Summary
نقدم هنا، بروتوكولا تجريبية التي يمكن أن تستخدم لتحديد الانتماءات الملزمة وطريقة التفاعل البروتين ملزمة فسفوليبيد خالية من تسمية annexin A2 مع المعطل تداولها المدعومة من الصلبة بيلاييرس (SLB) عن طريق قياس في وقت واحد الإقبال الجماهيري وخصائص لزج مطاطي من البروتين أنيكسين A2.
Abstract
تقنية ميكروبالانسي المسرف الكوارتز الكريستال نهج بسيطة وخالية من التسمية لقياس خصائص الامتصاص ولزج مطاطي الشامل من كتلة استوعبت معطلة على الأسطح الاستشعار، مما يسمح قياسات للتفاعل في وقت واحد من البروتينات مع السطوح الصلبة المدعومة، مثل بليرس الدهن، في الوقت الحقيقي وحساسية عالية. أنيكسينس هي مجموعة يحافظ على درجة عالية من البروتينات فسفوليبيد الملزمة التي تتفاعل مع هيدجروبس مشحونة سلبا عبر عكسية تنسيق أيونات الكالسيوم. هنا، يمكننا وصف بروتوكول التي استخدمت لتحليل كمي ربط annexin A2 (AnxA2) للدهن مستو بليرس أعد على سطح جهاز استشعار الكوارتز. هذا البروتوكول هو الأمثل للحصول على بيانات قوية واستنساخه، ويتضمن وصفاً مفصلاً خطوة بخطوة. يمكن تطبيق الطريقة أخرى ملزمة غشاء بروتينات والتراكيب بلير.
Introduction
الأغشية الخلوية هياكل حيوية للغاية ومعقدة. تجميع خليط مركب من الدهون غشاء، جنبا إلى جنب مع بروتينات الغشاء المرتبط محيطيا و/أو عضويا، بشكل ميكرودومينس. وتشارك المنظمة الإيقاع المكانية المنسقة لهذه ميكرودومينس الغشاء في العمليات الفسيولوجية الرئيسية1. هي تحرك غشاء ميكرودومين ديناميات التفاعل بين الغشاء الدهون، فضلا عن قدرة بروتينات الغشاء المحيطي للاعتراف وتتفاعل مع الدهون التي أثرت في ميكرودومينس. توظيف البروتينات الدهون محددة غالباً ما يتحقق عن طريق وحدات الاعتراف بالدهن، مثل التماثل بليكسترين (PH) أو2،3مجالات C2. الأساليب التحليلية الفيزيائية الحيوية باستخدام نموذج الأغشية مفتاح لفهم المبادئ الأساسية التي تحكم هذه العمليات على المستوى الجزيئي.
أنيكسينس، مولتيجيني-أسرة كبيرة، معروفة لقدرتها على ربط الدهون غشاء مشحونة سلبا، غالباً فوسفاتيديلسيريني (PS)، في Ca2 +-التحكم في طريقة2. السمة المميزة الثانية للأسرة أنيكسين هو وجود شريحة الهيكلية مصانة، أنيكسين كرر، هو الحالي أربع أو ثماني مرات، والمرافئ Ca2 +-والملزمة فسفوليبيد مواقع4. Ca2 +-يضع تفاعل الدهون تعتمد أننيكسينس في وضع مثالي للشعور وانقل Ca2 +-بوساطة إشارات للأغشية المستهدفة. الدوام، أنيكسينس قادرون على الحث على تشكيل ميكرودومينس أثري في نسبة الكولسترول في الدم، فوسفاتيديلينوسيتول-4، 5-بيسفوسفاتي (PI (4، 5) ف2) و PS، سواء في الأغشية الخلوية و/أو اصطناعية نظم5. ويصف هذا البروتوكول نهج لتحليل التفاعل غشاء أنيكسين استخدام7،،من6"كريستال الكوارتز ميكروبالانسي تبديد" (قكم-د)8.
هو المكون الأساسي في هذا ميكروبالانسي كريستال تتأرجح بمثابة سطح الاستشعار. الامتزاز و/أو ربط الجزيئات على السطح استشعار إنقاص تردد صدى (و) متناسبة مع الزيادة في الكتلة. إذا كان السطح فهي مغلفة بالتساوي مع فيلم، ربط المواد الإضافية قد تتداخل مع السلامة الهيكلية لهذه الطبقة، ويمكن رصد هذه التغيرات في فيسكولاستيسيتي (عنصر تبديد الطاقة د) بالإضافة إلى ذلك. وهذا أسلوب على نطاق واسع لدراسة التفاعل بين البروتينات الدهنية بليرس. في هذا النهج، يتم استيعابها الحويصلات الدهنية إلى سطح الاستشعار المغلفة بشكل مناسب. دهن بلير تشكيل مواتية في المواد القائمة على السليكا9،10، كما حويصلات لا تمزق غالباً على الأسطح الأخرى ماء، مثل الذهب11 تتأكسد بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية-الأوزون، TiO212أو ال 2س313. النشرات تمزق الحويصلات اندماج المرحلة المائية، مما يؤدي إلى تغييرات مميزة في الكتلة وتبديد. توليد بليرس المدعومة من الصلبة (SLB) طريق الانصهار حويصلة بسيطة وقوية، ويمكن استخدامها لتوليد النماذج المعقدة التي تحاكي الأغشية الخلوية.
ميكروبالانسي المسرف الكوارتز الكريستال أسلوب خال من التسمية والحساسة. وميزة رئيسية هي إمكانية معطف أي المواد التي تنشئ طبقة رقيقة بما فيه الكفاية على السطح، مما يوفر مجموعة واسعة من التطبيقات في مجالات البحوث المتنوعة. ولوحظ التفاعل البروتين-الأغشية في الوقت الحقيقي، ويمكن تحليل النتائج مباشرة. يمكن استخدام سطح الاستشعار نفسه في القياسات اللاحقة (بعد إجراء التنظيف الحد الأدنى كما هو مبين في هذا البروتوكول)، مما يسمح لضوابط داخلية دقيقة وقابليتها لمقارنة بين تحليلها.
Protocol
ملاحظة: يجب تصفية المخازن المؤقتة باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر ويطرد من فراغ ح 1.
1-الدهن حويصلة إعداد
- استخدام أنابيب زجاجية 2 مل. حل كل الدهن، 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (دوبك)، 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (بوبك)، 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (الملوثات العضوية الثابتة)، ونسبة الكولسترول في الدم (شول)، في خليط كلوروفورم/ الميثانول (50: 50 v/v) لإعداد حل دهن واضحة 5 ملم. حل 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI (4، 5) ف2) في خليط من كلوروفورم/الميثانول/المياه (20:9:1 v/v).
- تجمع الدهون المذابة في نسبة المولى المطلوب بوبك/الملوثات العضوية الثابتة (80/20)، ف بوبك/PI (4، 5)2 (95/5)، بوبك/الملوثات العضوية الثابتة/تشول (60/20/20)، بوبك/الملوثات العضوية الثابتة/PI (4، 5) ف2/Chol (60/17/3/20)، وف بوبك/دوبك/الملوثات العضوية الثابتة/PI (4، 5)2(/Chol (37/20/20/3/20) الجدول 1) في أنابيب زجاجية 10 مل.
ملاحظة: هو المبلغ النهائي للدهن مجموع 500 ميكروغرام. - تتبخر المذيبات العضوية باستخدام دفق جافة من النيتروجين. يترك خليط الدهن على نظام تفريغ العالي (ليوفيليزيشن) ح 3 لإزالة أي آثار متبقية من المذيبات.
ملاحظة: هذه النتائج في فيلم واضحة جافة. - ريسوسبيند الفيلم الدهن في 1 مل من سترات المخزن المؤقت (10 ملم صوديوم-سترات، 150 مم كلوريد الصوديوم، الأس الهيدروجيني 4.6). احتضان تعليق المادة الدهنية في 60 درجة مئوية (درجة حرارة هذا حوالي 10 درجات مئوية فوق درجة حرارة التحول مرحلة دهن ذوبان أعلى في الخليط) لمدة 30 دقيقة في حوض ماء، ودوامه أنها همة كل 5 دقائق.
ملاحظة: هذه النتائج في تشكيل حويصلات كبيرة، مولتيلاميلار (ملفس). ستبقى على تعليق أعلاه درجة حرارة التحول. - يسخن الطارد (عند 60 درجة مئوية وفي هذه الحالة) مزودة بغشاء البولي حجم المسام قطرها 50 نانومتر فوق درجة حرارة التحول (وهو 40-50 درجة مئوية هنا) لمدة 30 دقيقة.
- تحميل ملف التعليق في الطارد مسخن ويمر بلطف x 31 المخلوط عبر غشاء البولي شكل أونيلاميلار صغير الحويصلات (سيارات الدفع الرباعي)14. الحفاظ على درجة حرارة فوق درجة حرارة التحول.
- نقل تعليق سيارات الدفع الرباعي لسفينة رد فعل بلاستيك 2 مل وإضافة سترات المخزن المؤقت (راجع الخطوة 1، 4) لجعل وحدة التخزين النهائي 2 مل.
ملاحظة: هذا سيؤدي إلى تركيز دهن نهائي من 250 ميكروغرام/مل.
2-التعامل مع أجهزة الاستشعار الكوارتز
ملاحظة: دائماً معالجة أجهزة الاستشعار الكوارتز مع الملاقط.
- احتضان أربعة أجهزة استشعار بإدراجها في حامل تترافلوروايثيلين في حل الحزب الديمقراطي الصربي 2% ليغسل ≥ 30 دقيقة على نطاق واسع مع المياه النقية فائقة تماما إزالة الحزب الديمقراطي الصربي والسماح لهم الجافة باستخدام تيار من النيتروجين أو الأرجون الجافة.
- استخدام نظام البلازما التنظيف لإزالة أي ملوثات. إدراج أجهزة الاستشعار الجافة في قاعة تنظيف البلازما وإخلاء قاعة، وطرد x 3 مع الأكسجين. تشغيل الأنظف في البلازما. استخدام معلمات العملية التالية: 1 × 10-4 ميلليمتر زئبق ضغط وطاقة عالية تردد الراديو (RF)، و 10 دقيقة من وقت العملية. إيقاف تشغيل الجهاز وإخراج أجهزة الاستشعار.
3-ميكروبالانسي عملية
ملاحظة: نظام ميكروبالانسي مع أربع دوائر تدفق التحكم في درجة الحرارة في تكوين موازية، متصلاً بمضخة تمعجية وتعيين إلى معدل تدفق ميليلتر 80/دقيقة، تم استخدامه. في وضع تدفق مفتوحة، المخزن المؤقت تم ضخها من الخزان تغذية في الدبابة المستقبلة. في وضع حلقة، ترتبط الدبابة المستقبلة بخزان تغذية لتوليد حلقة مغلقة. وكان تعيين درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية.
- عناية إرساء أجهزة الاستشعار تنظيف البلازما في الدوائر، وتدفق 4 استخدام الملقط. تجنب ممارسة أي ضغط على أو التواء للدوائر والأنابيب التي قد تتسبب في تسرب.
- مسح النظام مع سترات المخزن المؤقت (10 ملم صوديوم-سترات، كلوريد الصوديوم، الأس الهيدروجيني 4.6 150 مم) في وضع تدفق مفتوحة لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: يتطلب هذا الضبط 3.2 مل من المخزن المؤقت، ولكن ينصح باستخدام فائض في المخزن المؤقت (10 مل). - بدء تشغيل البرنامج. بدء تسجيل أي تغيرات في تواتر وتبديد للهجة الأساسية الأولى (n = 1) والمدلول (n = 3-13) استخدام البرمجيات، وحتى خطوط الأساس التردد وتبديد مستقرة (وهذا سوف يستغرق حوالي 40-60 دقيقة).
ملاحظة: يجب أن تكون مستويات الضوضاء تردد (ذروة إلى ذروة) أقل من 0.5 هرتز، التبديد، أقل من 0.1·10-6، مع انجراف قصوى (في محلول مائي) من 1 هرتز/ح في التردد و 0.3·10/h-6في تبديد. - عند خطوط الأساس مستقرة، تطبيق تعليق سيارات الدفع الرباعي في سترات المخزن المؤقت (2 مل في أنبوب صغير). باستخدام سفينة رد فعل، إزالة 1.5 مل حجم القتلى. ثم قم بإغلاق النظام في وضع حلقة التدفق. سجل تحول التردد/تبديد لمدة 10 دقائق أخرى.
ملاحظة: سيتم خلال هذا الوقت، الحويصلات تنتشر على سطح SiO2 والصمامات بتشكيل15،بلير مستمر16 (الخطوة 2 في الأرقام 1و الشكل 2و الشكل 3). الامتزاز سيارات الدفع الرباعي على السطح للاستشعار اثنين طورية وتردد نموذجي الحد الأدنى والحد الأقصى في التبديد. خط تردد/تبديد جديدة مستقرة مع تحول تردد مميزة (اعتماداً على تكوين الدهن) من 26-29 هرتز (انظر الجدول 1) يشير إلى من بلير مستمر على السطح. - عندما يكون SLB مستقرة (راجع الخطوة 3، 4)، توازن النظام مع المخزن المؤقت قيد التشغيل (10 ملم حبيس، 150 مم كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 7.4) تركيزات المطلوب Ca2 + (تتراوح من 50 ميكرومتر يصل إلى 1 مم كاكل2، اعتماداً على التجربة) في وضع تدفق مفتوحة ل 40 دقيقة.
- إضافة البروتين (هنا، AnxA2) إلى التشغيل المخزن المؤقت Ca التي تحتوي على2 + (راجع الخطوة 3، 5). أداء تطبيق البروتين في وضع حلقة تدفق حتى يتم التوصل إلى إقامة دولة ثابت توازن (الخطوة 3 في الشكل 1و الشكل 2و الشكل 3).
ملاحظة: أن تركيز البروتين قد تتراوح من 1 إلى 400 نانومتر. النتائج البروتين الامتزاز في تحول تردد تعتمد على تركيز مما يعكس الامتزاز الجماهيري (بروتين). - فصل البروتين ملزمة خالب Ca2 + الأيونات مع 5 مم عطا في المخزن المؤقت قيد التشغيل في وضع تدفق مفتوحة (الخطوة 4 في الأرقام 1 و الشكل 2).
ملاحظة: يشير انتعاش من التردد وتبديد لخط الأساس SLB عكس مجموع البروتين ملزمة. يمكن أن تتكرر دورات تفكك رابطة لمقارنة تركيزات مختلفة أو البروتينات.
4-ميكروبالانسي التنظيف
ملاحظة: تنفيذ إجراء تنظيف الحد أدنى بعد كل قياس.
- تجديد نظام ميكروبالانسي مع 50 مل ddH2س في وضع تدفق مفتوحة باستمرار وإزالة الأنابيب من وعاء الماء، والسماح للنظام بتشغيل الجاف.
- إزالة جهاز استشعار كريستال بعناية وتنظيفه بحل الحزب الديمقراطي الصربي 2% باستخدام حامل تترافلوروايثيلين (راجع الخطوة 2، 1).
- الجاف للأجزاء المرئية الداخلية وحدة تدفق حيث تم وضع أجهزة الاستشعار.
ملاحظة: تنفيذ مكثف التنظيف الداخلي بعد سلسلة من القياسات 10. - تنظيف النظام بحل الحزب الديمقراطي الصربي 2% (50 مل) عند 40 درجة مئوية (الإعداد في البرنامج) في وضع استمرار تدفق مفتوحة (الأنبوب)، واستخدام معدل تدفق من 20 ميكروليتر/دقيقة لاتصالات موسعة مع مواد التنظيف.
- تنظيف مع 250 مل من ddH2س في وضع تدفق مفتوحة باستمرار بمعدل تدفق ميليلتر 160/دقيقة.
ملاحظة: بعد 4 أشهر، القيام بإجراء تنظيف واسعة وفقا للدليل الخاص بالشركة المصنعة.
Representative Results
النقصان في تواتر رنانة (Δf) يرتبط بطريقة خطية مع كتلة الممتزة (Δm)، حسب تعريف المعادلة ساوربري. 17
هنا، و هو تواتر رنانة، جو هو ثابت الذي يعتمد على الخصائص الهندسية والفيزيائية الكوارتز معين وتواتر رنانة، وهو مساحة استشعار.
في معظم تطبيقات الطبقة الممتزة ليست جامدة تماما لكن لزج مطاطي. الملطف الناتجة عن التذبذب استشعار الكوارتز يشار إلى تبديد (د). فيما يلي تعريف تبديد رصد التغييرات (ΔD) ترتبط بخصائص لزج مطاطي الشامل منضم18 وهي8.
هنا، هتبدد الطاقة فقدت خلال فترة التذبذب واحدة، والإلكترونيةالمخزنة هي الطاقة الإجمالية لاستشعار تتأرجح بحرية.
لتحليل وتحديد المعلمات ملزم، يتم اشتقاق إيسوثيرمس التردد برسم التحولات التردد توازن (ΔΔfه) ضد تركيزات البروتين. يعرف ΔΔfه
هنا، Δft1 يمثل البداية للبروتين الامتزاز و Δft2 حالة التوازن. يمكن تنفيذ ملائمة منحنى غير الخطية باستخدام عملية توسيع هيل في معادلة لانغموير كما يلي6،8.
هنا، هو ΔΔfماكس ΔΔfه من تركيز البروتين الناتج في ربط الحد الأقصى (تشبع) كد ثابت التفكك الواضح للبروتين/الغشاء المعقدة و n هو معامل هيل.
معامل هيل (ن) يصف كوبيراتيفيتي للربط. لقيم n = 1، نموذج الامتزاز هيل هو الايسوثرم لانغموير بسيطة (مواقع الربط متساوية وجميع الجزيئات ربط مستقلة عن بعضها البعض لبلير في الدهون). إذا تغير ≠ ن 1، يجند منضم غشاء ملزمة تقارب لغيرها يغاندس، أما زيادة (n > 1، كوبيراتيفيتي الإيجابية) أو تقليل (n < 1، كوبيراتيفيتي السلبية) التقارب.
ويبين الشكل 1 تخطيطي لسير العمل التجريبية المستخدمة في المختبر لقياس التغيرات في الرنين والتردد خلال Ca2 +-ملزمة تعتمد والإفراج عن AnxA2 لبلير الدهن في الطور السائل. ويرد على تسجيل نموذجية في الشكل 2. الشكل 2 يظهر تسجيل منحنى التردد ويبين الشكل 2ب التحولات الفقد. انخفاض بارز في التردد عند إضافة الدهنية (الشكل 2ألف [الخطوة 1]) يدل على الامتزاز. لأن الحويصلات تعبئة المخزن المؤقت ليست جامدة، ولكن يزيد لزج مطاطي، التبديد (الشكل 2ب [الخطوة 1]). وفي وقت لاحق، تمزق الحويصلات اندماج. إطلاق سراح ما يصاحب ذلك من المخزن المؤقت داخل الحويصلات إنقاص كتلة الممتزة حتى يتم التوصل إلى هضبة مستقرة (الشكل 2ألف [الخطوة 2]). من المذكرة، يؤدي إضافة حويصلات تحولاً تبديد عالية، بينما التحول في الاستجابة إلى بلير أصغر بكثير نظراً لطبيعة متجانسة جامدة SLB (الشكل 2ب [الخطوة 2]). الخطوة 3 في الشكل 2 ألف و 2 باء من سجلات ربط AnxA2 الدهون، مما يضيف الجماهيري، كما يراها التحول تردد واضح، ولكن لا تتداخل مع هيكل بلير، كما هو مبين بتغيير طفيف فقط في تبديد. عندما تتم إزالة Ca2 + وكيل شيلاتينغ عطا (الشكل 1 و الشكل 2 [الخطوة 4])، AnxA2 تنأى عن الفيلم الدهن. التردد، فضلا عن تبديد التسجيلات، التحول إلى مستويات ينظر مع بلير فقط (مقارنة الخطوتين 2 و 4 في الشكل 2 ألف و 2 باء)، مشيراً إلى أن ربط AnxA2 تعتمد اعتماداً كلياً على Ca2 + وأن الفيلم الدهن لا تزال سليمة.
AnxA2، كما يفعل أكثر من أنيكسينس، يعتمد على الدهون مشحونة سلبا مثل س. وهذا هو يرى بوضوح عندما تغيب الملوثات العضوية الثابتة في بيلايير المادة الدهنية (الشكل 3). الشكل 3 يظهر تسجيل منحنى التردد، ويبين الشكل 3ب التحولات تبديد. علما بأن وتيرة التحولات إلى خط أساس مستقر في هرتز-25، ولكن ليس التبديد غيرت الإرشادية (الشكل 3ب [الخطوة 2])، لتشكيل بلير السليم. ومع ذلك، هي تلاحظ أي تغييرات في التردد (الشكل 3أ) أو تبديد (الشكل 3ب) بعد إضافة AnxA2 حضور Ca2 + (الشكل 3 ألف و 3 باء [الخطوة 3]) أو عطا (الشكل 3A و 3 باء [الخطوة 4])، كما AnxA2 لا يمكن التفاعل مع الفيلم الدهن.
الشكل 1 : نموذج رسومي لسير العمل التجريبي- يقوم سير العمل هذا يوضح امتصاص حويصلة على سطح ماء الاستشعار (الخطوة 1)، حويصلة الانصهار/تمزق مما أدى إلى تشكيل SLB (الخطوة 2)، وفي كاليفورنيا2 +-الامتزاز يعتمد (الخطوة 3) وتعتمد على عطا الامتزاز من AnxA2 (الخطوة 4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تسجيل المثالية. إظهار هذه الألواح (أ) رصد تردد صدى يغلب 7th تعتمد على الوقت وتحولات (ب) التبديد من أجهزة الاستشعار الكوارتز أثناء القياس. تطبيق الدهنية يسبب انخفاضا سريعاً في الأساس التردد، بينما يزيد الأساس تبديد (الخطوة 1). تثبيت خطوط الأساس يشير إلى تشكيل بيلايير (الخطوة 2). AnxA2 (200 nM) الامتزاز (حضور Ca2 +) على بلير الدهون المحتوية على ملوثات عضوية ثابتة ويضيف الجماهيري دون تغيير إلى حد كبير التبديد، مشيراً إلى أن الفيلم الدهن لا تشعر بالقلق (الخطوة 3). استعادة خط الأساس التردد على Ca2 + الخلبية مع عطا يشير إلى الامتزاز مجموع البروتين (الخطوة 4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تجربة مراقبة سلبية، مما يدل على أن AnxA2 لا يلزم لبيان في حالة عدم وجود الملوثات العضوية الثابتة- وتظهر هذه اللوحات إضافة الدهنية وتشكيل SLB (الخطوات 1 و 2). أية تغييرات في التردد (أ) أو (ب) تبديد تتضح بعد إضافة AnxA2 (الخطوة 3; 200 نانومتر، حضور Ca2 +) أو عطا (الخطوة 4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| تكوين | ΔΔF/هرتز بعد تشكيل بيان | ΔΔD * 10-6 بعد تشكيل SLB |
| بوبك/الملوثات العضوية الثابتة (80:20) |
26.3 ± 0.2 | 0.26 ± 0.03 |
| بوبك/PI (4، 5) ف2 (95:5) |
26.5 ± 0.5 | 0.31 ± 0.02 |
| بوبك/الملوثات العضوية الثابتة/تشول (60:20:20) |
29.2 ± 0.2 | 0.45 ± 0.09 |
| بوبك/الملوثات العضوية الثابتة/بي/Chol2ف (4,5) (60:17:03: 20) |
29.6 ± 0.6 | 0.43 ± 0.10 |
| بوبك/دوبك/الملوثات العضوية الثابتة/بي/Chol2ف (4,5) (37:20:20: 03:20) |
29.4 ± 0.4 | 0.39 ± 0.14 |
الجدول 1: بيانات تكوين وتشكيل الدهون من SLB 7 .
Discussion
للإجابة على الأسئلة المتعلقة بعلاقة بنية-وظيفة الأغشية الخلوية بطريقة كمية ونوعية، خلية علم الأحياء أرباح هائلة من استخدام النهج الفيزيائية الأحيائية على أساس راسخ والتقنيات المستخدمة على نطاق واسع ، بما في ذلك الذري القوة مجهرية (فؤاد)، صدى السطحية مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة)، وتستخدم تقنية قكم-د هنا. أظهرنا في الدراسات السابقة التي تربط البروتينات أنيكسين في كاليفورنيا2 +-طريقة تعتمد على الغشاء المعطل تداولها مع تقارب عالية. ونحن نستخدم التردد وتبديد التحولات من يغلب السابع (Δf7) لأن هذا يمثل أفضل حل وسط للكشف عن حساسية والتذبذب الاستقرار.
ويسمح هذا الأسلوب أيضا وصفاً كمياً لتفاعل بروتين غشائي. AnxA2 ملزم للغشاء يتسم بالإيجابية كوبيراتيفيتي الذي هو توسط المجال الأساسية annexin المصانة ويعتمد على وجود نسبة الكولسترول في الدم. بالتفصيل في مكان آخر البيانات الكمية التي تم الحصول عليها لترد AnxA2 و AnxA8 في6،8.
هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. استخدام الدهنية الفور؛ خلاف ذلك، قد تلتحم حويصلات صغيرة في حويصلات أكبر مع التوتر السطحي أقل، مما يؤدي إلى تثبيط تشكيل بلير الدهن. الحفاظ على درجة حرارة ثابتة خلال القياسات. نتائج كل انحراف صغير في درجة الحرارة في تحول التردد وتبديد لا يكاد يذكر. تجنب فقاعات الهواء؛ وبخلاف ذلك، النظام غير مستقر، ولن تقيم خط أساس.
المعادلة ساوربري يسمح التحويل المباشر لتكرار الملاحظة يتغير إلى التغيرات في الكتلة، وهو، لذلك، تستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك، يحمل افتراض ارتباط خطي بين التغير في تردد صدى والشامل وأضاف فقط صحيح بالنسبة للعناصر التي تشكل فيلم جامدة وموحدة على سطح جهاز الاستشعار. لا يمكن استخدامه للزج مطاطي الممتزات مثل الأفلام البروتين الغنية بالمياه، والطبقات الدهنية بالماء، وأدرجت معادلة ساوربري أو حتى تمتز الخلايا. هنا، أكثر تعقيداً من النماذج الرياضية المطلوبة. ولذلك، أنها بالغة الأهمية لرصد التغييرات في نفس الوقت في التردد وتبديد. للكشف عن التغيرات الهيكلية أثناء أخذ القياس، يمكن رسم ΔD مقابل نسب Δf، مع خط مستقيم مما يشير إلى لا تغييرات كونفورماشونال.
وميزة رئيسية لهذا الأسلوب هي إمكانية استخدام مجموعة واسعة جداً من المواد بمثابة ركائز. وعلاوة على ذلك، أنها طريقة موثوق بها ومباشرة لدراسة طائفة واسعة من التفاعلات بين الجزيئات، كتشكيل مناسب للأفلام طلاء السطح (مثل SLB)، فضلا عن زيادة تفاعلات البروتينات الدهنية، يمكن رصدها على الإنترنت.
هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على غيرها من البروتينات الغشاء التفاعل، على سبيل المثال، شريط المجال البروتينات19، (ezrin وراديكسين وموسين) ERM الأسرة البروتين له دور هام في غشاء سيتوسكيليتون الربط20،21 ،22، أو البروتينات التي تحتوي على نطاقات C2 أو الأس الهيدروجيني. وعلاوة على ذلك، مجموعة واسعة من التطبيقات لهذه التقنية لدراسة المواد البيولوجية قد تم بنجاح نشر، وبالتالي إنشاء قكم كمنصة تجريبية مناسبة تماما دراسة التفاعلات التجميعات الجزيئات أكثر تعقيداً أو حتى الخلايا،من2324.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل الأوقيانوغرافية Deutsche تحت منح SFB 858/B04 و EXC 1003 SFB 1348/A04 SFB 1348/A11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
| Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
| HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
| Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
| PiP2 | Avanti | 850155P | |
| POPC | Avanti | 850457P | |
| POPS | Avanti | 840034P | |
| Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
| SDS | Roth | 183 | |
| Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
| Equipment | |||
| Extruder Liposofast | Avestin | ||
| Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
| QSense Dfind | Qsense | ||
| Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
| QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
| PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
| OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |
References
- Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-41 (2000).
- Gerke, V., Creutz, C. E., Moss, S. E. Annexins: linking Ca2+ signalling to membrane dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 449-461 (2005).
- Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends in Biochemical Science. 37, 526-533 (2012).
- Rescher, U., Ruhe, D., Ludwig, C., Zobiack, N., Gerke, V. Annexin 2 is a phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate binding protein recruited to actin assembly sites at cellular membranes. Journal of Cell Science. 117, 3473-3480 (2004).
- Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: from structure to function. Physiological Reviews. 82, 331-371 (2002).
- Heitzig, N., et al. Cooperative binding promotes demand-driven recruitment of AnxA8 to cholesterol-containing membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (4), 349-358 (2018).
- Drücker, P., Grill, D., Gerke, V., Galla, H. J. Formation and characterization of supported lipid bilayers containing phosphatidylinositol-4,5-biphosphate and cholesterol as functional surfaces. Langmuir. 30, 14877-14886 (2014).
- McConnell, H. M., Watts, T. H., Weis, M. R., Brian, A. A. Supported planar membranes in studies of cell-cell recognition in the immune system. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Biomembranes. 864, 95-106 (1986).
- Anderson, T. H., et al. Formation of supported bilayers on silica substrates. Langmuir. 25, 6997-7005 (2009).
- Pfeiffer, L., Petronis, S., Koper, I., Kasemo, B., Zach, M. Vesicle adsorption and phospholipid bilayer formation on topographically and chemically nanostructured surfaces. Journal of Physical Chemistry B. 114, 4623-4631 (2010).
- Cho, N. J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: a comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
- Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. J. Self-Assembly formation of lipid bilayer coatings on bare aluminium oxide: overcoming the force of interfacial water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
- Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
- Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of lipid vesicle deposition on solid surfaces: a combined QCM-D and AFM study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
- Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
- Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik A Hadrons and Nuclei. 155 (2), 206-222 (1959).
- Rodahl, M., Höök, F., Krozer, A., Brzezinski, P., Kasemo, B. Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q-factor measurements in gaseous and liquid environments. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3924-3930 (1995).
- Drücker, P., Pejic, M., Grill, D., Galla, H. J., Gerke, V. Cooperative binding of annexin A2 to cholesterol-and phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate-containing bilayers. Biophysical Journal. 107 (9), 2070-2081 (2014).
- Galic, M., et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 276-287 (2010).
- Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
- Bianco, M., et al. Quartz crystal microbalance as cell-based biosensor to detect and study cytoskeletal alterations and dynamics. Biotechnology Journal. , 1700699 (2018).
- Chen, J. Y., Penn, L. S., Xi, J. Quartz crystal microbalance: Sensing cell-substrate adhesion and beyond. Biosensors and Bioelectronics. 99, 593-602 (2018).
- Bragazzi, N. L., et al. Quartz-Crystal Microbalance (QCM) for Public Health: An Overview of Its Applications. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. Donev, R., et al. 101, Academic Press. 149-211 (2015).
