Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

إجراء جنبا إلى جنب على أساس اليغنوكليوتيد عزل الحمض النووي الريبي لاسترداد مجمعات البروتين مرناً حقيقية النواة

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/58223
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Dept. of Microbial Sciences, School of Biosciences and Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Surrey
* These authors contributed equally

Summary

ويرد وصف إجراء عزل الحمض النووي الريبي جنبا إلى جنب (رحلة) لانتعاش مجمعات البروتين مرناً اندوجينوسلي المشكلة. على وجه التحديد، مجمعات البروتين الحمض النووي الريبي كروسلينكيد في فيفو، الكشف بوليادينيلاتيد المعزولة من مقتطفات مع الخرز oligo(dT)، ويتم التقاطها مرناس خاصة مع تعديل الجيش الملكي النيبالي النوكليوتيد العقاقير. يتم الكشف عن البروتينات منضمة إلى مرناس بتحليل إيمونوبلوت.

Abstract

الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) دوراً رئيسيا في التحكم في بوستترانسكريبشونال التعبير الجيني. ولذلك توصيف البيوكيميائية مجمعات مرناً بالبروتين ضروري لفهم التنظيم مرناً الاستدلال بالبروتينات المتفاعلة أو الكشف غير الترميز. وهنا، نحن تصف إجراء عزل الحمض النووي الريبي جنبا إلى جنب (رحلة) التي تمكن من تنقية البروتين مرناً اندوجينوسلي شكلت مجمعات من مقتطفات الخلوية. يشمل البروتوكول خطوتين عزلة بوليادينيلاتيد مرناس مع حبات العقاقير oligo(dT) وبعد ذلك القبض على مرناً للفائدة مع 3 '--بيوتينيلاتيد 2-س-ميثليته النوكليوتيد العقاقير الجيش الملكي النيبالي، الذي يمكن أن تكون معزولة ثم مع حبات ستريبتافيدين. واستخدمت الرحلة لاسترداد في فيفو كروسلينكيد مرناً-ريبونوكليوبروتين (مرنب) مجمعات من الخميرة والديدان الخيطية والخلايا البشرية لمزيد من التحليل الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات. وبالتالي، رحلة من اتباع نهج متعدد الاستخدامات التي يمكن تكييفها لجميع أنواع بوليادينيلاتيد الكشف عبر الكائنات الحية لدراسة دينامية إعادة ترتيب مرنبس تفرضها العظة داخل الخلايا أو البيئية.

Introduction

هو الدافع وراء تنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال من خلال التفاعلات بين الكشف (نكرناس) ومرناس الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية)، غير الترميز، الذي المباشر التجهيز والتعريب والترجمة والانحلال من كل نسخة داخل الخلايا1 , 2-تحديد الممارسات التجارية التقييدية ونكرنا التفاعل مع مرناس خاصة، إنشاء ما يعرف باسم ريبونوكليوبروتين مجمعات/الجسيمات (رنبس)، ولذلك هو المفتاح لفهم مصير تحكم تعبير مرناس والجينات. تقوم نهج تكميلية لتوصيف البيوكيميائية رنب مجمعات3،4: بينما يستند النهج "البروتين التي تركز على" تنقية محددة الممارسات التجارية التقييدية، ينطوي "الجيش الملكي النيبالي" النهج المرتكز عزل الفئات السكانية الفرعية أو الكشف الفردي والتحليل اللاحق للبروتينات المتفاعلة أو الكشف. في الآونة الأخيرة، نهج المرتكز على الحمض النووي الريبي للتعرف على الممارسات التجارية التقييدية مرجع التفاعل مع بوليادينيلاتيد (poly(A)) الكشف5 أصبحت شعبية متزايدة بإدراج خطوة crosslinking ضوء (الأشعة فوق البنفسجية) الأشعة فوق البنفسجية على استقرار البروتين-الجيش الملكي النيبالي التفاعلات السابقة عزلة مرناس، الذي مدد كبير الكتالوج الخاص بالممارسات التجارية التقييدية في الخلايا البشرية6،،من78،،من910،11، ايليجانس كاينورهابديتيس 12،13،12، saccharomyces cerevisiae14، وسائر الكائنات الحية15،16،،من1718، ،من 1920. ومع ذلك، رسم خرائط للبروتينات و/أو نكرناس تجميعها على وقائع معينة لا يزال تحديا كبيرا. وتحقيقا لهذه الغاية، تستخدم حاليا نهجين رئيسيين: من ناحية، تنصهر فيها الجيش الملكي النيبالي ابتمر العلامات للجيش الملكي النيبالي الفائدة لتمكين انجذاب تطهير. وبالتالي، ربط الابتامرات الجيش الملكي النيبالي مع تقارب عالية للمضادات الحيوية امينوغليكوزيد بما في ذلك توبراميسين وستربتوميسين21،22،،من2324، أو للبروتينات، مثل البروتين معطف من R17/MS2 عاثية أو الجرثومي ستريبتافيدين S125،،من2627،،من2829. على الرغم من أن هذا النهج كان سيظهر أن تكون قوية ومرنة نسبيا، فإنه يتطلب استنساخ لتصميم الجيش الملكي النيبالي قيد التحقيق، وبالتالي لا يمكن استخدامها لالتقاط مرناس الطبيعية. من ناحية أخرى، النوكليوتيد العقاقير (منظمات خدمات الإيدز) استخدمت في وقت مبكر للانتعاش وتوصيف للغاية وأعرب عن30،رنبس الأصلية31 والفيروسية الكشف32. في الآونة الأخيرة، تم تطبيق منظمات خدمات الإيدز لالتقاط الترميز غير طويلة الكشف33،،من3435 و في المختبر شكلت مرنبس36. هو أحد العوامل المقيدة الرئيسية مع كافة النهج التي تركز على الحمض النووي الريبي عدد نسخ الحمض النووي الريبي للفائدة، مما يجعل استعادة مرناس منخفضة-وأعرب عن أكثر إشكالية. ويمكن التغلب على هذا القيد برفع مستوى رد فعل؛ ومع ذلك، هذا يمكن أن يحتمل أن يؤدي إلى زيادة الخلفية.

وهنا، يمكننا وصف لدينا وضعت مؤخرا على أساس أسو جنبا إلى جنب الجيش الملكي النيبالي العزل الداخلي (رحلة) لعزل مجمعات البروتين مرناً الأصلية بانتقائية عالية37 (الشكل 1). البروتوكول يتطلب خطوتين تنقية المستندة إلى أسو متسلسلة، وهي عزلة مرناس poly(A) مع oligo(dT) المتاحة تجارياً إلى جانب الخرز تليها أسر مرناس محددة تستخدم على وجه التحديد المصممة بيوتينيلاتيد قصيرة 2-ميثوكس الجيش الملكي النيبالي منظمات خدمات الإيدز. يساعد على القضاء على البروتينات تلويث هذا الإجراء المكون من مرحلتين ويضيف فرص للتعديل والتحسين. في هذه الحالة، رحلة كان يطبق على مرناس مختارة من الخميرة، الديدان الخيطية، وشكلت الخلايا البشرية لتأكيد في فيفو مرناً-البروتين المجمعات.

Protocol

1-تصميم العقاقير النوكليوتيد (منظمات خدمات الإيدز)

  1. تحليل بنية الثانوي مرناً أو جزء منه باستخدام الأدوات المتاحة على الإنترنت38. ولذلك، أدخل تسلسل النوكليوتيدات (nt) في المربع الفارغ. في مربع الخيارات الأساسية، حدد الحد الأدنى الطاقة الحرة (حجم) ووظيفة التقسيم و تجنب عزل قاعدة أزواج. في مربع خيارات الإخراج، حدد الأرض هيكل الثانوية "رنا التفاعلية" ، وأخيراً انقر فوق الزر متابعة . نافذة جديدة سوف المنبثقة التي تعرض بنية ثانوية من مرناً للفائدة.
  2. حدد على الأقل ثلاثة مختلفة 21-24 nts تسلسلات طويلة داخل مرناً للفائدة، ترتبط بشكل تفضيلي في المناطق التي تفتقر إلى الهياكل الثانوية يمكن كشفها (على سبيل المثال-، في الحلقات غير منظم) وأهمل في 3 مناطق (UTR).
    ملاحظة: فقد لوحظ أن منظمات خدمات الإيدز الصلب إلى تسلسل في 3 ' أهمل المناطق (UTR) أداء أفضل. كما أن أحد الاحتمالات أن ريبوسوم منضمة إلى تسلسل الترميز (الأقراص المضغوطة) قد يعرقل أحياناً الصلب لمنظمات خدمات الإيدز. لم يتم اختبار الصلب إلى 5 ' تحيلها منظمات خدمات الإيدز.
    1. تحديد المناطق التي توجد بها نسبة سيتوزين غوانيدين/ما يقرب من 50 في المائة وتفتقر إلى النوكليوتيدات جنبا إلى جنب ويكرر لتجنب احتمال تشكيل دبابيس الشعر أو الصلب الذاتي.
  3. يدوياً تعديل التصميم 2-ميثوكس النوكليوتيد الحمض النووي الريبي آخذة moiety بيوتين في 3 ', التكامل التام لمناطق مختارة (الخطوة 1، 2) داخل المطلوب استهداف مرناً.
    ملاحظة: التعديلات 2 '-ميثوكس تجعل مقاومة للحمض النووي الريبي رنسيس الخلوية ويزيد مزدوج ذوبان درجة الحرارة، والذي يسمح للغسيل الصارمة. مجموعة البيوتين مطلوب لالتقاط منظمات خدمات الإيدز مع ستريبتافيدين.
    1. ضبط درجة حرارة ذوبان الهجينة الحمض النووي الريبي ل ~ 60-65 درجة مئوية، وضمان أن يكون لديها تعقيد تسلسل لغوية عالية (> 60%) كما هو محدد مع أدوات الإنترنت مناسبة39.
    2. استخدم "أداة البحث الأساسية في محاذاة المحلية"40 للبحث عن المحتملة أسو عبر التهجين مع أخرى مرناس في الترنسكربيتوم. حدد الانفجار النوكليوتيداتوإدراج التسلسل في المربع الفارغ وحدد الكائن الحي للفائدة. تبقى المعلمات المتبقية كافتراضي وانقر فوق الانفجار.
      ملاحظة: يمكن أن تؤدي محاذاة مستمرة حتى ولو جزئية من 8-10 تي إس عبر التهجين واسترداد هذا مرناً.

2-خلية ثقافة واشعاع الأشعة فوق البنفسجية وخلية تفسخ

ملاحظة: في ما يلي، هو وصف للإجراءات التي مهدها الخميرة S. cerevisiaeوالديدان الخيطية C. ايليجانس، وخلايا الكلي الجنينية البشرية (HEK293). ومع ذلك، يمكن تكييفها للكائنات الحية الأخرى، وكذلك، على الرغم من أنه كان لا صراحة اختباره بعد.

  1. سيريفيسيا س.
    1. تنمو خلايا الخميرة (على سبيل المثال-، سلالة BY4743 متفرعة؛ MATa/α his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 LYS2/lys2Δ0 met15Δ0/MET15 ura3Δ0/ura3Δ0 PFK2:TAP/PFK2) في 500 مل من YPD وسائل الإعلام (استخراج الخميرة 1%، ببتون 2%، 2% د-الجلوكوز) عند 30 درجة مئوية مع الرج المستمر 220 لفة في الدقيقة.
    2. جمع الخلايا في سجل منتصف المرحلة (الكثافة البصرية في شمال البحر الأبيض المتوسط (OD) 600600 ~ 0.6) عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات النايلون ميكرومتر 0.45 أو بالطرد المركزي في 3,000 ز × 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). تجاهل-التدفق عبر أو المادة طافية، على التوالي.
    3. تغسل الخلايا ثلاث مرات مع 25 مل من الفوسفات-مخزنة-المالحة (PBS) باستخدام عامل التصفية النايلون 0.45 ميكرومتر أو تجميع باستخدام الطرد المركزي في 3,000 ز × 2 دقيقة على RT وتجاهل المادة طافية. جمع الخلايا بسرعة قدر الإمكان كما الضغوط المفروضة قد تؤثر على تفاعلات البروتين الجيش الملكي النيبالي.
    4. ريسوسبيند الخلايا في 25 مل من برنامج تلفزيوني وثم من أجل التعليق في 15 سم طبق بيتري. ضع الطبق على الجليد وإزالة الغطاء، وتعريض الخلايا ثلاث مرات مع 400 مللي جول سم-2 من 254 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية الضوء الأشعة فوق البنفسجية كروسلينكير مع فواصل 2-مين على الجليد بين كل دورة التعرض مع خلط لطيف.
    5. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل وجمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 3,000 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وإبقاء بيليه.
      ملاحظة: يمكن أن تكون الخلايا الإضافية المجمدة في النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية.
    6. ريسوسبيند الخلايا في 4 مل من تحلل مبردة المخزن المؤقت A (ألف رطل؛ 100 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 500 مم ليكل، 10 مم يدتا، 1% X-100 تريتون، 5 ملم DTT، 20 ش مل-1 الدناز، أكمل يو 100 مل-1 رناسين، خالية من يدتا كوكتيل مثبط البروتياز).
    7. نقل الخلايا إلى أنبوبين 2 مل. إضافة الحد الأقصى. وحدات التخزين ⅔ من يبرد الزجاج الخرز وتعطيل الخلايا في أنسجة في 30 هرتز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    8. لكمه ثقب في الجزء السفلي من الأنبوب بإبرة ساخنة ونقل إلى أنبوب جديد 1.5 مل بالطرد المركزي في 600 × ز لمدة 30 ثانية.
    9. مسح ليساتي قبل ثلاثة سينتريفوجيشنز متسلسلة في 4 درجات مئوية في 3,000 × ز لمدة 3 دقائق، ثم 5,000 × ز ز × 10,000 لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: مقتطفات يمكن تجميد المفاجئة في النتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. C. ايليجانس
    1. ثقافة بريستول N2 الديدان عند 20 درجة مئوية على لوحات متوسطة النمو ديدان أسطوانية (NGM) (0.3% كلوريد الصوديوم، أجار 1.7 ٪، ببتون 0.25%، 1 مم كاكل2، 5 ميكروغرام/مل الكولسترول، 1 مم MgSO4، 25 مم مشرف4 المخزن المؤقت، pH 6.0) المصنف مع سلالة OP50 الإشريكيّة القولونية 41 .
    2. إضافة 5 مل من M9 المخزن المؤقت41 (0.3% خ2ص4، 0.6% Na2هبو4، 0.5% كلوريد الصوديوم، 1 مم MgSO4) لكل لوحة، اهتز لوحة ريسوسبيند الديدان ونقل الديدان إلى أنبوب 15 مل. 2 ميليلتر من التعليق في شريحة وتعول الديدان في التعليق مع مجهر. قم بتطبيق عامل لحساب العدد من الديدان كل لوحة.
    3. جمع ~ الديدان 120,000 بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (400 × ز، 2 دقيقة، RT) وتجاهل المادة طافية.
    4. أغسل الديدان ثلاث مرات. ولذلك، أضف 10 مل من المخزن المؤقت M9 ومزيج من انعكاس وجمع الديدان بالطرد المركزي في 400 غ × 2 دقيقة في الرايت
    5. إضافة 15 مل M9 المخزن المؤقت للديدان ووضع على عجلة الدنمارك لمدة 15 دقيقة في الرايت
    6. نقل الديدان إلى لوحات NGM (الديدان ~ 4,000 كل لوحة) وكشف بالأشعة فوق البنفسجية-الضوء (254 نانومتر) في mJ 300 سم-2 في الأشعة فوق البنفسجية-كروسلينكير.
    7. إضافة 5 مل من المخزن المؤقت M9 مباشرة إلى اللوحة واهتز اللوح الذي ريسوسبيند الديدان في المخزن المؤقت. نقل التعليق مع ماصة لأنبوب 15 مل وجمع الديدان بالطرد المركزي في 400 غ × 2 دقيقة في الرايت
    8. ريسوسبيند الديدان في 2 مل من تحلل المخزن المؤقت ب (ب رطل؛ 100 ملم تريس-HCl، pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم يدتا، 0.75 في المائة إيجيبال، 1 مم DTT، 20 ش مل-1 الدناز، أكمل يو 100 مل-1 رناسين، خالية من يدتا كوكتيل مثبط البروتياز).
    9. طحن الديدان في قذيفة هاون مملوءة بالنتروجين السائل. جمع المسحوق في أنبوب 50 مل وذوبان الجليد في الرايت
      ملاحظة: يجب التعامل مع النتروجين السائل وفقا لإجراءات السلامة (مثل الدخان هود وسلامة قفازات)
    10. مسح ليستي بما في ذلك طبقة الدهون بالطرد المركزي في ز × 14,000 لمدة 10 دقائق وبعد ذلك يمر توضيح من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر مع المحاقن.
  3. الخلايا البشرية المستزرعة
    ملاحظة: يستند الوصف التالي عابرة تعداء الخلايا HEK293 pGL3-CDKN1B-3 ' بلازميد مراسل UTR أن تعرب عن 3′UTR CDKN1B-27 المصب من الجينات لوسيفراس اليراع 42.
    1. الثقافة HEK293 الخلايا في المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) التي تحتوي على جلوكوز 25 مم وبيروفات صوديوم 1 مم، تستكمل مع 100 مل-1 البنسلين يو، 100 ميكروغرام مل-1 ستربتوميسين ونسبة 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، واحتضان في 37 درجة مئوية في دائرة هوميديفيد (الحاضنة) التي تحتوي على 5% CO2.
    2. طبق البذور ~ 3 × 106 HEK293 الخلايا في ثقافة نسيج معيار 10 سم في اليوم قبل تعداء. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير.
    3. ميكس 2 ميكروغرام من الجينات مراسل (مثلاً.، pGL3-p27-3 ' UTR) مع 20 ميليلتر من كاشف تعداء وترانسفيكت الخلايا في كونفلوينسي 70% (~ 7 × 106 خلايا).
    4. وضع الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية لزيادة 48 ساعة قبل الحصاد.
    5. إزالة المتوسطة مع ماصة مصلية وتغسل بسرعة الخلايا مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة مصلية.
    6. إضافة مل 6 من برنامج تلفزيوني للطبق ووضع على الجليد وثم تعريض الخلايا لضوء الأشعة فوق البنفسجية (254 نانومتر) في 100 مللي جول سم-2 في الأشعة فوق البنفسجية-كروسلينكير.
      ملاحظة: يجب إبقاء اللوحة على الجليد خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية-الضوء.
    7. تتخلص من خارج الخلايا (في مجموع الخلايا7 ~ 10) في برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب 15 مل.
    8. تدور أسفل الخلايا في ز × 250 لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية ومن ثم إزالة المادة طافية مع ماصة.
      ملاحظة: يمكن تجميد المفاجئة في النتروجين السائل بيليه الخلية وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    9. ريسوسبيند الخلايا في 2 مل من المخزن المؤقت لتحلل مبردة مسبقاً (ألف رطل) من بيبيتينج صعودا وهبوطاً ل 5-6 مرات، مع إبقاء الأنبوب على الجليد.
    10. نقل مع ماصة لأنبوب 5 مل على الجليد.
    11. الموضوع إلى ثلاث جولات من سونيكيشن تتكون من 20 رشقات نارية s في 10 ميكرومترات السعة مع 30 s التبريد فترات على الجليد.
      ملاحظة: ينصح سونيكاتيون كما أنه يكمل تحلل الخلايا وأجزاء الحمض النووي.
    12. نقل أنابيب 2 مل وأجهزة الطرد المركزي في 15,000 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية (= استخراج) ونقل إلى أنبوب جديد. إزالة نموذج تحليلي (5-10 ٪) لمزيد من البروتين وتحليل الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة لإزالة أي حطام الخلايا المتبقية ويمكن أن يتكرر.

3-أول خطوة: Poly(A) الحمض النووي الريبي العزلة

  1. حجته 1 مغ من oligo(dT)25-إلى جانب الخرز المغناطيسية في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت تحلل كل منهما.
  2. الجمع بين 5 ملغ أو 10 ملغ أو 4 ملغ (بروتين) S. cerevisiae, C. ايليجانس أو مقتطفات HEK293، على التوالي، مع 1 مغ من oligo(dT)25 -إلى جانب الخرز المغناطيسية. مزيج من عينات قوة لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية في خلاط.
    ملاحظة: يمكن تحديد تركيزات البروتين من مقتطفات مع المقايسة برادفورد استخدام ألبومين المصل البقري (BSA) كمعيار مرجعي. اهتزاز قوي من عينات يمنع ترسب الخرز. تقييم خصوصية العزلة مرناً، تجربة التحكم يمكن أن يؤديها بالتوازي مشيراً إلى وجود فائض (20 ميكروغرام) من الأحماض بوليادينيليك (السلطة الفلسطينية).
  3. ضع الأنابيب في موقف مغناطيسي من أجل 10 s وإزالة المادة طافية. الاحتفاظ بالمادة طافية على الجليد للجولات اللاحقة للاسترداد (الخطوة 3، 7).
  4. إضافة 500 ميليلتر للمياه والصرف الصحي بالمخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 600 مم ليكل، 1 مم يدتا، 0.1% Triton X-100) الخرز ودوامه 5 s.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف تركيز ليكل في مخازن المياه والصرف الصحي. 600 مم ليكل ينصح ولكن أيضا اختبرت تركيزات أقل (500 مم C. ايليجانس، 300 مم ل HEK293).
  5. جمع الخرز مع مغناطيس ويغسل الخرز مرتين مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي ب (البنك الدولي؛ 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 600 مم ليكل، يدتا 1 مم).
  6. الوتي الجيش الملكي النيبالي في 30 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5 عند 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة مع الرج المستمر (1,000 لفة في الدقيقة) في خلاط. فورا بوضع الأنبوبة في الحامل المغناطيسي وجمع النذرة بعد 10 س. حفظ الخرز لجولات إضافية من تنقية.
    ملاحظة: جمع النذرة أسرع ما يمكن لمنع إعادة الربط المحتملة من مرناس الخرز عند درجات حرارة منخفضة.
  7. إضافة الخرز من الخطوة السابقة للمادة التي تم جمعها في الخطوة 3، 3 طافية، وكرر التقاط والغسيل وشطف من مرناس مرتين (الخطوات 3، 3، 3-6). ثم يتم الجمع بين الواتس من جولات متكررة ويمكن تخزينها في-80 درجة مئوية.

4-الخطوة ثانيا: مرناس "التقاط محددة" مع 3 '--بيوتينيلاتيد 2-ميثوكس معدلة العقاقير الجيش الملكي النيبالي النوكليوتيد

ملاحظة: لاختبار مدى ملاءمة لمنظمات خدمات الإيدز، يمكن تنفيذ الإجراء التالي مع مجموع الكشف المعزولة من الخلايا.

