Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

Published: November 1, 2018 doi: 10.3791/58224
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett experimentellt protokoll som kan användas för att fastställa bindande samhörighet och läge av växelverkan av etikett-fri fosfolipid-bindande proteinet annexin A2 med immobiliserade solid-stödda lipidmonolager (SLB) genom att samtidigt mäta den massa upptag och de viskoelastiska egenskaperna av proteinet annexin A2.

Abstract

Dissipativa quartz crystal microbalance tekniken är en etikett-gratis och enkel metod att mäta samtidigt massa upptag och viskoelastiska egenskaperna för absorberas/orörlig massan på sensorn ytor, vilket gör att mätningar av samspelet av proteiner med solid-stödda ytor, såsom lipid lipidmonolager, i realtid och med en hög känslighet. Annexins är en mycket grupp av fosfolipid-bindande proteiner som interagerar reversibelt med den negativt laddade headgroups via samordning av kalciumjoner. Här beskriver vi ett protokoll som var anställd för att kvantitativt analysera bindningen av annexin A2 (AnxA2) till planar lipid lipidmonolager beredd på ytan av en kvarts sensor. Detta protokoll är optimerad för att erhålla tillförlitliga och reproducerbara data och innehåller en detaljerad steg för steg beskrivning. Metoden kan tillämpas på andra membran-bindande proteiner och lipidens kompositioner.

Introduction

Cellulära membran är mycket dynamiska och komplexa strukturer. En sammansatt blandning av membran lipider, tillsammans med perifert eller intimt associerade membranproteiner, montera till formuläret microdomains. Samordnad tempo-rumsliga organisationen av dessa membran microdomains är involverad i viktiga fysiologiska processer1. Membran microdomain dynamics drivs av samspelet mellan membran lipider samt möjligheten för perifera membranproteiner att erkänna och interagera med lipider berikad i microdomains. Rekrytering av proteinerna till de specifika lipider är ofta uppnås via lipid-erkännande moduler, såsom den pleckstrin homologi (PH) eller C2 domäner2,3. Biofysiska analysmetoder använder modell membran är nyckeln till att förstå grundläggande principer för dessa processer på molekylär nivå.

Annexins, en stor multigene-familj, är välkänd för sin förmåga att binda till negativt laddade membran lipider, huvudsakligen Fosfatidylserin (PS) i en Ca2 +-kontrollerade sätt2. Andra kännetecknande för familjen annexin är förekomsten av ett bevarat strukturella segment, den annexin upprepa, d.v.s. nuvarande fyra eller åtta gånger och hamnar den Ca2 +- och fosfolipid-bindande platser4. Den Ca2 +-beroende lipid växelverkan förlägger annexins i ett perfekt läge att känna och förmedla Ca2 +-medierad signalering till målet membran. Annexins är konsekvent, kunna inducera bildandet av microdomains berikad i kolesterol, fosfatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI (4,5) P2) och PS, både i cellulära eller konstgjorda membranet system5. Det här protokollet beskriver en metod för att analysera annexin-membran samspelet använder en Quartz Crystal Microbalance försvinnande (QCM-D)6,7,8.

Den grundläggande komponenten i denna microbalance är en oscillerande kristall som fungerar som sensorn ytan. Den adsorption eller bindning av molekyler till sensorn ytan minskar resonansfrekvens (f) proportionellt till ökningen av massan. Om ytan är jämnt belagd med en film, bindningen av ytterligare ämnen kan störa den strukturella integriteten av detta skikt, och sådana förändringar i viskoelasticitet (energi skingrande faktor D) Dessutom kan övervakas. Detta är en utbredd teknik att studera interaktionen mellan proteiner och lipider lipidmonolager. I denna strategi absorberas lipid blåsor på lämpligt belagda sensorn ytan. Lipid lipidens bildandet är gynnsamt på kisel-baserade material9,10, som blåsor ofta inte brista på andra hydrofila ytor, såsom guld11 oxideras efter UV-ozon exponering, TiO212eller Al 2O313. Bristning av de skapar blåsor släpper vattenfasen, leder till karakteristiska förändringar i massa och försvinnande. Generering av solid-stödda lipidmonolager (SLB) av vesikler fusion är enkla och robusta och kan användas för att skapa komplexa modeller som efterliknar cellulära membran.

