Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Репрессии транскрипции гена, перенаправив клеточными с химической эпигеномные модификаторы

Published: September 20, 2018 doi: 10.3791/58222

Summary

Регулирование окружающей среды хроматина является важным процессом для надлежащего ген выражение. Здесь мы описываем метод для контроля экспрессии генов путем набора chromatin изменения механизма ген специфического и обратимым образом.

Abstract

Регулирование хроматина уплотнения является важным процессом, который регулирует экспрессию генов у высших эукариот. Хотя во многих заболеваний обычно разрушаются хроматина уплотнения и регулирование выражение гена, локус конкретных, эндогенного и реверсивные метод для изучения и контроля этих механизмов действий отсутствует. Для решения этой проблемы, мы разработали и характеризуется романа Джин регулируя бифункциональных молекул. Одним из компонентов бифункциональных молекулы связывается с ДНК белковых якорь так, что он будет набираться для Аллел Специфически Локус. Другой компонент занимается эндогенного chromatin изменения клеточными, рекрутинг эти белки для нокдауна определенного гена. Эти малые молекулы, называется химической эпигеномные модификаторы (CEMs), способны контролировать экспрессии генов и окружающей среды хроматина в зависимости от дозы и обратимым образом. Здесь мы подробно CEM подход и его применение к снижению экспрессии генов и ацетилирование гистона хвост на репортера Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП), расположенный в локусе Oct4 в мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs). Мы характеризуют ведущим CEM (CEM23) с помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и иммунопреципитации chromatin (обломока), а затем количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР). В то время как мощности этой системы проявляется в локусе Oct4 , концептуально, CEM технологии является модульной и может быть применен в других типах клеток и в других геномной локусов.

Introduction

Хроматин состоит из ДНК, обернутые вокруг гистона octamer белков, которые формируют ядро нуклеосома частиц. Регулирование хроматина уплотнения является важнейшим механизмом для надлежащего ДНК ремонт, репликации и выражение1,2,3. Один из способов, в котором клетки контролировать уровень уплотнения является добавление или удаление различных модификаций хвост столб-поступательные гистонов. Две такие изменения включают ацетилирования (1) Лизин, которая чаще всего ассоциируется с активацией генов, и (2) Лизин метилирования, который может быть связан с активации генов или репрессий, в зависимости от контекста аминокислоты. Добавление ацетилирования и метилирования марок катализировано гистона acetyltransferases (шляпы) и гистона methyltransferases (HMTs), соответственно, в то время как удаление знака осуществляется гистона комплексы (ГДА) и demethylases (HDMs гистона ), соответственно4,5. Хотя существование этих белков было известно на протяжении десятилетий, многие механизмы как chromatin изменения механизма работы должным образом регулировать экспрессию генов еще предстоит определить. С хроматином регуляторные процессы являются dysregulated в многих заболеваний человека, новые идеи механистического может привести к будущим терапевтического применения.

В естественных условиях chromatin assay (ЦРУ) является недавно описан метод, который использует химическое индуктором близости (CIP) для управления chromatin изменения механизма набора конкретных Локус6. Эта технология использовалась для изучения расширяющийся список динамики хроматина, включая изменения гистона белки, ремонтом хроматина и транскрипции факторов6,,78,9. На основе CIP хроматина привязывая экзогенно выраженной белков также продлевался мимо ЦРУ для модуляции немодифицированных генетических локусов использования с деактивированной кластерного регулярно Interspaced короткие палиндром повторяет ТРИФОСФАТЫ связанные белком (dCas9) 10 , 11. в системе ЦРУ, были изменены mESCs выразить репортер гена GFP в Oct4 локусе, сильно выраженный и строго регламентируются области генома mESC. Ранее, эта система применялась для описания дозозависимый и обратимым вербовки экзогенно выраженной гетерохроматин протеин 1 (HP1), фермент, который связывает H3K9me3 и распространяет репрессивных знаки (например, H3K9me3) и ДНК Метилирование6. Чтобы выполнить этот тип стратегии набора персонала, mESCs заражены плазмида, выражающий FK506-связывающий белок (FKBP), связанные с Gal4, который является ДНК белковых привязку, которая связывает массив Gal4-привязки GFP репортер вверх по течению. Клетки также инфицированы FKBP-rapamycin связывающий домен (FRB), подключенных к HP1. Когда mESCs подвергаются воздействию низких наномолярных концентрациях CIP, rapamycin, FRB и FKBP, сводятся воедино в локусе целевого объекта. В течение дней rapamycin лечения экспрессия гена целевой подавляется, что подтверждается флуоресцентной микроскопии и потока цитометрии и ацетилирование гистона уменьшается, чип и бисульфит последовательности. Хотя разработка и проверка этого подхода были значительные успехи в области исследований хроматина и регулирования, один недостаток — необходимые экзогенных выражение chromatin изменения механизма.

Чтобы сделать технологии, основанные на наборе только эндогенных физиологически соответствующих ферментов и сделать более модульной системы, мы разработан и характеризуется Роман бифункциональных молекул, называемых CEMs (рис. 1)12. Одним из компонентов CEMs включает FK506, который похож на rapamycin, связывает плотно и специально для FKBP. Таким образом CEMs по-прежнему будут набраны к Oct4 локус в ЦРУ mESCs. Другой компонент ПОВ является остаток, который связывает эндогенного chromatin изменения механизма. В экспериментальном исследовании мы протестировали пов, содержащие ингибиторы ГДАЦ. Хотя концепция использования ингибитора набирать гда кажется нелогичным, ингибитор, тем не менее возможность набирать HDAC активность гена интереса. Это достигается путем (1) перенаправление HDAC в локусе, выпуская энзим и увеличение плотности ООН препятствует гда в этом районе и (2) поддержание HDAC ингибирование в локусе, но найма репрессивных комплексы, которые связывают к тормозится гда, (3) или комбинация обоих. В предыдущем исследовании, мы показали, что CEMs смогли успешно подавить GFP-репортер в зависимости от дозы и времени, а также в духе, который был быстро обратимых (т.е., в течение 24 часов)12. Мы были характерны способность CEM технологий, представленные здесь для контроля экспрессии генов с помощью микроскопии флуоресцирования, проточной цитометрии и способности для управления средой хроматина, используя чип ПЦР6. Здесь мы описываем метод для использования и характеризующие пов, которые будут способствовать адаптации этой системы для ответа на дополнительные вопросы, относящиеся к биологии хроматина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) клеточной культуры линия для производства Лентивирусы

  1. Растут свежие, низкий проход (меньше, чем прохождение 30) 293T человеческих эмбриональных почек (ГЭС) клетки в высоких глюкозы Дульбекко модифицированная орел базы СМИ среднего (DMEM) дополнены с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 10 мм HEPES, 1 x несущественные аминокислот (NEAA), ручка / Стрептококк, 2-mercaptoenthanol в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2. Разбить ячейки каждые 3-5 d и прежде чем они становятся > 95% притока.
  2. Прохождение 293T ГЭС клетки с6 18 x 10 на 15 см пластины (один 15-см пластины для каждого вируса производства).
    1. Для 15-см формат аспирационная старых СМИ, добавляют 10 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS), аспирационная PBS и добавить 3 мл 0,05% трипсина. Инкубируйте клетки в трипсина 8 минут при 37 ° C, качалка и выстукивать на полпути через инкубации клеток.
      Примечание: Цель этого шага необходимо получить ячеек в одну ячейку подвеска.
  3. Когда клетки достигли 60% - 80% confluency следующий день, выполняют transfection polyethylenimine (PEI) с 13,5 мкг плазмида psPAX2, 4,5 мкг pMD2.G плазмиды, 18 мкг лентивирусные совместимых доставки вектора с гена интереса (т.е. , FKBP-Gal4), 108 мкл пей и 1,8 мл трансфекции средств массовой информации.
    1. Осторожно смешать ДНК, пей и трансфекции СМИ в 15 мл Конические трубки, инкубации образца при комнатной температуре в течение 15 мин и добавить его каплям к пластине 15-см.
      Примечание: Пожалуйста, используйте соответствующие меры безопасности и следовать всех институциональных и лабораторных процедур безопасности после этого шага, как все реагенты будут содержать живой вирус.
  4. После 16 h transfection и инкубации в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2аспирационная СМИ и осторожно добавить свежие 293 ГЭС СМИ (подставьте в ванну воды 37 ° C) плиты 15-см. Инкубируйте клетки в 37 ° C инкубатор с 5% CO2 в течение 48 часов после того, как средства массовой информации изменения. Вирус, то готовы быть собраны.

2) инфекции из мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESC) с человека

  1. Расти низкий проход (меньше, чем прохождение 35), фидер бесплатные адаптированные mESCs ЦРУ в высоких глюкозы DMEM базы СМИ дополнены 20% ESC-класс FBS, 10 мм HEPES, 1 x NEAA, перо/Strep, 2-mercaptoenthanol и 1: 500 лейкемии ингибитор фактор (LIF) в 37 ° C инкубатор с 5% CO2.
    Примечание: LIF получается из супернатант COS LIF-продуцирующих клеток, которые собираются в пакете и замороженные при температуре-80 ° C.
    1. Рост клеток на пластины, которые были преинкубации для 1-3 ч с 0,1% желатина в ПБС и впоследствии промывают с ПБС. Накормить клетки ежедневно и разделить их каждые 2-3 d, в зависимости от их плотности.
      Примечание: Морфологически, колоний эмбриональных стволовых клеток (ES) должны быть мелкие, круглые и отличаются друг от друга.
  2. Прохождение mESC в формате 12-ну пластины (100000 клеток/а) 1 d до инфекции.
    1. Подсчет количества ячеек с Горяева. Для клеток, выращиваемых в формате 10-см аспирационная старые средства массовой информации, добавить 5 мл ПБС, аспирационная PBS и добавить 1 мл 0,25% трипсина. Инкубируйте клетки в трипсина 8 минут при 37 ° C, качалка и выстукивать на полпути через инкубации клеток. Цель этого шага заключается в том, чтобы получить ячеек в одну ячейку подвеска.
  3. 48 ч после изменения СМИ от вирусных 293T15-см упаковка клетки от шага 1.4, удалить и передачи супернатант в 50-мл Конические трубки.
  4. Центрифуга супернатант в 300 x g за 5 мин до Пелле ячейки мусор.
  5. Фильтр супернатант через мембрану 0,45 мкм.
    Примечание: Не забудьте использовать поверхностно бесплатно ацетат целлюлозы (SFCA) мембраны, как некоторые другие материалы можно сохранить вирус и значительно снизить урожайность.
  6. Сосредоточиться вируса с ultracentrifugation, с помощью центрифуги с SW32 ротором и спина его на 20 000 об/мин (~ 72 000 x g) для 2,5 ч при 4 ° C.
  7. В то время как вирус концентрируется под ultracentrifugation, лечить mESCs ЦРУ в пластине 12-хорошо с свежими ES СМИ, содержащих 5 мкг/мл Полибрен.
  8. По окончании концентрация вируса тщательно удалить супернатант и приостановить Пелле вирус в 100 мкл ПБС (избежать избыточного пузыри).
  9. Добавьте вирус и ПБС отцентрифугировать 1,5 мл трубку. Вихревой/встряхнуть трубки 300 x g (или на самом низком настройки) полностью приостановить вирус. Спин вниз по трубе в мини Настольная центрифуга для 5-10 s для удаления пузырьков.
  10. Мкл 30 вируса в каждой скважине 12-ну плиты. Вихрем пластину и затем центрифуга пластину на 1000 x g 20 мин.
    Примечание: Количество вируса добавил могут варьируется в зависимости от вирусных титр, который пропорционален размер конструкции доставки.
    1. Кроме того flash заморозить вирус с жидким азотом и храните его при температуре-80 ° C. Однако замораживание вирус будет ниже вирусный титр.
  11. Место пластину 12-Ну обратно в инкубаторе 37 ° C и изменить СМИ следующее утро (~ 16 h) позднее с свежими ES СМИ (как описано в шаге 2.1).
  12. После 48 ч инфекции выберите для клеток, которые интегрированы вирусный плазмида, добавив соответствующий антибиотик (т.е., 1,5 мкг/мл puromycin, 10 мкг/мл blasticidin и т.д.). Измените средства массовой информации ежедневно и вымыть клетки с ПБС, если большинство клеток являются плавающие/мертвых. Сохранить выделение средств массовой информации на клетки для 72-96 h в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2.

3) подготовка s химических эпигеномные модификаторы (CEM) и лечение

  1. Приостановите пудры CEM в диметилсульфоксида (ДМСО) штока концентрации 1 мм и рабочие концентрации 100 мкм.
  2. После того, как клетки прошли отбор для 72-96 h, разделена на 12-ну формат с 100000 клеток/хорошо mESCs. Инкубировать клетки в 37 ° C инкубатор с 5% CO2 за 24 ч. После этого, приготовляют раствор средства массовой информации 100 Нм джем с ES СМИ. Используйте этот носитель для корма mESC ЦРУ с 1 мл/хорошо. В качестве элемента управления, держите колодец клеток без каких-либо добавлен пов.
    1. Средства массовой информации аспирационных старые средства массовой информации и добавив 1 мл/хорошо свежеприготовленные CEM-содержащих или беспроводной ЦЕМ ES СМИ каждые 24 ч для измените продолжительность эксперимента.

4) анализ экспрессии микроскопии и проточной цитометрии

  1. После 48 часов лечения CEM, изображение клетки без лечения джем и клетках, обработанных с 100 Нм джем с помощью микроскопа флуоресценции. Представитель изображения с помощью фазы или brightfield для записи морфология mESC при 20-кратном; клетки должны сформировали круглый колоний, с несколько дифференцированных клеток. Под каналом флуоресценции FITC изображение оба условия клетки.
  2. Изолируйте управления и CEM-лечение клетки для проточной цитометрии, аспирационных СМИ, мытья клетки с 1 мл раствора ПБС, аспирационных PBS и добавить 0,25 мл 0,25% трипсина с ЭДТА для 8-10 мин.
  3. Убедитесь, что клетки больше не являются в больших сгустков, глядя в Микроскоп. Используйте 20 кратным увеличением. Если ячейки не отображаются в одной ячейки подвеска, нежно, Пипетка вверх и вниз, с P1000 пипетку, чтобы полностью trypsinize клетки.
  4. Утолить трипсина с 1 мл свежего СМИ и Ресуспензируйте клетки на высокой скорости с Серологические Пипетки (или с помощью P1000 пипеткой и кончик) до тех пор, пока клетки находятся в одной ячейки подвеска.
  5. Спин вниз клетки на 300 x g 5 мин аспирата супернатант. Вымойте с ПБС и recentrifuge клетки. Аспирационная PBS супернатант.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мл буфера СУИМ (1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота [ЭДТА], ПБС и 0,2% альбумина bovine сыворотки [BSA]).
    1. Общий объем буфера СУИМ будет зависеть, сколько клетки присутствуют, но концентрация должна быть 1000-3000 клеток / мкл. подсчитать количество ячеек в 3 образцах и средняя концентрация клеток. При необходимости добавьте больше СУИМ буфера.
  7. Выполните проточной цитометрии > 50,000 клетки с подвесной клетки, сохраняя клетки на льду, когда они не анализируются. Используйте фильтр 530/40 (FITC, AF488, GFP и т.д.) для записи изменений в выражении. Определить соответствующие флуоресцентные напряжения с использованием необработанных управления ячейки выборки и установите напряжение иметь флуоресцентные пик быть в середине спектра записанные интенсивности. Выполнение примеров скоростью около 5000 клеток/с оболочкой.
  8. Экспортировать данные и анализировать ФТС файлы на программу цитометрии потока (т.е., FlowJo), сначала стробирования на вперед разброс против стороны разброс для живых клеток, а затем на вперед разброс высота против области для фуфайки. Затем, визуализировать GFP канала данных на гистограмме для определения относительной экспрессия гена GFP в целевых и контроля населения.

5) анализ Chromatin, Chromatin иммунопреципитации (чип) вслед за ПЦР

  1. Разделить mESCs на 10 см пластины с 3 миллионов клеток и 10 мл ES СМИ (одна пластина 10 см для каждой экспериментальной или контролировать состояние). Следующий день, добавляют 10 мл CEM-содержащих или джем свободных средств массовой информации. После 48 часов лечения CEM аспирационная старые средства массовой информации. Вымыть и удалить ячейки с 5 мл ПБС. Далее разбить ячейки с трипсин 0.25% и утолить трипсина с 10 мл ES СМИ. Граф и изолировать образец 10 миллионов клеток в состоянии.
  2. Спин вниз каждый из 10 миллионов клеток образцов на 300 x g за 5 мин.
  3. Ресуспензируйте каждой гранулы в 10 мл ПБС и recentrifuge клетки на 300 x g за 5 мин.
  4. Ресуспензируйте каждой гранулы в 10 мл ЦРУ исправить буфера (50 мм pH 8, 1 мм ЭДТА рН 8, 0.5 мм этиленгликоля бис [ß аминоэтил эфира]-N, N, N', N'-tetraacetic кислоты [EGTA] pH 8 и 100 мм хлорида натрия [NaCl]). Добавить 1 мл раствора формальдегида 11% и сразу Инвертируйте образцы 5 x - 10 x. Инкубируйте образца при комнатной температуре в течение 10 мин.
  5. Добавьте 0,5 мл 2,5 метров глицина. Инвертировать образцы сразу и инкубации образца на льду на 5 мин.
  6. Центрифугуйте образцы на 1200 x g 5 мин при 4 ° C. Аспирационная супернатант.
  7. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл 1 промойте ЦРУ (50 мм HEPES рН 8, 140 мм NaCl, 1 мм ЭДТА рН 8, 10% глицерина, 0,5% Nonidet P-40 [NP40] и 0,25% Тритон X100). Проинкубируйте образцы на льду за 10 мин центрифуга его на 1200 x g 5 мин при 4 ° C.
  8. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл ЦРУ промыть 2 (10 мм трис [гидроксиметил] aminomethane [трис] рН 8, 1 мм ЭДТА рН 8, 0,5 мм EGTA pH 8 и 200 мм NaCl). Центрифугуйте образцы на 1200 x g 5 мин при 4 ° C.
  9. Аккуратно добавьте 5 мл ЦРУ стрижка буфера (0,1% SDS, ЭДТА 1 мм и 10 мм трис рН 8) вдоль конической трубки смыть соль не нарушая гранулы. Центрифугуйте образцы на 1200 x g 3 мин при 4 ° C. Повторите шаг мыть.
  10. Ресуспензируйте гранулы в 90 мкл ЦРУ режа буфера и ингибиторы протеазы свежие (используйте смесь leupeptin, chymostatin и pepstatin A распущен вместе на 10 мг/мл в ДМСО сделать 1000 x Стоковый раствор, делая окончательный концентрации 10 мкг/мл). 10 мкл sonication повышения nanodroplets, сохраняя все на льду13,14.
  11. Трансфер 100 мкл раствора в стеклянной трубки и крышка трубки.
  12. Sonicate образцы для 3,5 мин (определяется на основе клеток линии и количество клеток). Во избежание перегрева образцов, обработки образцов в цикла 2-мин максимальной времена если общая sonication время превышает 2 мин.
    Примечание: Целенаправленное ultrasonicator используется здесь функций с высокой частотой (500 кГц). Запустить машину на акустической мощности 55 Вт. Продолжительность sonication следует заранее на каждый отдельным лаборатории.
  13. Передать новой пробки microcentrifuge 1,5 мл каждый образец sonicated хроматина. Спин трубы на 8000 x g на 2 мин при 4 ° C.
  14. Анализировать стрижка эффективность и определить их относительное количество хроматина, следовать протокол комплект Производитель чипа.
    Примечание: Определения концентрации ДНК спектрофотометрически (например, с помощью инструмента nanodrop ДНК), и запустить ~ 200 нг ДНК на геле агарозы 1% для проверки, что хроматина является sonicated для примерно 200-500 basepairs (bp) в размер.
  15. Для выполнения иммунопреципитации и изолировать хроматина, следовать протокол комплект Производитель чипа.
    Примечание: Для иммунопреципитации образцов с высокой концентрации ДНК, теплый Элюирующий буфер при 37 ° C и элюировать образцы 2 x с 30 мкл буфера (спиннинг за 1 мин каждый раз).
  16. Для выполнения ПЦР, загрузите реагентов в 384-ну плиту. Добавить 5 мкл 2 x асимметричный цианиновые краситель микс Мастер, 2,5 мкм каждого грунт, воду и 0,1 - 10 нг ДНК для каждой реакции.
    1. Дизайн праймеров для того чтобы усилить bp ампликонов 50-100 и значения CT нормализуются к гену домоустройства, intracisternal A-типа частиц (МАП).
      Примечание: Для дальнейших методов ПЦР, смотрите комплект Производитель протокол. Набор грунтовка, используются для таргетинга Oct4 Локус был: CACATGAAGCAGCACGACTT (F); (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Грунтовка управления, набор команд для цели МАП был: ATTTCGCCTAGGACGTGTCA (F); (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. На основании праймеры и желаемого продукта, запустите ПЦР с 40 циклов отжига температура 60 ° c за 1 мин.
      Примечание: Полученные данные был предел, с использованием Дельта дельта Ct сравнений между образцами, с CiA:Oct4 нормализуется через МАП. Результаты заключительного анализа отображаются как средние тройные экспериментальных образцов, с ошибкой, представлены как стандартное отклонение от среднего значения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы недавно разработали пов и продемонстрировал, что эта технология может применяться для регулирования экспрессии генов и окружающей среды хроматина в локусе репортер в зависимости от дозы и обратимым образом. На рисунке 1показана модель ведущего CEM, CEM23. HDAC машины к репортер Локус завербован ингибиторы ГДАЦ, который, в данном случае является журналистом GFP, вставляется в локусе Oct4 .

Мы стремились охарактеризовать CEM системы в локусе Oct4 в ЦРУ mESCs. Потому что клетки Экспресс GFP, можно было быстро визуализировать выражение репортер с микроскопии флуоресцирования. Клетки были образы после 48 часов лечения с 100 Нм CEM23, вместе с необработанными клетки. Фазы изображения показывают здоровый mESCs, что важно, потому что нездоровых или дифференцированных mESCs будет означать репрессий GFP-неспецифический. Флуоресценции снимках яркие экспрессия гена GFP в ячейках элемента управления и сокращение экспрессия гена GFP в mESCs с CEM23. Представитель изображения отображаются на рисунке 2.

Для количественной оценки изменения экспрессии гена GFP, был использован проточной цитометрии. Опять же, ЦРУ mESCs лечили 100 Нм CEM23 на 48 часов. Экспериментальная клетках, обработанных с CEM23 и управления клетки были подготовлены для проточной цитометрии, используя > 100000 клеток на сэмпл. Последовательно мы наблюдали > 30% снижение GFP-выражая клетки среди тех, кто лечится пов. Представитель гистограммы показан на рисунке 3.

После того, как был свидетельством CEM-индуцированной GFP ген выражение уменьшение, мы проверили на изменения в окружающей среде хроматина, используя чип. Одним из важных факторов для подготовки образцов для чипа является степень sonication хроматина. Чтобы иметь образцы как последовательно и правильно преобразованное максимально, 10 миллионов клеток были sonicated для 3,5 минут получить хроматина между 200 и 500 bp в размер (рис. 4). Потому что мы предположили, что репрессивных CEMs привязки и подбор HDAC белков и репрессивных комплексов репортер, мы проверили для изменения в хвост ацетилирование гистонов. Ацетилирование гистона 3 лизина 27 (H3K27ac) часто встречающиеся вдоль transcriptional стартовый сайт (TSS) генов. Мы чип с антитело для H3K27ac, а затем ПЦР с наборами грунтовка вверх и вниз по течению от TSS. Результаты показывают, что 48-часовой лечения с 100 Нм CEM23 снизился уровень H3K27ac в локусе цель по сравнению с клетки управления, не получавших CEMs (p < 0.01, два-Стьюдента t-тест с тремя биологического реплицирует, Рисунок 5).

Figure 1
Рисунок 1 : CEMs привязку к CiA:Oct4 Локус через набор FKBP троса эндогенного эпигеномные механизма и. Модель системы CEM показывает Gal4-FKBP как якорь белков и ДНК. FK506 часть CEM связывается FKBP и АБС битор HDAC новобранцев эндогенного HDAC белки для подавления гена GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 2
Рисунок 2 : Изображения флуоресценции мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs) с CiA:Oct4 - GFP репортер. Люминесцентная микроскопия изображения показывают снижение экспрессии гена GFP на джем лечение. Верхней панели показывает фазы и люминесцентные изображения mESCs, выросло с необработанной СМИ. На нижней панели показывает фазы и люминесцентных mESCs, лечили 100 Нм CEM23 на 48 часов. Изображения, адаптированных с разрешения от синтетической биологии АКГ12. Авторское право (2018) американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 3
Рисунок 3 : Cytometry анализ потока quantitates снижение выражение гена GFP в mESCs после CEM23 лечения. mESCs без CEM23 (синий) были по сравнению с mESCs, лечили 100 Нм CEM23 на 48 часов (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 4
Рисунок 4 : Sonication хроматина является единой, и мазок видна между 200 и 500 bp. Чтобы выполнить чип ПЦР, был sonicated хроматина от mESCs. Каждый образец состоял из примерно 10 миллионов клеток, которые были sonicated для 3,5 минут, производить аналогично стриженый хроматина образцы между 200 и 500 bp в длину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 5
Рисунок 5 : CEM23 лечения приводит к снижению H3K27ac в ЦРУ локусе. Чип ПЦР была выполнена для проверки изменений в окружающей среде хроматина. После 48 часов лечения с 100 Нм CEM23, было отмечено снижение в H3K27ac на CiA:Oct4 (**p < 0.01, два-Стьюдента t-тест с три биологических реплицирует. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описали недавно разработанная система CEM применяются для регулирования экспрессии генов и окружающей среды хроматина в конкретных генов в зависимости от дозы. Мы предоставляем точный метод для изучения динамики участвует в регуляции экспрессии генов путем выборочного набора конкретных эндогенного хроматина регуляторных белков. Это высоко модульная технология, которая может применяться для расследования, как различные белка и хроматин модифицирующие комплексы работу в концерте должным образом регулировать хроматина окружающей среды, а относительно изучения, как эти процессы являются dysregulated, с интересах достижения ген специфичности.

Здесь были продемонстрированы три способа визуализировать изменения в выражении структура и гена хроматина с новой технологией. После возмущения конкретных целевых локусов с пов реального времени изменения в экспрессии генов могут быть проанализированы микроскопии флуоресцирования. Затем изменения в уровнях выражения гена может быть измерена более количественно с проточной цитометрии в определенные конечные точки. Наконец были рассмотрены изменения в Посттрансляционная эпигенетических меток на хроматин чип; в частности в данном случае, H3K27ac. Мы не проверяли ГДАЦ вербовкой с чип ПЦР из-за разнообразия гда, которые действуют на концерте в одном локусе. Вполне вероятно, что был нанят однородным населением HDAC ферментов и он таким образом, будет технически трудно проверить их все на чип. В ранее опубликованной работе мы продемонстрировали, что прямого набора HDAC3 сплавливанием GAL4 вызванных подобную деятельность на ген выражение и хроматина модификации чип12. Если время модулируется репортер не флуоресцентные, изменения в экспрессии генов также может быть измерена путем анализа выражения (1 РНК с обратной транскриптазы ПЦР или (2) белков с Западный blotting, или изображений и проведение проточной цитометрии с Флуоресцентный вторичные антитела.

В отношении текущих методов на основе CIP, как ЦРУ системы12эта технология CEM имеет преимущество подбора эндогенного эпигеномные Модуляторы для целевого гена. Переориентации механизма собственных клеток создает более физиологически соответствующие средства модулирует выражение. Экзогенно выражая мастер ферменты, такие как шляпы и транскрипционных факторов, может привести к побочные эффекты от их увеличение выражение, особенно во время не активно вербуют для Локус гена.

Хотя эта статья показывает функциональность этой системы novel с пов, состоящий из HDAC ингибиторов, несколько других ингибиторов или вербовщиков белка может быть синтезирован вместо ингибиторы ГДАЦ. Для достижения ген активации, может быть синтезирован HAT ингибитор - или HDMT на основе ингибиторов пов. Для подавления и затем overexpress же ген, это можно лечить клетки с репрессивной CEM, мыть их с регулярные СМИ, а затем добавить активация CEM. Это позволило бы чистой системы для изучения динамики набора репрессивных и активация комплексов в регионе же геномную. При проектировании будущих пов, несколько характеристик нужно рассматривать, в том числе проницаемость клеток, ингибитор потенции, структура и кинетика ингибирующего. Компоновщик Длина между FK506 и группу рекрутер будет влиять на проницаемость пов, а также положение набираемого белка. При сравнении двух пов, которые отличаются только длиной компоновщика, джем с компоновщик короче было более эффективным12. Хотя он не был протестирован непосредственно здесь, выше эффективность является результатом большей проницаемостью клеток. Важно также выбор ингибиторов химической структуры поддаются модификации без нарушения часть, которая связывает активного узла целевого объекта. Потенция и специфики были также рассмотрены, выбрав ингибиторы с высокой потенции и специфичности для данного класса белков. Кинетика ингибирования может повлиять на эффективность пов. Пов состоит из ингибиторов с медленно-off ставки, как правило, менее эффективным.

Одно ограничение текущей технологии CEM это требование Gal4-привязки массива на целевой Локус гена. Набирать CEMs в регионе помимо Локус Oct4 ЦРУ , можно использовать любые из сотен линий инженерии Gal4 вверх по течению активации последовательности (УАС) доступны для научного сообщества. Один из способов, система будет производиться более модульным — путем включения деактивированной Cas9 (dCas9) с химической эпигеномные фермента набора10,11,15. Этот белок нуклеиназы мертвых от ТРИФОСФАТЫ-Cas9 системы по-прежнему будет набираться в любой регион генома, к которому руководство РНК (gRNA) предназначен, но он не будет вырезать ДНК. С помощью dCas9-FKBP фьюжн, компонент FKBP будет набирать пов, где набирается dCas9, значительно повышает простоту и гибкость потенциальных целевых генов. Представьте себе, используя эту технологию для болезни соответствующих генов как терапевтический потенциал или средство, с помощью которого обратимо и височно изучение механизмов болезни на уровне хроматина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить членов Hathaway и Цзинь лабораторий за их полезные дискуссии. Авторы также поблагодарить Dan Crona и Иэн Макдональд за их критического чтения рукописи. Эта работа частично поддержали R01GM118653 грант от национальных институтов здравоохранения США (до N.A.H.); и на гранты R01GM122749, R01CA218600 и R01HD088626 от США национального институтов здравоохранения (для J.J.). Эта работа была также поддержана уровня 3 и студент грант от КООН Эшелман Институт инноваций (N.A.H и Мехико, соответственно). Дополнительное финансирование из T-32 GM007092 (в Мехико) поддерживает эту работу. Проточная цитометрия, полученные данные на КООН потока цитометрии Core объекте финансируется P30 CA016086 рака центр основной поддержки Грант на КООН Lineberger всеобъемлющем онкологический центр.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013CV
NEAA Gibco 11140-050
HEPES (for tissue culture) Corning 25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol) Gibco 21985-023
FBS Atlantic Biologicals S11550 Individual lots tested for quality
Covaris tubes ThermoScientific C4008-632R
Covaris caps ThermoScientific C4008-2A
PEI (polyethylenimine) Polysciences 23966-1
Transfection media (Opti-mem) Gibco 31985070
Virus centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Virus filter membrane Corning 431220
Polybrene Santa Cruz Biotechnology SC134220
0.25 % Trypsin Gibco 25200-056 with EDTA
0.05 % Trypsin Gibco 25400-054 with EDTA
Puromycin InvivoGen ant-pr
Blasticidin InvivoGen ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) Roche 4913914001
H3K27ac antibody Abcam ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit Active Motif 53040
Sonicator Covaris E110
Ultracentrifuge Optima XPN-80
SW-32 centrifuge rotor Beckman Coulter 14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets Beckman Coulter 130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney Clontech 632180
PBS Corning 46-013-CM
BSA Fisher BP9700
EGTA Sigma E3889
EDTA Fisher S311-100
NaCl Fisher S271-1
Glycerol Fisher G33-1
Tris Fisher BP152
NP40 Roche 11754599001
Triton MP Biomedicals 807426
Glycine Fisher BP381-500
TE buffer Fisher BP2474-1
HEPES (for ChIP) Fisher BP310-100
Gelatin Sigma G1890
Flow cytometer, Attune NxT Thermo Fisher A24858
FKBP-Gal4 plasmid Addgene 44245
psPAX2 plasmid Addgene 12260
pMD2.G plasmid Addgene 12259
Nanodroplets MegaShear N/A
DNA Nanodrop Thermo Fisher ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin) Calbiochem/EMD 108975
Protease Inhibitors (Chymostatin) Calbiochem/EMD 230790
Protease Inhibitors (Pepstatin) Calbiochem/EMD 516481
CiA:Oct4 mESC The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells The kind gift of J. Wysocka

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
  5. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  6. Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
  7. Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
  8. Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
  9. Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
  10. Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
  11. Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
  12. Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
  13. Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
  14. Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

Tags

Биоинженерия выпуск 139 химической биологии бифункциональных молекул химическая индуцированной близости регулирование хроматина репрессии гена деацетилаз гистонов эпигенетики химических эпигеномные модификаторы пов
Репрессии транскрипции гена, перенаправив клеточными с химической эпигеномные модификаторы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiarella, A. M., Wang, T. A.,More

Chiarella, A. M., Wang, T. A., Butler, K. V., Jin, J., Hathaway, N. A. Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (139), e58222, doi:10.3791/58222 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter