Summary
クロマチン環境規制、適切な遺伝子発現に必要な重要なプロセスです。ここでは、クロマチン修飾の採用によって遺伝子発現を制御する手法について述べる遺伝子特異的かつ可逆的に機械。
Abstract
クロマチンの凝縮の規制は、高等真核生物における遺伝子発現を制御する重要なプロセスです。クロマチンの凝縮と遺伝子発現制御は通常、多くの病気で中断されたが研究し、アクションのこれらのメカニズムを制御する特定の軌跡、内因性、および可逆メソッドを欠いてきた。この問題に対処するため開発し、遺伝子調節塩基分子の特徴します。二官能性の分子の 1 つのコンポーネントは、対立遺伝子特定の遺伝子座に採用されるので、DNA タンパク質アンカーにバインドします。その他のコンポーネントは、内因性細胞クロマチン修飾機械装置、興味の遺伝子にこれらの蛋白質を募集を行っています。化学のエピジェネティックな修飾剤 (CEMs) と呼ばれるこれらの小さい分子は用量依存的かつ可逆的に遺伝子発現とクロマチン環境を制御することが可能です。ここでは、我々 は CEM アプローチと遺伝子の発現とマウス胚性幹細胞 (mESCs) のOct4遺伝子座にある緑色蛍光タンパク質 (GFP) 記者でヒストンの尾のアセチル化を減少への応用を詳しく説明します。我々 はリードを特徴付ける CEM (CEM23) 蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、クロマチン免疫沈降 (チップ) を使用して量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 続きます。概念的には、 Oct4遺伝子座でこのシステムの力を発揮しながら、CEM 技術はモジュール化され他の細胞型、他のゲノムの遺伝子座に適用できます。
Introduction
クロマチンは、DNA は、ヌクレオソーム粒子を形成するヒストン八量体タンパク質を包んだので構成されます。クロマチンの凝縮の規制は、適切な DNA 修復、レプリケーション、および式1,2,の3重要な仕組みです。細胞が圧縮のレベルを制御する方法の 1 つはまた、さまざまな翻訳後修飾ヒストンの尾の除去です。このような 2 つの変更には、遺伝子の活性化に最もよく関連付けられる (1) リジンのアセチル化と遺伝子の活性化や抑制、アミノ酸コンテキストに応じて関連付けることができます (2) リジンのメチル化が含まれます。アセチル化とメチル化マークの追加により触媒されるヒストン コリンアセチルトランスフェラーゼ (帽子) およびヒストンのメチル基転移酵素 (HMTs)、それぞれがマークの除去はヒストン脱アセチル化酵素 (Hdac) とヒストン脱メチル化酵素 (焦点によって行われます)、それぞれ4,5。これらの蛋白質の存在が知られていた何十年も、多くのメカニズムを定義するどのクロマチン修飾機械の遺伝子発現を適切に規制する作品が残っています。クロマチン規制プロセスは多くの人間の病気の調節不全なので新しい力学的洞察の将来の治療への応用に 。
アッセイ体内クロマチン (CiA) は、特定の軌跡6機械募集のクロマチン修飾を制御する近接 (CIP) の化学誘導を使用して最近説明手法です。この技術は、タンパク質のヒストン修飾、クロマチンの remodelers トランスクリプション要因6,7,8,9などのクロマチン動態の拡大のリストを勉強する使用されています。Cip 法に基づいたクロマチンが外に表現された蛋白質のテザリングもによって拡張されている過去の非変更された遺伝子座を調節する CiA 非アクティブ クラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す CRISPR 関連タンパク質 (dCas9) で使用10,11. Oct4遺伝子座、mESC ゲノムの高発現と厳しく規制された地域で GFP レポーター遺伝子を表現する CiA システムの mESCs が変更されました。外に表明したヘテロクロマチン蛋白質 1 (HP1)、H3K9me3 を結合し、抑圧的な印 (例えばH3K9me3) を伝達酵素の用量依存的かつ可逆的な募集を記述するこのシステムが適用された以前は、DNA とメチル化6。このタイプの募集戦略を達成するために、mESCs は GFP レポーターの上流 Gal4 結合配列に結合する DNA タンパク質アンカーの Gal4 にリンク FK506 結合タンパク質 (FKBP) を表現するプラスミッドに感染しています。セルは HP1 に接続 FKBP ラパマイシン結合ドメイン (FRB) にも感染しています。MESCs は、CIP の低ナノモル濃度にさらされれば、ラパマイシン、FRB と FKBP、ターゲット遺伝子座で一緒に取り込まれます。ラパマイシン標的治療の日、ターゲット遺伝子の発現が抑制され、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーによって証明されるよう、ヒストンのアセチル化を減少すると、チップと重亜硫酸塩の配列によって示されています。開発とこのアプローチの妥当性クロマチン研究と規制の分野で重要な進歩をされている、1 つの欠点はクロマチン修飾の外因性表現が求められる機械。
内因性の生理学的に関連した酵素のみの募集に基づく技術よりモジュラー システムの設計し、CEMs (図 1)12と呼ばれる塩基分子の特徴します。CEMs の 1 つのコンポーネントが含まれますラパマイシンのようしっかりと具体的にバインド FK506 には FKBP に。したがって、CEMs は CiA mESCs Oct4遺伝子座には募集まだ。CEMs の他のコンポーネントは、内因性クロマチン修飾機械を結合する部位です。パイロット研究では、CEMs HDAC の抑制剤が含まれているをテストしました。Hdacs をしたを募集する阻害剤を使用してのコンセプトは直感に反するようだ、阻害物質は興味の遺伝子に HDAC 活動を募集することができるそれにもかかわらず。これは、(1)、酵素を解放エリアに位置し、座 (2) 維持する HDAC 阻害 hdacs を非抑制したの密度を増加させ、バインド hdacs を抑制した抑圧的な複合体を採用、軌跡へ、HDAC のリダイレクトで(3)、または両方の組み合わせ。以前の研究では、CEMs が正常に用量と時間依存の方法でだけでなく、急速に可逆的であった方法で GFP レポーターを抑制できたことを示しました (すなわち、24 時間以内)12。蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、および機能を使用して、チップ qPCR6を使用してクロマチン環境を制御する遺伝子の発現を制御する紹介 CEM 技術の能力を特徴とします。ここを使用して、クロマチン生物学に関連する質問に答えるこの制度の適応を容易にする CEMs を特徴付けるのための方法について述べる.
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Protocol
1) レンチを製造ライン培養
- 成長低通路 (通路 30 未満) では、新鮮な高グルコース ダルベッコ人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 293 t 細胞のイーグル、変更された培地 (DMEM) 基本メディア添加 10% 牛胎児血清 (FBS) 10 mM HEPES、非本質的なアミノ酸 (NEAA) ペン × 1/連鎖球菌、2-5% CO2と 37 ° C の定温器で mercaptoenthanol。すべての 3-5 d セルを分割および > 95% の合流になる前に。
- 18 × 106 15 cm プレート (ウイルスごとに制作用 15 cm プレート 1 枚) あたりの通路 293 t HEK 細胞。
- 15 cm 形式の古いメディアを吸引、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 10 mL を追加し、吸引、PBS、0.05% トリプシンの 3 mL を加えます。8 分 37 ° C、ロッキングと孵化の途中のセルをタップでトリプシンで細胞を孵化させなさい。
注: この手順の目標は、単一細胞懸濁液に細胞を得ることです。
- 15 cm 形式の古いメディアを吸引、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 10 mL を追加し、吸引、PBS、0.05% トリプシンの 3 mL を加えます。8 分 37 ° C、ロッキングと孵化の途中のセルをタップでトリプシンで細胞を孵化させなさい。
- セルは、次の日に 60-80% の confluency に達して、psPAX2 プラスミド、pMD2.G プラスミドの 4.5 μ g、興味の遺伝子にレンチ ウイルス対応配信ベクトルの 18 μ g 13.5 μ g とポリエチレンイミン (PEI) トランスフェクションを実行 (すなわち、FKBP Gal4) 108、プリンスエド ワード島とトランスフェクション メディアの 1.8 mL μ L。
- 優しく DNA、プリンスエド ワード島、および 15 mL の円錐管にトランスフェクション メディア ミックス、室温、15 分間サンプルをインキュベートし、15 cm プレートに滴下追加。
注: は、この手順の後は、すべての試薬として安全検査がライブ ウイルスが含まれて安全性対策しすべて制度に従って、適切な使用をしてください。
- 優しく DNA、プリンスエド ワード島、および 15 mL の円錐管にトランスフェクション メディア ミックス、室温、15 分間サンプルをインキュベートし、15 cm プレートに滴下追加。
- トランスフェクションと 5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで孵化の 16 時間後メディアを吸い出しなさいし、優しく 15 cm プレートに新鮮な 293 HEK メディア (37 ° C の水浴中 prewarmed) を追加します。メディア変更後 48 時間 5% CO2と 37 ° C のインキュベーターでセルを孵化させなさい。ウイルス、収穫期になります。
2) 感染症のマウス胚性幹細胞 (mESC) レンチで
- 低通路 (通路 35 未満) を拡大、ESC グレード FBS、10 mM HEPES 20% を添加した高グルコース DMEM 基本メディアにフィーダー無料適応 CiA mESCs、1 x NEAA、ペン/連鎖球菌、2-mercaptoenthanol、1: 500 の白血病阻害因子 (LIF) 5 %37 ° C の定温器CO2。
注: バッチで収集されたされ、-80 ° C で凍っている COS LIF 産生細胞の培養上清から、LIF を取得します。- 1x PBS、0.1% ゼラチンで 1-3 h の虫と 1x PBS で洗浄した後されている板の細胞を成長します。毎日セルをフィードし、それらに彼らの密度に応じてすべての 2-3 d を分割します。
注: 形態、胚性幹細胞 (ES) 植民地する必要があります小さな、丸いと互いから明瞭です。
- 1x PBS、0.1% ゼラチンで 1-3 h の虫と 1x PBS で洗浄した後されている板の細胞を成長します。毎日セルをフィードし、それらに彼らの密度に応じてすべての 2-3 d を分割します。
- MESC 12 ウェル プレート形式 (100,000 細胞/ウェル) に感染する前に 1 d の通路します。
- 診断とセルをカウントします。10 cm 形式で育った細胞、古いメディアを吸引、5 mL の 1x PBS を追加、PBS を吸引し、0.25% トリプシンの 1 mL を追加します。8 分 37 ° C、ロッキングと孵化の途中のセルをタップでトリプシンで細胞を孵化させなさい。この手順の目的は、単一細胞懸濁液に細胞を得ることです。
- 48 h 293T15 cm ウイルスからメディアを変更した後包装手順 1.4 からセル削除し、50 mL コニカル チューブに上清を転送します。
- 細胞の残骸をペレットに 5 分間、300 x gで上清を遠心します。
- 0.45 μ m 膜上清をフィルター処理します。
注: するいくつか他の材料することができますウイルスを保持し、利回りを大幅に削減、界面活性剤フリー セルロース アセテート (SFCA) 膜を使用してください。 - SW32 ローターの遠心分離機を使用して超遠心法とは、ウイルスを集中し、4 ° C で 2.5 時間 20,000 rpm (72,000 ~ x g) でスピン
- ウイルスは、遠心の下で集中して、間は、polybrene の 5 μ g/mL を含む新鮮な ES メディアで 12 ウェル プレートに CiA mESCs を扱います。
- ウイルス濃度が完了したら、慎重に上清を吸引し、1 × pbs 100 μ L にウイルス ペレットを中断 (余分な泡を避けるため)。
- 1.5 mL および microfuge の管にウイルスと 1x PBS を追加します。渦/振るチューブ 300 g x (または最低の設定で) でウイルスを完全に中断します。泡を削除する 5-10 s のミニ卓上遠心管内スピンダウンします。
- 12 ウェル プレートの各ウェルにウイルスの 30 μ L を追加します。渦巻き模様のプレートと 20 分間 1,000 x gでプレートを遠心分離します。
注: 配信構築サイズに逆比例ウイルスの力価によって追加されたウイルスの量を変えることができます。- または、フラッシュが液体窒素でウイルスを凍結し、-80 ° C で保存ただし、ウイルスを凍結はウイルスの力価を下げます。
- 37 ° C の定温器に戻って 12 ウェル プレートを置き、次の朝 (~ 16 h) 後で新鮮な ES メディアでメディアの変更を (前述の手順 2.1)。
- 感染症の 48 時間後 (すなわちピューロマイシンの 1.5 μ g/mL、10 μ g/mLブラストサイジン等) の適切な抗生物質を追加することによってウイルスのプラスミッドの統合セルの選択します。毎日メディアを変更し、細胞の大半がフローティング/デッド場合 1 × PBS のセルを洗ってください。5% CO2と 37 ° C の定温器で 72 96 h のセルに選択メディアを保管します。
3) 化学のエピジェネティックな修飾剤 (CEM) s 準備と治療
- ジメチルスルホキシド (DMSO) に 1 mM のストック濃度と作業濃度 100 μ M の粉末の CEM を中断します。
- セル後 72 96 h、12 ウェル フォーマット 100,000 細胞/ウェルでの mESCs の分割の選択を受けています。その後 24 時間の 5% CO2と 37 ° C のインキュベーターでセルを孵化させなさい、100 のメディア ソリューションを準備 nM CEM ES メディア。1 mL で CiA mESC のフィード/まあこのメディアを使用します。コントロールとして、任意の追加の CEMs なしでセルの井戸を保ちます。
- メディアを変更して古いメディアを吸引してから 1 mL を追加/作りたての CEM を含むまたは ES の CEM 無料メディアのすべての 24 h 実験の持続期間のため。
4) 顕微鏡やフローサイトメトリーによる発現の解析
- CEM 治療の 48 時間後画像と CEM 治療せずセル 100 nM 蛍光顕微鏡を用いた CEM。フェーズまたは明視野観察を使用して 20 倍の倍率; で mESC 形態を記録する代表的な画像を取るセルは必要がありますいくつかの分化した細胞とのラウンド コロニーを形成しています。FITC 蛍光チャネルの下で細胞の両方の条件をイメージします。
- メディアを吸引、1 ml の 1x PBS のセルを洗浄、吸引、PBS、EDTA で 8-10 分のための 0.25% トリプシンの 0.25 mL の追加によってコントロールとフローサイトメトリー用 CEM 処理細胞を分離します。
- セルがもはや大きな塊で顕微鏡で見て確認してください。20 倍の倍率を使用します。セルは、単一細胞懸濁液中には表示されない場合のピペット優しく上下にセルを完全に trypsinize に P1000 ピペットと。
- 新鮮なメディアの 1 mL のトリプシンを消す血清ピペットと高速で細胞を再懸濁します (または P1000 ピペットおよびチップを使用して) 単一細胞懸濁液にあるセルまで。
- 300 x gで 5 分間吸引上澄みで細胞をスピンします。1x PBS で洗浄し、セルを recentrifuge します。PBS の上清を吸引します。
- FACS バッファー (1 mM エチレンジアミン四酢酸 [EDTA]、1 x PBS と 0.2% ウシ血清アルブミン [BSA]) の 200 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
- FACS バッファーの総量はどのように多くの細胞が存在に依存するが、濃度は 1,000-3,000 セルをする必要があります/μ L。 3 サンプル内のセル数をカウント、細胞の濃度を平均します。必要な場合より多くの FACS バッファーを追加します。
- > 50,000 分析されないときに氷で細胞を維持する、浮遊細胞で細胞のフローサイトメトリーを実行します。式の変更を記録するため(FITC、AF488、GFP 等)530/40 フィルターを使用します。無処理細胞サンプルを使用して適切な蛍光電圧を決定しに記録された強度スペクトルの真ん中に蛍光ピーク電圧を設定します。約 5,000 のセル/秒の鞘速度でサンプルを実行します。
- データをエクスポートし、ゲート最初の生きているセルの側方散乱と前方散乱し、シングレットの領域と前方散乱の高さによって (すなわちFlowJo) 流れの cytometry プログラムを FCS ファイルを分析します。次に、ターゲットの相対 GFP 式を決定し、制御するためにヒストグラム上 GFP チャネル データを視覚化集団。
5) クロマチンによるクロマチン免疫沈降 (チップ) 続いて qPCR の解析
- 300 万細胞と ES メディアの 10 mL 10 cm プレート、mESCs に分割 (各 10 cm ワンプレート実験条件を制御または)。次の日は、CEM 含むまたは CEM 無料メディアの 10 mL を追加します。CEM 治療の 48 時間後に、古いメディアを吸い出しなさい。洗うし、5 ml の 1x PBS の細胞を吸引します。次に、0.25% トリプシンで細胞を分離し、ES メディアの 10 mL のトリプシンを癒します。カウントし、条件あたり 1000 万の細胞のサンプルを分離します。
- 300 × gで 5 分で 1000 万の細胞サンプルのそれぞれをスピンします。
- 10 mL の 1x PBS でペレットを再懸濁します、300 x gで 5 分で細胞を recentrifuge します。
- CiA 修正バッファーの 10 mL にペレットを再懸濁します (50 ミリメートル pH 8、1 mM EDTA pH 8、0.5 mM エチレング リコール-ビス [β-アミノエチル エーテル]-N, N, N', N'-四酸 [グリコールエーテルジアミン四酢酸] pH 8、および 100 mM 塩化ナトリウム [食塩])。11% ホルムアルデヒド溶液 1 mL を追加し、サンプル 5 倍 - 10 倍を即座に反転します。10 分間室温でサンプルをインキュベートします。
- 2.5 M のグリシンの 0.5 mL を加えます。サンプルをすぐに反転し、5 分の氷のサンプルをインキュベートします。
- 4 ° C で 5 分間 1,200 x gでサンプルを遠心分離します。上清を吸引します。
- CiA リンス 1 の 10 mL にペレットを再懸濁します (50 mM HEPES pH 8、140 mM の NaCl、1 mM EDTA pH 8、10% グリセロール、0.5% ノニデット P-40 [NP40] と 0.25% トリトン X100)。10 分は 4 ° C で 5 分間 1,200 x gでそれを遠心分離機の氷のサンプルをインキュベートします。
- CiA リンス 2 (10 mM トリス [ヒドロキシメチル] アミノメタン [トリス] pH 8、1 mM EDTA pH 8、0.5 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 pH 8、および 200 mM の NaCl) 10 mL にペレットを再懸濁します。4 ° C で 5 分間 1,200 x gでサンプルを遠心分離します。
- 優しく、ペレットを中断させることがなく塩を洗浄するバッファー (0.1 %sds、1 mM EDTA と 10 mM Tris pH 8) 円錐形の管の側面に沿うせん断 CiA の 5 mL を追加します。4 ° C で 3 分間 1,200 x gでサンプルを遠心分離します。洗浄ステップを繰り返します。
- CiA せん断バッファーと新鮮なプロテアーゼ阻害剤 (leupeptin、ヒトデ、ペプスタチン A の混合溶解 10 mg/mL ごと x 貯蔵液、最終濃度 10 μ G/ml を作る 1,000 を DMSO 中で一緒に使用して) 90 μ L でペレットを再懸濁します。アイス13,14にすべてを維持しながら超音波を高めるナノドロップレットの 10 μ L を追加します。
- ガラス管にソリューションの 100 μ L を転送し、チューブのキャップします。
- 3.5 分のサンプルを超音波 (決定細胞とセルの数に基づいて)。サンプルの過熱を防ぐため、合計超音波処理時間が 2 分を超えた場合に 2 分最大のサイクル タイムのサンプルを処理します。
注: フォーカス ultrasonicator ここで使用関数 (500 kHz) の高周波。55 w. の音響パワーのマシンで実行します。超音波処理期間は、それぞれ独立した研究によって事前に決定する必要があります。 - 各超音波破砕したクロマチン サンプルを新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。スピンで 4 ° C で 2 分間 8,000 x gチューブ
- せん断効率を分析し、クロマチンの相対量を定量化するためには、チップ キット メーカーのプロトコルに従ってください。
注: はオンカラム DNA 濃度を決定する (例えば、DNA nanodrop 器具を使用して)、~ 200 を実行し、クロマチンはサイズで約 200-500 ヒト (bp) に超音波処理することを確認する 1% アガロースゲル上の DNA の ng。 - 免疫沈降を実行してクロマチンを分離するには、チップ キット メーカーのプロトコルに従います。
注: の DNA 濃度が高い試料の免疫沈降、37 ° C で溶出バッファーをウォームし、サンプル 2 を溶出溶出バッファー (各時間、回転 1 分) の 30 μ L で x。 - QPCR を実行するためには、384 ウェル プレートに試薬を読み込みます。非対称シアニン色素マスター ミックス × 2 の 5 μ L、2.5 μ M の各追加プライマー、水および 0.1 - 10 ng の DNA のそれぞれの反応。
- 50-100 bp 産物と CT 値を増幅するプライマーを設計の家は維持遺伝子、大槽内ステロイド A 型粒子 (IAP) に正規化されます。
注: さらに qPCR 法キット製造元のプロトコルを参照してください。Oct4遺伝子座をターゲットに使用されるプライマー セットがあった: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT;(R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC。ターゲット IAP に使用されて制御プライマーだった: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA;(R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC。 - プライマーと目的の製品は、1 分の 60 ° C の熱処理温度の 40 のサイクルで、qPCR を実行に基づいています。
注: 結果のデータは、 CiA:Oct4 IAP にわたって正規化とサンプル間のデルタ-デルタ Ct 比較を使用して測定しました。最終的な分析結果は、平均値から標準偏差として表されますエラーで帳票の実験サンプルの平均値として表示されます。
- 50-100 bp 産物と CT 値を増幅するプライマーを設計の家は維持遺伝子、大槽内ステロイド A 型粒子 (IAP) に正規化されます。
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Representative Results
最近、CEMs を開発し、用量依存的かつ可逆的に遺伝子発現とレポーター遺伝子座でクロマチン環境を規制するこの技術を適用できることを示した。図 1に、鉛のモデル CEM、CEM23 が表示されます。HDAC 機械記者軌跡に HDAC 阻害剤である、この場合、 Oct4遺伝子座で挿入される GFP レポーターによって募集しています。
我々 は CiA mESCs Oct4遺伝子座での CEM システムを特徴づけるしようと思う。細胞は、GFP を発現、蛍光顕微鏡による記者の表現をすばやく視覚化することが可能だった。100 投与の 48 時間後セルをイメージしました未処理細胞と一緒に、CEM23 の nM。位相画像表示健康的な mESCs は、不健全なまたは差別化された mESCs が非特異的 GFP 抑圧を示すので重要であります。蛍光画像表示制御細胞における明るい GFP 発現と GFP 発現の低下 mESCs CEM23 と扱われます。図 2に、代表的な画像が表示されます。
GFP 発現の変化を定量化、フローサイトメトリーを使用しました。再び、CiA の mESCs を施した 100 nM CEM23 の 48 時間。サンプルあたり > 100,000 細胞を用いたフローサイトメトリー用 CEM23 と制御細胞実験細胞を作製した.一貫して、CEMs で治療中でも GFP 発現細胞の減少 > 30% を見ました。代表的なヒストグラムを図 3に示します。
CEM 誘起 GFP 遺伝子発現減少の証拠が示された後、我々 はチップを用いたクロマチン環境の変化をテストします。チップのサンプルを準備するための 1 つの重要な要因は、クロマチン超音波照射の範囲です。できるだけ正しくせん断と一貫性のサンプルに、3.5 分間サイズ (図 4) で 200 と 500 bp クロマチンを取得する 1000 万の細胞が超音波。我々 の仮説抑圧 CEMs がバインドされ、HDAC 蛋白質および記者に抑圧的な複合体を採用、ので、我々 はアセチル化ヒストンの尾の変化をテストしました。3 ヒストンのリジン 27 のアセチル化 (H3K27ac)、一般的に遺伝子の転写開始部位 (TSS) に沿って発見します。我々 は H3K27ac の抗体チップを実行し、TSS の下流・上流のプライマー セットと qPCR を行いました。結果は 100 を 48 時間処理を示す CEM23 の nM はターゲット座 CEMs と扱われない制御の細胞と比較して H3K27ac の低下 (p < 0.01, 2 スチューデントの両側t-3 生体テストを複製する図 5)。
図 1:CEMs にバインド、CiA:Oct4FKBP とテザーの内因性エピジェネティック機器採用を通じて軌跡。CEM システムのモデルは、蛋白質・ DNA アンカーとして Gal4 FKBP を示しています。FKBP にバインド、CEM の FK506 部分と HDAC 阻害剤は GFP を抑制する内在性 HDAC 蛋白質を募集します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:蛍光画像によるマウス胚性幹細胞 (mESCs)、CiA:Oct4GFP レポーター 。蛍光顕微鏡画像処理する CEM GFP 発現の減少を示します。上部のパネルは、位相と未処理のメディアに成長した mESCs の蛍光画像を示しています。下部パネル フェーズと 100 mESCs の蛍光表示されます 48 時間 CEM23 の nM。ACS 合成生物学12から許可を適応した画像。著作権 (2018 年) アメリカ化学会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:フローサイトメトリー解析 quantitates CEM23 治療 mESCs の GFP の発現の低下。(青) CEM23 なし mESCs が 100 mESCs と比較された 48 時間 (赤) CEM23 の nM。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:クロマチンの超音波が均一で、塗抹標本は跪く 200 と 500 の間に見えるチップ qPCR を実行するには、mESCs からクロマチンは超音波処理します。各サンプルは、長さ 200 と 500 bp の間同様にせん断クロマチン サンプルを生成する 3.5 分間超音波処理した約 1000 万細胞から成っていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:CEM23 治療 H3K27ac CiA 遺伝子座での減少が発生します。チップ qPCR はクロマチン環境で変更をテストするために行った。100 投与 48 時間後 CEM23 の nM の, H3K27ac の減少が観測されたCiA:Oct4 (* *p < 0.01, 2 スチューデントの両側t-3 つの生物学的複製のテスト。誤差範囲を表す標準偏差)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、用量依存的遺伝子発現と特定の遺伝子のクロマチン環境を規制する適用される最近開発された CEM システムについて述べる。我々 は特定の内因性クロマチン制御調節タンパク質の選択的採用活動によって遺伝子発現の調節に関与するダイナミクスを研究する正確な方法を提供します。これは適用することができます非常にモジュール技術蛋白質-クロマチン修飾の異なる方法を調査する複合動作についてどのようにこれらのプロセスは、調節不全、研究とともに、クロマチン環境を適切に規制するコンサートで、遺伝子特異性を達成するための利益。
ここでは、新しい技術とクロマチン構造と遺伝子発現の変化を可視化する 3 つの方法を示した。CEMs 特定ターゲット遺伝子の摂動後、遺伝子発現のリアルタイム変更は、蛍光顕微鏡による分析でした。遺伝子発現の変化は定義されたエンドポイントでフローサイトメトリーによるより定量的に測定することができます。最後に、クロマチンの翻訳後のエピジェネティックなマークに変更がチップによって検討しました。具体的には、この例で、H3K27ac。呼応する単一遺伝子座で hdacs したの多様性のため、チップ qPCR で HDAC 募集を試しませんでした。酵素 HDAC の異種の人口が採用されましたし、したがって、ことは技術的に難しいチップすべてでそれらをテストする可能性が高いです。以前に公開された作品では、GAL4 融合による HDAC3 の直接採用により、同様の活性が遺伝子発現とクロマチン修飾のチップ12によって引き起こされることを説明してきました。場合は非蛍光レポーターを変調すると、遺伝子発現の変化を逆転写酵素 qPCR で (1) RNA 発現の解析、(2) 蛋白発現の西部のしみが付くこと、またはとイメージングと導電性のフローサイトメトリーによる測定も可能二次抗体を蛍光。
CiAシステム12のような現在の cip 法に基づいた技術に関連してこの CEM 技術募集ターゲット遺伝子エピジェネティックな変調器内因性の利点があります。数秒後にセルの機械式を調節する手段がもっと生理学的関連を作成します。外因の帽子と、転写因子のようなマスターの酵素を表現すると、副作用の発現の増加、特にない遺伝子座に積極的に募集した中から可能性があります。
HDAC の抑制剤から成る CEMs とこの新しいシステムの機能を説明する、一方、他のいくつかの阻害剤やタンパク質のリクルーターが HDAC 阻害剤の代わりに合成します。遺伝子の活性化を達成するために、阻害剤ハット - または HDMT 阻害剤ベース CEMs を合成できます。抑制し、同じ遺伝子をノザン、抑圧的な CEM 細胞を扱う、正規のメディアで洗って、活性化の CEM を追加し、することが可能です。これにより募集して同じゲノム領域に抑圧と活性化複合体のダイナミクスを調べるためクリーンなシステムに対応。将来 CEMs を設計するときいくつかの特性はセル透磁率、阻害剤の効力、構造、阻害の速度論など、考慮する必要があります。FK506 とリクルーター部位間のリンカーの長さは、CEMs の透過性だけでなく、採用の蛋白質の位置に影響を及ぼします。リンカーの長さでだけ異なる 2 つの CEMs を比較すると、短いリンカーと CEM はより効果的な12をだった。それはテストされていない直接ここで、大きいセル透磁率の結果は効果が高いです。ターゲットの活性部位に結合する部分を中断することがなく変更を受けやすい化学構造を持つ阻害剤を選択することも重要です。力と特異性も高ポーテンシーと蛋白質の特定のクラスに対して特異性阻害剤を選択することによって考えられていた。阻害の速度論 CEMs の有効性に影響を与える可能性があります。遅いオン ・ オフ率と阻害剤から成る CEMs は効果が低い傾向があります。
現在の CEM 技術の 1 つの制約は、ターゲット遺伝子座で Gal4 結合配列の要件です。Oct4 CiA軌跡以外の領域に CEMs を採用、設計された Gal4 上流活性化シーケンス (UAS) 線科学コミュニティに利用できる何百もを使えます。システムはモジュール化されること方法の 1 つは非アクティブ化された Cas9 を組み込むことによって (dCas9) 化学エピジェネティック酵素募集10、11,15。CRISPR Cas9 システムからのこのヌクレアーゼ死んだ蛋白質を募集してガイド RNA (gRNA) が設計、ゲノムのあらゆる領域になりますが、DNA はカットされません。DCas9 FKBP 融合を使用して、FKBP コンポーネントは、dCas9 が募集しています CEMs を採用しやすさと潜在的な標的遺伝子の柔軟性が大幅に向上します。潜在的な治療または可逆的、一時的クロマチン レベルで病気のメカニズムを研究するための手段として疾患関連遺伝子を対象とするこの技術を使用することを想像してください。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、役に立つ議論のため・ ハサウェイとジンの研究所のメンバーに感謝したいと思います。著者も原稿の彼らの重要な読書のダン クロナとイアン ・ マクドナルドに感謝します。この作品は一部 (N.A.H.); に米国国立保健研究所から助成金 R01GM118653 によって支えられました。助成金 R01GM122749、R01CA218600 と R01HD088626 米国国立から衛生研究所 (JJ) に。この作品も、層によって支えられた UNC Eshelman イノベーション研究所からの 3 および学生を与える (N.A.H し A.M.C、それぞれ)。(A.M.C) に T-32 GM007092 から追加の資金は、この仕事を支えた。フローサイトメトリーは、UNC 施設に P30 CA016086 がんセンター コア助成金によって資金を供給された UNC 流れ Cytometry 中核施設でデータが得られました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha - producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
References
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