Dissipativa quartz crystal microbalance är en etikett-fri och känslig teknik. En stor fördel är möjligheten att belägga material som genererar en tillräckligt tunn hinna på ytan, vilket ger ett brett användningsområde inom olika forskningsområden. Protein-membran interaktion har observerats i realtid, och resultaten kan analyseras direkt. Samma sensor yta kan användas i efterföljande mätningar (efter att ha utfört en minimal rengöring som beskrivs i detta protokoll), vilket möjliggör korrekt interna kontroller och en jämförbarhet mellan analyter.

Protocol

Obs: Buffertar bör filtreras med ett 0,22 µm filter och avgasas genom ett vakuum för 1 h.

1. lipid vesikler förberedelse

  1. Använd 2 mL glasrör. Lös upp varje lipid, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (pop) och kolesterol (Chol), i en blandning av kloroform / metanol (50: 50 v/v) att förbereda en tydlig 5 mM lipid lösning. Lös 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI (4,5) P2) i en blandning av kloroform/metanol/vatten (20:9:1 v/v).
  2. Kombinera de upplösta lipider i önskad molar förhållandet av POPC/dyker (80/20), POPC/PI (4,5) P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol (60/17/3/20) och POPC/DOPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol (37/20/20/3/20) () Tabell 1) i 10 mL glasrör.
    Obs: Det slutliga beloppet för totala lipid är 500 µg.
  3. Indunsta de organiska lösningsmedel som använder ett torrt flöde av kvävgas. Lämna lipid blandningen på en hög vakuum (frystorka den) system för 3 h att ta bort eventuella rester av lösningsmedel.
    Obs: Detta resulterar i en torr klar film.
  4. Återsuspendera lipid filmen i 1 mL citratbuffert (10 mM-Trinatriumcitrat, 150 mM NaCl, pH 4.6). Inkubera lipid suspensionen vid 60 ° C (denna temperatur är cirka 10 ° C över den fas övergången av den högsta smältande lipid i blandningen) i 30 min i ett vattenbad och vortex det kraftigt var 5: e minut.
    Obs: Detta resulterar i bildandet av stora, multilamellar blåsor (MLVs). Förvara suspensionen ovan övergångstemperaturen.
  5. Förvärma extrudern (vid 60 ° C i detta fall) utrustad med ett 50-nm diameter porstorlek polykarbonat membran ovan övergångstemperaturen (som är 40-50 ° C här) för 30 min.
  6. Läsa in MLV suspensionen i förvärmd extruder och försiktigt passera blandningen 31 x genom polykarbonat membranet att bilda små unilamellar blåsor (stadsjeepar)14. Hålla temperaturen ovan övergångstemperaturen.
  7. Överför SUV till en 2 mL plast reaktionskärlet och lägga till citratbuffert (se steg 1.4) att föra slutvolymen 2 mL.
    Obs: Detta kommer att ge en sista lipid koncentration av 250 µg/mL.

2. hantering av kvarts sensorerna

Obs: Hantera alltid kvarts sensorerna med en pincett.

  1. Inkubera fyra sensorer införas i en polytetrafluoreten innehavaren i en 2% SDS lösning för ≥ 30 min. tvätta dem i stor utsträckning med ultrarent vatten för att helt ta bort SDS och låt dem torka använda en ström av torr argon eller kväve.
  2. Använda ett plasma-rengöring för att helt ta bort eventuella föroreningar. Infoga torr sensorerna i plasma-rengöring kammaren, evakuera kammaren och spola 3 x med syre. Aktivera plasma renare på. Använd följande processparametrar: 1 x 10-4 Torr tryck, hög radiofrekvens (RF) makt och 10 min av bearbetningstid. Stäng av maskinen och ta ut sensorerna.

3. microbalance drift

Obs: En microbalance system med fyra temperaturreglerade flöde kammare i en parallell konfiguration, ansluten till en Peristaltisk pump och inställningen till ett flöde på 80 µL/min, användes. I det öppna flödet läget pumpades bufferten från mataren reservoaren i mottagande tanken. I loop läge förbands mottagande tanken med feeder reservoaren att generera en sluten slinga. Temperaturen var satt till 20 ° C.

  1. Noggrant docka plasma-rengöras sensorerna i de 4 flöde kammarna, använda pincett. Undvika trycket på eller vridning av kamrarna och rören som kan orsaka läckage.
  2. Spola systemet med citratbuffert (10 mM-Trinatriumcitrat, 150 mM NaCl, pH 4,6) i det öppna-flödet läget i 10 min.
    Detta kräver exakt 3,2 mL buffert, men det är tillrådligt att använda ett överskott av buffert (10 mL).
  3. Starta programmet. Starta inspelningen några förändringar i frekvens och försvinnande av den första grundläggande tonen (n = 1) och övertoner (n = 3-13) via programvaran tills frekvensen och försvinnande baslinjer är stabila (detta tar ca 40-60 min).
    Obs: Frekvens bullernivåer (topp-till-topp) bör vara lägre än 0,5 Hz och, för försvinnande, lägre än 0.1·10-6, med en maximal drift (i vattenlösning) 1 Hz/h i frekvens och 0.3·10-6h i försvinnande.
  4. När baslinjer är stabila, applicera SUV suspensionen i citratbuffert (2 mL i ett litet rör). Loss med ett reaktionskärl 1,5 mL döda volymen. Stäng sedan systemet i loop-flödet läge. Spela in frekvens/försvinnande skiftet i ytterligare 10 minuter.
    Obs: Under denna tid kommer blåsor breds på SiO2 ytan och säkring för att bilda en kontinuerlig lipidens15,16 (steg 2 i figur 1, figur 2och figur 3). Stadsjeepar adsorption på ytan av sensorn är två-phasic och har en typisk frekvens lägsta och högsta i försvinnande. En stabil ny frekvens/försvinnande baslinje med en karakteristisk frekvens Skift (beroende på lipid sammansättningen) från 26-29 Hz anger (se tabell 1) en kontinuerlig lipidens på ytan.
  5. När SLB är stabil (se steg 3,4), temperera systemet med rinnande bufferten (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) vid de krävs Ca2 + koncentrationerna (alltifrån 50 µM upp till 1 mM CaCl2, beroende på experimentet) i en öppen flödet läge för 40 min.
  6. Lägg till proteinet (här, AnxA2) till driften buffert innehållande Ca2 + (se steg 3.5). Utför programmet av protein i en loop-flödet läge tills en jämvikt steady state uppnås (steg 3 i figur 1, figur 2och figur 3).
    Obs: Det protein koncentrationen kan variera från 1 till 400 nM. Protein adsorption resulterar i en koncentrationsberoende frekvens Skift återspeglar massa (protein) adsorption.
  7. Separera proteinet bundna av kelaterande Ca2 + joner med 5 mM EGTA i rinnande bufferten i öppna flödet läge (steg 4 i figur 1 och figur 2).
    Obs: En återhämtning av frekvens och försvinnande i SLB originalplanen indikerar en total reversibilitet av proteinbindning. Föreningen-dissociation cykler kan upprepas för att jämföra olika koncentrationer eller proteiner.

4. microbalance rengöring

Obs: Utför en minimal rengöring efter varje mätning.

  1. Regenerera microbalance systemet med 50 mL av ddH2O i en kontinuerlig öppen flödet läge, ta bort rören från vattenbehållaren och låt systemet köras torr.
  2. Ta försiktigt bort crystal sensorn och rengör den med 2% SDS lösningen med polytetrafluoreten innehavaren (se steg 2.1).
  3. Torka de synliga delarna av flöde modul inre där sensorn placerades.
    Obs: Utföra en intensiv rengöring efter en serie av 10 mätningar.
  4. Rengöra systemet med en 2% SDS lösning (50 mL) vid 40 ° C (setup i programvaran) i en kontinuerlig öppen flödet (tub) läge, med en flödeshastighet av 20 µL/min för utökad kontakt med rengöringsmedel.
  5. Ren med 250 mL ddH2O i kontinuerlig öppen flödet läge med en flödeshastighet av 160 µL/min.
    Obs: Efter 4 månader, genomföra en omfattande rengöring förfarandet enligt tillverkarens manual.

Representative Results

Minskningen i den resonant frekvensen (Δf) korrelerar linjärt med adsorberade massan (Δm), som definieras av Sauerbrey ekvation. 17

Equation 1

Här, f är resonansfrekvens, Cf är en konstant som beror på de geometriska och fysiska egenskaperna hos given kvartar och resonansfrekvensen och A är sensorytan.

I de flesta program är det adsorberade skiktet inte helt stela men viskoelastiska. Den resulterande dämpning av kvarts sensor svängningen benämns som försvinnande (D). Den övervakade skingrande ändringar (ΔD) korrelerar med de viskoelastiska egenskaperna av bundna massa18 och är definierade enligt följande8.

Equation 2

Här Eskingras är den energi som förlorat under en svängning, och Elagras är den totala energin av fritt oscillerande sensorn.