  1. حجته 30 ميليلتر من ستريبتافيدين-إلى جانب الخرز المغناطيسية في 1 مل ملزمة وتغسل المخزن المؤقت (المخزن المؤقت ب ث؛ 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.5 مم يدتا، pH 8.0) الذي يحتوي على 0.1 مغ مل-1الإشريكيّة القولونية نقل الجيش الملكي النيبالي (الحمض الريبي النووي النقال) في دوار ح 1 في الرايت
    1. أغسل حبات ثلاث مرات مع ميليلتر 750 من المخزن المؤقت ب ث.
    2. ريسوسبيند الخرز في 30 ميليلتر من المخزن المؤقت ب ث والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
  2. تمييع ~ 35 ميكروغرام من البروتين الكلي من العزلة poly(A) السابقة (انظر 3) في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت ب ث في أنبوب 1.5 مل.
    ملاحظة: لاختبار الطابع الخاص لمنظمات خدمات الإيدز مع مجموع الجيش الملكي النيبالي، إضافة 600 نانوغرام لتنقية الحمض النووي الريبي الإجمالية إلى 100 ميليلتر من المخزن المؤقت ب ث.
  3. إضافة pmol 200 أسو كل منهما واحتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: درجة حرارة مرتفعة يحل الهياكل الثانوية في الجيش الملكي النيبالي تيسير الصلب ASO.
  4. إزالة الحرارة-كتلة كاملة من الجهاز ووضعه على RT لمدة 10 دقائق ليبرد ببطء.
  5. إضافة 30 ميليلتر من حبات مغناطيسية متوازن إلى جانب ستريبتافيدين من الخطوة 4، 1 إلى العينة.
  6. احتضان هذا الخليط لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية مع الرج المستمر 950 لفة في الدقيقة في خلاط.
    ملاحظة: من المستحسن لنفض الغبار أنابيب كل 10 دقيقة لمنع ترسب خرز.
  7. وضع الأنابيب على الوقوف المغناطيسية وإزالة المادة طافية وتغسل حبات ثلاث مرات مع ميليلتر 750 من المخزن المؤقت ب ث المعالجون مسبقاً في 55 درجة مئوية.
    ملاحظة: درجة حرارة الغسيل المثلى قد تختلف/تختلف قليلاً بين مختلف منظمات خدمات الإيدز. من المستحسن لضبط هذا الشرط مع غير كروسلينكيد مجموع الحمض النووي الريبي قبل القيام بالتجربة مع مقتطفات من الخلية.
  8. الوت الجيش الملكي النيبالي في 20 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5 عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع الرج المستمر 950 لفة في الدقيقة في خلاط. وضع الأنابيب في موقف المغناطيسي وجمع فورا النذرة.
    ملاحظة: لتحليل البروتين، إضافة ميليلتر 20 × 1 لايملي المخزن المؤقت إلى الخرز واحتضان عند 95 درجة مئوية للبروتينات 5 دقيقة تتم مراقبتها بواسطة تحليل immunoblot عقب البروتوكولات القياسية المختبر.

Representative Results

قمنا بتطوير استراتيجية عزل الحمض النووي الريبي المستندة إلى أسو، وصف الرحلة، لالتقاط مرناس خاصة مع تلك البروتينات منضم من الكائنات المختلفة الثلاثة37. أساسا، كان الجيش الملكي النيبالي-البروتين المجمعات كروسلينكيد في فيفو بالأشعة فوق البنفسجية-تشعيع الخلايا في 254 نانومتر، و poly(A) وعثر بالكشف مع الخرز اليغو المتوفرة تجارياً (dT) إلى جانب-المغنطيسية، ثم كان مرناً لمصلحة معزولة مع 3-بيوتينيلاتيد 2-0 '-ميثوكس تعديل العقاقير النوكليوتيد الحمض النووي الريبي (الشكل 1). ولذلك نحن مصممة عدة منظمات خدمات الإيدز nts تعديل 21-24 مع التكامل الكامل للمناطق في مرناس مختارة من الخميرة, C. ايليجانس والإنسان، واختبار صلاحيتهم لاسترداد مرناً للفائدة (ترد قائمة بأجهزة الإشعال ومنظمات خدمات الإيدز في الجدول 1)-الكفاءة والنوعية لمنظمات خدمات الإيدز الفردية وقيمت أولاً مع غير كروسلينكيد مجموع من الحمض النووي الريبي معزولة عن كل الكائنات الحية. في هذه التجارب، بالإضافة إلى حبات باراماجنيتيك streptavidin مترافق منظمات خدمات الإيدز الجيش الملكي النيبالي والمحتضنة مع غير كروسلينكيد رنا مجموع إعداد من الكائن المناظرة. بعد الإفراج عن الأسرى مرناس من الخرز، يستهدف وجود مرناً، وكذلك لا علاقة لها التحكم مرناس كان يرصدها النسخ العكسي (RT)-بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد)37. فقد لاحظنا أن اثنين من المتغيرات، وتركيز الملح ودرجة حرارة الغسيل المخازن المؤقتة، لعبت أدواراً حاسمة في الكفاءة للقبض على PFK2 مرناً من الخميرة التي تم اختبارها مع ثلاث منظمات خدمات الإيدز مختلفة (الشكل 2A). خفض تركيز الملح (كلوريد الصوديوم) إلى 25 مم تخفيض الانتعاش السلبية السيطرة مرناً (PFK1) إلى مستويات غير قابلة للاكتشاف مع جميع منظمات خدمات الإيدز، إلا أنه أيضا تقليل استرداد المطلوب استهداف مرناً PFK2 (10-15% المدخلات). على العكس من ذلك، زادت زيادة تركيزات الملح إلى المستويات الفسيولوجية (150 مم كلوريد الصوديوم) استرداد مرناس PFK2 تصل إلى 75% مع أسو PFK2-2، تزيد من عنصر التحكم PFK1 مرناً من 5 إضعاف على الأقل (الشكل 2A). لمزيد من الملاحظة، منظمات خدمات الإيدز مختلف أظهر التباين الكبير مرناً بلغت التقاط الهدف الملح-تركيزات فسيولوجية، وإذ تشدد على الحاجة إلى التحقق التجريبي لمنظمات خدمات الإيدز. ويتمثل الاعتماد لاسترداد مرناً على درجة حرارة المخزن المؤقت يغسل C. ايليجانس المجلس الانتخابي المؤقت-1 والخميرة مرناس RPS20 ، باستخدام كل منها منظمات خدمات الإيدز (الجدول 1). لاحظنا أن درجة حرارة الغسيل المثلى بين 50 درجة مئوية و 55 درجة مئوية، كما يتضح من الخلفية منخفضة مع مرناس غير ذات صلة وكفاءة استرداد مرناس المستهدفة (الشكل 2). عند هذه النقطة، نود أن نشدد على إمكانية التهجين الصليب لمنظمات خدمات الإيدز مع مرناس الأخرى. على سبيل المثال، أسو DNM1 كاملة مكملة لتسلسل داخل DNM1 الترميز تسلسل، لكن فإنه أننيالس أيضا جزئيا مع ACT1 مرناً. DNM1 منظمات خدمات الإيدز تعافي كلا مرناس بغض النظر عن درجة حرارة الغسيل، يظهر ميل قوي للصليب-التهجين (الشكل 2). وأخيراً، لدينا وتستخدم الاختبارات الموصوفة أعلاه وأمثل لتحديد ثلاث منظمات خدمات الإيدز التي كانت مناسبة لاسترداد مرناس هدف كل منهما من مجموع الجيش الملكي النيبالي معزولة عن S. cerevisiae, C. ايليجانس والخلايا البشرية (الشكل 2D ).

وبعد الاختيار الأولى لمناسبة منظمات خدمات الإيدز في المختبر، أجرينا رحلة مع مقتطفات الخلية التي تم الحصول عليها من الأشعة فوق البنفسجية-كروسلينكيد الكائنات الحية/الخلايا (الشكل 1). على وجه التحديد، نحن اختبار استرداد ثلاثة مرناس مختلفة من الكائنات المختلفة الثلاثة: مرناً PFK2 من الخميرة S. cerevisiae، المجلس الانتخابي المؤقت-1 من السلكية C. ايليجانس، وهو مراسل مرناً (pGL3-CDKN1B-3 'UTR) تحمل 3' UTR تسلسل من البشرية CDKN1B/p27 مرناً تنصهر لمراسل لوسيفراس (لوك) للتعبير عابر في الخلايا HEK293 البشرية. للتحكم في الخصوصية لعزل الحمض النووي الريبي، يمكننا رصد انتعاش مرناس لا علاقة لها عدة، وأجرينا التجارب المنافسة بالإضافة لوجود فائض من السلطة الفلسطينية إلى مقتطفات الخلية، التي تتنافس مع ربط مرناس الخلوية إلى oligo(dT)25 الخرز أثناء تنقية أول خطوة خطوة. كما يتضح سابقا مع غير كروسلينكيد مجموع الجيش الملكي النيبالي عينات (الشكل 2)، الرايت-بكر أكد إثراء مرناس كل منها استهداف مرناً أثناء الرحلة، بينما لم تم إثراء عدة غير المتصلة مراقبة مرناس (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، تم الكشف عنها ولا مرناس على الخرز دون منظمات خدمات الإيدز، تشير إلى إجراءات حظر المناسبة التي تجنب الربط غير محدد. على هذا الخط، كما يمكن استخدام منظمات خدمات الإيدز لا علاقة لها سارعت كمراقبة، رغم احتمال الصليب-التهجين مع بعض مرناس والتقاط المستدل من البروتينات منضم ثم أن تؤخذ في الاعتبار. حيث يمكن تصور البروتينات في النذرة النهائي صعوبة في الهلام بولياكريلاميدي الملطخة بالفضة (البيانات لا تظهر)، قيمت كذلك وجود البروتينات المتفاعلة مرناً المعروفة سابقا قبل التحليل إيمونوبلوت. وهذا يشمل Pfk2p من S. cerevisiae، الذي يربط بشكل انتقائي إلى PFK2 مرناً في طريقة مستقلة الريبوسوم12؛ شعبة الشؤون القانونية العامة-1 C. ايليجانس ، مكافحة الممارسات التجارية التقييدية الكنسي الذي يربط بين تسلسلات UTR المجلس الانتخابي المؤقت- 1 إلى 3 ' مرناً للتنظيم متعدية43؛ والحر، مكافحة الممارسات التجارية التقييدية التي تنظم الاستقرار مرناً وترجمة p27/CDKN1B مرناً44. كما هو متوقع، كل من هذه البروتينات قد حددت في الواتيس رحلة من مرناس كل منهما بتحليل "لطخة الغربية" (الشكل 3B).

Figure 1
رقم 1. التمثيل التخطيطي لرحلة. البروتينات كروسلينكيد للجيش النيبالي الملكي في فيفو باشعاع الأشعة فوق البنفسجية. في الخطوة الأولى (مربع الضوء الأخضر)، يتم استرداد مجمعات poly(A) الجيش الملكي النيبالي بالبروتين مع الخرز25 oligo(dT) تطبيق شروط صارمة الغسيل لإزالة البروتينات غير منضم. الخطوة الثانية (المربع الوردي)، مرنب الهدف هو سحب مغادرة النوكليوتيد الحمض النووي الريبي العقاقير بيوتينيلاتيد والخرز ستريبتافيدين. ثم يتم تحليل مرنبس المنقي RT-PCR وإيمونوبلوت/--قياس الطيف الكتلي (مللي ثانية) لتحديد الكشف والبروتينات التي تتفاعل مع مرناً للفائدة، على التوالي. تم تعديل الرقم من المنشور السابق37 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. تعديل عزلة مرناس مختارة من الجيش الملكي النيبالي مجموع الخلايا غير كروسلينكيد/الكائنات باستخدام المجسات التقاط antisense الحمض النووي الريبي. (أ) تأثير تركيزات الملح على كفاءة الالتقاط من الخميرة PFK2 مرناً مع منظمات خدمات الإيدز. جنبا إلى جنب مع منظمات خدمات الإيدز ذكر مجموع الجيش الملكي النيبالي من خلايا الخميرة وغسلها مع المخزن المؤقت الذي يحتوي على تركيز الملح (كلوريد الصوديوم) المحدد في 55 درجة مئوية. الأخضر، تمثل الخطوط الزرقاء والبرتقالي PFK2 مرناً الانتعاش مع مختلف منظمات خدمات الإيدز حسبما تقرره RT-PCR37: PFK2-1 و PFK2-2 يصلب في 3 ' UTR، PFK2-4 في أقراص مدمجة. PFK1 سلبي التحكم مرناً. وكان يؤديها مع 32 التضخيم دورات بكر وكمياً كما هو موضح سابقا37. (ب) جزء من جيم-اليجانسسيب-1 والخميرة RPS20 أسو ملزمة مرناس عند درجة حرارة الغسيل المختلفة، ممثلة في الخطوط السوداء والحمراء، على التوالي. جيم-اليجانسبجك-1 والخميرة ACT1 مرناس غير المستهدفة (التحكم). وطبقت 30 و 32 من دورات PCR للكشف عن الخميرة ومرناس C. ايليجانس ، على التوالي. (ج) التمثيل التخطيطي من التهجين من DNM1 أسو (أحمر) مع تسلسل في مرناً DNM1 ، فضلا عن التهجين عبر المحتملة مع مرناً ACT1 يظهر إلى اليسار. ويرد [اغروس] هلام عرض المنتجات من ردود RT-PCR (30 دورة) للكشف عن الخميرة DNM1 و ACT1 مرناس التيد من الخرز إلى اليمين. الإدخال، مجموع الجيش النيبالي الملكي؛ التعطيل، المادة طافية بعد الحضانة مع منظمات خدمات الإيدز؛ وأشار إلى ه، الواتيس من حبات غسلها في شطف مسبق درجات الحرارة (40 درجة مئوية، 50 درجة مئوية و 60 درجة مئوية). وأجرى تجربة التحكم (Ctrl) بالتوازي دون إضافة أسو. (د) [اغروس] هلام عرض منتجات RT-PCR للكشف عن مرناس (يمين) تم الاستيلاء عليها من الجيش الملكي النيبالي إجمالي الخميرة S. cerevisiae, C. ايليجانس، والخلايا HEK293 البشرية (H. العاقل). الإدخال، مجموع الجيش النيبالي الملكي؛ التعطيل، طافية؛ ﻫ، الواتس من الخرز. بكر كان يؤديها 30 دورات التضخيم للخميرة مرناس، 32 دورات مرناس C. ايليجانس ، ودورات 28 و 30 للبشرية tubulin ومرناس p27 ، على التوالي. تم تعديل الرقم من المنشور السابق37 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. القبض على مجمعات محددة من البروتين مرناً من مقتطفات المستمدة من الخلايا كروسلينكيد الأشعة فوق البنفسجية مع رحلة. [اغروس] (أ) المواد الهلامية للكشف عن مرناس (يمين) مع RT-PCR عند التقاط مع oligo(dT) وأشارت منظمات خدمات الإيدز من S. cerevisiae, C. ايليجانس ومقتطفات الخلية (H. العاقل) البشرية. الإدخال، مجموع الجيش الملكي النيبالي من الخلايا كروسلينكيد/الكائنات الحية؛ Ctrl، عنصر التحكم دون أسو. Poly(A)، المنافسة مع poly(A). أنجز RT-PCR ك وصف37 مع 35 التضخيم دورات لوك، دورات 32 ل p27، ودورات 29 توبولين. (ب) تحليل إيمونوبلوت للبروتينات مرناً زمنياً مع الأجسام المضادة المشار إليها (يمين). تحميل الكسور فيما يلي: 0.1%، 2.5% و 1% للخميرة، مدخلات السلكية والبشرية؛ 10% و 10% و 5% للخميرة، الممرات oligo(dT) السلكية والبشرية؛ و 66 في المائة لجميع منظمات خدمات الإيدز الممرات. يتم الإشارة إلى الأوزان الجزيئية (MW) في كيلودالتونس (كاتشين). الرقم نشرها مع إذن37. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

اسم الدليل التسلسل الهدف الحجم
Pfk2_Fwd جتجتاججتكاكاتجتكج PFK2 S. cerevisiae 133 bp
Pfk2_Rev كتككاككااتجتكاجك PFK2 S. cerevisiae 133 bp
Pfk1_Fwd جتجاتكتككاجتاتجاتج PFK1 S. cerevisiae 97 شركة بريتيش بتروليوم
Pfk1_Rev كتكجتاككتكجتااكاجك PFK1 S. cerevisiae 97 شركة بريتيش بتروليوم
Act1_Fwd جتكتجاتجتجتكتاتك ACT1 S. cerevisiae 85 شركة بريتيش بتروليوم
Act1_Rev جاككاكتتكجتكجتاتك ACT1 S. cerevisiae 85 شركة بريتيش بتروليوم
Dnm1_Fwd كتجتجتكجاتجكاتكاجاك DNM1 S. cerevisiae 156 bp
Dnm1_Rev كجكاكتككاتكتكتكتك DNM1 S. cerevisiae 156 bp
Rps20_Fwd كجكتجاكاكاكاكتج RPS20 S. cerevisiae 228 bp
Rps20_Rev جاجكاكاكاكتكجاك RPS20 S. cerevisiae 228 bp
Cep1_Fwd كجاتجاجاجاجتكجكتجت المجلس الانتخابي المؤقت-1 C. ايليجانس 110 بي بي
Cep1_Rev أتكتججاكتتتجكتكج المجلس الانتخابي المؤقت-1 C. ايليجانس 110 بي بي
Pgk1_Fwd جكجاتاتتاتجتكاتجاتجكتتك pgk-1 C. ايليجانس 74 شركة بريتيش بتروليوم
Pgk1_Rev تجاجتجكتكجاكتككاككا pgk-1 C. ايليجانس 74 شركة بريتيش بتروليوم
Mpk1_Fwd تجكتكاجتاتكجككاتج mpk-1 C. ايليجانس 74 شركة بريتيش بتروليوم
Mpk1_Rev تككاكاكتجككاااتكاا mpk-1 C. ايليجانس 74 شركة بريتيش بتروليوم
p27_Fwd تتااااتاكاتاتكجكتجاكتكاتج p27 H. العاقل 212 bp
p27_Rev كااجتتاتجتجكتاكاتاااجتاااا p27 H. العاقل 212 bp
Luc_Fwd آتجكتكاتاتكجكتككتجات لوسيفراس pγralis ص 117 شركة بريتيش بتروليوم
Luc_Rev تجاكجاتجككتجاتكتجتكت لوسيفراس pγralis ص 117 شركة بريتيش بتروليوم
Β-TUBULIN_Fwd كتجاككاككتجتكتكاجك Β-TUBULIN العاقل ه. 136 bp
Β-TUBULIN_Rev أجككاجكاتااجااتج Β-TUBULIN العاقل ه. 136 bp
أسو PFK2-1 أواجااجوجواواااجوكاو 3 ' UTR سيريفيسيا PFK2 س. -
أسو PFK2-2 جوووكاوجججواجواكووجو 3 ' UTR سيريفيسيا PFK2 س. -
أسو PFK2-4 كووجاجاجاجكجووكاوا ORF سيريفيسيا PFK2 س. -
DNM1 أولمبي أوكجوكاجوجاجووكاجكجووو ORF سيريفيسيا DNM1 س. -
RPS20 أولمبي جوكجواواجككووكوكووكووج ORF سيريفيسيا RPS20 س. -
المجلس الانتخابي المؤقت-1 أولمبي جوجاجاووجكجوجكوووجاا 3 ' UTR ايليجانس جيم-1 المجلس الانتخابي المؤقت -
p27 أولمبي أوكاواككككجكوككاكجوكاجوو 3 ' UTR p27 H. العاقل -

الجدول 1. تسلسلات اليغنوكليوتيد. قائمة [بكر] كبسولة تفجير ومنظمات خدمات الإيدز المستخدمة في هذا العمل وتسلسل التمهيدي والجينات المستهدفة وحجم جزء المتوقعة بعد التضخيم.

Discussion

رحلة يسمح تحليل البروتينات منضمة إلى مرناس محددة في فيفو بالوسائل البيوكيماوية. في حين أننا استخدمنا الأسلوب للتحقق من صحة التفاعل بين الممارسات التجارية التقييدية خاصة مع أهداف مرناً من الكائنات الحية/خلايا مختلفة، رحلة يمكن أن ينطبق أيضا على دراسة أنواع أخرى من poly(A) الكشف، مثل نكرناس طويلة هيولى. وعلاوة على ذلك، يمكن تحقيق تحليل منهجي للبروتينات منضم و/أو الكشف مع تسلسل الحمض النووي الريبي أو مرض التصلب العصبي المتعدد بزيادة من هذا الإجراء. وفي هذا الصدد، لدينا البيانات الأولية تشير إلى أن 1 لتر من الخميرة الثقافات ومالا يقل عن 100 مليون من الخلايا HEK293 البشرية يمكن أن توفر مواد انطلاق كافية للحصول على بيانات موثوقة من مرض التصلب العصبي المتعدد مرناس أعرب جيدا (غير منشورة النتائج).

يشمل البروتوكول رحلة وصف تشعيع الخلايا مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر للتفاعلات التشعب الجيش الملكي النيبالي بالبروتين. وهذا يتيح تنفيذ الشروط الصارمة أغسل أثناء تنقية. ومع ذلك، على الرغم من عدم وضوح اختبارها، نود أن نشير أن crosslinking اختيارية ويمكن أيضا استرداد رنبس النشطة مع المخازن المؤقتة الفسيولوجية. ومع ذلك، ينبغي إعادة ترتيب المحتملة من البروتينات واو الكشف عن هدف الجيش الملكي النيبالي في ليساتيس في هذه الحالة، في الاعتبار. على العكس من ذلك، إذا كانت الأشعة فوق البنفسجية أو غيرها من الإجراءات كروسلينكينج التطبيقية (مثلاً، والفورمالديهايد)، ينبغي تقييم سلامة الجيش الملكي النيبالي تدهور الجيش الملكي النيبالي يمكن أن يؤدي إلى تناقص استرداد مرنبس. بالإضافة إلى ذلك، كروسلينكينج الأشعة فوق البنفسجية عدم كفاءة بدلاً من ذلك (~ 5 ٪) وحتى أقل من ذلك للبروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، التي يمكن أن تستحدث التحيز للكشف عن فئات معينة من الممارسات التجارية التقييدية12. وأخيراً، يمكن أيضا حمل إشعاع الأشعة فوق البنفسجية كروسلينكس البروتين-بروتين والبروتين-الحمض النووي التي ينبغي النظر في البيانات الشفوية45،46. ولذلك، يمكن أيضا إجراءات crosslinking البديلة، على سبيل المثال مع فورمالدهايد، أهمية خاصة لالتقاط أكبر تجميعات البروتين في مرناس.

هو إحدى السمات الرئيسية لرحلة خطوتين الداخلي القائم على أسو تنقية لاسترداد الكشف خاصة، مما يزيد من الانتقائية وتقليل احتمال المشاركة تنقية الملوثات. على سبيل المثال، القلق واحدة تتعلق بإضافة منظمات خدمات الإيدز بيوتينيلاتيد مباشرة إلى مقتطفات الخلية، والتي يمكن أن تؤدي إلى تنقية المشارك من البروتينات البيوتين-ملزمة. وهذا هو التحايل في رحلة بتنفيذ جولة أولى من تنقية للكشف poly(A) باستخدام oligo-(dT) تساهمي إلى جانب25 المغناطيسي الخرز، مما يسمح لتنقية صرامة شروط كما فعلت لالتقاط إينتيراكتومي الجيش الملكي النيبالي بالبروتين. علاوة على ذلك، poly(A) الحمض النووي الريبي اختيار يزيل نكرناس وفرة عالية، مثل الكشف الريباسي وترناس، وذلك يقلل من تعقيد بعينه والمصادر المحتملة للصليب-التهجين والتلوث. في الخطوة الثانية، يتم استردادها مع بيوتينيلاتيد مرناس خاصة وتعديل لمنظمات خدمات الإيدز أن يصلب مع المناطق على أهداف مرناً. بدلاً من ذلك، تعديل منظمات خدمات الإيدز يمكن أن تكون مباشرة تساهمي تعلق أيضا على الخرز المغناطيسي عن طريق أمين-رابط، الحد من الميل إلى التقاط البيوتين ملزم البروتينات. ومع ذلك، في تجربتنا، حضانة كسر الجيش الملكي النيبالي poly(A) مع منظمات خدمات الإيدز قبل إضافة الخرز streptavidin تعافي مرنبس أكثر كفاءة من المباشرة إضافة إلى جانب أسو الخرز. ربما، هي كينيتيكالي يفضل أوليجوس الحرة مع وصول أفضل إلى تسلسل في الجيش الملكي النيبالي تنظيماً بالمقارنة مع أوليجوس المعطل تداولها. ومن ثم، اقتران التساهمية لمنظمات خدمات الإيدز لحبات قبل الاحتضان مع العينة يمكن أن تكون ضارة لانتعاش هدف الجيش الملكي النيبالي ويمكن اختباره تجريبيا.

عيب واحد مع أساليب أسو على أساس عدم كفاءة استرداد بعض مرناس المستهدفة. ولذلك نوصي بتقييم عدة منظمات خدمات الإيدز أن يصلب إلى مناطق مختلفة من النسخة. على وجه التحديد، فإننا نقترح تصميم منظمات خدمات الإيدز 2-3 أن يصلب مع تسلسل في 3 '-UTR أو الأقراص المضغوطة من مرناً للفائدة. كل أسو قد يحمل من كفاءة مختلفة لاسترداد الهدف مرناً كل منها، وينبغي أن يكون تجريبيا اختبار (الشكل 2 أ، ب، المعطيات غير معروضة). في النهاية، وجدنا أن منظمات خدمات الإيدز الصلب لتحيلها 3 ' أداء أفضل بالمقارنة مع تلك الصلب إلى أقراص مدمجة. يمكن أن يكون هذا بسبب زيادة إمكانية الوصول إلى مواقع في تحيلها الربط بسبب عدم وجود ترجمة ريبوسوم، بينما ريبوسوم قد يعرقل التهجين كفاءة داخل الاسطوانات. شهدنا أيضا أن الجمع بين عدة منظمات خدمات الإيدز يمكن أن يؤدي إلى زيادة التلوث من وفرة غير المستهدفة مرناس وانخفاض كفاءة المنسدلة. على أي حال، يمكن التحكم بانتقائية أوليجوس المختار بالتجارب المنافسة (على سبيل المثال-، إضافة أوليجوس المتنافسة).

أخرى القلق يتصل بالتهجين عبر المحتملة مع الكشف غير ذات صلة، كما لاحظنا أن التهجين حتى ولو جزئية مع مرناس الأخرى يمكن أن يؤدي إلى استرداد تلك مرناً (الشكل 2). لتقييم مدى ملاءمة منظمات خدمات الإيدز مصممة، ولذلك نوصي أداء الأولية في المختبر التجارب مع الكشف التام تركيزات الملح ودرجة حرارة الغسيل من المخازن المؤقتة على النحو الأمثل. في أيدينا، غسالة من ستريبتافيدين-إلى جانب الخرز المغناطيسية في المخازن المؤقتة التي تحتوي على 150 مم كلوريد الصوديوم في 55 درجة مئوية أداء أفضل، ولكن نوصي باختبارات مستقلة من الشروط لكل أسو مصممة. الجدير بالذكر، وجدنا أن جميع منظمات خدمات الإيدز المحدد من تجارب في المختبر (الشكل 2D) كانت مناسبة لالتقاط الهدف مرناً كل منهما من مقتطفات الخلية كروسلينكيد (الشكل 3)، كذلك تثبت صحة في المختبر الاختبار. وإلى جانب تصميم منظمات خدمات الإيدز مناسبة لالتقاط مرناً، يمكن أن تؤثر عوامل إضافية على الانتقائية. ولذلك، يمكن منع إجراءات حظر شامل مع جيش صرب البوسنة و/أو الحمض الريبي النووي النقال وفقا لمواصفات نوع حبة ملزمة غير محدد الخرز. لزيادة خفض الاستيعاب غير محدد من البروتينات، نوصي أيضا باستخدام لو-ربط الأنابيب، خاصة عند العمل مع كميات قليلة من العينات.

وبصفة عامة، يمكن أن تكمل الرحلة النهوج المتبعة سابقا لالتقاط الكشف مع منظمات خدمات الإيدز. على سبيل المثال، كان الجيش الملكي النيبالي غير الترميز زيست معزولة مع البروتينات منضم من مقتطفات النووية المستمدة من 200 مليون من الخلايا كروسلينكيد الأشعة فوق البنفسجية باستخدام صفيف من الطويل (90-مير) بيوتينيلاتيد الحمض النووي النوكليوتيد التي غطت نص كامل 34،35. ومع ذلك، يمكن أن يصبح النهج المختار تبليط إشكالية في ضوء إمكانات كبيرة للصليب-التهجين مع الكشف لا علاقة لها، ولا يمكن استخدامه لتحديد نسخة محددة، على سبيل المثال-، وبدلاً من ذلك تقسم أشكال. في الآونة الأخيرة، مصممة خصيصا مؤمن الحمض النووي (LNA) أو ميكسميرس "أسو الحمض النووي" تم إرفاقه تساهمي راتنج مغناطيسي لاسترداد نسخة في المختبر أو الغاية المعلنة الريباسي الكشف من مقتطفات الخلية الحرة؛ ومع ذلك، لم تم اختباره لاسترداد في فيفو شكلت مرناً بالبروتين المجمعات36. في ضوء زيادة الاعتراف بالجينات بوستترانسكريبشونال مراقبة الممارسات التجارية التقييدية ونكرنا، نعتقد أن الرحلة وسيلة مفيدة للتحقيق في تكوينها وديناميات مجمعات رنب داخل الخلايا عند الإشارات داخل الخلايا والبيئية وتأثيرها في الصحة والمرض.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نحن ممتنون للدكتور جوناثان هول وماورو زيمرمان (ETH زيوريخ) لتركيب PFK2 و المجلس الانتخابي المؤقت-1 منظمات خدمات الإيدز، الدكتور صدر ووترز لتصميم منظمات خدمات الإيدز p27/CDKN1B، والدكتور رافال سيوسك (فريدريك ميسشر معهد "البحوث الطبية الحيوية"، بازل) للأجسام المضادة-شعبة الشؤون القانونية العامة-1. هذا العمل كان تدعمها التكنولوجيا الحيوية ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (BB/K009303/1) والملكية المجتمع وولفسون البحوث جائزة الجدارة (WM170036) إلى A.P.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MaxQ 5000 Large Incubated and Refrigerated Orbital Shaker Thermo Fisher Scientific SHKE5000-8CE Floor shaker to grow yeast cells
BBD 6220 Thermo Fisher Scientific CO2 incubator to grow human cells
Sonicator Soniprep150 MSE MSS150.CX4.5 Sonicator/cell disruptor. Used to shear DNA in human cell lysates
Stratalinker 1800 Stratagene Stratalinker to expose cells to UV light at 254 nm
Tissue Lyser Qiagen RETSCH MM200 Device to mechanically disrupt yeast cells
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5810R Centrifuge to spin down cells, lysates
Shaking incubator, Thriller Peqlab Thermoshaker for 1.5 mL tubes
Glass beads 0.5mm Stratech Scientific Limited 11079105 Lysis of yeast cells
Nylon Filter, 0.41 μm Millipore NY4104700 Collection of yeast cells
Millex-HA Filter, 0.45 µm EMD Millipore SLHA02510 Filter to clear nematode lysate
Eppendorf LoBind microcentrifuge tubes Protein 1.5 mL Sigma-Aldrich 22431081 Minimise protein loss
2 mL microfuge tube Ambion AM12425 Yeast extract preparation and other applications
5 mL tube Thermo Fisher Scientific 129A Collection of HEK293 cell lysate
15 mL tube Sarstedt 62.547.254 Collection C. elegans
50 mL plastic tube Sarstedt 62.554.502 Collection yeast cells
DMEM, high glucose, pyruvate Thermo Fisher Scientific 41966 Media for culturing HEK293 cells
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Used to supplement cell culture media to control bacterial contamination
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524 Used to supplement cell culture media
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 DNAse I to degrade DNA from cell lysate
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2611 RNase inhibitor to avoid RNA degradation
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitor cocktail to avoid protein degradation
Dynabeads Oligo (dT)25 Thermo Fisher Scientific 61011 Magnetic beads required for the first step of mRNA-protein complex purification
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D Magnetic beads required for the second step of mRNA-protein complex purification
E. coli tRNA Sigma-Aldrich 10109550001 transfer RNA from E. coli used for blocking streptavidin beads and avoid unsepecific interactions
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent BioRad 5000205 To determine protein concentration within lysates, using BSA as reference
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-100G Used to perform the standard curve that will be used as reference for protein concentration determination
mouse anti-Act1 MP Biomedicals 869100 Antibody for detection of yeast actin in Western blot (1:2,500)
mouse anti-Act1 Sigma A1978 Antibody for detection of human actin in Western blot (1:2,000)
mouse anti-HuR Santa Cruz sc-5261 Antibody for detection of HuR in Western blot (1:500)
mouse anti–CYC-1 Invitrogen 456100 Antibody for detection of Cyc-1 in Western blot (1:1,000)
peroxidase anti-peroxidase soluble complex Sigma P1291 Detection of Pfk2:TAP in Western blot (1:5,000)
HRP-conjugated sheep anti-mouse IgG Amersham NXA931 HRP-coupled secondary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Molecular Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
  2. Iadevaia, V., Gerber, A. P. Combinatorial Control of mRNA Fates by RNA-Binding Proteins and Non-Coding RNAs. Biomolecules. 5 (4), 2207-2222 (2015).
  3. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biology. 15 (1), 203 (2014).
  4. Matia-González, A. M., Gerber, A. P. Ch. 14. Fungal RNA Biology. Sesma, A., von der Haar, T. , Springer. 347-370 (2014).
  5. Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 5 (9), (2010).
  6. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  7. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  8. Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nature Protocols. 8 (3), 491-500 (2013).
  9. Liao, Y., et al. The Cardiomyocyte RNA-Binding Proteome: Links to Intermediary Metabolism and Heart Disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
  10. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding Proteins in Macrophages by Interactome Capture. Molecular Cell Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
  11. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212 (2016).
  12. Matia-Gonzalez, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural and Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
  13. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
  14. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127 (2015).
  15. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
  16. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
  18. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42 (2016).
  19. Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  20. Koster, T., Marondedze, C., Meyer, K., Staiger, D. RNA-Binding Proteins Revisited - The Emerging Arabidopsis mRNA Interactome. Trends Plant Sciences. 22 (6), 512-526 (2017).
  21. Hamasaki, K., Killian, J., Cho, J., Rando, R. R. Minimal RNA constructs that specifically bind aminoglycoside antibiotics with high affinities. Biochemistry. 37 (2), 656-663 (1998).
  22. Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5 (11), 1509-1516 (1999).
  23. Vazquez-Pianzola, P., Urlaub, H., Rivera-Pomar, R. Proteomic analysis of reaper 5' untranslated region-interacting factors isolated by tobramycin affinity-selection reveals a role for La antigen in reaper mRNA translation. Proteomics. 5 (6), 1645-1655 (2005).
  24. Hartmuth, K., Vornlocher, H. P., Luhrmann, R. Tobramycin affinity tag purification of spliceosomes. Methods Molecular Biology. 257, 47-64 (2004).
  25. Beach, D. L., Keene, J. D. Ribotrap : targeted purification of RNA-specific RNPs from cell lysates through immunoaffinity precipitation to identify regulatory proteins and RNAs. Methods Molecular Biology. 419, 69-91 (2008).
  26. Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16 (11), 2277-2290 (2010).
  27. Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Molecular Biology. 714, 387-406 (2011).
  28. Yoon, J. H., Gorospe, M. Identification of mRNA-Interacting Factors by MS2-TRAP (MS2-Tagged RNA Affinity Purification). Methods Molecular Biology. 1421, 15-22 (2016).
  29. Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42 (2), 13 (2014).
  30. Blencowe, B. J., Sproat, B. S., Ryder, U., Barabino, S., Lamond, A. I. Antisense probing of the human U4/U6 snRNP with biotinylated 2'-OMe RNA oligonucleotides. Cell. 59 (3), 531-539 (1989).
  31. Lingner, J., Cech, T. R. Purification of telomerase from Euplotes aediculatus: requirement of a primer 3' overhang. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 10712-10717 (1996).
  32. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Molecular Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  33. Imig, J., et al. miR-CLIP capture of a miRNA targetome uncovers a lincRNA H19-miR-106a interaction. Nature Chemical Biology. 11 (2), 107-114 (2015).
  34. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  35. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  36. Rogell, B., et al. Specific RNP capture with antisense LNA/DNA mixmers. RNA. 23 (8), 1290-1302 (2017).
  37. Matia-Gonzalez, A. M., Iadevaia, V., Gerber, A. P. A versatile tandem RNA isolation procedure to capture in vivo formed mRNA-protein complexes. Methods. , 93-100 (2017).
  38. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), Available from: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi W70-W74 (2008).
  39. Kalendar, R., Khassenov, B., Ramankulov, Y., Samuilova, O., Ivanov, K. I. FastPCR: An in silico tool for fast primer and probe design and advanced sequence analysis. Genomics. 109 (3-4), Available from: http://primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.html 312-319 (2017).
  40. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
  41. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  42. Kedde, M., et al. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3' UTR controls miR-221 and miR-222 accessibility. Nature Cell Biology. 12 (10), 1014-1020 (2010).
  43. Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
  44. Ziegeler, G., et al. Embryonic lethal abnormal vision-like HuR-dependent mRNA stability regulates post-transcriptional expression of cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kip1. Journal of Biological Chemistry. 285 (20), 15408-15419 (2010).
  45. Itri, F., et al. Femtosecond UV-laser pulses to unveil protein-protein interactions in living cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 637-648 (2016).
  46. Zhang, L., Zhang, K., Prandl, R., Schoffl, F. Detecting DNA-binding of proteins in vivo by UV-crosslinking and immunoprecipitation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 322 (3), 705-711 (2004).

Tags

الكيمياء الحيوية، 138 قضية، والجيش الملكي النيبالي-البروتين، وتنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال، بوليادينيلاتيد الجيش الملكي النيبالي، اليغنوكليوتيد ribonucleoprotein المعقدة، والعقاقير، والخميرة، ايليجانس كاينورهابديتيس، والخلايا البشرية
إجراء جنبا إلى جنب على أساس اليغنوكليوتيد عزل الحمض النووي الريبي لاسترداد مجمعات البروتين مرناً حقيقية النواة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iadevaia, V., Matia-González,… More

Iadevaia, V., Matia-González, A. M., Gerber, A. P. An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes. J. Vis. Exp. (138), e58223, doi:10.3791/58223 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter