Summary
क्रोमेटिन पर्यावरण का विनियमन उचित जीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक प्रक्रिया है । यहां, हम एक जीन विशिष्ट और प्रतिवर्ती तरीके से क्रोमेटिन-संशोधित मशीनरी की भर्ती के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए एक विधि का वर्णन ।
Abstract
क्रोमेटिन संकुचन का विनियमन एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो उच्च eukaryotes में जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करती है । हालांकि क्रोमेटिन संकुचन और जीन अभिव्यक्ति विनियमन सामांयतः कई रोगों में बाधित कर रहे हैं, एक लोकस विशिष्ट, अंतर्जात, और प्रतिवर्ती विधि का अध्ययन करने के लिए और कार्रवाई के इन तंत्र को नियंत्रित करने में कमी आई है । इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, हम विकसित किया है और उपंयास जीन-विनियमन bifunctional अणुओं विशेषता । bifunctional अणु का एक घटक एक डीएनए प्रोटीन एंकर को बांधता है ताकि यह एक एलील-विशिष्ट लोकस के लिए भर्ती किया जाएगा । अंय घटक अंतर्जात सेलुलर क्रोमेटिन-संशोधित मशीनरी संलग्न, ब्याज की एक जीन के लिए इन प्रोटीन की भर्ती । इन छोटे अणुओं, रासायनिक epigenetic संशोधक (CEMs) कहा जाता है, जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में सक्षम है और एक खुराक में क्रोमेटिन वातावरण पर निर्भर और प्रतिवर्ती तरीके से । यहां, हम विस्तार से एक CEM दृष्टिकोण और उसके आवेदन के लिए जीन अभिव्यक्ति और हिस्टोन पूंछ acetylation में कमी एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) रिपोर्टर में Oct4 लोकस पर स्थित माउस भ्रूण स्टेम सेल (mESCs) । हम सीसा CEM (CEM23) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, फ्लो cytometry, और क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) का उपयोग कर, एक मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) के बाद की विशेषता है । जबकि इस प्रणाली की शक्ति Oct4 लोकस पर प्रदर्शन किया है, धारणा, CEM प्रौद्योगिकी मॉड्यूलर है और अंय प्रकार के सेल में लागू कर सकते है और अंय जीनोमिक loci पर ।
Introduction
क्रोमेटिन हिस्टोन octamer प्रोटीन है कि कोर nucleosome कण फार्म के आसपास डीएनए लिपटे होते हैं । क्रोमेटिन संकुचन के विनियमन उचित डीएनए की मरंमत, प्रतिकृति, और अभिव्यक्ति1,2,3के लिए एक आवश्यक तंत्र है । एक तरीका है जिसमें कोशिकाओं के संकुचन के स्तर को नियंत्रित करने के अलावा या विभिंन पोस्ट-शोधों हिस्टोन पूंछ संशोधनों को हटाने के माध्यम से है । दो ऐसे संशोधनों में शामिल है (1) lysine acetylation, जो सबसे अधिक जीन सक्रियण के साथ जुड़ा हुआ है, और (2) lysine मिथाइल, जो या तो जीन सक्रियण या दमन के साथ संबद्ध किया जा सकता है, एमिनो एसिड संदर्भ पर निर्भर करता है । इसके अतिरिक्त acetylation और मिथाइल मार्क्स का catalyzed हिस्टोन acetyltransferases (सलाम) और हिस्टोन methyltransferases (HMTs) द्वारा क्रमशः किया जाता है जबकि मार्क को हटाने का कार्य हिस्टोन deacetylases (HDACs) और हिस्टोन demethylases (HDMs ), क्रमशः४,५. हालांकि इन प्रोटीन के अस्तित्व दशकों के लिए जाना जाता है, कैसे क्रोमेटिन-संशोधित मशीनरी ठीक से जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए काम करता है के कई तंत्र को परिभाषित किया जा रह । चूंकि क्रोमेटिन नियामक प्रक्रियाओं कई मानव रोगों में dysregulated हैं, नई यंत्रवत अंतर्दृष्टि भविष्य चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
vivo परख (सीआईए) में क्रोमेटिन एक हाल ही में वर्णित तकनीक है कि निकटता (CIP) के एक रासायनिक उत्प्रेरण का उपयोग करता है क्रोमेटिन को नियंत्रित करने के लिए एक विशिष्ट लोकस6के लिए मशीनरी भर्ती संशोधित । इस प्रौद्योगिकी क्रोमेटिन गतिशीलता की एक विस्तृत सूची का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, हिस्टोन-संशोधित करने प्रोटीन, क्रोमेटिन रिमॉडलर सहित, और प्रतिलेखन कारकों6,7,8,9. exogenously के CIP आधारित क्रोमेटिन tethering व्यक्त प्रोटीन भी पिछले सीआईए विस्तारित किया गया है एक निष्क्रिय संकुल के साथ प्रयोग द्वारा गैर-संशोधित आनुवंशिक loci मिलाया जा चुका है नियमित रूप से अंतराल कम Palindromic दोहराता (CRISPR)-एसोसिएटेड प्रोटीन (dCas9) 10 , 11. सीआईए प्रणाली में, mESCs को Oct4 लोकस, एक अत्यधिक व्यक्त और mESC जीनोम के सख्ती से विनियमित क्षेत्र में एक GFP रिपोर्टर जीन एक्सप्रेस संशोधित किया गया है । पहले, इस प्रणाली का वर्णन करने के लिए लागू किया गया है खुराक-आश्रित और प्रतिवर्ती भर्ती exogenously के heterochromatin प्रोटीन 1 व्यक्त (HP1), एक एंजाइम कि बांधता H3K9me3 और प्रचार के दमन के निशान (जैसे, H3K9me3) और डीएनए मिथाइल6. इस प्रकार की भर्ती की रणनीति को पूरा करने के लिए, mESCs एक प्लाज्मिड से संक्रमित होते हैं जो एक FK506-बाइंडिंग प्रोटीन (FKBP) को व्यक्त करते हैं, जो एक Gal4 से जुड़ा होता है, जो डीएनए-प्रोटीन एंकर है जो Gal4 रिपोर्टर के GFP-बाइंडिंग सरणी को बांधता है । कोशिकाओं को भी एक FKBP-rapamycin-बाध्यकारी डोमेन (FRB) से जुड़े HP1 से संक्रमित हैं । जब mESCs CIP, rapamycin, दोनों FRB और FKBP के कम nanomolar सांद्रता के लिए संपर्क कर रहे हैं, एक साथ लक्ष्य लोकस पर लाया जाता है । rapamycin उपचार के दिनों के भीतर, लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति दमित है, के रूप में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry द्वारा सबूत है, और हिस्टोन acetylation कमी आई है, चिप और bisulfite अनुक्रमण द्वारा दिखाया गया है । हालांकि विकास और इस दृष्टिकोण के सत्यापन क्रोमेटिन अनुसंधान और विनियमन के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति की गई है, एक खामी क्रोमेटिन संशोधित मशीनरी की आवश्यक exogenous अभिव्यक्ति है ।
केवल अंतर्जात शारीरिक रूप से प्रासंगिक एंजाइमों की भर्ती पर आधारित प्रौद्योगिकी बनाने के लिए और एक अधिक मॉड्यूलर प्रणाली बनाने के लिए, हम डिजाइन और चरित्र bifunctional अणुओं की विशेषता, CEMs (चित्रा 1)12का कार्यकाल । CEMs के एक घटक FK506 शामिल है जो, rapamycin के समान, कसकर बांध और विशेष रूप से FKBP के लिए । इस प्रकार CEMs को अभी भी सीआईए mESCs में Oct4 लोकस की भर्ती की जाएगी । CEMs के दूसरे घटक एक moiety है कि अंतर्जात क्रोमेटिन-संशोधित मशीनरी बांधता है । एक पायलट अध्ययन में, हम CEMs परीक्षण किया है कि HDAC अवरोधकों होते हैं । जबकि HDACs भर्ती करने के लिए एक अवरोधक का उपयोग करने की अवधारणा काउंटर सहज ज्ञान युक्त लगता है, अवरोध करनेवाला फिर भी ब्याज की जीन के लिए HDAC गतिविधि भर्ती करने में सक्षम है । यह (1) HDAC लोकस को पुनः निर्देशित कर पूरा किया है, एंजाइम जारी है, और संयुक्त राष्ट्र के घनत्व में वृद्धि HDACs क्षेत्र में बाधा और (2) लोकस में HDAC अवरोध को बनाए रखने, लेकिन भर्ती दमन परिसरों कि बाधा HDACs को बांध, या (3) दोनों का एक संयोजन । पिछले एक अध्ययन में, हमें पता चला कि CEMs को सफलतापूर्वक एक खुराक में GFP रिपोर्टर दमन और समय पर निर्भर तरीके से कर रहे थे, साथ ही साथ एक तरह से है कि तेजी से प्रतिवर्ती (यानी, 24 घंटे के भीतर)12। हम CEM प्रौद्योगिकी की क्षमता की विशेषता यहां प्रस्तुत जीन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, प्रवाह cytometry का उपयोग कर अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए, और क्रोमेटिन चिप-6qPCR का उपयोग कर पर्यावरण को नियंत्रित करने की क्षमता । यहाँ, हम का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन और निस्र्पक CEMs, जो क्रोमेटिन जीव विज्ञान से संबंधित अतिरिक्त प्रश्नों का उत्तर देने के लिए इस प्रणाली के अनुकूलन की सुविधा होगी.
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Protocol
1) Lentivirus उत्पादन के लिए सेल लाइन संस्कृति
- बढ़ती ताजा, कम बीतने (30 से कम गद्यांश) 293T मानव भ्रूण गुर्दा (HEK) उच्च ग्लूकोज Dulbecco है संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) बेस मीडिया में कोशिकाओं के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 10 mM HEPES, 1x गैर-जरूरी अमीनो एसिड्स (NEAA), पेन/ Strep, 2-5% सह2के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में mercaptoenthanol । हर 3-5 घ कोशिकाओं विभाजन और इससे पहले कि वे बन > ९५% धाराप्रवाह ।
- 18 x 106 प्रति 15-सेमी प्लेट (प्रत्येक वायरस का उत्पादन के लिए १ १५-cm प्लेट के साथ 293T HEK कोशिकाओं गद्यांश) ।
- एक 15 सेमी के प्रारूप के लिए, पुराने मीडिया महाप्राण, 1x फास्फेट के 10 मिलीलीटर-बफर खारा (पंजाब) जोड़ें, पंजाबियों महाप्राण, और ०.०५% trypsin के 3 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए trypsin में कोशिकाओं की मशीन, कमाल है और आधी गर्मी के माध्यम से कोशिकाओं दोहन ।
नोट: इस चरण का लक्ष्य कक्षों को एकल-कक्ष निलंबन में प्राप्त करना है.
- एक 15 सेमी के प्रारूप के लिए, पुराने मीडिया महाप्राण, 1x फास्फेट के 10 मिलीलीटर-बफर खारा (पंजाब) जोड़ें, पंजाबियों महाप्राण, और ०.०५% trypsin के 3 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए trypsin में कोशिकाओं की मशीन, कमाल है और आधी गर्मी के माध्यम से कोशिकाओं दोहन ।
- जब कक्ष ६०%-८०% तक पहुँच गए हैं, तो निम्न दिन को प्रभावित करते हैं, एक polyethylenimine (पी) अभिकर्मक के साथ १३.५ µ जी के psPAX2 प्लाज्मिड, ४.५ µ जी के pMD2. जी प्लाज्मिड, 18 µ जी के lentiviral-संगत डिलीवरी वेक्टर के जीन के साथ ब्याज (यानी , FKBP-Gal4), पी के १०८ µ एल, और अभिकर्मक मीडिया के १.८ मिलीलीटर ।
- धीरे डीएनए, पी, और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अभिकर्मक मीडिया मिश्रण, 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना मशीन, और यह 15 सेमी की थाली में dropwise जोड़ें ।
नोट: कृपया उचित सुरक्षा उपायों का उपयोग करें और इस कदम के बाद सभी संस्थागत और प्रयोगशाला सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें, के रूप में सभी एजेंट एक जीवित वायरस शामिल होंगे ।
- धीरे डीएनए, पी, और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अभिकर्मक मीडिया मिश्रण, 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना मशीन, और यह 15 सेमी की थाली में dropwise जोड़ें ।
- 5% कं2के साथ एक ३७ ° c मशीन में अभिकर्मक और मशीन के 16 ज के बाद, मीडिया महाप्राण और धीरे से ताजा २९३ HEK मीडिया जोड़ें (एक ३७ ° c पानी के स्नान में गर्म) 15 सेमी प्लेटों के लिए । एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में 5% CO2 के साथ ४८ h के लिए मीडिया परिवर्तन के बाद में गर्मी कोशिकाओं । इसके बाद वायरस को कटाई के लिए तैयार किया जाता है ।
2) Lentivirus के साथ माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESC) के संक्रमण
- बढे कम गद्यांश (गद्यांश ३५ से कम), फीडर मुक्त अनुकूलित सीआईए mESCs उच्च ग्लूकोज DMEM बेस मीडिया में 20% ESC ग्रेड FBS, 10 मिमी HEPES, 1x NEAA, कलम/Strep, 2-mercaptoenthanol, और 1:500 ल्यूकेमिया अवरोधक कारक (लिफ) के साथ पूरक में एक ३७ डिग्री सेल्सियस के साथ 5% सीओ2.
नोट: लिफ के supernatant से प्राप्त की है क्योंकि लिफ-उत्पादन कोशिकाओं है, जो बैच में एकत्र कर रहे है और ८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ।- प्लेटें कि 1x पंजाब में ०.१% जिलेटिन के साथ 1-3 एच के लिए विकसित किया गया है पर कोशिकाओं को बढ़ने, और बाद में 1x पंजाबियों के साथ धोया । दैनिक कोशिकाओं फ़ीड और उंहें हर 2-3 डी विभाजन, उनके घनत्व पर निर्भर करता है ।
नोट: आकृति विज्ञान, भ्रूण स्टेम सेल (ES) कालोनियों छोटे, गोल, और एक दूसरे से अलग होना चाहिए ।
- प्लेटें कि 1x पंजाब में ०.१% जिलेटिन के साथ 1-3 एच के लिए विकसित किया गया है पर कोशिकाओं को बढ़ने, और बाद में 1x पंजाबियों के साथ धोया । दैनिक कोशिकाओं फ़ीड और उंहें हर 2-3 डी विभाजन, उनके घनत्व पर निर्भर करता है ।
- एक 12-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में mESC गद्यांश (१००,००० कोशिकाओं/1 डी संक्रमण से पहले ।
- किसी hemocytometer के साथ कक्षों की गणना करना. एक 10-मुख्यमंत्री प्रारूप में उगाई गई कोशिकाओं के लिए, पुराने मीडिया महाप्राण, 1x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर जोड़ने, पंजाबियों महाप्राण, और ०.२५% trypsin की 1 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए trypsin में कोशिकाओं की मशीन, कमाल है और आधी गर्मी के माध्यम से कोशिकाओं दोहन । इस चरण का लक्ष्य कक्षों को एकल-कक्ष निलंबन में प्राप्त करना है ।
- ४८ ज से मीडिया को बदलने के बाद 293T15-cm वायरल पैकेजिंग कोशिकाओं से कदम १.४, हटाने और एक ५० एमएल शंकु ट्यूब supernatant स्थानांतरण ।
- केंद्रापसारक सेल मलबे के लिए 5 मिनट के लिए ३०० x g पर supernatant ।
- एक ०.४५-µm झिल्ली के माध्यम से supernatant फिल्टर ।
नोट: surfactant मुक्त फाइबर एसीटेट (SFCA) झिल्ली का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें, के रूप में कुछ अन्य सामग्री वायरस को बनाए रखने और काफी पैदावार को कम कर सकते हैं. - ultracentrifugation के साथ वायरस ध्यान केंद्रित, एक SW32 रोटर के साथ एक केंद्रापसारक का उपयोग कर, और यह २०,००० rpm पर स्पिन (~ ७२,००० x जी) २.५ के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एच ।
- जबकि वायरस ultracentrifugation के तहत ध्यान केंद्रित, 12 में सीआईए mESCs का इलाज अच्छी तरह से ES 5 µ जी युक्त मीडिया के साथ प्लेट/polybrene के एमएल ।
- जब वायरस एकाग्रता समाप्त हो गया है, ध्यान से supernatant महाप्राण और १०० 1x पंजाब के µ एल में वायरस गोली निलंबित (अतिरिक्त बुलबुले से बचें) ।
- एक १.५-एमएल microfuge ट्यूब करने के लिए वायरस और 1x पंजाबियों जोड़ें । भंवर/शेक ३०० x जी पर ट्यूब (या सबसे कम सेटिंग में) पूरी तरह से वायरस को निलंबित करने के लिए । एक मिनी में ट्यूब नीचे स्पिन-तालिका 5-10 के लिए बुलबुले हटाने एस के लिए ।
- एक 12-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से वायरस के 30 µ एल जोड़ें । थाली भंवर और फिर 20 मिनट के लिए १,००० x g पर थाली केंद्रापसारक ।
नोट: वायरस की मात्रा जोड़ा वायरल titer, जो व्युत्क्रम वितरण के आकार का निर्माण करने के लिए संबंधित है के आधार पर अलग किया जा सकता है ।- वैकल्पिक रूप से, फ्लैश तरल नाइट्रोजन के साथ वायरस फ्रीज और यह दुकान पर-८० ° c । हालांकि, ठंड वायरस वायरल titer कम हो जाएगा ।
- 12-अच्छी तरह से ३७ ° c मशीन में वापस थाली प्लेस और मीडिया के बाद सुबह (~ 16 बाद) ताजा ES मीडिया (के रूप में चरण २.१ में वर्णित) के साथ बदल जाते हैं ।
- संक्रमण के ४८ ज के बाद, उन कोशिकाओं के लिए चयन करें जो वायरल प्लाज्मिड को उपयुक्त एंटीबायोटिक (अर्थात, १.५ µ g/एमएल ऑफ puromycin, 10 µ g/एमएल ऑफ blasticidin, आदि) जोड़कर एकीकृत करते हैं । मीडिया को दैनिक बदलें और 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो अगर कोशिकाओं के बहुमत तैर रहे है/ 5% CO2के साथ एक ३७ ° c मशीन में ७२-९६ h के लिए कक्षों पर चयन मीडिया रखें ।
3) रासायनिक Epigenetic संशोधक (CEM) एस तैयारी और उपचार
- dimethyl sulfoxide (DMSO) में 1 मिमी और १०० µ एम के एक काम एकाग्रता के एक शेयर एकाग्रता के लिए पाउडर CEM निलंबित ।
- के बाद कोशिकाओं ७२-९६ ज के लिए चयन आया है, एक 12 में mESCs विभाजन अच्छी तरह से १००,००० कोशिकाओं के साथ प्रारूप/ एक ३७ ° c मशीन में 5% CO2 के साथ 24 घंटे के लिए कोशिकाओं की मशीन । बाद में, ES मीडिया के साथ १०० एनएम CEM का एक मीडिया समाधान तैयार करते हैं । इस मीडिया का इस्तेमाल कर सीआईए mESC को 1 एमएल/ नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए, किसी भी जोड़े CEMs बिना कक्षों की एक अच्छी तरह से रखें ।
- पुराने मीडिया aspirating द्वारा मीडिया को बदलने और एक प्रयोग की अवधि के लिए ताजा तैयार CEM-युक्त या CEM से मुक्त ES मीडिया हर 24 ज की 1 मिलीलीटर/
4) सूक्ष्म और प्रवाह Cytometry द्वारा अभिव्यक्ति का विश्लेषण
- CEM उपचार के ४८ घंटे के बाद, CEM उपचार और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर १०० एनएम CEM के साथ इलाज कोशिकाओं के बिना कोशिकाओं की छवि । 20X आवर्धन पर mESC आकृति विज्ञान को रिकॉर्ड करने के लिए चरण या brightfield का उपयोग करके प्रतिनिधि छवियों को लें; कोशिकाओं के दौर कालोनियों का गठन किया जाना चाहिए, कुछ विभेदित कोशिकाओं के साथ । FITC प्रतिदीप्ति चैनल के तहत, दोनों कक्ष शर्तों छवि ।
- मीडिया को aspirating करके प्रवाह cytometry के लिए नियंत्रण और CEM-उपचारित कक्षों को अलग करें, सेल को 1 मिलीलीटर, 1x पंजाबियों के aspirating के साथ धुलाई, और 8-10 मिनट के लिए trypsin के साथ ०.२५% EDTA की ०.२५ मिलीलीटर को जोड़ना ।
- इस बात की पुष्टि करें कि माइक्रोस्कोप में देखकर अब कोशिकाएं बड़े झुरमुट में नहीं रह जाती हैं । एक 20X आवर्धन का उपयोग करें । यदि कक्ष किसी एकल-कक्ष निलंबन में प्रकट नहीं होते हैं, तो धीरे से कक्षों को पूरी तरह trypsinize करने के लिए P1000 पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पिपेट.
- ताजा मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ trypsin बुझाने और एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ उच्च गति पर कोशिकाओं resuspend (या एक P1000 पिपेट और टिप का उपयोग कर) जब तक कोशिकाओं को एक एकल सेल निलंबन में हैं ।
- 5 मिनट के लिए ३०० x g पर नीचे स्पिन कोशिकाओं supernatant महाप्राण । 1x पंजाबियों के साथ धो और कोशिकाओं recentrifug । महाप्राण ने पंजाबियों supernatant.
- FACS बफर (1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड [EDTA], 1x पंजाबियों, और ०.२% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन [BSA]) के २०० मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
- FACS बफ़र की कुल मात्रा कितनी कोशिकाओं मौजूद हैं पर निर्भर हो जाएगा, लेकिन एकाग्रता होना चाहिए १,०००-३,००० कोशिकाओं/µ l. 3 नमूनों में कोशिकाओं की संख्या और औसत कोशिकाओं की एकाग्रता की गणना. यदि आवश्यक हो तो अधिक FACS बफ़र जोड़ें ।
- प्रदर्शन प्रवाह cytometry पर > ५०,००० कोशिकाओं को निलंबित कोशिकाओं के साथ, जब वे विश्लेषण नहीं किया जा रहा है बर्फ पर कोशिकाओं को रखते हुए । व्यंजक में परिवर्तनों को रिकॉर्ड करने के लिए 530/40 फ़िल्टर (FITC, AF488, GFP, आदि) का उपयोग करें . उपयुक्त फ्लोरोसेंट वोल्टेज का निर्धारण एक अनुपचारित नियंत्रण सेल नमूना का उपयोग कर और वोल्टेज सेट करने के लिए फ्लोरोसेंट चोटी दर्ज की तीव्रता स्पेक्ट्रम के बीच में हो । नमूनों को लगभग ५,००० कोशिकाओं के म्यान गति पर भागो/
- डेटा निर्यात और एक प्रवाह cytometry कार्यक्रम पर FCS फ़ाइलों का विश्लेषण (यानी, FlowJo) पर गेटिंग पहले आगे तितर बितर बनाम की ओर लाइव कोशिकाओं के लिए तितर बितर और फिर आगे तितर बितर ऊंचाई पर singlets के लिए बनाम क्षेत्र । फिर, लक्षित और नियंत्रण आबादी में सापेक्ष GFP अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए हिस्टोग्राम पर GFP चैनल डेटा कल्पना ।
5) क्रोमेटिन Immunoprecipitation द्वारा क्रोमेटिन का विश्लेषण (चिप) qPCR द्वारा पीछा किया
- ३,०००,००० कोशिकाओं और ES मीडिया के 10 मिलीलीटर (१ १०-प्रत्येक प्रयोगात्मक या नियंत्रण शर्त के लिए मुख्यमंत्री प्लेट) के साथ एक 10 सेमी प्लेट में mESCs भाजित । अगले दिन, CEM-युक्त या CEM-मुक्त मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें । CEM उपचार के ४८ घंटे के बाद, पुराने मीडिया महाप्राण । 1x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोकर महाप्राण । अगले, ०.२५% trypsin के साथ कोशिकाओं अलग कर देना, और ES मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ trypsin बुझाने । गणना और शर्त प्रति १०,०००,००० कोशिकाओं का एक नमूना अलग ।
- 5 मिनट के लिए ३०० x g पर १०,०००,००० सेल नमूनों में से प्रत्येक नीचे स्पिन ।
- 1x पंजाबियों के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली resuspend और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं resuspend ।
- सीआईए फिक्स बफर के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली resuspend (५० मिमी पीएच 8, 1 मिमी EDTA पीएच 8, ०.५ मिमी ईथीलीन ग्लाइकोल-भा [ß-aminoethyl ईथर]-n, n, n ', N'-tetraacetic अम्ल [EGTA] ph 8, and १०० mM सोडियम क्लोराइड [NaCl]). 1 मिलीलीटर 11% formaldehyde समाधान जोड़ें और तुरंत नमूने 5x-10x उलटा । 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना मशीन ।
- जोड़ें २.५ एम glycine की ०.५ मिलीलीटर । नमूने तुरंत उलटा और 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना मशीन ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १,२०० x g पर नमूना केंद्रापसारक । महाप्राण supernatant ।
- सीआईए कुल्ला 1 (५० mm HEPES पीएच 8, १४० mm NaCl, 1 mm EDTA पीएच 8, 10% ग्लिसरॉल, ०.५% Nonidet पी-४० [NP40], और ०.२५% ट्राइटन X100) के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend । 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना मशीन 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १,२०० x g पर यह केंद्रापसारक ।
- सीआईए कुल्ला 2 के 10 मिलीलीटर (10 मिमी tris [hydroxymethyl] aminomethane [tris] पीएच 8, 1 मिमी EDTA पीएच 8, ०.५ मिमी EGTA पीएच 8, और २०० मिमी NaCl) में गोली फिर से स्थगित । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १,२०० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
- धीरे सीआईए कतरनी बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें (०.१% एसडीएस, 1 मिमी EDTA, और 10 मिमी Tris पीएच 8) शंकु ट्यूब के पक्ष के साथ बंद गोली बाधित बिना किसी भी नमक धोने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए १,२०० x g पर नमूना केंद्रापसारक । धो चरण दोहराएँ.
- सीआईए कतरनी बफर और ताजा तंग अवरोधकों के ९० µ एल में गोली resuspend (leupeptin का एक मिश्रण का उपयोग करें, chymostatin, और pepstatin 10mg/एमएल में एक साथ एक भंग DMSO में एक 1, 000x शेयर समाधान बनाने के लिए, 10 µ जी की एक अंतिम एकाग्रता बनाने/एमएल) । बर्फ13,14पर सब कुछ रखते हुए sonication-बढ़ाने nanodroplets के 10 µ एल जोड़ें ।
- एक ग्लास ट्यूब के समाधान के १०० µ एल स्थानांतरण और ट्यूब टोपी ।
- ३.५ मिनट के लिए नमूनों को Sonicate (सेल लाइन और कोशिकाओं की संख्या के आधार पर निर्धारित) । नमूने overheating से बचने के लिए, 2-ंयूनतम-अधिकतम चक्र बार में नमूनों की प्रक्रिया यदि कुल sonication समय 2 मिनट से अधिक है ।
नोट: केंद्रित ultrasonicator यहां एक उच्च आवृत्ति (५०० kHz) पर कार्य करता था । ५५ डब्ल्यू की एक ध्वनिक शक्ति पर मशीन भागो sonication अवधि प्रत्येक व्यक्ति प्रयोगशाला द्वारा पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए । - प्रत्येक sonicated क्रोमेटिन नमूना एक नया १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ८,००० x g पर ट्यूबों स्पिन ।
- कतरनी दक्षता का विश्लेषण करने के लिए और क्रोमेटिन के सापेक्ष राशि को बढ़ाता है, चिप किट निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ।
नोट: निर्धारित डीएनए एकाग्रता spectrophotometrically (उदाहरणके लिए, एक डीएनए nanodrop साधन का उपयोग करके), और चलाने ~ २०० डीएनए के एनजी 1% agarose जेल पर सत्यापित करें कि क्रोमेटिन लगभग २००-५०० sonicated (बीपी) आकार में करने के लिए basepairs है । - immunoprecipitation करने और क्रोमेटिन को अलग करने के लिए, चिप किट निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ।
नोट: उच्च डीएनए सांद्रता के साथ नमूनों की immunoprecipitation के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस पर रेफरेंस बफर गर्म और elute के नमूने 30 µ एल के साथ 2x के रेफरेंस बफर (1 मिनट के लिए कताई हर बार). - qPCR करने के लिए, एक ३८४-well प्लेट में रिएजेंट लोड । 2x विषम cyanine डाई मास्टर मिश्रण के 5 µ एल जोड़ें, प्रत्येक प्राइमर, पानी के २.५ µ मीटर, और ०.१-10 प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए डीएनए के एनजी ।
- डिजाइन प्राइमर बढ़ाना करने के लिए ५०-१०० बीपी amplicons, और सीटी मूल्यों एक घर रखने जीन, intracisternal एक प्रकार के कणों (आईएपी) के लिए सामान्यीकृत हैं ।
नोट: आगे qPCR विधियों के लिए, किट निर्माता का प्रोटोकॉल देखें । Oct4 लोकस को टारगेट करने के लिए इस्तेमाल किया गया प्राइमरी सेट था: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC । आईएपी लक्ष्य करने के लिए इस्तेमाल किया नियंत्रण प्राइमर सेट था: (च) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC । - प्राइमरों और वांछित उत्पाद के आधार पर, 1 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस के एक एनीलिंग तापमान के ४० चक्र के साथ qPCR चलाते हैं ।
नोट: परिणामी डेटा quantitated के बीच डेल्टा डेल्टा सीटी तुलना का उपयोग कर रहा था, सीआईए के साथ: आईएपी से अधिक सामान्यीकृत Oct4 . अंतिम विश्लेषण परिणाम तपसिल प्रयोगात्मक नमूनों के औसत के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं, मतलब से मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत त्रुटि के साथ.
- डिजाइन प्राइमर बढ़ाना करने के लिए ५०-१०० बीपी amplicons, और सीटी मूल्यों एक घर रखने जीन, intracisternal एक प्रकार के कणों (आईएपी) के लिए सामान्यीकृत हैं ।
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Representative Results
हम हाल ही में CEMs विकसित की है और यह दर्शाता है कि इस तकनीक को जीन अभिव्यक्ति और एक रिपोर्टर लोकस में एक खुराक पर निर्भर और प्रतिवर्ती तरीके से क्रोमेटिन पर्यावरण को विनियमित लागू किया जा सकता है । चित्रा 1में, लीड CEM, CEM23, का एक मॉडल दिखाया गया है । HDAC मशीनरी HDAC अवरोधक जो, इस मामले में, GFP Oct4 लोकस में डाला रिपोर्टर है द्वारा रिपोर्टर लोकस के लिए भर्ती है ।
हम सीआईए mESCs में Oct4 लोकस में CEM प्रणाली की विशेषता की मांग की । क्योंकि कोशिकाओं GFP एक्सप्रेस, यह जल्दी से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ रिपोर्टर की अभिव्यक्ति की कल्पना संभव था । कोशिकाओं CEM23 के १०० एनएम के साथ इलाज के ४८ घंटे के बाद imaged थे, अनुपचारित कोशिकाओं के साथ साथ । चरण छवियां स्वस्थ mESCs, जो महत्वपूर्ण है क्योंकि अस्वस्थ या विभेदित mESCs एक गैर विशिष्ट GFP दमन का संकेत होता दिखा । प्रतिदीप्ति छवियों नियंत्रण कोशिकाओं में एक उज्ज्वल GFP अभिव्यक्ति और CEM23 के साथ इलाज mESCs में एक कम GFP अभिव्यक्ति दिखाते हैं । प्रतिनिधि छवियां चित्र 2में प्रदर्शित की जाती हैं ।
GFP व्यंजक में परिवर्तनों का अंदाजा लगाने के लिए, फ़्लो cytometry का उपयोग किया गया. फिर, सीआईए mESCs ४८ घंटे के लिए CEM23 के १०० एनएम के साथ इलाज किया गया । प्रयोगात्मक CEM23 और नियंत्रण कोशिकाओं के साथ इलाज कोशिकाओं प्रवाह cytometry के लिए तैयार थे, का उपयोग कर > १००,००० नमूने प्रति कोशिकाओं । लगातार, हम एक > 30% GFP-CEMs के साथ इलाज उन लोगों के बीच में व्यक्त कोशिकाओं में कमी मनाया । एक प्रतिनिधि हिस्टोग्राम चित्रा 3में दिखाया गया है ।
एक बार CEM प्रेरित GFP जीन अभिव्यक्ति कमी का सबूत दिखाया गया था, हम क्रोमेटिन चिप का उपयोग कर वातावरण में परिवर्तन के लिए परीक्षण किया । चिप के लिए नमूनों की तैयारी के लिए एक महत्वपूर्ण कारक क्रोमेटिन sonication की हद है । नमूने के रूप में सुसंगत है और ठीक से संभव के रूप में बाल काटना, १०,०००,००० कोशिकाओं ३.५ मिनट के लिए sonicated थे २०० और ५०० के बीच क्रोमेटिन प्राप्त करने के लिए आकार में बीपी (चित्रा 4) । क्योंकि हम परिकल्पना की है कि दमन CEMs के लिए बाध्यकारी थे और रिपोर्टर को HDAC प्रोटीन और दमित परिसरों की भर्ती, हम हिस्टोन पूंछ acetylation में परिवर्तन के लिए परीक्षण किया । हिस्टोन 3 Lysine 27 acetylation (H3K27ac) सामांयतः जीन के transcriptional प्रारंभ साइट (TSS) के साथ पाया जाता है । हम H3K27ac के लिए एक एंटीबॉडी के साथ चिप प्रदर्शन किया और फिर प्राइमर के साथ एक qPCR प्रदर्शन ऊपर और TSS के बहाव सेट । परिणाम बताते है कि CEM23 के १०० एनएम के साथ एक ४८ घंटे के उपचार के लक्ष्य लोकस पर H3K27ac के स्तर में कमी आई जब नियंत्रण कोशिकाओं CEMs के साथ इलाज नहीं की तुलना में (p < ०.०१, दो-पुच्छ छात्र का t-परीक्षण के साथ तीन जैविक प्रतिकृति, चित्रा 5) ।
चित्रा 1 : CEMs बाँध को सीआइए: Oct4 FKBP और तार अंतर्जात epigenetic मशीनरी के लिए भर्ती के माध्यम से लोकस । CEM प्रणाली के मॉडल को प्रोटीन के रूप में Gal4-FKBP से पता चलता है डीएनए लंगर । CEM बाँध के FK506 भाग को FKBP और HDAC अवरोधक रंगरूट अंतर्जात HDAC प्रोटीन को दमित GFP. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : प्रतिदीप्ति के साथ माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESCs) की छवियां सीआइए: Oct4 -GFP रिपोर्टर । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों CEM उपचार पर GFP अभिव्यक्ति में कमी दिखा । शीर्ष पैनल अनुपचारित मीडिया के साथ बड़े mESCs के चरण और फ्लोरोसेंट छवियों को दर्शाता है । नीचे पैनल चरण और ४८ घंटे के लिए CEM23 के १०० एनएम के साथ इलाज mESCs के फ्लोरोसेंट दिखाता है । छवियों ACS सिंथेटिक जीवविज्ञान12से अनुमति के साथ अनुकूलित । कॉपीराइट (२०१८) अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : प्रवाह cytometry विश्लेषण CEM23 उपचार पर mESCs में GFP की एक कम अभिव्यक्ति quantitates। CEM23 बिना mESCs (नीला) ४८ घंटे (लाल) के लिए CEM23 के १०० एनएम के साथ इलाज mESCs के साथ तुलना की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : Sonication क्रोमेटिन की वर्दी है, और एक धब्बा २०० और ५०० बीपी के बीच दिखाई दे रहा है । चिप-qPCR प्रदर्शन करने के लिए, mESCs से क्रोमेटिन sonicated था । प्रत्येक नमूना लगभग १०,०००,००० कोशिकाओं है, जो ३.५ मिनट के लिए sonicated थे शामिल हैं, इसी प्रकार-कतरनी क्रोमेटिन नमूनों के बीच २०० और ५०० बीपी लंबाई में उत्पादन करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : CEM23 उपचार सीआईए लोकस में H3K27ac में कमी का कारण बनता है । चिप-qPCR क्रोमेटिन वातावरण में परिवर्तन के लिए परीक्षण करने के लिए किया गया था । CEM23 के १०० एनएम के साथ एक ४८ घंटे के उपचार के बाद, H3K27ac में एक कमी सीआईए में मनाया गया था : Oct4 (* *पी < ०.०१, दो पूंछ छात्र के टीपरीक्षण के साथ तीन जैविक प्रतिकृति । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां, हमने बताया कि हाल ही में विकसित CEM प्रणाली एक खुराक पर निर्भर तरीके से एक विशिष्ट जीन में जीन अभिव्यक्ति और क्रोमेटिन पर्यावरण को विनियमित करने के लिए लागू किया जा रहा है । हम विशिष्ट अंतर्जात क्रोमेटिन विनियामक प्रोटीन के चयनात्मक भर्ती के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में शामिल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक सटीक तरीका प्रदान करते हैं । यह एक उच्च मॉड्यूलर तकनीक है कि कैसे अलग प्रोटीन की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है और क्रोमेटिन-कंसर्ट में जटिल काम को संशोधित करने के लिए ठीक से क्रोमेटिन पर्यावरण को विनियमित, साथ ही साथ अध्ययन कैसे इन प्रक्रियाओं dysregulated रहे हैं, के साथ जीन विशिष्टता को प्राप्त करने का लाभ ।
यहां तीन तरीकों से नई तकनीक के साथ क्रोमेटिन संरचना और जीन अभिव्यक्ति में बदलाव की कल्पना का प्रदर्शन किया गया । CEMs के साथ विशिष्ट लक्षित loci के गड़बड़ी के बाद, जीन अभिव्यक्ति के लिए वास्तविक समय परिवर्तन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । फिर, जीन अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन निर्धारित अंतिमबिंदु पर प्रवाह cytometry के साथ अधिक मात्रा में मापा जा सकता है । अंत में, क्रोमेटिन पर posttranslational epigenetic चिह्नों में परिवर्तन चिप द्वारा जांच की गई; विशेष रूप से, इस मामले में, H3K27ac । हम चिप के साथ HDAC भर्ती परीक्षण नहीं किया है क्योंकि HDACs की विविधता के qPCR है कि संगीत समारोह में एक ही लोकस में अभिनय । यह संभावना है कि HDAC एंजाइमों की एक heterogenous जनसंख्या भर्ती किया गया था और यह, इसलिए, तकनीकी रूप से उन सभी चिप द्वारा परीक्षण करने के लिए मुश्किल हो सकता है । एक पहले प्रकाशित काम में, हम दिखा दिया है कि एक GAL4 संलयन द्वारा HDAC3 की सीधी भर्ती जीन अभिव्यक्ति और क्रोमेटिन संशोधन पर चिप12द्वारा इसी तरह की गतिविधि का कारण बना । यदि एक गैर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर संग्राहक जा रहा है, जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन भी (1) रिवर्स transcriptase qPCR या (2) पश्चिमी सोख्ता, या इमेजिंग और के साथ प्रवाह cytometry के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ एक आरएनए अभिव्यक्ति विश्लेषण से मापा जा सकता है फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी ।
सीआईए सिस्टम12की तरह वर्तमान CIP आधारित तकनीकों के संबंध में, इस CEM प्रौद्योगिकी लक्ष्य जीन को अंतर्जात epigenetic संग्राहक की भर्ती का लाभ है । सेल की अपनी मशीनरी पुनः निर्देशित अभिव्यक्ति संग्राहक के एक अधिक शारीरिक प्रासंगिक साधन बनाता है । Exogenously एक्सप्रेस मास्टर एंजाइमों टोपी और प्रतिलेखन कारकों की तरह, उनके वृद्धि हुई अभिव्यक्ति से साइड इफेक्ट में परिणाम हो सकता है, विशेष रूप से, जबकि सक्रिय रूप से जीन लोकस के लिए भर्ती नहीं किया जा रहा.
जबकि इस लेख HDAC अवरोधकों, कई अंय अवरोधकों या प्रोटीन नियोक्ताओं से बना CEMs के साथ इस उपंयास प्रणाली की कार्यक्षमता से पता चलता है HDAC अवरोध करनेवाला के स्थान पर संश्लेषित किया जा सकता है । जीन सक्रियण प्राप्त करने के लिए, HAT अवरोधक-या HDMT अवरोधक आधारित CEMs संश्लेषित किया जा सकता है । दमन और फिर एक ही जीन को व्यक्त करने के लिए, यह एक दमनकारी CEM के साथ कोशिकाओं का इलाज संभव है, उंहें नियमित रूप से मीडिया के साथ धोने, और फिर एक सक्रिय CEM जोड़ें । यह एक स्वच्छ प्रणाली के लिए दमन की भर्ती की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए और एक ही जीनोमिक क्षेत्र के परिसरों को सक्रिय करने की अनुमति होगी । जब भविष्य CEMs डिजाइन, कई विशेषताओं सेल पारगम्यता, अवरोध करनेवाला शक्ति, संरचना, और निरोधात्मक कैनेटीक्स सहित, पर विचार किया जाना चाहिए । FK506 और भर्ती moiety के बीच linker लंबाई CEMs की पारगम्यता को प्रभावित करेगा, साथ ही साथ भर्ती प्रोटीन की स्थिति. जब दो CEMs है कि केवल linker लंबाई में मतभेद की तुलना, छोटा लिंकर के साथ CEM और12प्रभावी था । हालांकि यह सीधे यहां परीक्षण नहीं किया गया है, उच्च प्रभावशीलता अधिक से अधिक सेल पारगम्यता का परिणाम है । रासायनिक संरचनाओं के साथ अवरोधकों का चयन हिस्सा है कि लक्ष्य की सक्रिय साइट बांध में खलल डाले बिना संशोधन के लिए उत्तरदायी भी महत्वपूर्ण है. शक्ति और विशिष्टता भी प्रोटीन का एक दिया वर्ग के लिए एक उच्च शक्ति और विशिष्टता के साथ अवरोधकों का चयन करके विचार किया गया । निषेध के कैनेटीक्स CEMs की प्रभावशीलता को प्रभावित कर सकते हैं । CEMs के साथ अवरोधकों के शामिल बंद दरों पर कम प्रभावी हो जाते हैं ।
वर्तमान CEM प्रौद्योगिकी की एक बाधा लक्ष्य जीन लोकस में एक Gal4-बाध्यकारी सरणी की आवश्यकता है । Oct4 सीआईए लोकस के अलावा किसी अन्य क्षेत्र में CEMs की भर्ती करने के लिए, इंजीनियर Gal4 ऊपर सक्रियण अनुक्रम (यूएएस) वैज्ञानिक समुदाय के लिए उपलब्ध लाइनों के सैकड़ों में से किसी का इस्तेमाल किया जा सकता है । एक तरह से प्रणाली और अधिक मॉड्यूलर बनाया जाएगा रासायनिक epigenetic एंजाइम भर्ती10,11,15के साथ एक निष्क्रिय Cas9 (dCas9) को शामिल करके है । CRISPR-Cas9 प्रणाली से इस nuclease-मृत प्रोटीन को अभी भी जीनोम के किसी भी क्षेत्र में भर्ती किया जाएगा जिसके लिए एक गाइड आरएनए (gRNA) तैयार की गई है, लेकिन इससे डीएनए में कटौती नहीं होगी. एक dCas9-FKBP फ्यूजन का प्रयोग, FKBP घटक CEMs भर्ती जहां dCas9 भर्ती है, बहुत आसानी और संभावित लक्ष्य जीन के लचीलेपन में वृद्धि होगी । इस तकनीक का उपयोग करने के लिए एक संभावित चिकित्सीय या एक साधन है जिसके द्वारा reversibly और अस्थाई क्रोमेटिन स्तर पर रोग तंत्र का अध्ययन करने के रूप में रोग-प्रासंगिक जीन लक्ष्य की कल्पना करो ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक हैथवे और जिन प्रयोगशालाओं के सदस्यों को उनके मददगार विचार-विमर्श के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । लेखक भी पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए दान Crona और इयान मैकडोनाल्ड धंयवाद । इस काम के हिस्से में अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (N.A.H.) से अनुदान R01GM118653 द्वारा समर्थित किया गया; और अनुदान R01GM122749, R01CA218600, और R01HD088626 से अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (जे जे के लिए) । इस कार्य के लिए एक टियर 3 और एक छात्र अनुदान के लिए UNC Eshelman संस्थान से नवाचार के लिए (एन. ए. एच और ए. एम. सी., क्रमशः) का भी समर्थन किया गया. एक टी-३२ GM007092 (ए. एम. सी.) से अतिरिक्त फंडिंग इस काम का समर्थन किया । प्रवाह cytometry डेटा unc Lineberger व्यापक कैंसर केंद्र के लिए एक P30 CA016086 कैंसर केंद्र कोर समर्थन अनुदान द्वारा वित्त पोषित की सुविधा के cytometry कोर में प्राप्त किया गया था ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Corning | 10-013CV | |
NEAA | Gibco | 11140-050 | |
HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
Sonicator | Covaris | E110 | |
Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
PBS | Corning | 46-013-CM | |
BSA | Fisher | BP9700 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
EDTA | Fisher | S311-100 | |
NaCl | Fisher | S271-1 | |
Glycerol | Fisher | G33-1 | |
Tris | Fisher | BP152 | |
NP40 | Roche | 11754599001 | |
Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
Glycine | Fisher | BP381-500 | |
TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
Lif-1C-alpha - producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
References
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