För att analysera och kvantifiera bindningsparametrarna, härleds frekvens isotermerna genom att plotta jämvikt frekvens Skift (ΔΔfe) mot protein koncentrationerna. ΔΔfe definieras som

Equation 3

Här, representerar Δft1 början av protein adsorption och Δft2 tillståndet jämvikt. Ickelinjär kurva montering kan utföras med hjälp av en Hill expansion av Langmuir ekvationen som följer6,8.

Equation 4

Här ΔΔfmax är ΔΔfe protein koncentration vilket resulterar i maximal (mättar) bindande, Kd är den uppenbara dissociationskonstant för protein/membranet komplexa, och n är koefficienten som Hill.

Den Hill koefficienten (n) beskriver kooperativitet bindning. För n = 1, Hill adsorption modellen är en enkel Langmuir isotherm (lika bindande platser och alla molekyler binder oberoende av varandra till en lipid lipidens). Om n ≠ 1, en bundna ligand ändrar membranet bindande affinitet för andra ligander, antingen ökar (n > 1, positiva kooperativitet) eller minskar (n < 1, negativa kooperativitet) affinitet.

Figur 1 visar en schematisk av experimentella arbetsflödet används i vårt laboratorium för att mäta förskjutningarna i resonans och frekvens under Ca2 +-beroende bindande och frisläppandet av AnxA2 till de lipid lipidens i den flytande fasen. En exemplarisk inspelning visas i figur 2. Figur 2 A visar inspelningen av frekvenskurvan och figur 2B visar de försvinnande förskjutningarna. Den framstående nedgången i frekvensen vid tillägg av liposomer (figur 2A [steg 1]) anger sin adsorption. Eftersom de buffert-fyllda blåsor inte är styva, men viskoelastiska, försvinnande ökar (figur 2B [steg 1]). Därefter skapar blåsor brista. Samtidig minskar bufferten inuti blåsor adsorberade massan tills en stabil platå uppnås (figur 2A [steg 2]). Notera, tillägg av blåsor resulterar i en hög värmeavledning Skift, medan övergången för att bemöta lipidens är mycket mindre på grund av hur styv homogen i SLB (figur 2B [steg 2]). Steg 3 i figur 2A och 2B records bindning av AnxA2 till de lipider, som lägger till massa, som ses av tydliga frekvens Skift, men stör inte lipidens struktur, som indikeras av den enda liten förändringen i försvinnande. När Ca2 + tas bort av kelatbildare EGTA (figur 1 och figur 2 [steg 4]), separerar AnxA2 från lipid filmen. Frekvensen, liksom skingra inspelningarna, skifta till de nivåer som ses med lipidens endast (jämför steg 2 och 4 i figur 2A och 2B), som anger att AnxA2 bindande är helt beroende av Ca2 + och som lipid filmen förblir intakt.

AnxA2, som gör mest av annexins, beror på negativt laddade lipider som PS. Detta syns tydligt när dyker är frånvarande i de lipid lipidens (figur 3). Figur 3 A visar inspelningen av frekvenskurvan och figur 3B visar de försvinnande förskjutningarna. Observera att frekvensen skiftar till en stabil baslinje vid-25 Hz, men försvinnande är inte ändras (figur 3B [steg 2]), som tyder på en ordentlig lipidens formation. Dock observeras inga förändringar i frekvens (figur 3A) eller försvinnande (figur 3B) efter tillägg av AnxA2 i närvaro av Ca2 + (figur 3A och 3B [steg 3]) eller EGTA (figur 3a och 3B [steg 4]), som AnxA2 inte kan interagera med lipid filmen.

Figure 1
Figur 1 : Grafisk modell av experimentella arbetsflödet. Detta arbetsflöde illustrerar vesikler absorptionen till hydrofil sensorn ytan (steg 1), vesikler fusion/bristning leder till SLB bildandet (steg 2), och Ca2 +-beroende adsorption (steg 3) och EGTA-beroende desorption av AnxA2 (steg 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 2
Figur 2 : Exemplariskt inspelning. Dessa paneler visar (A) tidsberoende övervakning av 7: e övertonen resonansfrekvens och (B), försvinnande skiftar av kvarts sensorer under mätningen. Tillämpningen av liposomer orsakar en snabb nedgång i frekvensen baslinjen, medan skingrande baslinjen ökar (steg 1). Stabiliseringen av baslinjer visar bildandet av lipidens (steg 2). AnxA2 (200 nM) adsorption (i närvaro av Ca2 +) på den dyker-innehållande lipid lipidens lägger till massa utan att väsentligt ändra den försvinnande, vilket indikerar att lipid filmen inte är orolig (steg 3). Återvinning av frekvens baslinjen vid Ca2 + kelering med EGTA anger den totala desorptionen av proteinet (steg 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Negativ kontroll experiment, visar att AnxA2 inte binder till SLBs i avsaknad av dyker. Dessa paneler visar tillägg av liposomer och SLB bildandet (steg 1 och 2). Inga förändringar i frekvens (A) eller (B) försvinnande är uppenbara efter tillsats av AnxA2 (steg 3; 200 nM, i närvaro av Ca2 +) eller EGTA (steg 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Sammansättning ΔΔF/Hz efter bildandet av SLBs ΔΔD * 10-6 efter bildandet av SLB
POPC/DYKER
(80: 20)
26,3 ± 0,2 0,26 ± 0,03
POPC/PI (4,5) P2
(95: 5)
26,5 ± 0,5 0,31 ± 0,02
POPC/POPS/Chol
(60: 20: 20)
29,2 ± 0,2 0,45 ± 0,09
POPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol
(60: 17: 3:20)
29,6 ± 0,6 0,43 ± 0,10
POPC/DOPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol
(37: 20: 20: 3:20)
29,4 ± 0,4 0,39 ± 0,14

Tabell 1: Lipid sammansättning och bildande data av SLB 7 .

Discussion

För att besvara frågor om struktur och funktion förhållandet mellan cellulära membran både kvantitativa och kvalitativa, cellbiologi vinsterna oerhört från användningen av biofysikaliska metoder baserade på väl etablerade och ofta används tekniker , inklusive atomic force microscopy (AFM), ytan plasmon resonans (SPR), och QCM-D tekniken anställd här. Vi visade i tidigare studier som annexin proteiner binder i en Ca2 +-beroende sätt till immobiliserade membranet med hög affinitet. Vi använder frekvens och skingrande skiftar i den 7: e övertonen (Δf7) eftersom detta utgör den bästa kompromissen av upptäckt känslighet och svängning stabilitet.

Denna teknik tillåter även en kvantitativ beskrivning av membranprotein interaktionen. AnxA2 bindning till membranet karaktäriseras av positiva kooperativitet som medieras av de bevarade annexin core-domänen och beror på närvaron av kolesterol. De kvantitativa data som erhållits för AnxA2 och AnxA8 redovisas i detalj på annan plats6,8.

Det finns många kritiska steg i detta protokoll. Använda liposomer omedelbart; annars små blåsor kan smälta samman till större blåsor med mindre ytspänning, vilket leder till hämning av lipid lipidens bildandet. Hålla en konstant temperatur under mätningarna. Varje liten avvikelse i temperatur resulterar i en inte försumbar frekvens och försvinnande SKIFT. Undvika luftbubblor; annars systemet är instabilt och kommer inte att upprätta en originalplan.

Sauerbrey ekvationen tillåter direkt omvandling av observerade frekvensen ändras till förändringar i vikt och är därför ofta används. Dock gäller antagandet av en linjär korrelation mellan förändringen i resonansfrekvensen och extra massan endast komponenter bilda en styv och enhetlig film på sensorn ytan. Sauerbrey ekvationen kan inte användas för viskoelastiska adsorbents såsom vatten-rika protein filmer, lipid skikt med ingående vatten, eller ens adsorberat celler. Här krävs mer komplexa matematiska modeller. Därför är det extremt viktigt att samtidigt övervaka förändringar i frekvens och försvinnande. För att upptäcka strukturella förändringar under mätningen, kan ΔD kontra Δf nyckeltal ritas, med en rak linje som anger ingen konfirmerande förändringar.

En stor fördel med denna teknik är möjligheten att använda ett mycket brett spektrum av material som substrat. Dessutom är det en pålitlig och direkt metod för att studera ett brett spektrum av makromolekylära interaktioner, som korrekt bildandet av surface-beläggning filmerna (såsom SLB), samt ytterligare protein-lipid interaktioner, kan övervakas online.

Detta protokoll kan tillämpas på andra membran-interagera proteiner, till exempel BAR domän proteiner19, ERM (ezrin, radixin och moesin) proteinfamiljen som har en viktig roll i membran-cytoskelettet koppling20,21 ,22eller proteiner som innehåller C2 eller PH domäner. Dessutom har ett brett utbud av tillämpningar av denna teknik att studera biologiska material framgångsrikt publicerats, således upprättande QCM som en väl lämpad experimentell plattform att studera interaktioner av mer komplexa makromolekylära församlingar eller ens celler23,24.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av den Deutsche Forschungsgemeinschafts under bidrag SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 och SFB 1348/A11.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Calciumchloride Merck 017-013-00-2 99%
Chloroform Roth 4432.1 99%
DOPC Avanti 850375P
EGTA PanReac AppliChem A0878 99%
HEPES PanReac AppliChem A1069
Methanol PanReac AppliChem A3493
PiP2 Avanti  850155P
POPC Avanti  850457P
POPS Avanti  840034P
Sodiumchloride PanReac AppliChem A1149
SDS Roth 183
Trisodium citrate PanReac AppliChem A3901
Equipment 
Extruder Liposofast Avestin
Qsense E4 Analyzer Qsense
QSense Dfind Qsense
Pump IPC 4 Ismatec ISM 930
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm Qsense QSX 303
PC Membranes 0.05μm Avanti polar lipids 610003
OriginPro OriginLab Corporation Version 8 and 9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-41 (2000).
  2. Gerke, V., Creutz, C. E., Moss, S. E. Annexins: linking Ca2+ signalling to membrane dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 449-461 (2005).
  3. Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends in Biochemical Science. 37, 526-533 (2012).
  4. Rescher, U., Ruhe, D., Ludwig, C., Zobiack, N., Gerke, V. Annexin 2 is a phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate binding protein recruited to actin assembly sites at cellular membranes. Journal of Cell Science. 117, 3473-3480 (2004).
  5. Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: from structure to function. Physiological Reviews. 82, 331-371 (2002).
  6. Heitzig, N., et al. Cooperative binding promotes demand-driven recruitment of AnxA8 to cholesterol-containing membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (4), 349-358 (2018).
  7. Drücker, P., Grill, D., Gerke, V., Galla, H. J. Formation and characterization of supported lipid bilayers containing phosphatidylinositol-4,5-biphosphate and cholesterol as functional surfaces. Langmuir. 30, 14877-14886 (2014).
  8. McConnell, H. M., Watts, T. H., Weis, M. R., Brian, A. A. Supported planar membranes in studies of cell-cell recognition in the immune system. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Biomembranes. 864, 95-106 (1986).
  9. Anderson, T. H., et al. Formation of supported bilayers on silica substrates. Langmuir. 25, 6997-7005 (2009).
  10. Pfeiffer, L., Petronis, S., Koper, I., Kasemo, B., Zach, M. Vesicle adsorption and phospholipid bilayer formation on topographically and chemically nanostructured surfaces. Journal of Physical Chemistry B. 114, 4623-4631 (2010).
  11. Cho, N. J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: a comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  12. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. J. Self-Assembly formation of lipid bilayer coatings on bare aluminium oxide: overcoming the force of interfacial water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  13. Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
  14. Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of lipid vesicle deposition on solid surfaces: a combined QCM-D and AFM study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik A Hadrons and Nuclei. 155 (2), 206-222 (1959).
  17. Rodahl, M., Höök, F., Krozer, A., Brzezinski, P., Kasemo, B. Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q-factor measurements in gaseous and liquid environments. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3924-3930 (1995).
  18. Drücker, P., Pejic, M., Grill, D., Galla, H. J., Gerke, V. Cooperative binding of annexin A2 to cholesterol-and phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate-containing bilayers. Biophysical Journal. 107 (9), 2070-2081 (2014).
  19. Galic, M., et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  20. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 276-287 (2010).
  21. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  22. Bianco, M., et al. Quartz crystal microbalance as cell-based biosensor to detect and study cytoskeletal alterations and dynamics. Biotechnology Journal. , 1700699 (2018).
  23. Chen, J. Y., Penn, L. S., Xi, J. Quartz crystal microbalance: Sensing cell-substrate adhesion and beyond. Biosensors and Bioelectronics. 99, 593-602 (2018).
  24. Bragazzi, N. L., et al. Quartz-Crystal Microbalance (QCM) for Public Health: An Overview of Its Applications. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. Donev, R., et al. 101, Academic Press. 149-211 (2015).

Tags

Biokemi fråga 141 Microbalance solid-stödda lipidens fosfolipid microdomains kolesterol annexins kooperativitet bindande dynamics viskoelastiska egenskaperna
Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matos, A. L. L., Grill, D., Kudruk,More

Matos, A. L. L., Grill, D., Kudruk, S., Heitzig, N., Galla, H. J., Gerke, V., Rescher, U. Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator. J. Vis. Exp. (141), e58224, doi:10.3791/58224 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter