Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Repressing Gene transkripsjon av omadresserer cellulære maskiner med kjemiske Epigenetic modifikatorer

Published: September 20, 2018 doi: 10.3791/58222
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4
1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

Summary

Regulering av chromatin miljøet er en viktig prosess kreves for riktig genuttrykk. Her vi beskriver en metode for å kontrollere genuttrykk gjennom rekrutteringen av chromatin-modifisere maskiner i en gen-spesifikke og reversibel måte.

Abstract

Regulering av chromatin komprimering er en viktig prosess som styrer genuttrykk i høyere eukaryoter. Selv om chromatin komprimering og gene expression regulering er ofte forstyrret i mange sykdommer, har locus-spesifikke endogene og reversibel metode å studere og kontrollere disse virkningsmekanismer manglet. For å løse dette problemet, har vi utviklet og preget romanen gen-regulere bifunctional molekyler. Én komponent av bifunctional molekyl bindes til en DNA-protein anker slik at det vil bli rekruttert til en allel-bestemte locus. Den andre komponenten engasjerer endogene mobilnettet chromatin-modifisere maskiner, rekruttere disse proteinene til en genet av interesse. Disse små molekyler, som kalles kjemiske epigenetic modifikatorer (CEMs), er i stand til å kontrollere genuttrykk og chromatin miljø i en doseavhengig og reversibel måte. Her, detalj vi en CEM tilnærming og dens anvendelse å redusere genuttrykk og histone hale acetylation på grønn fluorescerende Protein (GFP) reporter på Oct4 locus i mus embryonale stamceller (mESCs). Vi karakteriserer ledelsen CEM (CEM23) med fluorescerende mikroskopi, flowcytometri og chromatin immunoprecipitation (ChIP), etterfulgt av en kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR). Mens kraften i dette systemet er demonstrert på Oct4 locus, konseptuelt, CEM teknologien er modulære og kan brukes i andre celletyper og andre genomisk loci.

Introduction

Chromatin består av DNA pakket rundt histone octamer proteiner som danner kjernen nucleosome partikkel. Regulering av chromatin komprimering er en viktig mekanisme for riktig DNA reparasjon, replikering og uttrykk1,2,3. En måte som cellene kontrollere nivået av komprimering er gjennom tillegging eller fjerning av ulike post-translasjonell histone hale modifikasjoner. To slike endringer inkluderer (1) lysin acetylation, som er oftest assosiert med gene aktivisering, og (2) lysin metylering, som kan være assosiert med gene aktivisering eller undertrykkelse, avhengig av aminosyre konteksten. Tillegg av acetylation og metylering merkene er katalysert av histone acetyltransferases (luer) og histone methyltransferases (HMTs), henholdsvis, mens fjerning av merket gjøres ved histone deacetylases (HDACs) og histone demethylases (HDMs ), henholdsvis4,5. Selv om eksistensen av disse proteinene har vært kjent i flere tiår, mange mekanismer av hvordan chromatin-modifisere maskiner fungerer å riktig regulere genuttrykk gjenstår for å defineres. Siden chromatin lovgivende prosesser er dysregulated i mange menneskelige sykdommer, kan ny mekanistisk innsikt føre til fremtidige terapeutiske programmer.

Chromatin i vivo analysen (CiA) er en nylig beskrevet teknikk som bruker en kjemisk induser av nærhet (CIP) til å kontrollere chromatin-modifisere maskiner rekruttering til en bestemte locus6. Denne teknologien har blitt brukt til å studere et voksende liste av chromatin dynamikk, inkludert endring av histone proteiner, chromatin remodelers og transkripsjon faktorer6,7,8,9. CIP-baserte chromatin tethering exogenously uttrykt proteiner har også blitt utvidet tidligere CiA å modulere ingen-modifisert genetisk loci ved bruk med en deaktivert gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjentar CRISPR-assosiert protein (dCas9) 10 , 11. i CiA systemet, mESCs er endret for å uttrykke en GFP reporter genet på Oct4 locus, et svært uttrykt og strengt regulert område av mESC genomet. Tidligere dette systemet brukes for å beskrive doseavhengig og reversibel rekruttering exogenously uttrykt heterochromatin protein 1 (HP1), et enzym som binder H3K9me3 og overfører undertrykkende merker (f.eksH3K9me3) og DNA metylering6. For å oppnå denne typen rekrutteringsstrategi, er mESCs infisert med en plasmider som uttrykker en FK506-binding protein (FKBP) koblet til en Gal4, som er en DNA-protein som binder en Gal4-binding rekke oppstrøms GFP reporter. Cellene er likeledes infisert med et FKBP-rapamycin-bindende domene (FRB) koblet til HP1. Når mESCs er utsatt for lav nanomolar konsentrasjoner av CIP, samles rapamycin, både FRB og FKBP, på målet locus. Uttrykk for målet genet er undertrykt, som dokumentert av fluorescens mikroskopi og flyt cytometri dagers rapamycin behandling, og histone acetylation er redusert, vist av ChIP og bisulfite sekvensering. Mens utvikling og validering av denne tilnærmingen har vært betydelige fremskritt innen chromatin forskning og regulering, ettall ulempen er nødvendig ytre uttrykk for chromatin-modifisere maskiner.

Å få basert på rekruttering av bare endogene fysiologisk relevante enzymer og lage et mer modulsystem, vi designet og preget romanen bifunctional molekyler, kalt CEMs (figur 1)12. En del av CEMs inkluderer FK506 som ligner på rapamycin, binder tett og spesielt til FKBP. Dermed vil i CEMs fortsatt bli rekruttert til Oct4 locus i CiA mESCs. Den andre komponenten av CEMs er en moiety som binder endogene chromatin-modifisere maskiner. I en pilotstudie testet vi CEMs som inneholder HDAC hemmere. Selv om konseptet med å bruke en inhibitor for å rekruttere HDACs synes counter-intuitive, er inhibitor likevel kunne rekruttere HDAC aktiviteten til genet av interesse. Dette oppnås ved å (1) omdirigere HDAC til locus, slippe enzymet, og øker tettheten av un hemmet HDACs i området og (2) opprettholde HDAC hemming på locus, men rekruttere undertrykkende komplekser som binder seg til de hemmet HDACs, eller (3) en kombinasjon av begge. I en tidligere studie, vi viste at CEMs kunne med hell undertrykke GFP reporteren i en dose - og tidsavhengige måte og på en måte som var raskt reversibel (dvs., innen 24 timer)12. Vi preget evne til CEM teknologien presentert her for kontroll genuttrykk bruker fluorescens mikroskopi, flowcytometri og muligheten til å kontrollere chromatin miljøet bruker ChIP-qPCR6. Her beskriver vi en metode for å bruke og karakteriserer CEMs, som vil lette tilpasning av dette systemet for å svare på flere spørsmål knyttet til chromatin biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) cellen linje kultur for å produsere Lentivirus

  1. Vokse friske, lav-passasjen (mindre enn passering 30) 293T menneskelige embryonale nyre (HEK) celler i høy-glukose Dulbecco modifiserte Eagle er middels (DMEM) base media supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), penn / Streptokokk, 2-mercaptoenthanol i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Dele cellene hver 3-5 d, og før de blir > 95% confluent.
  2. Passasjen 293T HEK celler med 18 x 106 per 15 cm plate (en 15 cm plate for hver virus produsert).
    1. For en 15 cm format, Sug opp den gamle mediet, legge 10 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS), Sug opp PBS og legge 3 mL 0,05% trypsin. Inkuber cellene i trypsin i 8 min ved 37 ° C, rock og trykke cellene halvveis gjennom inkubasjon.
      Merk: Målet med dette trinnet er å få cellene i en enkeltcelle suspensjon.
  3. Når cellene har nådd 60% - 80% confluency dagen, utføre en polyethylenimine (PEI) hva med 13,5 µg psPAX2 plasmider, 4,5 µg av pMD2.G plasmider, 18 µg av lentiviral-kompatibelt levering vektor med genet av interesse (dvs. , FKBP-Gal4), 108 µL PEI og 1,8 mL transfection medier.
    1. Forsiktig blanding av DNA, PEI og hva media i et 15-mL konisk rør, ruge prøven ved romtemperatur i 15 min, og legger den dropwise til 15 cm plate.
      Merk: Bruk passende sikkerheten måler og følger alle institusjonelle og laboratorium prosedyrer etter dette trinnet som reagenser vil inneholde levende virus.
  4. Etter 16 h transfection og inkubasjon i en 37 ° C inkubator med 5% CO2, Sug opp media og forsiktig legge frisk 293 HEK media (prewarmed i et vannbad 37 ° C) til 15 cm plater. Inkuber cellene i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 for 48 timer etter at mediet endrer. Viruset er da klar til å bli høstet.

2) infeksjon av mus embryonale stamceller (mESC) med Lentivirus

  1. Vokse lav-passasjen (mindre enn passering 35), mater-gratis tilpasset CiA mESCs i høy-glukose DMEM base media supplert med 20% ESC-grade FBS, 10 mM HEPES, 1 x NEAA, penn/Strep, 2-mercaptoenthanol og 1:500 leukemi hemmer faktor (LIF) i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
    Merk: LIF hentes fra nedbryting av COS LIF-produserende celler, som er samlet i batch og frosset på-80 ° C.
    1. Vokse celler på plater som er preincubated for 1-3 h med 0,1% gelatin i 1 x PBS, og deretter vasket med 1 x PBS. Feed cellene daglig og dele dem hver 2-3-d, avhengig av tetthet deres.
      Merk: Morphologically, embryonale stamcelleforskningen (ES) koloniene bør være små, runde, og forskjellig fra hverandre.
  2. Passasje mESC i 12-vel plate format (100 000 celler/vel) 1 d før infeksjon.
    1. Telle celler med en hemocytometer. For celler dyrket i 10 cm format, Sug opp den gamle mediet, legge til 5 mL 1 x PBS, Sug opp PBS og legge 1 mL av 0,25% trypsin. Inkuber cellene i trypsin i 8 min ved 37 ° C, rock og trykke cellene halvveis gjennom inkubasjon. Målet med dette trinnet er å få cellene i en enkeltcelle suspensjon.
  3. 48 timer etter skiftende media fra 293T15-cm viral emballasje celler fra trinn 1.4, fjern og overføre nedbryting til en 50-mL konisk rør.
  4. Sentrifuge nedbryting på 300 x g for 5 min til pellets celle rusk.
  5. Filtrere nedbryting gjennom en 0.45-µm membran.
    Merk: Pass på å bruke surfactant-fri celluloseacetat (SFCA) membraner, noen andre materialer kan beholde virus og redusere avkastningen.
  6. Konsentrere viruset med ultracentrifugation, ved hjelp av en sentrifuge med en SW32 rotoren, og spinn på 20 000 rpm (~ 72,000 x g) for 2,5 t på 4 ° C.
  7. Mens viruset konsentrerer under ultracentrifugation, kan du behandle CiA mESCs i 12-vel platen med fersk ES mediet som inneholder 5 µg/mL av polybrene.
  8. Når virus konsentrasjonen er ferdig, nøye Sug opp nedbryting og avbryte virus pellet 100 µL av 1 x PBS (unngå overflødig bobler).
  9. Legg viruset og 1 x PBS slik 1.5-mL microfuge. Vortex/riste røret på 300 g (eller på den laveste innstillingen) fullt suspendere viruset. Nedspinning røret i en mini tabletop centrifuge for 5-10 s fjerne bobler.
  10. Legge til 30 µL av viruset i hver brønn av en 12-vel plate. Snurr den og deretter virvel platen på 1000 x g for 20 min.
    Merk: Mengden av virus lagt kan endres avhengig av viral titer, hvilke er omvendt relatert til levering konstruere størrelse.
    1. Alternativt flash fryse viruset med flytende nitrogen og lagre den på-80 ° C. Imidlertid vil frysing viruset redusere viral titer.
  11. Plasser platen 12-vel tilbake i inkubator 37 ° C og endre media morgenen (~ 16 h) senere med fersk ES media (som beskrevet i trinn 2.1).
  12. Etter 48 timer av infeksjon, Merk for celler som integrert viral plasmider ved å legge det aktuelle antibiotikumet (dvs., 1,5 µg/mL av puromycin, 10 µg/mL av blasticidin, etc.). Endre media daglig og vask cellene med 1 x PBS hvis et flertall av cellene er flytende/dead. Holde valg-media på celler for 72-96 h i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.

3) kjemiske Epigenetic modifikatorer (CEM) s forberedelse og behandling

  1. Suspendere pulverisert CEM i dimethyl sulfoxide (DMSO) å en lager konsentrasjon av 1 mM og en arbeider konsentrasjon av 100 µM.
  2. Etter cellene har gjennomgått utvalget for 72-96 h, delt på mESCs i et 12-vel format med 100.000 celler/godt. Inkuber cellene i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 for 24 h. etterpå, forberede media løsning på 100 nM CEM ES Media. Bruk dette mediet å mate CiA-mESC med 1 mL/godt. For å tjene som en kontroll, kan du holde et godt av celler uten noen ekstra CEMs.
    1. Endre media av aspirating gamle medier og legge 1 mL/vel av nylagde CEM inneholder eller CEM-ledig ES media hver 24 timer for varigheten av et eksperiment.

4) analyse av uttrykket av mikroskopi og flowcytometri

  1. Etter 48 timer CEM behandling image cellene uten CEM behandling og cellene behandlet med 100 nM CEM bruker fluorescens mikroskop. Ta representant bilder bruker fase eller brightfield til å registrere mESC morfologi på 20 X forstørrelse; cellene skal har dannet rundt koloniene, med noen differensierte celler. Under FITC fluorescens kanalen, bilde begge celle betingelsene.
  2. Isolere kontroll og CEM-behandlet celler for flowcytometri av aspirating media, vaske cellene med 1 mL 1 x PBS, aspirating PBS og legge 0,25 mL av 0,25% trypsin med EDTA i 8-10 min.
  3. Kontroller at cellene er ikke lenger i store klumper ved å se i mikroskop. Bruk en 20 X forstørrelse. Hvis cellene ikke vises i en enkeltcelle suspensjon, Pipetter forsiktig opp og ned med en P1000 pipette til fullt trypsinize cellene.
  4. Slukke trypsin med 1 mL av fersk media og resuspend cellene i høy hastighet med en serologisk pipette (eller bruke en P1000 pipette og tips) til cellene er i en enkeltcelle suspensjon.
  5. Nedspinning cellene på 300 x g for 5 min. leveringstanken nedbryting. Vask med 1 x PBS og recentrifuge celler. Sug opp PBS nedbryting.
  6. Resuspend celle pellet i 200 mL FACS buffer (1 mM ethylenediaminetetraacetic syre [EDTA], 1 x PBS og 0,2% bovin serum albumin [BSA]).
    1. Det totale volumet av FACS buffer vil være avhengig av hvor mange celler er til stede, men konsentrasjonen bør være 1000-3000 celler / µL. teller antall celler i 3 prøver og gjennomsnittlig konsentrasjonen av celler. Legge til flere FACS buffer hvis nødvendig.
  7. Utfør flowcytometri > 50 000 celler med suspendert celler, holder cellene på is når de ikke blir analysert. Bruke filtere 530/40 (FITC, AF488, GFP, etc.) for registrering av endringene i uttrykket. Fastslå riktige fluorescerende spenningen ved å bruke en ubehandlet kontroll celle utvalg og angi spenning å ha fluorescerende toppen være i midten av innspilte intensitetsspekteret. Kjøre prøver på en skjede hastighet på rundt 5000 celler/s.
  8. Eksportere dataene og analysere FCS filene på en flyt cytometri program (dvs.FlowJo) av gating først på fremover scatter vs siden scatter for levende celler og deretter fremover scatter høyde vs område for singleter. Deretter visualisere GFP kanaldata på et histogram bestemmer det relative GFP uttrykket i den målrettede og kontrollere befolkninger.

5) analyse av Chromatin av Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) etterfulgt av qPCR

  1. Delt av mESCs i en 10 cm plate med 3 millioner celler og 10 mL ES media (en 10 cm plate for hver eksperimentelle eller kontrollere tilstand). Dagen legge 10 mL CEM inneholder eller CEM-frie medier. Sug opp den gamle mediet etter 48 timer CEM behandling. Vask og Sug opp cellene med 5 mL 1 x PBS. Deretter distansere cellene med 0,25% trypsin og slukke trypsin med 10 mL ES media. Telle og isolere 10 millioner celler per betingelse.
  2. Nedspinning hver 10 millioner celle prøvene på 300 x g i 5 min.
  3. Resuspend hver pellet i 10 mL 1 x PBS og recentrifuge cellene på 300 x g i 5 min.
  4. Resuspend hver pellet i 10 mL av CiA fastsette buffer (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM etylenglykol-bis [ß-aminoethyl Eter]-N, N, N', N'-tetraacetic syre [EGTA] pH 8 og 100 mM natriumklorid [NaCl]). Legg 1 mL av 11% formaldehyd løsning og umiddelbart Inverter prøvene 5 x - 10 x. Inkuber prøven ved romtemperatur for 10 min.
  5. Legg til 0,5 mL 2,5 M glysin. Invertere prøvene umiddelbart og ruge prøven på is 5 min.
  6. Sentrifuge prøven på 1200 x g i 5 min på 4 ° C. Sug opp nedbryting.
  7. Resuspend pellet i 10 mL CiA skyll 1 (50 mM HEPES pH 8 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10% glyserol, 0,5% Nonidet P-40 [NP40], og 0,25% Triton X100). Inkuber prøven på is for 10 min. sentrifuge det 1200 x g i 5 min på 4 ° C.
  8. Resuspend pellet i 10 mL av CiA skyll 2 (10 mM tris [hydroxymethyl] aminomethane [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM EGTA pH 8 og 200 mM NaCl). Sentrifuge prøven på 1200 x g i 5 min på 4 ° C.
  9. Forsiktig legge 5 mL av CiA klipping buffer (0,1% SDS, 1 mM EDTA og 10 mM Tris pH 8) langs sidene av koniske røret å vaske noen salt uten å forstyrre pellet. Sentrifuge prøven på 1200 x g i 3 minutter på 4 ° C. Gjenta trinnet vask.
  10. Resuspend pellet i 90 µL av CiA klipping buffer og frisk proteasehemmere (bruk en blanding av leupeptin, chymostatin og pepstatin A oppløst sammen på 10mg/mL hver i DMSO lage et 1000 x lagerløsning, gjør en siste konsentrasjon av 10 µg/mL). Legge til 10 µL av sonication-forsterke nanodroplets mens du holder alt med is13,14.
  11. Overføre 100 µL av løsningen til røret og lue røret.
  12. Sonicate prøvene for 3,5 min (bestemmes basert på celle linje og antall celler). For å unngå overoppheting prøvene, behandle prøvene i 2-min-maksimale syklustider hvis den totale sonication tiden overstiger 2 min.
    Merk: Den fokusert ultrasonicator brukt her funksjoner på en høy frekvens (500 kHz). Kjøre maskinen på en akustisk power 55 W. Hele sonication skal være forutbestemt av hver individuelle lab.
  13. Overføre hver sonicated chromatin prøve til en ny 1.5-mL microcentrifuge tube. Spin rør 8000 x g i 2 minutter på 4 ° C.
  14. Analysere klipping effektivitet og kvantifisere relative chromatin, følg ChIP kit produsentens protokollen.
    Merk: Bestemme DNA konsentrasjonen spektrofotometrisk (f.eksved hjelp av en DNA nanodrop instrument), og løpe ~ 200 ng av DNA på en 1% agarose gel å bekrefte at chromatin er sonicated til omtrent 200-500 basepairs (bp) i størrelse.
  15. Utføre immunoprecipitation og isolere i chromatin, følger ChIP kit produsentens protokollen.
    Merk: For immunoprecipitation av prøver med høyere DNA konsentrasjoner, varme elueringsbufferen på 37 ° C og elute prøvene 2 x med 30 µL av elueringsbufferen (roterer for 1 min hver gang).
  16. For å utføre qPCR, Legg reagenser i en 384-vel plate. Legge til 5 µL av 2 x asymmetrisk cyanine fargestoff master mix, 2,5 µM hver primer, vann og 0,1 - 10 ng DNA for hver reaksjon.
    1. Design primere å forsterke 50-100 bp amplicons og CT verdier blir normalisert til en rengjøring genet, intracisternal A-type partikler (IAP).
      Merk: For ytterligere qPCR metoder, se kit produsentens protokollen. Primer settet brukes til å målrette Oct4 locus var: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Kontroll primer sett brukt til målet IAP var: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. Basert på primerne og det ønskede produktet, kjøre qPCR med 40 sykluser av en annealing temperatur på 60 ° C i 1 min.
      Merk: Resultatdataene var quantitated med delta-deltaet Ct sammenligninger mellom eksempler, med CiA:Oct4 normalisert over IAP. Siste analyseresultatene vises som gjennomsnitt av tre eksemplarer eksperimentelle prøver, med feil vises som standard avvik fra gjennomsnittet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har nylig utviklet CEMs og viste at denne teknologien kan brukes for å regulere genuttrykk og chromatin miljø på en reporter locus i en doseavhengig og reversibel måte. CEM, CEM23, vises en modell av ledelsen i figur 1. HDAC maskiner er rekruttert til reporter locus av den HDAC inhibitor som i dette tilfellet er GFP reporteren inn ved Oct4 locus.

Vi søkte å karakterisere CEM systemet Oct4 locus i CiA mESCs. Fordi cellene express GFP, var det mulig å raskt visualisere uttrykket av reporteren med fluorescens mikroskopi. Cellene ble fotografert etter 48 timer av behandling med 100 nM i CEM23, sammen med ubehandlet celler. Fase bildene viser sunn mESCs, som er viktig fordi usunn eller differensiert mESCs skulle tilsi en uspesifisert GFP undertrykkelse. Fluorescens bildene viser et lys GFP uttrykk i kontroll cellene og et redusert GFP uttrykk i mESCs behandlet med CEM23. Representant bilder vises i figur 2.

For å kvantifisere endringene i GFP uttrykket, ble flowcytometri brukt. Igjen, CiA mESCs ble behandlet med 100 nM i CEM23 i 48 timer. Eksperimentell cellene behandles med CEM23 og kontroll celler var forberedt flowcytometri, bruke > 100.000 celler per prøve. Konsekvent, observerte vi en > 30% reduksjon i GFP-uttrykke celler blant dem behandlet med CEMs. Et representativt histogram vises i Figur 3.

Når bevis på CEM-indusert GFP gene expression nedgang ble vist, testet vi for endringer i chromatin miljøet med ChIP. En viktig faktor for å forberede prøver for ChIP er omfanget av chromatin sonication. Hvis du prøver så konsekvent og riktig skåret som mulig, ble 10 millioner celler sonicated i 3,5 minutter å få chromatin mellom 200 og 500 bp i størrelse (Figur 4). Fordi vi hypotesen at de undertrykkende CEMs var binde til og rekruttere HDAC proteiner og undertrykkende komplekser til reporteren, testet vi for endringer i histone hale acetylation. Histone 3 lysin 27 acetylation (H3K27ac) er ofte funnet langs transcriptional startwebstedet (TSS) av gener. Vi utførte ChIP med et antistoff for H3K27ac og har utført en qPCR med primer sett oppstrøms og nedstrøms av TSS. Resultatene viser at en 48-timers behandling med 100 nM i CEM23 redusert nivået av H3K27ac på målet locus sammenlignet med kontrollen celler ikke behandles med CEMs (p < 0.01, tosidige Student t-test med tre biologiske replikerer, Figur 5).

Figure 1
Figur 1 : CEMs binder seg til den CiA:Oct4 locus gjennom rekruttering til FKBP og tjore endogene epigenetic maskiner. Modell av CEM systemet viser Gal4-FKBP som protein-til-DNA ankeret. Den FK506 delen av CEM binder til FKBP og den HDAC inhibitor rekrutterer endogene HDAC proteiner for å undertrykke GFP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 2
Figur 2 : Fluorescens bilder av mus embryonale stamceller (mESCs) med en CiA:Oct4 - GFP reporter. Fluorescens mikroskopi bilder viser en nedgang i GFP uttrykk på CEM behandling. Toppanelet viser fase og fluorescerende bilder av mESCs vokst med ubehandlet media. Det nedre panelet viser fase og fluorescerende av mESCs behandlet med 100 nM i CEM23 i 48 timer. Bilder tilpasset med tillatelse fra ACS syntetisk biologi12. Opphavsrett (2018) American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 : Flow cytometri analyse quantitates et redusert uttrykk for GFP i mESCs ved CEM23 behandling. mESCs uten CEM23 (blå) ble sammenlignet med mESCs behandlet med 100 nM i CEM23 i 48 timer (rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 4
Figur 4 : Sonication av chromatin er uniform, og en smear vises mellom 200 og 500 bp. For å utføre ChIP-qPCR, var chromatin fra mESCs sonicated. Hvert utvalg bestod av ca 10 millioner celler, som var sonicated i 3,5 minutter, for å produsere tilsvarende skåret chromatin prøver mellom 200 og 500 bp i lengde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 5
Figur 5 : CEM23 behandling forårsaker en reduksjon i H3K27ac på CiA locus. ChIP-qPCR ble utført for å teste for endringer i chromatin miljøet. Etter en 48-timers behandling med 100 nM i CEM23, en nedgang i H3K27ac ble observert CiA:Oct4 (**p < 0.01, tosidige Student t-test med tre biologiske gjentak. Feilfeltene representerer standardavvik). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrev vi nylig utviklet CEM systemet brukes for å regulere genuttrykk og chromatin miljø på et bestemt gen i en doseavhengig måte. Vi gir en nøyaktig metode for å studere dynamikken involvert i å regulere genuttrykk gjennom selektive rekrutteringen av bestemte endogene chromatin regulatoriske proteiner. Dette er en svært modulær teknologi som kan brukes til å undersøke hvordan forskjellige protein - og chromatin-modifisere komplekser jobber sammen å riktig regulere chromatin miljøet, samt for å studere hvordan disse prosessene er dysregulated, med den Fordelen med å oppnå genet spesifisitet.

Her ble tre måter vist for å visualisere endringer i chromatin struktur og gene uttrykket med ny teknologi. Etter forstyrrelsene for bestemte målrettet loci med CEMs, kunne sanntid endringer genuttrykk analyseres av fluorescens mikroskopi. Deretter kan endringer i gene expression nivåer måles mer kvantitativt med flowcytometri på definerte endepunkt. Til slutt, endringer i posttranslational epigenetic merkene på chromatin ble undersøkt av ChIP; spesifikt, i dette tilfellet H3K27ac. Vi teste ikke HDAC rekruttering med ChIP-qPCR på grunn av mangfoldet av HDACs som fungerer sammen på et enkelt locus. Det er sannsynlig at heterogene innbyggere HDAC enzymer ble rekruttert og det vil derfor være teknisk vanskelig å teste dem alle med ChIP. I et tidligere publiserte arbeid, har vi vist at direkte rekrutteringen av HDAC3 av en GAL4 blanding forårsaket lignende aktivitet på gene expression og chromatin endring av ChIP12. Hvis en ikke-fluorescerende reporter å være modulert, kan endringer i genuttrykk også måles ved (1) en RNA uttrykk analyse med revers transkriptase qPCR eller (2) protein uttrykk med vestlige blotting eller imaging og gjennomfører flowcytometri med fluorescerende sekundære antistoffer.

I forhold til gjeldende CIP-baserte teknikker som CiA systemet12har denne CEM teknologien fordelen av rekruttering endogene epigenetic modulatorer til målet genet. Omdirigere cellens egne maskiner oppretter et mer fysiologisk relevante middel for modulerende uttrykk. Exogenously uttrykke master enzymer, som hatter og transkripsjonsfaktorer, kan resultere i bivirkninger av deres økt uttrykk, spesielt mens ikke blir aktivt rekruttert til genet locus.

Mens denne artikkelen viser funksjonaliteten til denne romanen system med CEMs består av HDAC hemmere, kan flere andre hemmere eller protein rekrutterere syntetiseres i stedet for den HDAC inhibitor. For å oppnå genet aktivisering, kan lue inhibitor- eller HDMT hemmer-basert CEMs syntetiseres. Å undertrykke og så overexpress det samme genet, er det mulig å behandle cellene med en undertrykkende CEM, vaske dem med vanlige medier, og deretter legge til en aktivering CEM. Dette gir et rent system å studere dynamikken i rekruttering undertrykkende og aktivere komplekser til samme genomisk regionen. Når du utformer fremtidige CEMs, må flere egenskaper vurderes, inkludert celle permeabilitet, hemmer styrke, struktur og hemmende kinetics. Koblingsfunksjonalitet lengden mellom FK506 og rekrutterer moiety vil påvirke permeabilitet av CEMs og plasseringen av rekruttert protein. Når du sammenligner to CEMs som ulik bare på koblingsfunksjonalitet lengde, var CEM med kortere linker mer effektiv12. Mens det ikke har blitt testet direkte her, er høyere effektiviteten et resultat av større celle permeabilitet. Det er også viktig å velge hemmere med kjemiske strukturer mottakelig for endring uten å forstyrre delen som binder det aktive området av målet. Styrken og spesifisitet ble også vurdert ved å velge hemmere med høy styrke og spesifisitet for en gitt klasse av proteiner. The kinetics av hemming kan påvirke effektiviteten av CEMs. CEMs består av hemmere med langsom-på prisene pleier å være mindre effektiv.

En begrensning av gjeldende CEM teknologien er behovet av en Gal4-binding matrise på målet genet locus. For å rekruttere CEMs til et annet område enn Oct4 CiA locus, kan noen av hundrevis av foretatt Gal4 oppstrøms aktivisering sekvens (UAS) linjer tilgjengelig for vitenskapelige samfunnet brukes. En måte systemet skal gjøres mer modulær er ved å innlemme en deaktiverte Cas9 (dCas9) med kjemiske epigenetic enzym rekruttering10,11,15. Denne nuclease-død protein fra CRISPR-Cas9 systemet vil fortsatt bli rekruttert til et område i genomet som er utformet for en guide RNA (gRNA), men det vil ikke kutte DNA. Bruker en dCas9-FKBP-blanding, komponenten FKBP vil rekruttere CEMs hvor dCas9 er rekruttert, sterkt økende lettheten og fleksibiliteten av potensielle mål gener. Tenk deg bruke denne teknologien for å målrette sykdom relevante gener som en potensiell terapeutisk eller midler som reversibel og timelig studere sykdom mekanismer på chromatin nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke medlemmer av Hathaway og Jin laboratoriene for diskusjonene nyttig. Forfatterne takker også Dan Crona og Ian MacDonald for deres kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet var støttes delvis av Grant R01GM118653 fra det amerikanske National Institutes of Health (til N.A.H.); og av tilskudd R01GM122749, R01CA218600 og R01HD088626 fra det amerikanske nasjonalt institutter for helse (til JJ). Dette arbeidet ble også støttet av et nivå 3 og student grant fra UNC Eshelman Institutt for innovasjon (N.A.H og A.M.C, henholdsvis). Ytterligere midler fra en T-32 GM007092 (til A.M.C) støttet dette arbeidet. Flow cytometri data ble oppnådd ved UNC Flow cytometri Core anlegget finansiert av en P30 CA016086 Cancer Center Core støtte stipend for UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013CV
NEAA Gibco 11140-050
HEPES (for tissue culture) Corning 25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol) Gibco 21985-023
FBS Atlantic Biologicals S11550 Individual lots tested for quality
Covaris tubes ThermoScientific C4008-632R
Covaris caps ThermoScientific C4008-2A
PEI (polyethylenimine) Polysciences 23966-1
Transfection media (Opti-mem) Gibco 31985070
Virus centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Virus filter membrane Corning 431220
Polybrene Santa Cruz Biotechnology SC134220
0.25 % Trypsin Gibco 25200-056 with EDTA
0.05 % Trypsin Gibco 25400-054 with EDTA
Puromycin InvivoGen ant-pr
Blasticidin InvivoGen ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) Roche 4913914001
H3K27ac antibody Abcam ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit Active Motif 53040
Sonicator Covaris E110
Ultracentrifuge Optima XPN-80
SW-32 centrifuge rotor Beckman Coulter 14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets Beckman Coulter 130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney Clontech 632180
PBS Corning 46-013-CM
BSA Fisher BP9700
EGTA Sigma E3889
EDTA Fisher S311-100
NaCl Fisher S271-1
Glycerol Fisher G33-1
Tris Fisher BP152
NP40 Roche 11754599001
Triton MP Biomedicals 807426
Glycine Fisher BP381-500
TE buffer Fisher BP2474-1
HEPES (for ChIP) Fisher BP310-100
Gelatin Sigma G1890
Flow cytometer, Attune NxT Thermo Fisher A24858
FKBP-Gal4 plasmid Addgene 44245
psPAX2 plasmid Addgene 12260
pMD2.G plasmid Addgene 12259
Nanodroplets MegaShear N/A
DNA Nanodrop Thermo Fisher ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin) Calbiochem/EMD 108975
Protease Inhibitors (Chymostatin) Calbiochem/EMD 230790
Protease Inhibitors (Pepstatin) Calbiochem/EMD 516481
CiA:Oct4 mESC The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells The kind gift of J. Wysocka

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
  5. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  6. Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
  7. Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
  8. Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
  9. Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
  10. Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
  11. Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
  12. Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
  13. Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
  14. Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

Tags

Bioteknologi problemet 139 kjemiske biologi bifunctional molekyler kjemisk indusert nærhet chromatin regulering gene undertrykkelse histone deacetylase epigenetics kjemiske epigenetic modifikatorer CEMs
Repressing Gene transkripsjon av omadresserer cellulære maskiner med kjemiske Epigenetic modifikatorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiarella, A. M., Wang, T. A.,… More

Chiarella, A. M., Wang, T. A., Butler, K. V., Jin, J., Hathaway, N. A. Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (139), e58222, doi:10.3791/58222 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter