Summary
Chromatin 환경 규칙은 적절 한 유전자 발현에 필요한 필수적인 과정 이다. 우리가 chromatin 수정의 채용을 통해 유전자 발현을 제어 하기 위한 메서드를 설명 하는 여기, 유전자 및 가역 방식 기계.
Abstract
Chromatin 압축의 규칙은 더 높은 진핵생물의 유전자 발현에 중요 한 프로세스 이다. Chromatin 압축 및 유전자 표현 규제는 일반적으로 많은 질병에 중단 됩니다, 하지만 로커 스, 내 생, 및 가역 방법을 연구 하 고 이러한 행동의이 메커니즘을 제어 부족 되어 있다. 이 문제를 해결 하려면 우리 개발 하 고 새로운 유전자 조절 bifunctional 분자가 특징. 대립 유전자 특정 소재 시에 채용 될 것 이다 있도록 bifunctional 분자의 한 구성 요소 DNA-단백질 앵커에 바인딩합니다. 생 세포 chromatin 수정 기계, 관심사의 유전자가이 단백질을 모집을 종사 하는 다른 구성 요소. 이 작은 분자, 화학 epigenetic 한정자 (Cem) 라는 복용량 의존 및 가역 방식 chromatin 환경과 유전자 발현을 제어 할 수 있다. 여기, 우리 선발 CEM 접근 및 유전자 발현와 히스톤 꼬리 acetylation 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 Oct4 로커 스에 있는 녹색 형광 단백질 (GFP) 기자에의 응용. 우리는 리드 특징 CEM (CEM23) 형광 현미경, cytometry, chromatin immunoprecipitation (칩)을 사용 하 여 다음 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량). 이 시스템의 전원 Oct4 로커 스에서 개념적으로 설명 된다, 반면 CEM 기술 모듈식 이며 다른 세포 유형 및 다른 게놈 loci에 적용할 수 있습니다.
Introduction
DNA 코어 nucleosome 입자를 형성 하는 히스톤 octamer 단백질을 감싸 염색 질에 의하여 이루어져 있다. Chromatin 압축의 규정은 적절 한 DNA 복구, 복제 및 식1,2,3에 대 한 필수적인 메커니즘입니다. 있는 셀 압축의 수준을 제어 하는 한 가지 방법은 추가 또는 제거의 다양 한 닢 히스톤 꼬리 수정을 통해 이다. 이러한 두 수정, 가장 일반적으로 유전자의 활성화와 연결 되는 (1) 리 acetylation 등 (2) 리 메 틸 화, 유전자 활성화 또는 아미노산 컨텍스트에 따라 억압에 연관 될 수 있는. Acetylation와 메 틸 화 마크의 추가 촉매 히스톤 acetyltransferases (모자) 및 히스톤 methyltransferases (HMTs), 각각, 반면 마크의 제거는 히스톤 deacetylases (HDACs) 및 히스톤 demethylases (HDMs 하면 됩니다. ), 각각4,5. 이 단백질의 존재는 알려져 왔다 십 년간, 많은 메커니즘에 대 한 어떻게 chromatin 수정 기계 제대로 유전자 발현을 조절 하는 작품 정의 유지. Chromatin 규제 프로세스 dysregulated 많은 인간 질병에 있기 때문에, 새로운 기계 통찰력 미래의 치료 응용 프로그램에 발생할 수 있습니다.
분석 결과 vivo에서 chromatin (CiA)는 최근 설명된 기법 사용 하 여 근접 (CIP)의 화학 유도 제어 기계 모집 chromatin 수정 특정 로커 스6입니다. 이 기술은 chromatin 역학, 단백질 히스톤 수정, chromatin remodelers, 및 녹음 방송 요인6,7,,89의 확장 목록 공부에 사용 되었습니다. CIP 기반 chromatin 것 표현한 단백질의 tethering 또한 확장 되었습니다 수정 비 유전 loci를 변조 하는 CiA 과거 비활성화 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복 CRISPR 관련 된 단백질 (dCas9)와 함께 사용 하 여 10 , 11. CiA 시스템에서 mESCs Oct4 로커 스, mESC 게놈의 매우 표현 하 고 엄격 하 게 규제 지역에서 GFP 취재 원 유전자를 표현 하기 위해 수정 되었습니다. 이전에이 시스템 것 표현된 섬으로 단백질 1 (HP1), H3K9me3를 바인딩하고 억압 적인 표시 (예, H3K9me3)를 전파 하는 효소의 복용량 의존 및 가역 채용 설명에 적용 된 및 DNA 메 틸 화6. 모집 전략의이 유형을 달성 하는 mESCs FK506 의무적인 단백질 (FKBP)는 GFP 기자의 상류 Gal4 바인딩 배열에는 DNA-단백질 앵커 Gal4에 연결을 표현 하는 플라스 미드와 함께 감염 됩니다. 셀은 HP1에 연결 FKBP rapamycin 바인딩 도메인 (FRB)도 감염 됩니다. mESCs는 CIP의 낮은 nanomolar 농도에 노출은, rapamycin, FRB와 FKBP, 대상 현장에 함께 가져 있습니다. Rapamycin 치료 일 이내 대상 유전자의 표현에 억압, 형광 현미경 검사 법 및 흐름 cytometry에 의해 입증 고 histone acetylation 감소, 칩 및 황산 시퀀싱 표시. 1 개의 결점은 chromatin 수정 필요한 세 식 동안 개발 및이 방법의 유효성 검사 chromatin 연구와 레 귤 레이 션의 분야에서 중요 한 발전, 기계.
만 생 순수 관련 효소의 채용에 따라 기술 고 모듈식 시스템, 하 우리 설계 하 고 쌤 (그림 1)12되 나 소설 bifunctional 분자 특징. 쌤의 한 구성 요소가 포함 되어 FK506, rapamycin, 비슷한 바인딩하는 밀접 하 게 그리고 특히 FKBP에. 따라서,는 쌤 여전히 CiA mESCs에서 Oct4 로커 스를 모집 합니다. 다른 구성 요소는 쌤의 moiety 생 chromatin 수정 기계는 이다. 파일럿 연구에서 우리 쌤 HDAC 저 해제를 포함 하는 테스트. 모집 HDACs 억제제를 사용 하 여 개념 반 직관적 보인다, 그러나는 억제제는 그럼에도 불구 하 고 관심사의 유전자를 HDAC 활동 모집 수 있습니다. 이 (1) 리디렉션는 HDAC 효소를 방출 하 고 지역에는 현장에서 (2) 유지 HDAC 억제 되지 않은 금된 HDACs의 밀도 증가 하지만 저해 HDACs 바인딩할 억압 단지 모집 로커 스에 의해 수행 됩니다. (3) 또는 둘 다의 조합. 이전 연구에서 우리는 쌤 성공적으로 신속 하 게 되돌릴 수는 방식 뿐만 아니라 복용량과 시간에 따른 방식에서 GFP 기자를 주체 할 수 있었다 보였다 (즉, 24 시간 이내)12. 우리는 형광 현미경 검사 법, cytometry, 그리고 능력을 사용 하 여 칩 정량6을 사용 하 여 염색 질 환경을 제어 하는 제어 유전자 발현을 여기에 제시 된 CEM 기술 능력을 특징. 여기, chromatin 생물학에 관련 된 추가 질문에 답변을이 시스템의 적응을 촉진 한다 Cem 및 사용 하는 방법을 설명 합니다.
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Protocol
1) 셀 라인 문화 Lentivirus를 생산
- 낮은-통로 (통로 30 미만), 성장 293T 인간 미 발달 신장 (HEK) 셀 높은 포도 당 Dulbecco에이 글을 수정의 매체 (DMEM) 기본 미디어 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 10 mM HEPES, 비필수 아미노산 (NEAA), 펜 x 1 / 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 strep, 2-mercaptoenthanol. 매일 3-5 d 셀을 분할 하 고 그들은 > 95% 합칠 되기 전에.
- (각 바이러스에 대 한 15 cm 플레이트 생산 1) 15 cm 접시 당 18 x 106 293T HEK 세포를 통과.
- 15 cm 형식에 대 한 오래 된 미디어를 발음 하 고, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 10 mL을 추가 하 고, PBS, 발음 한 0.05 %trypsin 3 개 mL를 추가. 셀 락과 인큐베이션을 통해 중간 셀 도청 37 ° C에서 8 분에 대 한 트립 신에 품 어.
참고:이 단계의 목표는 단일 세포 현 탁 액으로 세포를 얻는 것입니다.
- 15 cm 형식에 대 한 오래 된 미디어를 발음 하 고, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 10 mL을 추가 하 고, PBS, 발음 한 0.05 %trypsin 3 개 mL를 추가. 셀 락과 인큐베이션을 통해 중간 셀 도청 37 ° C에서 8 분에 대 한 트립 신에 품 어.
- 셀 다음 날 60%-80 %confluency 도달, psPAX2 플라스 미드, 플라스 미드 pMD2.G의 4.5 µ g, 관심사의 유전자와 호환 lentiviral 배달 벡터의 18 µ g의 13.5 µ g와 polyethylenimine (페이) transfection 수행 (, 즉 , FKBP-Gal4) 108, 페이, transfection 미디어의 1.8 mL의 µ L.
- 부드럽게 DNA, 페이, 15 mL 원뿔 튜브에서 transfection 미디어 믹스, 15 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어 고 dropwise 15 cm 접시에 추가.
참고: 사용 적절 한 안전 대책 및 모든 기관에 따라 모든 시 약으로이 단계를 수행한 후 실험실 안전 절차 라이브 바이러스 포함 됩니다 하십시오.
- 부드럽게 DNA, 페이, 15 mL 원뿔 튜브에서 transfection 미디어 믹스, 15 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어 고 dropwise 15 cm 접시에 추가.
- Transfection 및 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 부 화 16 h 후 미디어를 발음 하 고 부드럽게 15 cm 번호판 신선한 293 HEK 미디어 (37 ° C 물 욕조에 prewarmed)를 추가 합니다. 미디어 변경 후 48 h에 대 한 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 세포를 품 어. 바이러스 다음 수확 될 준비가 되어 있습니다.
2) 감염의 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) Lentivirus
- 낮은-통로 (통로 35 미만), 20% 높은 포도 당 DMEM 기본 미디어에 적응된 CiA mESCs 급지대 무료 보충 ESC-학년 FBS, 10 mM HEPES, 1 x NEAA, 펜/Strep, 2-mercaptoenthanol, 및 1: 500 백혈병 억제제 요인 (LIF) 5 %37 ° C 배양 기 CO2.
참고:는 LIF은 일괄 처리에서 수집 되 고 냉동-80 ° c.에는 COS LIF 생산 세포의 상쾌한에서 얻은- 1-3 h 1 x PBS에 0.1% 젤라틴에 대 한 preincubated 및 이후 1 x PBS로 세척 접시에 셀 성장. 매일 셀을 공급 하 고 그들에 게 그들의 조밀도 따라서 매 2-3 d를 분할.
참고: 형태학 상으로, 배아 줄기 세포 (ES) 식민지 이어야 한다 작은, 라운드, 그리고 서로 다릅니다.
- 1-3 h 1 x PBS에 0.1% 젤라틴에 대 한 preincubated 및 이후 1 x PBS로 세척 접시에 셀 성장. 매일 셀을 공급 하 고 그들에 게 그들의 조밀도 따라서 매 2-3 d를 분할.
- 감염 전에 1 d 12 잘 플레이트 형식 (100000 셀/잘)으로 mESC을 통과.
- hemocytometer 셀을 계산 합니다. 10 cm 형태로 성장 하는 셀에 대 한 오래 된 미디어를 발음 하 고, 1 x PBS의 5 mL을 추가 하 고, PBS, 발음 한 0.25 %trypsin 1 mL를 추가. 셀 락과 인큐베이션을 통해 중간 셀 도청 37 ° C에서 8 분에 대 한 트립 신에 품 어. 이 단계의 목표는 단일 세포 현 탁 액으로 세포를 얻는 것입니다.
- 293T15-cm 바이러스에서 미디어를 변경한 후 48 h 제거 하 고 50 mL 원뿔 튜브에는 상쾌한 전송 단계 1.4에서 세포를 포장.
- 작은 세포 파편을 5 분에 대 한 300 x g 에서 상쾌한 원심
- 0.45 μ 막 통해 상쾌한 필터링.
참고: 사용 하는 계면 활성 제 없는 셀 루 로스 아세테이트 (SFCA) 막, 기타 자료 바이러스를 유지 하 고 수익률을 크게 줄일 수 있는지 확인 합니다. - Ultracentrifugation, SW32 회전자는 원심 분리기를 사용 하 여 바이러스를 집중 하 고 20000 rpm (~ 72000 x g) 2.5 h 4 ° c.에 대 한 회전
- 바이러스는 ultracentrifugation에서 집중 한다, 하는 동안 polybrene의 5 µ g/mL를 포함 하는 신선한 ES 미디어와 12-잘 접시에 CiA mESCs를 취급 합니다.
- 바이러스 농도 완료 되 면, 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 바이러스 펠 릿 1 x PBS의 100 µ L에서 일시 중지 (과잉 거품을 피하기 위해).
- 1.5 mL microfuge 관에 바이러스 및 1 x PBS를 추가 합니다. 소용돌이/쉐이크 튜브 300 g x (또는 가장 낮은 설정에서)에서 바이러스를 완전히 중단 하. 거품을 제거 하 5-10 s 미니 탁상 원심 분리기에 튜브 아래로 회전 합니다.
- 12-잘 접시의 각 음에 바이러스의 30 µ L를 추가 합니다. 접시를 소용돌이 그리고 20 분 1000 x g 에서 격판덮개 원심.
참고: 추가 하는 바이러스의 양은 배달 구성 크기에 반비례 관련 바이러스 titer에 따라 다양 수 있습니다.- 또한, 플래시 동결 액체 질소로 바이러스 및-80 ° c.에 그것을 저장합니다 그러나, 바이러스를 동결 하는 것은 바이러스 titer를 낮출 것 이다.
- 37 ° C 배양 기에 다시 12-잘 접시를 놓고 변경 미디어 다음 아침 (~ 16 h) 나중 신선한 ES 미디어 (2.1 단계에서 설명).
- 감염의 48 h 후 적절 한 항생제 (즉, puromycin의 1.5 µ g/mL, blasticidin, 등의 10 µ g/mL)을 추가 하 여 바이러스 성 플라스 미드를 통합 하는 셀을 선택 합니다. 매일 미디어를 변경 하 고 셀의 대부분은 부동/죽은 경우 1 x PBS 가진 세포를 씻어. 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 72 96 h에 대 한 셀에 선택 미디어를 유지.
3) 화학 Epigenetic 한정자 (CEM) s 준비 및 치료
- 1 m m의 재고 농도를 100 µ M의 작업 집중에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 가루 CEM를 일시 중단 합니다.
- 셀 후 72 96 h, 100, 000 셀/잘 12 잘 형식으로는 mESCs 분할에 대 한 선택 받은. 이후 24 헤에 대 한 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 세포를 품 어, 100의 미디어 솔루션 준비 nM CEM ES 미디어. 이 미디어를 사용 하 여 1 mL와 함께 CiA mESC 피드/잘. 컨트롤 역할, 어떤 추가 쌤 없이 세포의 유지.
- 변경 미디어/갓된 포함 하는 CEM 또는 CEM 무료 ES 미디어의 오래 된 미디어를 발음 하 고 1 mL을 추가 하 여 모든 24 h 실험의 기간에 대 한.
4) 현미경 검사 법 및 Cytometry 식의 분석
- CEM 치료의 48 시간 후 이미지 CEM 치료 없이 세포와 세포 치료 100 nM CEM 형광 현미경을 사용 하 여. 20 X 확대; mESC 형태학 기록 단계 또는 명시를 사용 하 여 대표 이미지 셀 몇 가지 차별화 된 세포와 라운드 식민지 형성 해야한다. FITC 형광 채널에서 두 셀 조건 이미지.
- 미디어를 발음, 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척 하 고 PBS, 발음 하 고, 8-10 분에 대 한 EDTA와 0.25 %trypsin 0.25 mL를 추가 하 여 컨트롤 및 cytometry 셀 CEM 처리를 격리 합니다.
- 세포가 더 이상 큰 덩어리에서 현미경을 보고 확인 합니다. 20 배 확대를 사용 합니다. 셀은 단일 셀 서 스 펜 션에 표시 되지 않으면, 부드럽게 위아래로 P1000 피 펫 셀을 완벽 하 게 trypsinize를 가진 플라스틱.
- 신선한 미디어의 1 mL와 트립 신을 냉각 및 resuspend 혈 청 학적인 피 펫을 빠른 속도로 세포 (또는 P1000 피 펫, 팁을 사용 하 여) 셀을 단일 셀에 때까지.
- 5 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 300 x g 에서 셀 아래로 회전 합니다. 1 x PBS로 세척 하 고 셀을 recentrifuge. PBS 상쾌한 발음
- FACS 버퍼 (1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 [EDTA], 1 x PBS 및 0.2% 소 혈 청 알 부 민 [BSA]) 200 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
- FACS 버퍼의 총 볼륨 셀 수 있는지에 의존 될 것입니다 하지만 농도 1000-3000 셀 이어야 한다 / µ L. 3 샘플 셀 개수 그리고 세포의 농도 평균. 필요한 경우 더 많은 FACS 버퍼를 추가 합니다.
- 그들은 분석 되는 때 얼음에 셀 유지 중단 셀 > 50000 셀에 cytometry를 수행 합니다. 530/40 필터 (FITC, AF488, GFP, 등)를 사용 하 여 식에는 변화를 기록. 치료 컨트롤 셀 샘플을 사용 하 여 적절 한 형광 전압을 결정 하 고 기록 된 강도 스펙트럼 중에 형광 피크를가지고 전압을 설정 합니다. 약 5, 000 셀/s의 속도 칼 집에서 샘플을 실행 합니다.
- 데이터를 내보내고 게이팅 먼저 앞으로 분산형 대 측 분산형 라이브 셀에 그리고 singlets에 대 한 지역 대 앞으로 살포 높이에 의해 교류 cytometry 프로그램 (즉, FlowJo)에 FCS 파일 분석. 그런 다음, 타겟에서 상대 GFP 식을 결정 하 고 제어 하는 히스토그램에 GFP 채널 데이터 시각화 인구.
5) 정량에 의해 염색 질 Chromatin에서 Immunoprecipitation (칩) 어의 분석
- 10 cm 접시 3 백만 세포와 ES 미디어의 10 mL에는 mESCs를 분할 (각 한 10 cm 접시 실험 상태를 제어 하는 또는). 다음 날, CEM 포함 하거나 CEM 무료 미디어의 10 mL를 추가 합니다. CEM 치료의 48 시간 후에 오래 된 미디어를 발음. 세척 하 고 셀 1 x PBS의 5 mL을 발음. 다음, 0.25 %trypsin 세포 분열 하 고 ES 미디어의 10 mL와 트립 신을 끄다. 계산 하 고 조건 당 10 백만 세포의 샘플을 분리.
- 300 x g 5 분에서 10 백만 셀 샘플의 각각 아래로 회전 합니다.
- 1 x PBS의 10 mL에 각 펠 릿을 resuspend 하 고 5 분 동안 300 x g 에서 셀 recentrifuge.
- CiA 수정 버퍼의 10 mL에 각 펠 릿 resuspend (50mm pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0.5 m m 에틸렌 글리콜-두번째 [에테르 ß-aminoethyl]-N, N, N', N'-tetraacetic 산 [EGTA] pH 8, 및 100 m m 염화 나트륨 [NaCl]). 11% 포름알데히드 용액 1 mL를 추가 하 고 즉시 반전 샘플 5 배-10 배. 10 분 동안 실내 온도에 샘플을 품 어.
- 2.5 M 글리신의 0.5 mL를 추가 합니다. 샘플을 즉시 반전 하 고 5 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 1200 x g 에서 샘플을 원심 상쾌한 발음
- CiA 린스 1의 10 mL에 펠 릿을 resuspend (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10% 글리세롤, 0.5% Nonidet P-40 [NP40], 그리고 0.25% 트리톤 X100). 10 분 4 ° c.에서 5 분 동안 1200 x g 에서 원심에 대 한 얼음에 샘플을 품 어
- CiA 린스 2 (10 mM tris [hydroxymethyl] aminomethane [트라이앵글] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0.5 m m EGTA pH 8, 및 200 m m NaCl) 10 mL에 펠 릿을 resuspend. 4 ° c.에서 5 분 동안 1200 x g 에서 샘플을 원심
- 부드럽게 펠 릿을 방해 하지 않고 어떤 소금을 씻어 버퍼 (0.1 %SDS, 1 mM EDTA, 그리고 10 mM Tris pH 8) 원뿔 튜브의 측면을 따라 전단 하는 CiA의 5 mL를 추가 합니다. 1200 x g 4 ° c.에 3 분에 샘플을 원심 세척 단계를 반복 합니다.
- CiA 전단 버퍼와 신선한 protease 억제제 (leupeptin, chymostatin, 및 pepstatin A의 혼합물에서 10 mg/mL 각 재고 솔루션, 10 µ g/mL의 최종 농도 만드는 x 1000을 DMSO에 함께 녹아 사용) 90 µ L에 펠 릿을 resuspend. 얼음13,14에 모든 것을 유지 하면서 쥡니다 강화 nanodroplets의 10 µ L를 추가 합니다.
- 유리 튜브에는 솔루션의 100 µ L를 전송 하 고 튜브 캡.
- 3.5 분 샘플을 sonicate (결정 셀 라인 및 셀의 수에 따라). 총 쥡니다 시간 2 분을 초과 하는 경우 샘플 과열 방지를 위해, 2-분-최대 사이클 시간에 예제를 처리 합니다.
참고: 집중된 ultrasonicator 여기 함수에 사용 높은 주파수 (500khz). W. 55의 음향 파워에 기계를 실행 각 개별 연구소 쥡니다 기간을 미리 해야 한다. - 새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 각 chromatin sonicated 샘플을 전송. 4 ° c.에 2 분 동안 8000 x g 에서 튜브를 회전
- 전단 효율을 분석 하 고 chromatin의 상대적인 양을 계량 칩 장비 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
참고: spectrophotometrically DNA 농도 결정 (예를 들면, DNA nanodrop 악기를 사용 하 여), ~ 200을 실행 하 고 대략 200-500 basepairs (bp) 크기에서에 chromatin sonicated 됩니다 확인 하는 1 %agarose 젤에 DNA의 ng. - Immunoprecipitation을 수행 하는 chromatin를 격리 칩 장비 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
참고: 높은 DNA 농도와 샘플의 immunoprecipitation에 대 한 37 ° C에서 차입 버퍼 따뜻하고 elute 샘플 2 차입 버퍼 (회전 1 분 동안 각 시간)의 30 µ L x. - 정량 Pcr을 수행 하는 시 약 384-잘 접시에 로드 합니다. 비대칭 cyanine 염료 마스터 믹스 x 2의 5 µ L, 각 2.5 µ M 추가 뇌관, 물, 그리고 0.1-10 각 반응에 대 한 DNA의 ng.
- 50-100 bp amplicons CT 값을 증폭에 디자인 뇌관 집 유지 유전자, intracisternal A 형 입자 (IAP) 정규화 됩니다.
주: 추가 정량 방법에 대 한 키트 제조 업체의 프로토콜을 참조 하십시오. 뇌관 세트 Oct4 로커 스를 대상 하는 데 사용 했다: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC입니다. 설정 대상 IAP를 사용 하는 제어 뇌관 했다: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC입니다. - 뇌관 및 원하는 제품을 1 분 동안 60 ° C의 어 닐 링 온도 40 주기는 정량 실행을 기반으로 합니다.
참고: 결과 데이터 CiA:Oct4 IAP를 통해 정규화 된 샘플 간의 델타-델타 Ct 비교를 사용 하 여 quantitated 이었다. 최종 분석 결과 평균에서 표준 편차로 표시 하는 오류와 함께 triplicate 실험 샘플의 평균으로 표시 됩니다.
- 50-100 bp amplicons CT 값을 증폭에 디자인 뇌관 집 유지 유전자, intracisternal A 형 입자 (IAP) 정규화 됩니다.
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Representative Results
우리는 최근 쌤을 개발 하 고이 기술 복용량 의존 및 가역 방식 기자 로커 스에서 chromatin 환경과 유전자 발현 조절에 적용할 수 있는 증명. 그림 1에 리드 모델 CEM, CEM23, 표시 됩니다. HDAC 기계는 HDAC 억제제는,이 경우에, Oct4 로커 스에 삽입 GFP 기자 기자 로커 스를 기용.
우리 CiA mESCs에서 Oct4 로커 스에서 CEM 시스템을 특성화 하고자 했다. 셀 GFP 익스프레스, 때문에 신속 하 게 시각화 형광 현미경 검사 법으로 기자 표현 가능 했다. 셀 100 치료의 48 시간 후 촬영 했다 치료 셀 함께 CEM23의 nM. 단계 이미지 보여 건강 한 mESCs, 때문에 건강에 해로운 또는 차별화 된 mESCs는 일반적인 GFP 억압을 나타내는 것이 중요 하다. 형광 이미지 표시 컨트롤 셀에 밝은 GFP 식 감소 GFP 식 mESCs CEM23 치료에. 대표 이미지는 그림 2에 표시 됩니다.
GFP 표정에 변화를 계량, cytometry 사용 되었다. 다시, CiA mESCs 100로 치료 했다 48 시간 동안 CEM23의 nM. CEM23 및 제어 셀으로 치료 하는 실험적인 세포 cytometry, 샘플 당 > 100000 셀을 사용 하 여 준비 했다. 일관 되 게, GFP 표현 셀 쌤을 다룰 때는 그 사이에서 감소 > 30% 관찰 합니다. 대표 히스토그램은 그림 3에 표시 됩니다.
일단 CEM 유도 GFP 유전자 식 감소의 증거를 표시 했다, 우리는 칩을 사용 하 여 염색 질 환경 변화에 대 한 테스트. 칩에 대 한 샘플을 준비 하기 위한 하나의 중요 한 요소가 chromatin 쥡니다의 범위입니다. 일관 되 고 제대로 가능한 전단으로 샘플을가지고, 10 백만 셀 크기 (그림 4)에서 200와 500 bp 사이 chromatin를 3.5 분 sonicated 했다. 때문에 우리는 억압 적인 쌤에 바인딩 되었고 모집 HDAC 단백질과 기자에 게 억압 적인 단지 가설, 히스톤 꼬리 acetylation에 변화에 대 한 테스트. 히스톤 3 리 27 acetylation (H3K27ac)는 일반적으로 유전자의 transcriptional 시작 사이트 (TSS)에 따라 발견 됩니다. 우리는 H3K27ac에 대 한 항 체를 사용 하 여 칩을 수행 하 고 뇌관 세트 업스트림과 다운스트림는 TSS의 정량 수행. 결과 표시는 100 48 시간 치료 CEM23의 nM 쌤으로 대우 되지 제어 셀에 비해 대상 장소에 H3K27ac의 수준을 감소 (p < 0.01, 양측 스튜던트 t-테스트 3 생물 복제, 그림 5).
그림 1 : 쌤 바인딩할는 CiA:Oct4 FKBP 및 밧줄 생 후 성적인 기계 채용을 통해 로커 스. CEM 시스템의 모델 단백질-DNA 앵커 Gal4-FKBP를 표시합니다. CEM의 FK506 부분 FKBP를 한다 HDAC 억제제 신병 생 HDAC 단백질 GFP를 억 누르다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 와 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 형광 이미지는 CiA:Oct4 -GFP 기자. 형광 현미경 이미지 표시 GFP 식 CEM 치료 시 감소 합니다. 상단 패널 단계와 치료 미디어와 함께 성장 하는 mESCs의 형광 이미지를 보여줍니다. 하단 패널 표시 위상 및 100으로 치료 하는 mESCs의 형광 48 시간 동안 CEM23의 nM. ACS 합성 생물학12허가 적응 이미지. 저작권 (2018) 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 교류 cytometry 분석 quantitates mESCs CEM23 치료 시에 GFP의 감소 식. mESCs 100로 치료 비교 되었다 mESCs CEM23 (블루) 없이 48 시간 (빨간색)에 대 한 CEM23의 nM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Chromatin의 쥡니다 유니폼, 이며 얼룩 200, 500 bp. 사이 표시 칩-정량 Pcr을 수행 하려면 mESCs에서 chromatin sonicated 했다. 약 10 백만 셀, 3.5 분, 길이 200, 500 bp 사이 마찬가지로 전단 chromatin 샘플 생산 sonicated 했다 각 샘플에 의하여 이루어져 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : CEM23 치료 CiA 로커 스에서 H3K27ac 감소 발생. 칩-정량 chromatin 환경 변화에 대 한 테스트를 수행 했습니다. 100 48 시간 처리 후 CEM23 nM, H3K27ac 감소 CiA:Oct4 에서 관찰 되었다 (* *p < 0.01, 양측 스튜던트 t-3 생물 복제와 함께 테스트. 오차 막대를 나타냅니다 표준 편차). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 복용량-의존 방식으로 유전자 발현 및 특정 유전자에서 chromatin 환경 규제에 적용 되 고 최근에 개발 된 CEM 시스템을 설명 합니다. 우리는 특정 내 생 chromatin 규제 단백질의 선택적인 신규 모집을 통해 유전자 발현 조절에 관련 된 역학을 공부 하는 정확한 방법을 제공 합니다. 이것은 적용 될 수 있는 높게 모듈형 기술 어떻게 다른 단백질 및 chromatin 수정 조사 단지 작업 제대로 어떻게 이러한 프로세스는 dysregulated, 공부로 뿐만 아니라 chromatin 환경을 조절 하는 콘서트에는 유전자 특이성을 달성의 혜택입니다.
여기, 세 가지 방법으로 새로운 기술로 chromatin 구조와 유전자 표현에 변화를 시각화를 시연 했다. 쌤과 특정 타겟된 loci의 섭 동, 후 유전자 발현을 실시간 변경 형광 현미경 검사 법에 의해 분석 수 있습니다. 다음, 유전자 표현 수준에 변화 cytometry에 정의 된 끝점으로 더 양적 측정 될 수 있습니다. 마지막으로, chromatin posttranslational epigenetic 표시 변경 칩;에 의해 시험 되었다 특히,이 경우에, H3K27ac. HDAC 모집 칩 정량으로 단일 장소에서 콘서트에는 HDACs의 다양성 때문에 테스트 하지 않았다. HDAC 효소의 이기종 인구 보충 되었다 그리고 그것은, 그러므로, 기술적으로 어려운 것 칩으로 모든 테스트 높습니다. 이전에 게시 작업에 우리 GAL4 융합에 의해 HDAC3 직접 모집 칩12유전자 표현과 chromatin 수정에 비슷한 활동 발생을 증명 하고있다. 역전사 정량 분석 (1) RNA 식 또는 서 부 럽와 (2) 단백질 식이나와 이미징 및 실시 cytometry 유전자 발현에 변화를 측정 또한 수 비 형광 기자는 변조 되 고, 경우 형광등 2 차 항 체입니다.
CiA 시스템12같은 현재 CIP 기반 기술에 관하여이 CEM 기술 모집 대상 유전자 생 후 변조기의 이점이 있다. 셀의 기계를 리디렉션 변조 식의 더 순수 관련 수단을 만듭니다. 것 표현 하는 모자와 녹음 방송 요인, 같은 마스터 효소 부작용 특히 하지 적극적으로 유전자 소재 시에 보충 하는 동안 그들의 증가 식에서 발생할 수 있습니다.
이 문서 쌤 HDAC 저 해제로 구성 된이 새로운 시스템의 기능을 보여, 여러 다른 억제제 또는 단백질 채용 HDAC 억제제 대신 합성 수 있습니다. 유전자 활성화를 위해 모자 억제제-또는 HDMT 억제제 기반 쌤 합성 될 수 있습니다. 참다 다음 동일한 유전자 overexpress, 억압 적인 CEM으로 세포 치료, 일반 미디어와 함께 그들을 씻어 다음 활성화 CEM 추가 하 가능 하다. 이 같은 게놈 영역을 억압 하 고 활성화 단지 모집의 역학을 공부 하는 시스템에 대 한 수 것입니다. 미래 쌤을 설계할 때 여러 특성 세포 침투성, 억제제 힘, 구조, 억제 활동 등 고려 될 필요가 있다. FK506 모집 moiety 사이 링커 길이 쌤의 침투성 뿐만 아니라 채용된 단백질의 위치를 좌우할 것 이다. 링커 길이에서 서만 달랐다 두 쌤을 비교할 때 짧은 링커 CEM 더 효과적인12했다. 그것은 테스트 되지 않았습니다 직접 여기, 하는 동안 더 높은 효과 큰 세포 침투성의 결과 이다. 바인딩 대상의 활성 사이트 부분을 방해 하지 않고 억제제 화학 구조 수정 의무가 선택도 중요 하다. 힘 및 특이성 또한 높은 힘 및 특이성 단백질의 특정된 클래스에 대 한 저 해제를 선택 하 여 고려 되었다. 억제의 활동은 쌤의 효과 영향을 미칠 수 있습니다. 억제제 느린 온-오프 최저가 구성 쌤 덜 효과적이 어 경향이 있다.
현재 CEM 기술에의 한 제약은 대상 유전자 소재 시에 Gal4 바인딩 배열의 요건 이다. Oct4 CiA 로커 스 이외의 지역에 쌤을 모집, 조작된 Gal4 상류 활성화 순서 (UAS) 라인 과학 지역 사회에 사용할 수의 수백의 사용할 수 있습니다. 한 가지 방법은 모듈식 시스템 만든 것입니다 통합 비활성화 Cas9입니다 (dCas9) 화학 epigenetic 효소 모집10,,1115. CRISPR-Cas9 시스템에서 nuclease 죽은 단백질이 여전히 가이드 RNA (gRNA) 설계는 게놈의 모든 지역에 채용 될 하지만 DNA를 잘라 하지 않습니다. DCas9-FKBP 퓨전을 사용 하 여 FKBP 구성 요소는 dCas9 모집 쌤을 모집 하는 것입니다 매우 편리 하 고 잠재적인 대상 유전자의 유연성을 증가. 이 기술을 사용 하 여 잠재적인 치료 또는 역 및 일시적으로 chromatin 수준에서 질병 메커니즘을 연구 하는 수단으로 질병 관련 유전자를 대상 상상해 보세요.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 그들의 유용한 토론에 대 한 헤더 웨이 및 진 실험실의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 저자는 또한 그들의 중요 한 독서의 원고에 대 한 댄 Crona 및 Ian 맥도날드 감사합니다. 이 작품은 (N.A.H.);를 미국 국립 보건원에서 그랜트 R01GM118653에 의해 부분적으로 지원 그리고 교부 금 R01GM122749에 의해 R01CA218600, 및 R01HD088626 미국 국가에서 (제이)에 건강의 학회. 이 작품 또한 계층에 의해 지원 되었다 3와 학생 혁신에 대 한 UNC Eshelman 연구소에서 부여 (N.A.H와 A.M.C, 각각). 이 작업을 지원 추가 자금 T-32 GM007092에서 (A.M.C). 교류 cytometry 데이터 UNC Flow Cytometry 핵심 시설 P30 CA016086 암 센터 코어 지원 교부 금에 의해 UNC Lineberger 종합 암 센터 투자에서 얻은 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha - producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
References
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