Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Ompressning gentranskription genom att omdirigera cellulära maskineriet med kemiska epigenetiska modifierare

Published: September 20, 2018 doi: 10.3791/58222

Summary

Reglering av kromatin miljön är en viktig process som krävs för korrekt genuttryck. Här, vi beskriver en metod för att kontrollera genuttryck genom rekrytering av kromatin-modifiera maskiner på ett sätt som gen-specifika och reversibla.

Abstract

Reglering av kromatin packning är en viktig process som reglerar genuttryck i högre Eukaryoter. Även om kromatin kompaktering och uttryck genreglering störs ofta i många sjukdomar, har en locus-specifika, endogena och reversibel metod att studera och styra dessa verkningsmekanismer saknats. För att åtgärda det här problemet har vi utvecklat och karakteriseras romanen gen-reglerande bifunktionell molekyler. En komponent av bifunktionell molekylen binder till en DNA-protein ankare så att det kommer att rekryteras till en allel-specifika locus. Den andra komponenten engagerar endogena cellulära kromatin-modifiera maskiner, rekrytera dessa proteiner till en gen av intresse. Dessa små molekyler, som kallas kemisk epigenetiska modifierare (CEMs), klarar av att kontrollera genuttryck och kromatin miljön på ett dosberoende och reversibel sätt. Här, detalj vi ett CEM tillvägagångssätt och dess tillämpning på minska genuttryck och Histon svans acetylering på grönt fluorescerande Protein (GFP) reporter ligger på det Oct4 locus i mus embryonala stamceller (mESCs). Vi präglar ledningen CEM (CEM23) med hjälp av fluorescerande mikroskopi och flödescytometri kromatin immunoprecipitation (ChIP), följt av en kvantitativ polymeras-kedjereaktion (qPCR). Medan kraften i detta system demonstreras på det Oct4 locus, begreppsmässigt, CEM tekniken är modulära och kan appliceras i andra celltyper och på andra genetiska loci.

Introduction

Kromatin består av DNA lindad runt Histon octamer proteiner som bildar kärna nukleosomens partikeln. Reglering av kromatin packning är en mycket viktig mekanism för korrekt DNA reparation, replikering och uttryck1,2,3. Ett sätt där celler styr nivån på kompaktering är genom tillägg eller borttagning av olika post-translationella Histon svans modifikationer. Två sådana ändringar omfattar (1) lysin acetylering, som oftast förknippas med gen aktivering, och (2) lysin metylering, som kan förknippas med antingen gen aktivering eller förtryck, beroende på kontexten aminosyra. Tillägg av markeringarna acetylering och metylering är katalyseras av Histon acetyltransferaser (hattar) och Histon metyltransferaser (HMTs), respektive, medan avlägsnandet av märket görs genom Histon deacetylases (HDAC) och Histon demethylases (HDMs ), respektive4,5. Även om förekomsten av dessa proteiner har varit känt i årtionden, många mekanismer av hur kromatin-ändra maskiner fungerar att ordentligt reglera genuttrycket återstår för att definieras. Eftersom kromatin tillsynsprocesser dysreglerad i många sjukdomar, kan nya mekanistiska insikter leda till framtida terapeutiska tillämpningar.

Kromatin i vivo analysen (CiA) är en nyligen beskriven teknik som använder en kemisk inducerare av närhet (CIP) för att styra kromatin-modifiera maskiner rekrytering till en viss locus6. Denna teknik har använts för att studera en växande lista av kromatin dynamik, inklusive Histon-ändra proteiner, kromatin remodelers och transkription faktorer6,7,8,9. CIP-baserade kromatin tjudra av exogent uttryckta proteiner har också förlängts förbi CiA att modulera icke-modifierade genetiska loci genom användning med en inaktiverad klustrade regelbundet mellanliggande kort Palindromic upprepar CRISPR-associerade protein (dCas9) 10 , 11. i CiA-systemet mESCs har ändrats för att uttrycka en god Jordbrukarsed reporter gen på det Oct4 locus, ett starkt uttryckt och strikt reglerade område av mESC genomet. Tidigare, detta system har använts för att beskriva dosberoende och reversibel rekrytering av exogent uttryckt Heterokromatin protein 1 (HP1), ett enzym som binder H3K9me3 och propagerar repressiva märken (t.ex., H3K9me3) och DNA metylering6. För att åstadkomma denna typ av rekryteringsstrategin, är mESCs infekterad med en plasmid som uttrycker en FK506-bindande protein (FKBP) kopplad till en Gal4, vilket är ett DNA-protein-ankare som binder till en Gal4-bindande uppsättning uppströms GFP reportern. Cellerna är också smittade med en FKBP-rapamycin-bindande domän (FRB) ansluten till HP1. När mESCs utsätts för låga nanomolar koncentrationer av CIP, rapamycin, både FRB och FKBP, sammanförs på det mål locus. Inom dagar rapamycin behandling, uttryck av målgenen är förträngt, vilket framgår av fluorescence mikroskopi och flöde flödescytometri och Histon acetylering minskas, visas av ChIP och bisulfite sekvensering. Medan utveckling och validering av detta tillvägagångssätt har varit stora framsteg inom området kromatin forskning och förordning, en nackdel är krävs exogena uttrycket av kromatin-modifiera maskiner.

För att göra tekniken baserat på rekrytering av endast endogena fysiologiskt relevanta enzymer och göra en mer modulära system, vi utformade och karakteriseras romanen bifunktionell molekyler, så kallade CEMs (figur 1)12. En komponent i CEMs inkluderar FK506, som liknar rapamycin, binder tätt och specifikt till FKBP. CEMs kommer således fortfarande att rekryteras till det Oct4 locus i den CiA-mESCs. Den andra komponenten i CEMs är en del som binder endogena kromatin-modifiera maskiner. I en pilotstudie testade vi CEMs som innehåller HDAC-hämmare. Medan begreppet med en hämmare för att rekrytera HDAC verkar kontraproduktivt intuitivt, är hämmaren ändå kunna rekrytera HDAC aktiviteter till genen av intresse. Detta åstadkoms genom att (1) omdirigera HDAC till det locus, släppa enzymet, och öka tätheten av un-hämmade HDAC i området och (2) upprätthålla HDAC hämning vid locus, men rekrytera repressiva komplex som binder till de hämmade HDAC, eller (3) en kombination av båda. I en tidigare studie visade vi att CEMs kunde framgångsrikt förtränga GFP reporter i ett dos - och tidsberoende sätt, liksom på ett sätt som var snabbt reversibel (dvs.inom 24 timmar)12. Vi kännetecknas förmågan av CEM teknik presenteras här till kontroll genuttryck med fluorescensmikroskopi, flödescytometri och förmågan för att styra kromatin miljön använder ChIP-qPCR6. Här, beskriver vi en metod för att använda och karaktärisera de CEMs, vilket kommer att underlätta anpassningen av detta system att besvara ytterligare frågor relaterade till kromatin biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

(1) cell linje kultur för att producera Lentivirus

  1. Odla färska, låg-passagen (mindre än passage 30) 293T mänskliga embryonala njurar (HEK) celler i hög-glukos Dulbecco ändrade Eagle är medium (DMEM) base media kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x icke-essentiella aminosyror (NEAA), penna / STREP, 2-mercaptoenthanol i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Dela celler varje 3-5 d och innan de blivit > 95% konfluenta.
  2. Passagen 293T HEK celler med 18 x 106 per 15-cm platta (en 15-cm platta för varje virus produceras).
    1. För en 15-cm format, aspirera gamla media, tillsätt 10 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), aspirera PBS och tillsätt 3 mL 0,05% trypsin. Inkubera cellerna i trypsin i 8 min vid 37 ° C, gunga och trycka på cellerna som är halvvägs genom inkubering.
      Obs: Målet med detta steg är att få cellerna till en enskild cell suspension.
  3. När cellerna har nått 60-80% konfluens följande dag, utföra en polyethylenimine (PEI) transfection med 13,5 µg psPAX2 plasmiden, 4,5 µg pMD2.G plasmiden, 18 µg av lentiviral-kompatibla leverans vektor med gen av intresse (dvs. , FKBP-Gal4), 108 µL av PEI och 1,8 mL transfection media.
    1. Försiktigt blanda DNA, PEI och transfection media i en 15 mL koniska rör, inkubera provet i rumstemperatur i 15 min och lägga droppvis till 15-cm plattan.
      Obs: Använd lämplig säkerhet mäter och följer alla institutionella och laboratorierutiner säkerhet efter detta steg, som alla reagenser innehåller levande virus.
  4. Efter 16 h transfection och inkubation i en 37 ° C inkubator med 5% CO2, aspirera media och försiktigt lägga färska 293 HEK media (föruppvärmd i 37 ° C vattenbad) till 15-cm plattorna. Inkubera cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 för 48 h efter media ändra. Viruset är sedan redo att skördas.

