עם 1 מ"ל של 1 x PBS, כ רפה בעברית של PBS והוספת 0.25 mL של טריפסין 0.25% עם EDTA למשך 8-10 דקות.
  3. ודא כי התאים אינם עוד במקבצים גדולים על ידי הסתכלות במיקרוסקופ. השתמש 20 X הגדלה. אם התאים אינם מופיעים להיות השעיה מתא בודד, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 כדי trypsinize באופן מלא את התאים.
  4. להרוות את טריפסין 1 מ של מדיה חדשה, resuspend את התאים במהירות גבוהה עם פיפטה סרולוגית (או באמצעות פיפטה P1000 עצה) עד התאים נמצאים השעיה תא בודד.
  5. ספין למטה התאים ב x 300 גרם במשך 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע. לשטוף עם PBS 1 x, recentrifuge את התאים. וארוקן את תגובת שיקוע PBS.
  6. Resuspend בגדר תא ב- 200 מ ל מאגר FACS (1 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה [EDTA], 1 x PBS ו- 0.2% אלבומין שור [BSA]).
    1. הנפח הכולל של מאגר FACS יהיה תלוי כמה תאים קיימים, אבל הריכוז צריך להיות 1,000-3,000 תאים / µL. לספור את מספר התאים בדגימות 3 ולחשב ממוצע את הריכוז של תאים. להוסיף מאגר FACS יותר במידת הצורך.
  7. מבצע cytometry זרימה > 50,000 תאים עם תאי מושעה, להשאיר את התאים על הקרח כאשר הם לא נבחנים. השתמש במסנן 530/40 (FITC, AF488, ה-GFP, וכו ') עבור הקלטה של השינויים בביטוי. לקבוע המתח פלורסנט המתאים באמצעות דוגמה תא בקרה לא מטופל ולהגדיר את המתח יש הפסגה פלורסנט להיות באמצע הספקטרום בעוצמה המוקלט. הפעל את הדגימות במהירות מעטפת של תאים כחמשת אלפים/s.
  8. לייצא את הנתונים ולנתח את הקבצים FCS על תוכנית cytometry זרימה (קרי, FlowJo) על ידי gating קודם על פיזור קדימה לעומת הצד פיזור עבור תאים חיים ואז על פיזור קדימה גובה לעומת אזור עבור ללבישה. לאחר מכן, להמחיש GFP ערוץ נתוני היסטוגרמה כדי לקבוע את הביטוי GFP יחסית ב המיועד ולשלוט אוכלוסיות.

5) ניתוח של כרומטין מאת כרומטין Immunoprecipitation (ChIP) שהופעל על ידי qPCR

  1. לפצל את mESCs צלחת 10-ס מ עם 3 מיליון תאים ו- 10 מ"ל של ES מדיה (לוח אחד ס מ-10 לכל אחד ניסיוני או לשלוט בתנאי). למחרת, להוסיף 10 מ של מדיה המכילים צ'ם או נטול צ'ם. לאחר 48 שעות של טיפול צ'ם, תשאף את המדיה הישנה. רוחצים את האחות התאים עם 5 מ של 1 x PBS. בשלב הבא, לנתק את התאים עם 0.25% טריפסין, להרוות את טריפסין עם 10 מ"ל של ES מדיה. לספור ולבודד מדגם של 10 מיליון תאים לכל תנאי.
  2. ספין לאורך כל הדגימות תא 10 מיליון ב x 300 גרם במשך 5 דקות.
  3. Resuspend כל גלולה ב 10 מ"ל של 1 x PBS, recentrifuge את התאים ב x 300 גרם במשך 5 דקות.
  4. Resuspend כל גלולה ב 10 מ ל CiA תיקון מאגר (50 מ מ pH 8, 1 מ מ EDTA pH 8, 0.5 מ מ אתילן גליקול-bis [אתר ß-aminoethyl]-N, N, N', N'-tetraacetic אסיד [EGTA] pH 8, ו- 100 מ מ נתרן כלורי [NaCl]). להוסיף 1 מ"ל של 11% פורמלדהיד פתרון, מיד היפוך הדגימות 5 x - 10 x. דגירה המדגם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  5. להוסיף 0.5 מ של גליצין 2.5 מטר. היפוך הדגימות מיד, דגירה המדגם על קרח למשך 5 דקות.
  6. Centrifuge הדגימה ב x 1,200 g למשך 5 דקות ב 4 º C. וארוקן את תגובת שיקוע.
  7. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של ה-CiA שטיפה 1 (50 מ מ HEPES pH 8, 140 מ מ NaCl, pH EDTA 1 מ 8, 10% גליצרול, 0.5% Nonidet P-40 [NP40] ו- 0.25% טריטון X100). דגירה המדגם על קרח במשך 10 דקות Centrifuge זה ב 1,200 x g למשך 5 דקות ב 4 º C.
  8. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של ה-CiA שטיפה 2 (10 מ מ טריס [hydroxymethyl] aminomethane [טריס] pH 8, 1 מ מ EDTA pH 8, 0.5 מ מ EGTA pH 8, ו- 200 מ מ NaCl). Centrifuge הדגימה ב x 1,200 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
  9. בעדינות הוסף 5 מ של ה-CiA הטיה מאגר (0.1% מרחביות EDTA 1 מ מ, 10 מ מ טריס pH 8) לאורך צידי הצינור חרוט לשטוף לך מלח מבלי לשבש את פעולת בגדר. Centrifuge הדגימה ב x 1,200 g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. חזור על השלב לשטוף.
  10. Resuspend בגדר ב 90 µL של המאגר הטיית ה-CiA, מעכבי פרוטאז טריים (השתמש תערובת של leupeptin, chymostatin ו- pepstatin A נעלם ביחד על 10 מ"ג/מ"ל כל אחד בדימתיל סולפוקסיד להכין 1,000 x פתרון מניות, ביצוע ריכוז הסופי של µg 10/mL). להוסיף 10 µL של nanodroplets לשיפור sonication תוך שמירה על הכל על קרח13,14.
  11. µL 100 של הפתרון להעביר צינור זכוכית, קאפ ברכבת התחתית.
  12. Sonicate את הדגימות 3.5 דקות (נקבע בהתבסס על שורת התאים מספר תאים). כדי למנוע התחממות יתר הדגימות, לעבד את הדגימות בזמנים מחזור 2-דקות-מקסימום אם הזמן sonication הכולל עולה על 2 דקות.
    הערה: ultrasonicator ממוקד המשמש כאן פונקציות בתדר גבוה (500 kHz). להפעיל את המכונה כוח אקוסטית של 55 W. משך sonication צריך להיות מראש באמצעות כל מעבדה בודדים.
  13. העברת כל מדגם sonicated כרומטין צינור 1.5-mL microcentrifuge. לסובב את הצינורות ב x 8000 g למשך 2 דקות ב 4 º C.
  14. כדי לנתח את יעילות ההטיה לכמת את הכמות היחסית של כרומטין, בצע הפרוטוקול של היצרן ערכת השבבים.
    הערה: לקבוע את ריכוז הדנ א spectrophotometrically (למשל, באמצעות מכשיר nanodrop DNA), ולהפעיל ~ 200 ng של הדי-ג'ל agarose 1% כדי לאמת כרומטין היא sonicated כדי בערך 200-500 basepairs (bp) בגודל.
  15. כדי לבצע immunoprecipitation ולבודד את כרומטין, בצע את הפרוטוקול של היצרן ערכת השבבים.
    הערה: עבור immunoprecipitation של דגימות עם ריכוז גבוה של ה-DNA, לחמם את המאגר • תנאי ב 37 מעלות צלזיוס, elute את הדגימות 2 x עם µL 30 מאגר • תנאי (ספינינג עבור 1 דקות כל פעם).
  16. כדי לבצע qPCR, לטעון את ריאגנטים לתוך צלחת 384-. טוב. להוסיף 5 µL 2 x מיקס מאסטר לצבוע cyanine סימטרית, 2.5 מיקרומטר מכל פריימר, מים ו 0.1 - 10 ng של ה-DNA עבור כל תגובה.
    1. עיצוב תחל כדי להגביר 50-100 bp amplicons וערכים CT הינם מנורמל ל גן משק בית, intracisternal A-סוג החלקיקים (חוג ידידי הפקולטה).
      הערה: לקבלת עוד שיטות qPCR, ראה הפרוטוקול של היצרן קיט. ערכת פריימר להשתמש כדי למקד את לוקוס Oct4 היה: CACATGAAGCAGCACGACTT (נ); (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. מן המפתח שליטה להגדיר להתרגל חוג ידידי הפקולטה היעד היה: ATTTCGCCTAGGACGTGTCA (נ); (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. מבוסס על תחל את המוצר הרצוי, להפעיל את qPCR עם 40 מחזורי מחזק בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.
      הערה: הנתונים המתקבלים היה quantitated באמצעות השוואות Ct של דלתא-delta בין דגימות, עם CiA:Oct4 מנורמל מעל חוג ידידי הפקולטה. תוצאות ניתוח סופי מוצגים ממוצעים של דגימות ניסיוני triplicate, עם השגיאה מיוצג סטיית התקן של הממוצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו לאחרונה פיתח CEMs, הדגימו כי טכנולוגיה זו יכול להיות מיושם להסדיר ביטוי גנים וסביבה כרומטין-לוקוס הכתב באופן תלוי מינון הפיך. איור 1, דגם של ההפניה צ'ם, CEM23, מוצג. HDAC מכונות הוא גויס על מיקומה כתב על ידי החומר המדכא HDAC אשר, במקרה זה, הוא הכתב GFP להוסיפה אצל מיקומה Oct4 .

אנחנו ביקשו לאפיין את המערכת CEM-מיקומה Oct4 ב CiA mESCs. כי התאים אקספרס GFP, זה היה אפשר לדמיין במהירות הביטוי של הכתב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ. התאים היו עם תמונה לאחר 48 שעות של טיפול עם 100 ננומטר של CEM23, יחד עם תאים ללא טיפול. תמונות שלב הצג mESCs בריא, וזה חשוב כי mESCs לא בריאה או הבדיל יצביע על דיכוי GFP שאינם ספציפיים. הדימויים פלורסצנטיות להראות ביטוי GFP בהיר בתאים בקרת ביטוי GFP מופחת ב mESCs שטופלו CEM23. להחליפן בתמונות מוצגות באיור2.

כדי לכמת את השינויים בביטוי ה-GFP, שימש cytometry זרימה. שוב, mESCs ה-CiA שטופלו 100 ננומטר של CEM23 למשך 48 שעות. ניסיוני תאים שטופלו תאים CEM23 ושליטה הוכנו עבור cytometry זרימה, באמצעות > 100,000 תאים עבור דגימה. באופן עקבי, הבחנו > 30 אחוז ירידה בתאים המבטאים-GFP בין אלה שטופלו CEMs. היסטוגרמה מייצגת מוצג באיור3.

פעם הראו עדות ירידה ביטוי הגן GFP-induced צ'ם, בדקנו עבור שינויים בסביבת כרומטין באמצעות שבב. גורם חשוב אחד עבור הכנת דוגמאות עבור השבב הוא מידת sonication כרומטין. כדי לקבל את הדגימות עקבית, כראוי הוטו ככל האפשר, 10 מיליון תאים היו sonicated 3.5 דקות. להשיג כרומטין בין 200 ל 500 bp בגודלם (איור 4). כי שיערנו כי CEMs דכאניים היו איגוד ואת גיוס HDAC חלבונים ו מתחמי דכאניים לכתב, בדקנו לקראת שינויים היסטון הזנב acetylation. היסטון 3 27 ליזין acetylation (H3K27ac) נפוץ לאורך האתר התחלה תעתיק (TSS) של גנים. אנו לבצע שבב עם נוגדן עבור H3K27ac ולאחר מכן ביצע qPCR עם ערכות פריימר ויוצאת של TSS. התוצאות מראים כי טיפול של 48 שעות עם 100 nM של CEM23 ירד הרמה של H3K27ac-מיקומה היעד בהשוואה לתאי הבקרה אינו מטופל באמצעות CEMs (p < 0.01, דו-זנבית של סטודנט t-מבחן עם שלושה ביולוגית משכפל, איור 5).

Figure 1
איור 1 : CEMs לאגד CiA:Oct4 לוקוס דרך הגיוס FKBP הקשר אנדוגני epigenetic מכונות- המודל של מערכת צ'ם מראה Gal4-FKBP כעוגן חלבון-ל-DNA. בחלק FK506 של צ'ם נקשר FKBP, החומר המדכא HDAC מגייס חלבונים HDAC אנדוגני להדחיק GFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 2
איור 2 : קרינה פלואורסצנטית תמונות של תאי גזע עובריים בעכבר (mESCs) עם CiA:Oct4 כתב - GFP. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונות להראות ירידה בביטוי GFP על טיפול צ'ם. הפאנל העליון מציג שלב ותמונות פלורסנט של mESCs עם מדיה ללא טיפול. החלונית התחתונה מציגה שלב פלורסנט של mESCs מטופלים עם 100 ננומטר של CEM23 למשך 48 שעות. הדימויים הותאם באישור ביולוגיה סינתטית ACS12. זכויות יוצרים (2018) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 3
איור 3 : ניתוח cytometry זרימה quantitates ביטוי ירידה של GFP ב mESCs על טיפול CEM23. mESCs ללא CEM23 (כחול) הושוו עם mESCs שטופלו 100 ננומטר של CEM23 48 שעות (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 4
איור 4 : Sonication של כרומטין הוא אחיד, והוא כתם גלוי בין 200 ל 500 bp. כדי לבצע שבב-qPCR, היה sonicated של כרומטין מן mESCs. כל מדגם כללה כ-10 מיליון תאים, אשר היו sonicated 3.5 דקות, כדי לייצר לכסנתם באופן דומה כרומטין דגימות בין 200 ל 500 bp אורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 5
איור 5 : CEM23 הטיפול גורם לירידה H3K27ac-מיקומה CiA. שבב-qPCR בוצעה לבדיקת שינויים בסביבת כרומטין. לאחר טיפול של 48 שעות עם 100 nM של CEM23, נצפתה ירידה ב- H3K27ac- CiA:Oct4 (* *p < 0.01, דו-זנבית של סטודנט t-מבחן עם משכפל ביולוגי שלוש. קווי השגיאה לייצג סטיית תקן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנחנו תיאר מערכת צ'ם שפותחו לאחרונה מיושמת להסדיר ביטוי גנים וסביבה כרומטין-גן ספציפי באופן תלוי מינון. אנו מספקים שיטה מדויקת כדי ללמוד את הדינמיקה מעורב בוויסות ביטוי גנים דרך גיוס סלקטיבית של חלבוני כרומטין אנדוגני ספציפיים. זוהי טכנולוגיה מאוד מודולריות שניתן להחיל לחקור כמה שונה חלבון וכרומטין-שינוי מתחמי לעבוד ביחד כדי לווסת כהלכה הסביבה כרומטין, כמו גם כדי ללמוד כיצד תהליכים אלה הם dysregulated, עם היתרון של השגת ירידה לפרטים ג'ין.

. הנה, שלוש דרכים היו הפגינו להמחיש שינויים בביטוי כרומטין המבנה של ג'ין עם טכנולוגיה חדשה. לאחר למבוכת לוקוסים יישוב מסוים עם CEMs, שינויים בזמן אמת ביטוי גנים יכול להיות מנותח על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. לאחר מכן, שינויים ברמות ביטוי גנים ניתן למדוד באופן כמותי יותר עם cytometry זרימה על נקודות קצה מוגדרות. לבסוף, שינויים epigenetic posttranslational. הסימנים על כרומטין נבדקו על-ידי שבב; באופן ספציפי, במקרה זה, H3K27ac. אנחנו לא מבחן HDAC גיוס עם שבב-qPCR בגלל המגוון של HDACs שפועלים בקונצרט ב לוקוס בודד. סביר כי אוכלוסיה heterogenous של אנזימים HDAC גויס ויהיה לו, לכן, מבחינה טכנית קשה לבדוק אותם על השבב. עבודה שפורסמו בעבר, הראו כי גיוס ישיר של HDAC3 על ידי שילוב GAL4 גרמה פעילות דומה על התאמת כרומטין וביטוי גנים-צ'יפ12. אם להיות מאופנן כתב שאינו-פלורסנט, שינויים בביטוי הגנים גם יכול להימדד על-ידי (1) ניתוח ביטוי RNA עם רוורס טרנסקריפטאז qPCR או חלבון (2) הביטוי סופג המערבי, או הדמיה ו ניצוח cytometry זרימה עם נוגדנים משניים פלורסנט.

ביחס הנוכחי מבוסס-CIP טכניקות כמו מערכת ה-CiA 12, טכנולוגיה זו צ'ם יש את היתרון של גיוס אנדוגני מאפננים epigenetic אל הגן היעד. ניתוב מחדש של המנגנון של התא יוצר אמצעי רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית להתכוונן הביטוי. Exogenously לבטא אנזימים ראשיים, כמו כובעים, גורמי שעתוק, עלולה לגרום תופעות לוואי הביטוי המוגבר שלהם, במיוחד תוך כדי לא להיות פעיל גייס את מיקומה ג'ין.

בעוד מאמר זה מציג את הפונקציונליות של מערכת חדשנית זו עם CEMs המורכב מעכבי HDAC, מספר מעכבי אחרים או מגייסים חלבון יכול להיות מסונתז במקום החומר המדכא HDAC. כדי להשיג הפעלת גנים, מעכב את הכובע - או HDMT מבוססי מעכב CEMs יכול להיות מסונתז. להדחיק, ואז overexpress אותו גן, זה ניתן לטיפול תאי עם צ'ם הדיכוי, לשטוף אותם עם המדיה הרגיל ולאחר מכן הוסף את צ'ם הפעלת. זה יאפשר למערכת נקי ללמוד את הדינמיקה של גיוס נוקשים, הפעלת מתחמי באזור גנומית. בעת עיצוב CEMs בעתיד, מספר מאפיינים צריכים לקחת בחשבון, כולל תא פרמאביליות, מעכב, מבנה, והכוחות קינטיקה מעכבות. אורך מקשר בין FK506 לבין moiety מגייס את תשפיע את החדירות של CEMs, כמו גם מיקומו של החלבון מגויס. בעת השוואת שני CEMs מהתפיסה רק באורכו מקשר, צ'ם עם מקשר קצר היה יעיל יותר12. בזמן זה לא נבדק ישירות כאן, יעילות גבוהה יותר היא תוצאה של חדירות תאים גדול יותר. בחירת מעכבי עם מבנה כימי לבצע שינוי מבלי להפריע את החלק המאגד את האתר הפעיל של היעד זה היא גם חשובה. עוצמת וספציפיות נחשבו גם על-ידי בחירת מעכבי עם עוצמה גבוהה, ירידה לפרטים עבור מחלקה נתונה של חלבונים. קינטיקה של דיכוי עשויים להשפיע את האפקטיביות של CEMs. CEMs מורכבת מעכבי איטי ב- off המחירים נוטים להיות פחות יעיל.

אילוץ אחד של הטכנולוגיה צ'ם הנוכחית היא הדרישה של מערך Gal4 מחייב-מיקומה ג'ין היעד. לגייס CEMs לאזור שונה מיקומה Oct4 CiA , כל אחד ממאות מהונדסים Gal4 במעלה הפעלת רצף (UAS) קווים לרשות הקהילה המדעית יכול לשמש. דרך אחת המערכת יבוצעו יותר מודולרית היא על-ידי שילוב של Cas9 שהפעלתם בוטלה (dCas9) עם אנזים כימי epigenetic גיוס10,11,15. חלבון זה נוקלאז-מת מן המערכת CRISPR-Cas9 עדיין להיות מגויס בכל אזור של הגנום שאליו מיועדת של RNA מדריך (gRNA), אבל זה לא מספיק דנ א. באמצעות שילוב dCas9-FKBP, הרכיב FKBP יוכלו לגייס את CEMs איפה dCas9 הוא גויס, המגביר את נוחות וגמישות של גנים יעד פוטנציאליים. דמיינו בעזרת טכנולוגיה זו היעד גנים מחלות רלוונטיות פוטנציאל טיפולי או אמצעי שבאמצעותו ללמוד הפיכה של חנותם מנגנוני המחלה ברמה כרומטין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות לחברים של המעבדות הת'אוויי וג'ין לדיונים מועיל שלהם. המחברים מודים גם דן Crona, איאן מקדונלד בקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק R01GM118653 של ארה ב מכוני הבריאות הלאומיים (ל N.A.H.); על ידי מענקים R01GM122749, R01CA218600, R01HD088626 מ לאומי ארה ב מכוני הבריאות (כדי ג'יי ג'יי). עבודה זו גם נתמך על ידי שכבה 3 וסטודנט להעניק ממכון Eshelman UNC לחדשנות (N.A.H, A.M.C, בהתאמה). מימון נוסף GM007092 T-32 (ל A.M.C) תמיכה עבודה זו. נתונים cytometry זרימה הושג במתקן של UNC Flow Cytometry הליבה במימון P30 CA016086 סרטן מרכז הליבה תמיכה מענק UNC Lineberger מקיף במרכז לחקר הסרטן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013CV
NEAA Gibco 11140-050
HEPES (for tissue culture) Corning 25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol) Gibco 21985-023
FBS Atlantic Biologicals S11550 Individual lots tested for quality
Covaris tubes ThermoScientific C4008-632R
Covaris caps ThermoScientific C4008-2A
PEI (polyethylenimine) Polysciences 23966-1
Transfection media (Opti-mem) Gibco 31985070
Virus centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Virus filter membrane Corning 431220
Polybrene Santa Cruz Biotechnology SC134220
0.25 % Trypsin Gibco 25200-056 with EDTA
0.05 % Trypsin Gibco 25400-054 with EDTA
Puromycin InvivoGen ant-pr
Blasticidin InvivoGen ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) Roche 4913914001
H3K27ac antibody Abcam ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit Active Motif 53040
Sonicator Covaris E110
Ultracentrifuge Optima XPN-80
SW-32 centrifuge rotor Beckman Coulter 14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets Beckman Coulter 130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney Clontech 632180
PBS Corning 46-013-CM
BSA Fisher BP9700
EGTA Sigma E3889
EDTA Fisher S311-100
NaCl Fisher S271-1
Glycerol Fisher G33-1
Tris Fisher BP152
NP40 Roche 11754599001
Triton MP Biomedicals 807426
Glycine Fisher BP381-500
TE buffer Fisher BP2474-1
HEPES (for ChIP) Fisher BP310-100
Gelatin Sigma G1890
Flow cytometer, Attune NxT Thermo Fisher A24858
FKBP-Gal4 plasmid Addgene 44245
psPAX2 plasmid Addgene 12260
pMD2.G plasmid Addgene 12259
Nanodroplets MegaShear N/A
DNA Nanodrop Thermo Fisher ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin) Calbiochem/EMD 108975
Protease Inhibitors (Chymostatin) Calbiochem/EMD 230790
Protease Inhibitors (Pepstatin) Calbiochem/EMD 516481
CiA:Oct4 mESC The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells The kind gift of J. Wysocka

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
  5. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  6. Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
  7. Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
  8. Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
  9. Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
  10. Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
  11. Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
  12. Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
  13. Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
  14. Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

Tags

מולקולות bifunctional ביולוגיה כימית גיליון 139 בביו-הנדסה כימית המושרה קרבה רגולציה כרומטין דיכוי גנים היסטון deacetylase אפיגנטיקה המגבילים epigenetic כימי CEMs
הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiarella, A. M., Wang, T. A.,… More

Chiarella, A. M., Wang, T. A., Butler, K. V., Jin, J., Hathaway, N. A. Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (139), e58222, doi:10.3791/58222 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter