Summary
Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.
Abstract
Regulación de la compactación de la cromatina es un proceso importante que regula la expresión génica en eucariotas superiores. Aunque la compactación de la cromatina y regulación de la expresión génica se interrumpen comúnmente en muchas enfermedades, ha faltado un método para estudiar y controlar estos mecanismos de acción específicas de locus endógeno y reversible. Para solucionar este problema, hemos desarrollado y caracterizado novela moléculas bifuncionales Regulación génica. Uno de los componentes de la molécula bifuncional se une a un anclaje de proteínas de ADN que se reclutarán a un locus específico de alelo. El otro componente activa endógena celular maquinaria de modificadores de la cromatina, reclutamiento de estas proteínas a un gen de interés. Estas pequeñas moléculas, llamadas modificadores químicos epigenéticos (CEMs), son capaces de controlar la expresión de genes y el ambiente de la cromatina en forma dosis dependiente y reversible. Aquí detallamos un enfoque CEM y su aplicación para disminuir la expresión génica y la acetilación de histonas cola a un reportero de la proteína fluorescente verde (GFP) situado en el locus Oct4 en células madre embrionarias de ratón (troncales). Caracterizamos el plomo CEM (CEM23) mediante microscopia fluorescente, citometría de flujo e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), seguida de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Mientras que la potencia de este sistema se demuestra en el locus Oct4 , conceptualmente, la tecnología CEM es modular y puede ser aplicada en otros tipos celulares y en otros lugares geométricos genomic.
Introduction
La cromatina consiste en ADN envuelto alrededor de las proteínas de octámero de histonas que forman la partícula núcleo del nucleosoma. Regulación de la compactación de la cromatina es un mecanismo esencial para adecuada ADN reparación, replicación y expresión1,2,3. Una forma en la que las células controlan el nivel de compactación es a través de la adición o eliminación de varias modificaciones de cola post-traduccionales de la histona. Dos tales modificaciones incluyen acetilación de la lisina (1), que es más comúnmente asociada con la activación del gen, y la metilación de la lisina (2), que puede estar asociada con activación de gen o represión, dependiendo del contexto del aminoácido. La adición de las marcas de la acetilación y la metilación es catalizada por las histonas acetiltransferasas (HATs) e histona metiltransferasas (HMTs), respectivamente, mientras que la eliminación de la marca se hace por histona deacetilasas (HDAC) e histona demetilasas (HDMs ), respectivamente de4,5. Aunque la existencia de estas proteínas ha sido conocida durante décadas, muchos mecanismos de maquinaria como modificadores de la cromatina obras para regular adecuadamente la expresión de genes quedan por definirse. Procesos de regulación de la cromatina son normales en muchas enfermedades humanas, nueva visión mecanicista podría conducir a futuras aplicaciones terapéuticas.
La cromatina en vivo (CiA) es una técnica recientemente descrita que utiliza un inductor químico de proximidad (CIP) para controlar la contratación de maquinaria modificadores de la cromatina a un locus específico6. Esta tecnología se ha utilizado para el estudio de una lista creciente de la dinámica de la cromatina, como modificación de las histonas proteínas, remodeladores de cromatina y transcripción factores6,7,8,9. Cromatina basada en CIP inmovilización de proteínas expresadas exógenamente ha también se ha extendido más allá de la CiA para modular lugares geométricos genéticos no modificado por uso con una proteína desactiva agrupadas regularmente otro corto palindrómico repite CRISPR (dCas9) 10 , 11. en el sistema CiA, troncales han sido modificados para expresar un gen reportero GFP en el locus Oct4 , una zona altamente expresa y estrictamente regulado del genoma mESC. Anteriormente, este sistema se ha aplicado para describir la contratación dependiente de la dosis y reversible de la proteína exógena expresada de la heterocromatina 1 (HP1), una enzima que se une de H3K9me3 y propaga represivas marcas (por ejemplo, H3K9me3) y ADN la metilación6. Para lograr este tipo de estrategia de reclutamiento, las troncales se infectan con un plásmido que expresa una proteína de unión a FK506 (FKBP) ligada a un Gal4, que es un ancla de ADN-proteína que se une a una matriz de Unión Gal4 aguas arriba de la reportera GFP. Las células también están infectadas con un dominio de FKBP-rapamicina-obligatorio (FRB) conectado a HP1. Cuando las troncales son expuestos a concentraciones nanomolar baja del CIP, rapamicina, FRB y FKBP, se reunió en el lugar de destino. Dentro de días de tratamiento de rapamicina, se reprime la expresión del gen objetivo, evidenciada por citometría de flujo y microscopía de fluorescencia, y la acetilación de las histonas está disminuida, de viruta y secuenciación de bisulfito. Mientras que el desarrollo y validación de este enfoque han sido significativos avances en el campo de la investigación de la cromatina y la regulación, una desventaja es la necesaria expresión exógena de modificadores de la cromatina maquinaria.
Para que la tecnología basada en el reclutamiento de sólo endógenas enzimas fisiológicamente relevantes y hacer un sistema más modular, había diseñado y caracterizado nuevos moléculas bifuncionales, denominadas CEMs (figura 1)12. Uno de los componentes de las CEMs incluye FK506 que, similar a la rapamicina, se une firmemente y específicamente a FKBP. Así, los CEMs todavía serán reclutados para el locus Oct4 en las troncales de la CiA. El otro componente de las CEMs es una molécula que se une maquinaria endógena modificadores de la cromatina. En un estudio piloto, hemos probado CEMs que contienen inhibidores de las HDACS. Mientras que el concepto de usar un inhibidor para recluta HDAC parece contra-intuitivo, el inhibidor es capaz de reclutar actividad HDAC al gen de interés. Esto se logra mediante (1) reorientar la HDAC al lugar geométrico, liberando la enzima, aumentando la densidad de las HDACs no inhibidas en el área y la inhibición de la HDAC (2) mantener en el lugar geométrico, y reclutamiento de complejos represivos que se unen a las HDACs inhibidas, o (3) una combinación de ambos. En un estudio anterior, demostramos que la CEMs fueron capaces de reprimir con éxito el reportero GFP de forma dosis y tiempo dependiente, así como de una manera que fue rápidamente reversible (es decir, dentro de las 24 horas)12. Nos caracteriza la capacidad de la tecnología CEM presentada aquí a la expresión de genes de control usando microscopía de fluorescencia, citometría de flujo y la capacidad para controlar el ambiente de cromatina mediante qPCR ChIP6. Aquí, describimos un método para el uso y caracterización de los CEMs, que facilitarán la adaptación de este sistema para responder a preguntas adicionales relacionadas con la biología de la cromatina.
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Protocol
1) cultura de línea de la célula para la producción de Lentivirus
- Crecer, paso bajo (menos de paso 30) células de riñón embrionario humano (HEK) 293T en alta glucosa Dulbecco de modificado Eagle de media base mediano (DMEM) suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS), 10 mM HEPES, 1 x aminoácidos no esenciales (AANE), pluma / Estreptococo, 2 mercaptoenthanol en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2. Dividir las celdas cada 3-5 d y antes de que se vuelven confluentes de > 95%.
- Paso de las células HEK 293T con 18 x 106 por placa de 15 cm (una placa de 15 cm para cada virus producida).
- Para un formato de 15 cm, aspirar viejos media, añadir 10 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS), aspirar el PBS y añadir 3 mL de tripsina 0,05%. Incubar las células en tripsina durante 8 min a 37 ° C, balanceo y golpeando ligeramente las células a la mitad de la incubación.
Nota: El objetivo de este paso es obtener las células en una suspensión unicelular.
- Para un formato de 15 cm, aspirar viejos media, añadir 10 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS), aspirar el PBS y añadir 3 mL de tripsina 0,05%. Incubar las células en tripsina durante 8 min a 37 ° C, balanceo y golpeando ligeramente las células a la mitad de la incubación.
- Cuando las células han alcanzado 60% - 80% de confluencia al día siguiente, realizar una transfección de polietilenimina (PEI) con 13,5 μg de plásmido psPAX2, 4,5 μg de plásmido pMD2.G, 18 μg de vectores lentivirales compatible entrega con el gen de interés (es decir, , FKBP-Gal4), 108 μl del PEI y 1,8 mL de medio de transfección.
- Suavemente mezcle el ADN, PEI y transfección de medios en un tubo cónico de 15 mL, incubar la muestra a temperatura ambiente durante 15 minutos y añadir gota a gota a la placa de 15 cm.
Nota: Por favor, uso apropiado de medidas de seguridad y siga todo institucional y procedimientos de seguridad de laboratorio después de este paso, como todos los reactivos que contienen un virus vivo.
- Suavemente mezcle el ADN, PEI y transfección de medios en un tubo cónico de 15 mL, incubar la muestra a temperatura ambiente durante 15 minutos y añadir gota a gota a la placa de 15 cm.
- Después de 16 h de incubación en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2y transfección, aspirar los medios de comunicación y añadir suavemente fresca media HEK 293 (precalentado en un baño de agua de 37 ° C) a las placas de 15 cm. Incubar las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2 durante 48 h después de cambian de los medios de comunicación. El virus es entonces listo para ser cosechada.
2) infección de ratón células madre embrionarias (mESC) con Lentivirus
- Crecer paso bajo (menos de paso 35), troncales de CiA adaptado libre de alimentador en media base de DMEM alta glucosa suplementado con 20% FBS grado ESC, 10 mM HEPES, inhibidor de la leucemia x NEAA, pluma/Strep, 2 mercaptoenthanol y 1: 500 1 factor (LIF) en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2.
Nota: El LIF se obtiene a partir del sobrenadante de células productoras de COS LIF, que se recogen en lote y congelados a-80 ° C.- Crecen las células en las placas que han sido incuba durante 1-3 h con 0.1% gelatina de 1 x PBS y posteriormente se lavaron con PBS 1 x. Alimentación de las células diariamente y dividirlas cada 2-3 días, dependiendo de su densidad.
Nota: Morfológicamente, las colonias de células madre embrionarias (ES) deben ser pequeño, redondo y distintos unos de otros.
- Crecen las células en las placas que han sido incuba durante 1-3 h con 0.1% gelatina de 1 x PBS y posteriormente se lavaron con PBS 1 x. Alimentación de las células diariamente y dividirlas cada 2-3 días, dependiendo de su densidad.
- Paso mESC en un formato de placa de 12 pozos (100.000 células/pocillo) 1 d antes de la infección.
- Contar las células con un hemocitómetro. Para las células cultivadas en un formato de 10 cm, aspirar viejos media, añadir 5 mL de PBS 1 x, aspirar el PBS y añadir 1 mL de tripsina 0.25%. Incubar las células en tripsina durante 8 min a 37 ° C, balanceo y golpeando ligeramente las células a la mitad de la incubación. El objetivo de este paso es obtener las células en una suspensión unicelular.
- 48 h después de cambiar los medios de comunicación de la 293T15-cm viral embalaje células de paso 1.4, retirar y transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL.
- Centrifugar el sobrenadante a 300 x g durante 5 minutos para que sedimenten restos celulares.
- Filtrar el sobrenadante a través de una membrana de 0,45 μm.
Nota: Asegúrese de utilizar membranas de acetato de celulosa libre de surfactante (SFCA), como algunos otros materiales pueden retener virus y reducir significativamente los rendimientos. - Concentrar el virus con ultracentrifugación, utilizando una centrífuga con un rotor SW32 y vuelta a 20.000 rpm (~ 72.000 x g) durante 2,5 h a 4 ° C.
- Mientras que el virus se concentra en la ultracentrifugación, tratar las troncales de la CiA en la placa de 12 pozos con dulce ES los medios de comunicación que contiene 5 μg/mL de polibreno.
- Una vez terminada la concentración del virus, cuidadosamente aspirar el sobrenadante y suspender el sedimento virus en 100 μl de PBS 1 x (Evite las burbujas exceso).
- Añadir el virus y 1 x PBS a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Vortex/agitar el tubo de 300 x g (o en la posición más baja) de suspender completamente el virus. Girar hacia abajo el tubo en una centrífuga de mesa Mini para 5-10 s eliminar burbujas.
- Añadir 30 μL del virus en cada pocillo de una placa de 12 pozos. Remolino de la placa y luego centrifugar la placa a 1.000 x g durante 20 min.
Nota: La cantidad de virus añadido puede variar dependiendo de la titulación viral, que es inversamente proporcional al tamaño de la construcción de entrega.- Por otra parte, flash congelar el virus con nitrógeno líquido y almacenarlo a-80 ° C. Sin embargo, el virus de la congelación bajará el título viral.
- Vuelva a colocar la placa de 12 pozos en la incubadora de 37 ° C y cambiar a los medios de comunicación a la mañana siguiente (~ 16 h) más adelante con medios ES frescas (como se describe en el paso 2.1).
- Después de 48 h de la infección, seleccione para las células que integran el plásmido viral añadiendo el antibiótico apropiado (es decir, 1,5 μg/mL de puromicina, 10 μg/mL de blasticidin, etc.). Cambiar los medios de comunicación diariamente y lavar las células con PBS 1 x, si la mayoría de las células es muertas o flotante. Mantener los medios de selección sobre las celdas de 72-96 h en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2.
3) tratamiento y preparación modificadores epigenéticos química (CEM)
- Suspender la CEM en polvo en dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración stock de 1 mM y una concentración de trabajo de 100 μm.
- Después de que las células han sido sometidos a la selección de 72-96 h, dividir las troncales en un formato de 12-bien con 100.000 células/pozo. Incubar las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2 para 24 h. posteriormente, preparar una solución de medios de comunicación de 100 nM CEM con medios ES. Utilice este medio para alimentar la mESC CiA con 1 mL/pozo. Para servir como un control, mantener una fuente de células sin ningún añadidos CEMs.
- Cambiar el medio aspirar viejos media y añadiendo 1 mL/bien de recién preparados que contienen CEM o libre de CEM ES cada 24 h para la duración de un experimento.
4) análisis de la expresión por microscopia y citometría de flujo
- Después de 48 horas de tratamiento del CEM, imagen de las células sin tratamiento de CEM y las células tratadas con 100 nM CEM utilizando un microscopio de fluorescencia. Tomar imágenes representativas con fase o trasmitida para registrar la morfología mESC con 20 aumentos; las células deben forman colonias redondas, con unas células diferenciadas. Bajo el canal de fluorescencia FITC, imagen ambas condiciones de la célula.
- Aislar el control y células tratadas con CEM para citometría de flujo de aspiración de los medios de comunicación, lavar las células con 1 mL de 1 x PBS, aspirando el PBS y agregar 0,25 mL de tripsina 0.25% con EDTA para 8-10 minutos.
- Confirman que las células ya no son grumos grandes mirando en el microscopio. Usar un aumento de X 20. Si las células no parecen ser una suspensión unicelular, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 a trypsinize completamente las células.
- Saciar la tripsina con 1 mL de medio fresco y resuspender las células en alta velocidad con una pipeta serológica (o usando una pipeta P1000 y punta) hasta que las células en una suspensión unicelular.
- Desactivación de las células a 300 x g durante 5 min aspirar el sobrenadante. Lavado con PBS 1 x y centrifugar las células. Aspirar el sobrenadante de PBS.
- Resuspender el precipitado de células en 200 mL de tampón FACS (ácido etilendiaminotetracético de 1 mM [EDTA] 1 x PBS y 0.2% albúmina de suero bovino [BSA]).
- El volumen total de tampón FACS dependerá cuántas células están presentes, pero la concentración debe ser de 1.000-3.000 células / μl. contar el número de células en las 3 muestras y media de la concentración de células. Añadir tampón FACS más si es necesario.
- Realizar citometría de flujo en > 50.000 células con las células de suspensión, manteniendo las células en hielo cuando no están siendo analizados. Utilice un filtro de 530/40 (FITC, AF488, GFP, etc.) para grabar los cambios en la expresión. Determinar el voltaje fluorescente apropiado utilizando una muestra de células de control sin tratamiento y ajustar la tensión de tener el pico fluorescente en el medio del espectro de la intensidad registrada. Ejecutar las muestras a una velocidad de envoltura de alrededor 5.000 células/s.
- Exportar los datos y analice los archivos FCS en un programa de citometría de flujo (es decir, FlowJo) bloquean primero en forward scatter vs lado dispersión de células vivas y en dispersión delantera altura vs área para camisetas. Entonces, visualizar datos del canal GFP en un histograma para determinar la expresión relativa de la GFP en el destino y control de las poblaciones.
5) el análisis de la cromatina de cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación seguido por qPCR
- Dividir las troncales en una placa de 10 cm con 3 millones de células y 10 mL de media ES (una placa de 10 cm para cada uno experimental o condición de control). Al día siguiente, añadir 10 mL de medio que contiene el CEM o CEM-libre. Después de 48 horas de tratamiento del CEM, aspirar viejos media. Lavar y aspirar las células con 5 mL de 1 x PBS. A continuación, disociar las células con tripsina 0.25% y calmar la tripsina con 10 mL de medio de ES. Contar y aislar una muestra de 10 millones de células por condición.
- Girar por cada una de las muestras de células 10 millones a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspender cada precipitado en 10 mL de 1 x PBS y centrifugar las células a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspender cada precipitado en 10 mL de tampón de la solución de CiA (50 mM de pH 8, pH de EDTA 1 mM 8 mM 0,5 etilenglicol bis [ß-aminoetil éter]-N, N, N', N'-tetraacético ácido [EGTA] pH 8 y 100 mM cloruro de sodio [NaCl]). Añadir 1 mL de solución de formaldehído de 11% e invertir inmediatamente las muestras 5 x - 10. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Añadir 0,5 mL de 2,5 M glicina. Invertir las muestras inmediatamente e incubar la muestra en hielo durante 5 minutos.
- Centrifugar la muestra a 1.200 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 10 mL de enjuague de CiA 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, glicerol al 10%, de 0,5% Nonidet P-40 [NP40] y 0.25% Triton X100). Incubar la muestra en hielo por 10 minutos lo centrifugar a 1.200 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado en 10 mL de enjuague de CiA 2 (10 mM tris [hidroximetil] aminometano [Tris] pH 8, pH de EDTA 1 mM 8, 0,5 mM EGTA pH 8 y 200 mM NaCl). Centrifugar la muestra a 1.200 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Suavemente, añadir 5 mL de CiA corte buffer (SDS 0.1%, EDTA 1 mM y 10 mM Tris pH 8) a lo largo de los lados del tubo cónico para lavar sal sin perturbar el pellet. Centrifugar la muestra a 1.200 x g durante 3 min a 4 ° C. Repetir el lavado.
- Resuspender el precipitado en 90 μl de tampón corte CiA e inhibidores de la proteasa frescas (uso una mezcla de leupeptin, chymostatin y pepstatin A disuelto junto con 10mg/mL cada en DMSO para hacer 1.000 x solución, hacer una concentración final de 10 μg/mL). Añadir 10 μl de mejora de la sonicación nanodroplets manteniendo todo hielo13,14.
- Transferir 100 μl de la solución a un tubo de vidrio y la tapa del tubo.
- Someter a ultrasonidos las muestras durante 3,5 minutos (determinado basado en la línea celular y el número de células). Para evitar el sobrecalentamiento de las muestras, procesar las muestras en tiempos de ciclo de 2 min de máxima si el tiempo de sonicación total supera los 2 minutos.
Nota: Ultrasonicador centrado había utilizado aquí funciones de una alta frecuencia (500 kHz). Haga funcionar la máquina en una potencia acústica de 55 w. La duración de la sonicación debe ser predeterminada por cada laboratorio individual. - Transferir cada muestra de sonicación de la cromatina a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Girar los tubos a 8.000 x g durante 2 min a 4 ° C.
- Para analizar la eficacia de la corte y para cuantificar la cantidad relativa de cromatina, seguir protocolo de kit de fabricante ChIP.
Nota: Determinar la concentración de DNA mediante espectrofotometría (p. ej., utilizando un instrumento de nanodrop de ADN), y ~ 200 ng de ADN en un gel de agarosa 1% para verificar que la cromatina se sonicó para aproximadamente 200-500 basepairs (bp) de tamaño. - Para realizar la inmunoprecipitación y aislar la cromatina, seguir protocolo de kit de fabricante ChIP.
Nota: Para la inmunoprecipitación de muestras con altas concentraciones de ADN, caliente el tampón de elución a 37 ° C y eluir las muestras 2 x con 30 μl de tampón de elución (spinning por 1 min cada vez). - Para realizar la qPCR, cargar los reactivos en una placa de 384 pozos. Añadir 5 μl de 2 x mezcla maestro de tinte de Cianina asimétrica, 2.5 μm de cada primer, agua y 0.1 - 10 ng de ADN para cada reacción.
- Diseño primers para amplificar amplicones bp 50-100 y los valores de CT se normalizan a un gen de mantenimiento de la casa, partículas de tipo intracisternal (IAP).
Nota: Para otros métodos de qPCR, ver protocolo del fabricante kit. El sistema de cartilla usado para apuntar el locus Oct4 era: CACATGAAGCAGCACGACTT (F); (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. La cartilla de control ajustar a destino IAP fue: ATTTCGCCTAGGACGTGTCA (F); (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC. - Basado en las cartillas y el producto deseado, ejecute la qPCR con 40 ciclos de una temperatura de recocido de 60 ° C durante 1 minuto.
Nota: Los datos resultantes se cuantificaron mediante las comparaciones de delta-delta Ct entre muestras, con CiA:Oct4 normalizado sobre IAP. Los resultados del análisis final aparecen como promedios de muestras experimentales por triplicado, con el error representado como la desviación estándar de la media.
- Diseño primers para amplificar amplicones bp 50-100 y los valores de CT se normalizan a un gen de mantenimiento de la casa, partículas de tipo intracisternal (IAP).
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Representative Results
Recientemente había desarrollado CEMs y demostró que esta tecnología puede aplicarse para regular la expresión de genes y el ambiente de la cromatina en un locus de reportero en una manera dosis dependiente y reversible. En la figura 1, se muestra un modelo del cable de la CEM, CEM23. Maquinaria HDAC es reclutada al lugar geométrico de reportero por el inhibidor HDAC que, en este caso, es el reportero GFP insertado en el locus Oct4 .
Intentamos caracterizar el sistema CEM en el locus Oct4 en CiA troncales. Porque las células expresan GFP, fue posible visualizar rápidamente la expresión de la periodista con microscopía de fluorescencia. Las células fueron fotografiadas después de 48 horas de tratamiento con 100 nM de CEM23, junto con las células no tratadas. Las imágenes de fase muestran troncales saludables, que es importante porque troncales insalubres o diferenciado indicaría una represión de GFP no específicos. Las imágenes de fluorescencia muestran una brillante expresión de GFP en las células control y una reducida expresión de GFP en troncales tratadas con CEM23. Imágenes representativas se muestran en la figura 2.
Para cuantificar los cambios en la expresión de GFP, citometría de flujo se utiliza. Una vez más, las troncales de la CiA fueron tratados con 100 nM de CEM23 por 48 horas. Las células experimentales tratadas con células CEM23 y control fueron preparadas para citometría de flujo, con > 100.000 células por muestra. Constantemente, observamos un > 30% disminución de células GFP-expresando entre aquellos tratados con CEMs. Un representante de histograma se muestra en la figura 3.
Una vez que fue demostrado evidencia de disminución de expresión de gene GFP CEM-inducida, probamos para cambios en el entorno de cromatina mediante ChIP. Un factor importante para la preparación de muestras para el ChIP es la medida de sonicación de cromatina. Para las muestras como consistente y correctamente esquilado como sea posible, 10 millones de células se sonicó durante 3,5 minutos para obtener la cromatina entre 200 y 500 PB de tamaño (figura 4). Porque la hipótesis de que la CEMs represivas atar a y reclutamiento HDAC proteínas y represivas complejos para el reportero, probamos los cambios en la acetilación de histonas cola. Acetilación de histona 3 lisina 27 (H3K27ac) se encuentra comúnmente en el sitio de inicio transcripcional (TSS) de genes. Realizamos ChIP con un anticuerpo para H3K27ac y luego realiza una qPCR con conjuntos de primer upstream y downstream del TSS. Los resultados muestran que un tratamiento de 48 horas con 100 nM de CEM23 disminuido el nivel de H3K27ac en el lugar de destino en comparación con las células control no tratadas con CEMs (p < 0,01, de Student dos colas t-test con tres biológicos replica, Figura 5).
Figura 1 : CEMs se unen a la CiA:Oct4 lugar geométrico a través de reclutamiento a la FKBP y anclaje maquinaria epigenética endógena. El modelo del sistema CEM muestra Gal4-FKBP como el anclaje de proteínas a ADN. La porción de FK506 de la CEM se une a FKBP y el inhibidor de HDAC recluta proteínas endógenas de las HDACS para reprimir la GFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imágenes de fluorescencia de células de madre embrionarias del ratón (troncales) con un CiA:Oct4 Reportero GFP-. Imágenes de microscopía de fluorescencia muestran una disminución de expresión de GFP sobre el tratamiento de la CEM. El panel superior muestra fase e imágenes fluorescentes de troncales convertido medios no tratados. El panel inferior muestra fase y fluorescentes de las troncales tratadas con 100 nM de CEM23 por 48 horas. Las imágenes adaptadas con permiso de la biología sintética ACS12. Derechos de autor (2018) Sociedad Americana de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de citometría de flujo quantitates una disminuida expresión de GFP en troncales sobre el tratamiento de CEM23. Troncales sin CEM23 (azul) se compararon con troncales tratadas con 100 nM de CEM23 48 horas (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Sonicación de la cromatina es uniforme, y un borrón de transferencia es entre 200 y 500 BP Para realizar el ChIP-qPCR, la cromatina de troncales fue sonicada. Cada muestra consistió de aproximadamente 10 millones células, que se sonicó durante 3,5 minutos, para producir muestras de cromatina semejantemente esquilado entre 200 y 500 PB de longitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : CEM23 tratamiento provoca una disminución de H3K27ac en el locus de la CiA. ChIP-qPCR fue realizado para probar los cambios en el entorno de la cromatina. Después de un tratamiento de 48 horas con 100 nM de CEM23, se observó una disminución en H3K27ac en CiA:Oct4 (**p < 0.01, de dos colas estudiante t-pruebas con tres réplicas biológicas. Las barras de error representan el desvío estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, describimos el sistema recientemente desarrollado de CEM se aplica para regular la expresión de genes y medio ambiente de la cromatina en un gen específico en una manera dose-dependent. Ofrecemos un método preciso para estudiar la dinámica implicada en la regulación de expresión génica a través de la contratación selectiva de proteínas reguladoras específicas cromatina endógena. Esta es una tecnología altamente modular que puede ser aplicada para investigar cómo diferentes proteínas y cromatina-modificadores complejos de trabajan en conjunto para regular adecuadamente el entorno de la cromatina, así como para estudiar cómo estos procesos son normales, con la beneficio de lograr especificidad gen.
Aquí, tres formas fueron demostrados para visualizar los cambios en la cromatina estructura y expresión genética con la nueva tecnología. Después de la perturbación de loci específicos dirigidos con CEMs, en tiempo real cambios en expresión génica podrían analizados por microscopía de fluorescencia. Entonces, cambios en los niveles de expresión génica se podían medir cuantitativamente más con citometría de flujo en puntos finales definidos. Finalmente, examinaron cambios postraduccionales marcas epigenéticas en la cromatina ChIP; en concreto, en este caso, H3K27ac. No probamos reclutamiento de HDAC con ChIP-qPCR debido a la diversidad de las HDACs que actúan en concierto en un solo locus. Es probable que una población heterogénea de enzimas HDACS fue contratada y, por lo tanto, sería técnicamente difícil probar todo por ChIP. En un trabajo publicado previamente, hemos demostrado que la contratación directa de HDAC3 por una fusión de GAL4 causado actividad similar en la gene expresión y cromatina modificación por viruta12. Si un reportero fluorescente no está siendo modulado, cambios en la expresión génica pueden medirse también por (1) un análisis de expresión ARN con transcriptasa reversa qPCR o expresión de la proteína (2) con western blot, o proyección de imagen y realizar citometría de flujo con anticuerpos secundarios fluorescentes.
En lo referente a las técnicas basadas en el CIP actuales como el sistema de CiA 12, esta tecnología CEM tiene la ventaja de reclutar endógenos epigenéticos moduladores para el gene de la blanco. Redirigiendo la maquinaria de la célula crea un medio más fisiológico relevante de modular la expresión. Exógeno expresando enzimas principales, como sombreros y factores de transcripción, podría resultar en efectos secundarios de su aumento de la expresión, especialmente al no activamente reclutados para el lugar geométrico del gene.
Mientras que este artículo muestra la funcionalidad de este novedoso sistema con CEMs compuesto por inhibidores de las HDACS, varios otros inhibidores o reclutadores de proteína pueden ser sintetizados en lugar el inhibidor de HDAC. Para lograr la activación de genes, se pueden sintetizar inhibidor de sombrero o HDMT basado en inhibidor de la CEMs. Para reprimir y luego sobreexpresan el gen mismo, es posible tratar las células con un CEM represivo, lávelos con medios de comunicación regulares y luego agregar una activación CEM. Esto permitiría un sistema limpio estudiar la dinámica de reclutamiento de complejos represivos y activación a la misma región genómica. Al diseñar el futuro CEMs, varias características necesitan ser considerados, incluyendo la permeabilidad de la célula, inhibidor de la potencia, estructura y cinética de inhibidor. La longitud de vinculador entre el FK506 y la parte de la selección influirá en la permeabilidad de los CEMs, así como la posición de la proteína a. Cuando se comparan dos CEMs que diferenciaron solamente en longitud de linker, lo CEM con el vinculador más corto era más eficaz12. Mientras que no se ha probado directamente aquí, la mayor efectividad es el resultado de una mayor permeabilidad de la célula. También es importante elegir inhibidores con estructuras químicas susceptibles de modificación sin alterar la porción que se une al sitio activo del blanco. La potencia y la especificidad también eran considerados mediante la selección de inhibidores de alta potencia y especificidad para una determinada clase de proteínas. La cinética de inhibición puede influir en la eficacia de las CEMs. CEMs de inhibidores con tasas de encendido y apagado lento tienden a ser menos eficaz.
Una restricción de la tecnología CEM es el requisito de una matriz de Gal4-atascamiento en el locus del gen objetivo. Para reclutar a CEMs a una región que no sea el locus Oct4 CiA , se puede utilizar cualquiera de los cientos de ingeniería Gal4 activación upstream secuencia (UAS) las líneas disponibles a la comunidad científica. Una forma del sistema se hará más modular es incorporando un Cas9 desactivado (dCas9) con química enzima epigenéticos reclutamiento10,11,15. Esta proteína nucleasa-muertos del sistema CRISPR Cas9 todavía se reclutarán a cualquier región del genoma que un RNA de la guía (gRNA) está diseñado, pero no cortan el ADN. Con una fusión de dCas9-FKBP, el componente FKBP reclutará las CEMs donde la dCas9 es reclutado, grandemente aumentando la facilidad y flexibilidad de posibles genes diana. Imaginar esta tecnología a genes relevantes de la enfermedad un potencial terapéutico como un medio por el cual reversible y temporal estudiar mecanismos de la enfermedad en el nivel de la cromatina.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros de los laboratorios de Hathaway y Jin para sus discusiones útiles. Los autores agradecen también Dan Crona y Ian MacDonald para su lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por Grant R01GM118653 de los institutos nacionales de salud de Estados Unidos (a N.A.H.); y por donaciones R01GM122749, R01CA218600 y R01HD088626 de la Nacional de los Estados Unidos institutos de salud (J.J.). Este trabajo fue apoyado también por un nivel 3 y un estudiante becado por la UNC Eshelman Instituto de innovación (N.A.H y A.M.C, respectivamente). Financiación adicional de un GM007092 de T-32 (a A.M.C) apoyó este trabajo. Datos de citometría de flujo se obtuvieron en la UNC flujo Cytometry instalaciones centrales financiado por una P30 CA016086 cáncer centro base apoyo beca a UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha - producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
References
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