(2) infektion av mus embryonala stamceller (mESC) med Lentivirus

  1. Växa låg-passagen (mindre än passage 35), feeder-gratis anpassade CiA mESCs i hög-glukos DMEM base media kompletteras med 20% ESC-grade FBS, 10 mM HEPES, 1 x NEAA, penna/Strep, 2-mercaptoenthanol och 1: 500 leukemi-hämmare faktor (LIF) i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
    Obs: LIF erhålls från supernatanten COS LIF-producerande celler, som samlas in i baken och fryst vid-80 ° C.
    1. Odla cellerna på tallrikar som har teststamman för 1-3 h med 0,1% gelatin i 1 x PBS, och därefter tvättas med 1 x PBS. Foder celler dagligen och dela dem varje 2-3 d, beroende på deras densitet.
      Obs: Morfologiskt, embryonala stamceller (ES) kolonier ska vara små, runda, och skiljer sig från varandra.
  2. Passagen mESC till ett 12-well platta format (100 000 celler per brunn) 1 d före infektion.
    1. Räkna cellerna med en hemocytometer. För celler odlas i en 10-cm format, aspirera gamla media, tillsätt 5 mL av 1 x PBS, aspirera PBS och tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin. Inkubera cellerna i trypsin i 8 min vid 37 ° C, gunga och trycka på cellerna som är halvvägs genom inkubering. Målet med detta steg är att få cellerna till en enskild cell suspension.
  3. 48 h efter byte media från den 293T15-cm viral förpackning celler från steg 1.4, ta bort och överför supernatanten till en 50 mL konisk slang.
  4. Centrifugera supernatanten vid 300 x g för 5 min till pellet cellfragment.
  5. Filtrera supernatanten genom ett 0,45 µm membran.
    Obs: Se till att använda ytaktivt ämne-fri cellulosaacetat (SFCA) membran, som vissa andra material kan behålla virus och avsevärt minska avkastningen.
  6. Koncentrera sig viruset med ultracentrifugering, med hjälp av en centrifug med en SW32 rotor, och spinna på 20.000 rpm (~ 72 000 x g) för 2,5 timmar vid 4 ° C.
  7. Medan viruset koncentrerar under ultracentrifugering, behandla den CiA-mESCs i 12-väl plattan med färska ES media innehållande 5 µg/mL polybrene.
  8. När virus koncentrationen har körts, noggrant Aspirera supernatanten och centrifugerade virus i 100 µL av 1 x PBS (Undvik överflödiga bubblor).
  9. Lägga till viruset och 1 x PBS i ett 1,5 mL mikrofugrör. Vortex/skaka röret på 300 x g (eller på den lägsta inställningen) att helt upphäva viruset. Snurra ner röret i en mini bordsskiva centrifug för 5-10 s ta bort bubblor.
  10. Tillsätt 30 µL av viruset till varje brunn 12-bra platta. Snurra på plattan och sedan Centrifugera plattan vid 1 000 x g i 20 min.
    Obs: Mängden virus som har lagt till kan varieras beroende på viral titern, som är omvänt relaterad till leverans konstruera storlek.
    1. Alternativt, flash frysa viruset med flytande kväve och förvara den vid-80 ° C. Dock kommer att frysning viruset sänka viral titern.
  11. Placera plattan 12-väl tillbaka i 37 ° C inkubatorn och ändra media följande morgon (~ 16 h) senare med färska ES media (som beskrivs i steg 2.1).
  12. Efter 48 h av infektion, Välj för celler som integrerade viral plasmiden genom att lägga till lämpliga antibiotika (dvs, 1,5 µg/mL puromycin, blasticidin, etc.10 µg/mL). Ändra media dagligen och tvätta cellerna med 1 x PBS om en majoritet av cellerna är flytande/dead. Hålla urval media på cellerna för 72-96 h i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.

(3) kemiska epigenetiska modifierare (CEM) s beredning och behandling

  1. Avbryta den pulveriserade CEM in dimetyl sulfoxid (DMSO) till en lager koncentration av 1 mM och en fungerande koncentrationen 100 µM.
  2. När cellerna har genomgått valet för 72-96 h, delas upp i mESCs i ett 12-väl format med 100 000 celler per brunn. Inkubera cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 för 24 h. efteråt, förbereda en medielösning 100 nM CEM med ES media. Använd detta media att mata den CiA-mESC med 1 mL/väl. För att tjäna som en kontroll, hålla en brunn av celler utan någon extra CEMs.
    1. Ändra media genom att aspirera gamla medier och lägga 1 mL/väl av nylagade CEM-innehållande eller CEM-fri ES media varje 24 h för varaktigheten av ett experiment.

(4) analys av uttrycket av mikroskopi och flödescytometri

  1. Efter 48 timmar av CEM behandling, bild de utan CEM behandling och de celler som behandlas med 100 nM CEM med fluorescens Mikroskop. Ta representativa bilder med fas eller brightfield för att spela in mESC morfologi på 20 X förstoring; cellerna bör har bildat runda kolonier, med några differentierade celler. Under FITC fluorescens kanalen, bild båda cellen villkor.
  2. Isolera kontroll och CEM-behandlade celler för flödescytometri av aspirering media, tvätta cellerna med 1 mL 1 x PBS, aspirera PBS och lägga till 0,25 mL av 0,25% trypsin med EDTA för 8-10 min.
  3. Bekräfta att cellerna inte längre i stora klumpar genom att titta i mikroskopet. Använd en 20 X förstoring. Om cellerna inte visas i en enskild cell suspension, Pipettera försiktigt upp och ner med en P1000 pipett till fullt trypsinize cellerna.
  4. Släcka trypsin med 1 mL färsk media och resuspendera cellerna i hög hastighet med en serologisk pipett (eller använda en P1000 pipett och tip) tills cellerna är i en enskild cell suspension.
  5. Snurra ner cellerna vid 300 x g för 5 min. Aspirera supernatanten. Tvätta med 1 x PBS och recentrifuge celler. Aspirera supernatanten PBS.
  6. Återsuspendera cellpelleten i 200 mL FACS buffert (1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt [EDTA], 1 x PBS och 0,2% bovint serumalbumin [BSA]).
    1. Den totala volymen av FACS bufferten kommer att vara beroende av hur många celler är närvarande, men koncentrationen bör vara 1000-3000 celler / µL. räkna antalet celler i 3 prover och genomsnittliga koncentrationen av celler. Tillsätt mer FACS buffert vid behov.
  7. Utföra flödescytometri på > 50.000 celler med suspenderade celler, att hålla cellerna på is när de inte analyseras. Använda 530/40 filter (FITC, AF488, GFP, etc.) för att registrera förändringar i uttryck. Fastställa lämpliga fluorescerande spänningen med en obehandlad kontrollodling cell prov och Ställ in spänningen till har fluorescerande topp i mitten av det inspelade intensitet spektrumet. Kör exemplen på en slida hastighet av cirka 5 000 celler/s.
  8. Exportera data och analysera FCS filer på ett flöde flödescytometri program (dvs.FlowJo) av gating först på framåt scatter vs. side scatter för levande celler och sedan på framåt scatter höjd vs. område för undertröjor. Sedan, visualisera GFP kanaldata på ett histogram att avgöra det relativa GFP uttrycket i den riktade och kontrollera populationer.

(5) analys av kromatin av kromatin Immunoprecipitation (ChIP) följt av qPCR

  1. Delas upp i mESCs i en 10-cm platta med 3 miljoner celler och 10 mL ES media (en 10-cm plåt för varje experimentella eller kontrollera skick). Följande dag, tillsätt 10 mL av CEM-innehållande eller CEM-fri media. Efter 48 timmar av CEM behandling, aspirera gamla media. Tvätta och sug upp cellerna med 5 mL 1 x PBS. Därefter separera celler med 0,25% trypsin och släcka trypsin med 10 mL ES media. Räkna och isolera ett urval av 10 miljoner celler per tillstånd.
  2. Snurra ner varje 10 miljoner cell prov vid 300 x g i 5 min.
  3. Återsuspendera varje pellet i 10 mL 1 x PBS och recentrifuge cellerna vid 300 x g i 5 min.
  4. Återsuspendera varje pellet i 10 mL av CiA Fix buffert (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM etylenglykol-bis [ß-aminoethyl eter]-N, N, N', N'-tetraacetic acid [EGTA] pH 8 och 100 mM natriumklorid [NaCl]). Tillsätt 1 mL 11% formaldehydlösning och omedelbart Invertera proverna 5 x - 10 x. Inkubera provet vid rumstemperatur i 10 min.
  5. Tillsätt 0,5 mL av 2,5 M glycin. Invertera proverna omedelbart och inkubera provet på is för 5 min.
  6. Centrifugera provet vid 1,200 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Aspirera supernatanten.
  7. Återsuspendera pelleten i 10 mL av CiA skölj 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10% glycerol, 0,5% Nonidet p-40 [NP40] och 0,25% Triton X100). Inkubera provet på is för 10 min. Centrifugera det 1200 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
  8. Återsuspendera pelleten i 10 mL av CiA skölj 2 (10 mM tris [hydroxymetyl] aminometan [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM EGTA pH 8 och 200 mM NaCl). Centrifugera provet vid 1,200 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
  9. Varsamt Tillsätt 5 mL av CiA klippning buffert (0,1% SDS, 1 mM EDTA och 10 mM Tris pH 8) längs sidorna av koniska röret att tvätta bort eventuell salt utan att störa pelleten. Centrifugera provet vid 1,200 x g under 3 minuter vid 4 ° C. Upprepa tvättningen.
  10. Återsuspendera pelleten i 90 µL av CiA klippning buffert och färska proteashämmare (Använd en blandning av leupeptin, chymostatin och pepstatin A upplöst tillsammans på 10mg/mL varje i DMSO att göra en 1.000 x stamlösning, att göra en slutlig koncentration på 10 µg/mL). Tillsätt 10 µL av ultraljudsbehandling förbättrar nanodroplets samtidigt allt på isen13,14.
  11. Överför 100 µL av lösningen till ett glasrör och locket röret.
  12. Sonikera proverna för 3,5 min (bestäms utifrån cellinje och antal celler). För att undvika överhettning proverna, bearbeta proverna i 2-min-max cykeltider om den totala ultraljudsbehandling tid överstiger 2 min.
    Obs: Fokuserad ultrasonicator används här funktioner med hög frekvens (500 kHz). Kör maskinen på en akustisk effekttäthet 55 W. Ultraljudsbehandling varaktighet bör vara förutbestämt av varje enskild lab.
  13. Överföra varje sonicated kromatin sampling till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör. Snurra rören vid 8000 x g under 2 minuter vid 4 ° C.
  14. Att analysera klippning effektivitet och kvantifiera den relativa mängden kromatin, följ ChIP kit tillverkarens protokollet.
    Obs: För att bestämma DNA koncentration spektrofotometriskt (t.ex., med ett DNA nanodrop instrument), och kör ~ 200 ng DNA på en 1% agarosgel att verifiera att kromatinet är sonicated till ungefär 200-500 basepairs (bp) i storlek.
  15. Att utföra immunoprecipitation och isolera kromatinet, följ ChIP kit tillverkarens protokollet.
    Obs: För immunoprecipitation av prover med högre DNA koncentrationer, värma eluering bufferten vid 37 ° C och eluera proverna 2 x med 30 µL av eluering buffert (snurrar för 1 min varje gång).
  16. För att utföra qPCR, Fyll på reagenserna i en plattan med 384 brunnar. Tillsätt 5 µL av 2 x asymmetrisk cyanin dye master mix, 2,5 µM varje primer, vatten och 0,1 - 10 ng DNA för varje reaktion.
    1. Design grundfärger att förstärka 50-100 bp amplikoner och CT-värden är normaliserad till en städning gen, intracisternal A-typ partiklar (IAP).
      Anmärkning: För ytterligare qPCR metoder, se kit tillverkarens protokollet. De primer som används att rikta det Oct4 locus var: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Kontroll primer som används till målet IAP var: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. Baserat på primers och önskad produkt, kör qPCR med 40 cykler av en glödgning temperatur av 60 ° C i 1 min.
      Obs: Den resulterande data var quantitated med delta-delta Ct jämförelser mellan prover, med CiA:Oct4 normaliserade över IAP. Slutliga analysresultaten visas som genomsnitt av tre exemplar experimentprover, med fel representerade som standardavvikelsen från medelvärdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har nyligen utvecklat CEMs och visat att denna teknik kan användas för att reglera genuttryck och kromatin miljön på en reporter locus i en dosberoende och reversibel sätt. I figur 1visas en modell av bly CEM, CEM23. HDAC maskiner rekryteras till det reporter locus av den HDAC-hämmare som i detta fall är god Jordbrukarsed reportern infogas vid det Oct4 locus.

Vi försökte karaktärisera CEM systemet på det Oct4 locus i CiA mESCs. Eftersom cellerna uttrycker GFP, var det möjligt att snabbt visualisera uttrycket av reportern med fluorescensmikroskopi. Cellerna var avbildade efter 48 timmar efter behandling med 100 nM CEM23, tillsammans med obehandlade celler. Fas bilderna visar friska mESCs, vilket är viktigt eftersom ohälsosamma eller differentierade mESCs tyder på en icke-specifik GFP repression. Fluorescens bilderna visar en ljusa GFP uttryck i kontroll celler och en minskad GFP-uttryck i mESCs behandlade med CEM23. Representativa bilder visas i figur 2.

För att kvantifiera förändringar i GFP uttrycket användes flödescytometri. Igen, de CiA mESCs behandlades med 100 nM CEM23 i 48 timmar. Experimentell celler behandlas med CEM23 och kontroll celler var förberedda för flödescytometri, med > 100 000 celler per prov. Vi observerade konsekvent, > 30% minskning av GFP-uttryckande celler bland dem som behandlades med CEMs. Ett representativt histogram visas i figur 3.

När bevis för CEM-inducerad GFP-genen uttryck minskning visades, testade vi för förändringar i kromatin miljön med ChIP. En viktig faktor för att förbereda prover för ChIP är omfattningen av kromatin ultraljudsbehandling. För att ha proverna som konsekvent och korrekt klippt som möjligt, var 10 miljoner celler sonicated för 3,5 minuter att hämta kromatin mellan 200 och 500 bp i storlek (figur 4). Eftersom vi hade en hypotes att de repressiva CEMs bindande till och rekrytera HDAC proteiner och repressiva komplex till reporter, testade vi för förändringar i Histon svans acetylering. Histon 3 lysin 27 acetylering (H3K27ac) är vanligt förekommande längs den transkriptionell startwebbplats (TSS) av gener. Vi utförde ChIP med en antikropp för H3K27ac och därefter utförs en qPCR med primer uppsättningar uppströms och nedströms av TSS. Resultaten visar att en 48-timmars behandling med 100 nM CEM23 minskade nivån av H3K27ac på det mål locus jämfört med kontroll celler inte behandlas med CEMs (p < 0,01, tvåsidiga Students t-test med tre biologiska replikerar, Figur 5).

Figure 1
Figur 1 : CEMs binder till den CiA:Oct4 locus genom rekrytering till FKBP och tjudra endogena epigenetiska maskineriet. Modellen av CEM systemet visar Gal4-FKBP som protein-till-DNA fästpunkten. FK506 portion av CEM binder till FKBP och den HDAC-hämmaren rekryterar endogena HDAC proteiner för att förtränga GFP. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 2
Figur 2 : Fluorescens bilder av mus embryonala stamceller (mESCs) med en CiA:Oct4 - GFP reporter. Fluorescence mikroskopi bilder visar en minskning av GFP uttryck vid CEM behandling. Den övre panelen visar fas och fluorescerande bilder av mESCs växt med obehandlade media. Den nedre panelen visar fas och lysrör av den mESCs som behandlades med 100 nM CEM23 i 48 timmar. Bilderna anpassad med tillstånd från ACS syntetisk biologi12. Upphovsrätt (2018) American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 3
Figur 3 : Flödescytometri Flödesanalys quantitates ett minskat uttryck av GFP i mESCs vid CEM23 behandling. mESCs utan CEM23 (blå) jämfördes med mESCs behandlades med 100 nM CEM23 i 48 timmar (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 4
Figur 4 : Ultraljudsbehandling av kromatin är enhetliga, och ett utstryk syns mellan 200 och 500 bp. För att utföra ChIP-qPCR, var kromatinet från mESCs sonicated. Varje prov består av cirka 10 miljoner celler, som var sonicated för 3,5 minuter, för att producera på samma sätt-klippt kromatin prover mellan 200 och 500 bp i längd. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 5
Figur 5 : CEM23 behandling orsakar en minskning av H3K27ac på det CiA-locus. ChIP-qPCR utfördes för att testa för förändringar i kromatin. Efter en 48-timmars behandling med 100 nM CEM23, observerades en minskning av H3K27ac vid CiA:Oct4 (**p < 0,01, tvåsidiga Students t-test med tre biologiska replikat. Felstaplar representera standardavvikelsen). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskrev vi den nyligen utvecklat CEM system tillämpas som reglerar genuttryck och kromatin miljö på en specifik gen på ett dosberoende sätt. Vi tillhandahåller en noggrann metod för att studera dynamiken som är involverade i reglering av genuttryck genom selektiv rekrytering av specifika endogena kromatin reglerande proteiner. Detta är ett mycket modulärt teknik som kan användas för att undersöka hur olika protein - och kromatin-ändra komplex arbeta i samförstånd att ordentligt reglera kromatin miljön, samt för att studera hur dessa processer är dysreglerad, med den Fördelen med att uppnå gen specificitet.

Här visades tre sätt för att visualisera förändringar i kromatin struktur och gen uttryck med ny teknik. Efter störning av särskilda riktade loci med CEMs, kan realtid förändringar i genuttryck analyseras genom fluorescensmikroskopi. Sedan, förändringar i genen uttrycksnivåerna kunde mätas mer kvantitativt med flödescytometri på definierade ändpunkter. Slutligen, förändringar posttranslationell epigenetiska märkena på kromatin granskades av ChIP; specifikt, i detta fall, H3K27ac. Vi har inte testa HDAC rekrytering med ChIP-qPCR på grund av mångfalden av HDAC att agera i konsert på en enda locus. Det är troligt att en heterogen befolkning av HDAC-enzymer rekryterades och det skulle därför vara tekniskt svårt att testa dem alla av ChIP. I en tidigare publicerade arbete, har vi visat att direkt rekrytering av HDAC3 av en GAL4 fusion orsakade liknande verksamhet på uttryck och kromatin genmodifiering av ChIP12. Om en icke-fluorescerande reporter som moduleras, kan förändringar i genuttryck även mätas genom (1) en RNA uttryck analys med omvänt transkriptas qPCR eller (2) protein uttryck med western blotting eller imaging och bedriver flödescytometri med fluorescerande sekundära antikroppar.

I förhållande till nuvarande CIP-baserade tekniker som de CiA system12har CEM tekniken fördelen att rekrytera endogena epigenetiska modulatorer till målgenen. Omdirigera cellens egna maskiner skapar ett mer fysiologiskt relevanta sätt att modulera uttrycket. Exogent uttrycker master enzymer, som hattar och transkriptionsfaktorer, kan resultera i biverkningar från deras ökat uttryck, speciellt vid inte rekryteras aktivt till det gen locus.

Medan denna artikel visar funktionerna i detta nya system med CEMs består av HDAC-hämmare, kan flera andra hämmare eller protein rekryterare syntetiseras i stället för den HDAC-hämmaren. För att uppnå gen aktivering, kan HAT-hämmare- eller HDMT hämmare-baserade CEMs syntetiseras. För att förtrycka och sedan överuttrycka samma gen, är det möjligt att behandla cellerna med en repressiv CEM, tvätta dem med vanlig media och sedan lägga till en aktiverande CEM. Detta skulle möjliggöra ett rent system att studera dynamiken i rekrytera hämmande och aktiverande komplex till samma genomiska regionen. När du utformar framtida CEMs, måste flera egenskaper beaktas, inklusive cell permeabilitet, hämmare potens, struktur och hämmande kinetik. Linker längden mellan FK506 och den rekryterare biexponentiellt kommer att påverka permeabiliteten i CEMs, liksom placeringen av proteinet rekryterade. När man jämför två CEMs som skilde sig endast i linker längd, var CEM med kortare länkaren effektivare12. Medan det inte har testats direkt här, är högre effektiviteten ett resultat av större cell permeabilitet. Det är också viktigt att välja hämmare med kemiska strukturer kan bli föremål för ändring utan att störa den del som binder den aktiva platsen för målet. Styrkan och specificitet ansågs också genom att välja hämmare med hög potens och specificitet för en viss klass av proteiner. Kinetiken för hämning kan påverka effekten av CEMs. CEMs består av hämmare med långsam avstängning på priserna tenderar att vara mindre effektiv.

En begränsning av den nuvarande CEM-tekniken är kravet på en Gal4-bindande matrisen vid det mål gen locus. För att rekrytera CEMs till en annan region än den Oct4 CiA -locus, kan någon av hundratals bakåtkompilerade Gal4 uppströms aktivering sekvensen (UAS) linjer tillgängliga för det vetenskapliga samfundet användas. Ett sätt som systemet kommer att göras mer modulär är genom att införliva en inaktiverad Cas9 (dCas9) med kemiska epigenetiska enzym rekrytering10,11,15. Detta nuclease-döda protein från CRISPR-Cas9 systemet kommer fortfarande att rekryteras till någon region i genomet som en guide RNA (gärna) är utformad, men det kommer inte att minska DNA. Använder en dCas9-FKBP fusion, FKBP komponenten kommer att rekrytera de CEMs där dCas9 rekryteras, vilket kraftigt ökar enkelheten och flexibiliteten av potentiella målgener. Föreställ dig använda denna teknik för att nå sjukdom-relevanta gener som en terapeutisk potential eller ett medel att reversibelt och temporally studera sjukdomsmekanismer på nivån kromatin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka medlemmarna i Hathaway och Jin laboratorierna för deras bra diskussioner. Författarna också tacka Dan Crona och Ian MacDonald för deras kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöds delvis av Grant R01GM118653 från amerikanska National Institutes of Health (till N.A.H.); och av bidrag R01GM122749, R01CA218600 och R01HD088626 från den amerikanska nationellt institut för hälsa (till J.J.). Detta arbete var också stöds av en tier 3 och en student bevilja från UNC Eshelman Institutet för Innovation (N.A.H och A.M.C, respektive). Ytterligare finansiering från en T-32 GM007092 (till A.M.C) stött detta arbete. Flödescytometri data erhölls vid UNC-Flow flödescytometri Core anläggningen finansieras av ett P30 CA016086 Cancer Center Core stöd bidrag till UNC Lineberger omfattande Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013CV
NEAA Gibco 11140-050
HEPES (for tissue culture) Corning 25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol) Gibco 21985-023
FBS Atlantic Biologicals S11550 Individual lots tested for quality
Covaris tubes ThermoScientific C4008-632R
Covaris caps ThermoScientific C4008-2A
PEI (polyethylenimine) Polysciences 23966-1
Transfection media (Opti-mem) Gibco 31985070
Virus centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Virus filter membrane Corning 431220
Polybrene Santa Cruz Biotechnology SC134220
0.25 % Trypsin Gibco 25200-056 with EDTA
0.05 % Trypsin Gibco 25400-054 with EDTA
Puromycin InvivoGen ant-pr
Blasticidin InvivoGen ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) Roche 4913914001
H3K27ac antibody Abcam ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit Active Motif 53040
Sonicator Covaris E110
Ultracentrifuge Optima XPN-80
SW-32 centrifuge rotor Beckman Coulter 14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets Beckman Coulter 130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney Clontech 632180
PBS Corning 46-013-CM
BSA Fisher BP9700
EGTA Sigma E3889
EDTA Fisher S311-100
NaCl Fisher S271-1
Glycerol Fisher G33-1
Tris Fisher BP152
NP40 Roche 11754599001
Triton MP Biomedicals 807426
Glycine Fisher BP381-500
TE buffer Fisher BP2474-1
HEPES (for ChIP) Fisher BP310-100
Gelatin Sigma G1890
Flow cytometer, Attune NxT Thermo Fisher A24858
FKBP-Gal4 plasmid Addgene 44245
psPAX2 plasmid Addgene 12260
pMD2.G plasmid Addgene 12259
Nanodroplets MegaShear N/A
DNA Nanodrop Thermo Fisher ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin) Calbiochem/EMD 108975
Protease Inhibitors (Chymostatin) Calbiochem/EMD 230790
Protease Inhibitors (Pepstatin) Calbiochem/EMD 516481
CiA:Oct4 mESC The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells The kind gift of J. Wysocka

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
  5. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  6. Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
  7. Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
  8. Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
  9. Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
  10. Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
  11. Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
  12. Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
  13. Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
  14. Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

Tags

Fråga 139 kemisk biologi bioteknik bifunktionell molekyler kemisk inducerad närhet kromatin förordning gen förtryck Histon histondeacetylas epigenetik kemiska epigenetiska modifierare CEMs
Ompressning gentranskription genom att omdirigera cellulära maskineriet med kemiska epigenetiska modifierare
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiarella, A. M., Wang, T. A.,More

Chiarella, A. M., Wang, T. A., Butler, K. V., Jin, J., Hathaway, N. A. Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (139), e58222, doi:10.3791/58222 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter