Summary
بروتوكول قدمه لتعريب Ag في أنسجة الكبد والكلى الحيتانيات أوتوميتالوجرافي. وعلاوة على ذلك، أعد مقايسة جديدة، تسمى المقايسة Ag النسيجي الحيتانيات (شا) لتقدير تركيزات Ag في تلك الأنسجة.
Abstract
جسيمات فضة نانوية (أجنبس) وقد استخدمت على نطاق واسع في المنتجات التجارية، بما في ذلك المنسوجات ومستحضرات التجميل، وعناصر الرعاية الصحية، بسبب آثارها الميكروبات قوية. كما أنها قد تطلق في البيئة وتتراكم في المحيط. ولذلك، أجنبس هي المصدر الرئيسي لتلوث Ag، وهو زيادة وعي الجمهور بالسمية البيئية ل Ag. أظهرت الدراسات السابقة على التراكم الأحيائي (بالمنتجين) والتكبير (في المستهلكين/الحيوانات المفترسة) من Ag. الحيتانيات، كالحيوانات المفترسة ابيكس للمحيطات، ربما قد تأثرت سلبا بمركبات Ag/Ag. على الرغم من أن يمكن قياس تركيزات مركبات Ag/Ag في الأنسجة الحيتانيات ببلازما الحث يقترن التحليل الطيفي الشامل (برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد)، يقتصر استخدام برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد ارتفاع تكلفة رأس المال والحاجة إلى تخزين الأنسجة والتحضير. ولذلك، أوتوميتالوجرافي (AMG) أسلوب مع تحليل كمي صورة باستخدام الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة (فب) قد يكون أسلوب adjuvant لتوطين Ag التوزيع على مستوى سبورجن وتقدير تركيز Ag في للحيتانيات الأنسجة. إشارات إيجابية AMG أساسا البنى إلى حبيبات سوداء من مختلف الأحجام في السيتوبلازم من ظهارة الأنبوبي الكلوي الدانية، وخلايا الكبد، وخلايا كوبفر. في بعض الأحيان، تتم الإشارة إلى بعض غير متبلور أصفر ذهبي إلى بني AMG إشارات إيجابية في التجويف والغشاء من بعض الكلوية الدانية. الفحص لتقدير تركيز Ag يدعى للحيتانيات النسيجي Ag المقايسة (شا)، ونموذج انحدار المنشأة بالبيانات من صورة التحليل الكمي لأسلوب AMG وبرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد. ويوفر استخدام AMG مع شا إلى ترجمة وشبه قياس المعادن الثقيلة منهجية ملائمة للدراسات الزمانية والصليب-الأنواع.
Introduction
جسيمات فضة نانوية (أجنبس) وقد استخدمت على نطاق واسع في منتجات تجارية، بما في ذلك المنسوجات ومستحضرات التجميل، وعناصر الرعاية الصحية، بسبب ما آثار مضادات الميكروبات كبيرة1،2. لذلك، يتم زيادة إنتاج أجنبس والعدد من المنتجات المحتوية على عنب على مر الوقت3،4. ومع ذلك، أجنبس قد تطلق في البيئة وتتراكم في5،المحيط6. فقد أصبحت مصدرا رئيسيا للتلوث Ag، وهي زيادة الوعي العام بالسمية البيئية ل Ag.
مركز أجنبس و Ag في البيئة البحرية المعقد والمتغير باستمرار. أشارت الدراسات السابقة إلى أن أجنبس يمكن أن تبقى الجسيمات، التجميعية، حل، وتتفاعل مع مختلف الأنواع الكيميائية، أو يمكن إعادة إنشائها من أيونات Ag+ 7،8. قد تم العثور على عدة أنواع من المركبات Ag، مثل أجكل، في الرواسب البحرية، حيث يمكن بلعها من الكائنات القاعية وأدخل9،السلسلة الغذائية10. ووفقا لدراسة سابقة أجريت في منطقة البحيرة كو تشي على طول الساحل الجنوبي الغربي لتايوان، Ag تركيزات الرواسب البحرية منخفضة للغاية وشبيه الوفرة في القشرة الأرضية، وتلك من أنسجة الأسماك الكبد عادة دون الكشف عن الحد (< 0.025 ميكروغرام/غرام رطب/رطب)11. ومع ذلك، أظهرت دراسات سابقة أجريت في بلدان مختلفة Ag تركيزات عالية نسبيا في الكبد من الحيتانيات12،13. تركيز Ag في الكبد من الحيتان تعتمد على العمر، مما يوحي بأن مصدر Ag في أجسادهم على الأرجح على فريسة12. وتوحي هذه النتائج زيادة التضخم أحيائي Ag في الحيوانات عند المستويات التغذوية. الحيتانيات، المفترسات العليا في المحيط، وقد عانت من الآثار الصحية السلبية الناجمة عن Ag/Ag مركبات12،،من1314. الأهم من ذلك، أن البشر هم مثل الحيتان، الثدييات، والصحية السلبية التي قد تحدث التأثيرات الناجمة عن المركبات Ag/Ag في الحيتانيات في البشر. وبعبارة أخرى، يمكن أن تكون الحيتان الحيوانات الحارس على صحة البشر والبيئة البحرية. ولذلك، الآثار الصحية، وتوزيع الأنسجة، وتركيز Ag في الحيتانيات مصدر قلق كبير.
على الرغم من أن يمكن قياس تركيزات مركبات Ag/Ag في الأنسجة الحيتانيات ببلازما الحث يقترن التحليل الطيفي الشامل (برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد)، استخدام برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد هو محدودة بارتفاع تكاليفه الرأسمالية (الصك والصيانة) ومتطلبات تخزين الأنسجة /preparation،من1215. وبالإضافة إلى ذلك، من الصعب عادة لجمع عينات الأنسجة شاملة في جميع التحقيقات في حالات الحيتانيات الذين تقطعت بهم السبل بسبب الصعوبات اللوجستية، ونقص في القوى العاملة، والافتقار إلى الموارد ذات الصلة12. لا يتم تخزين عينات الأنسجة المجمدة لتحليل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد بسهولة بسبب المساحة المحدودة التبريد، وقد يتم تجاهل عينات الأنسجة المجمدة بسبب معدات التبريد كسر12. هذه العقبات السالفة الذكر تعيق التحقيقات المتعلقة بمستويات التلوث في الأنسجة الحيتانيات بتحليل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام عينات الأنسجة المجمدة. وفي المقابل، الفورمالين الثابتة عينات الأنسجة سهلة نسبيا لجمع خلال نيكروبسي الحيتانيات الموتى-الذين تقطعت بهم السبل. ولذلك، من الضروري تطوير طريقة سهلة وغير مكلفة الكشف عن/قياس المعادن الثقيلة في أنسجة الحيتانيات باستخدام الفورمالين الثابتة عينات الأنسجة.
على الرغم من أن يغير توزيعات سبورجن وتركيزات الفلزات القلوية والقلوية الأرض خلال الفورمالين--الثابتة، كانت جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) عملية، إلا أقل آثار المعادن الانتقالية، مثل مجموعة أستراليا، أشار إلى16. ومن ثم، كانت تعتبر الأنسجة FFPE موردا عينة مثالية للتعريب معدنية وقياسات16،17. يمكن تضخيم أوتوميتالوجرافي (AMG)، عملية histochemical، والمعادن الثقيلة العارضة الحجم أصفر ذهبي إلى أسود AMG إشارات إيجابية في أقسام الأنسجة FFPE، ويمكن تصور هذه المعادن الثقيلة مكبرة تحت المجهر الخفيفة18، 19 , 20 , 21-ومن ثم فأسلوب AMG ويقدم معلومات عن التوزيعات سبورجن من المعادن الثقيلة. أنها يمكن أن توفر معلومات إضافية هامة لدراسة المسارات الأيضية للمعادن الثقيلة في النظم البيولوجية لبرنامج المقارنات الدولية-MS فقط يمكن قياس تركيز المعادن الثقيلة في الجهاز مستوى18. وعلاوة على ذلك، طبق البرنامج تحليل الصور الرقمية، مثل إيماجيج، للتحليل الكمي لانسجة النسيجي المقاطع22،23. أصفر ذهبي الحجم مغايرة للأسود AMG إشارات إيجابية من أقسام الأنسجة FFPE يمكن قياسها كمياً والمستخدمة لتقدير تركيزات المعادن الثقيلة. رغم أنه لا يمكن تحديد تركيز Ag المطلق مباشرة بواسطة الأسلوب AMG مع التحليل الكمي الصورة، يمكن تقدير من نموذج انحدار استناداً إلى البيانات التي تم الحصول عليها من التحليل الكمي الصورة وبرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد، يدعى للحيتانيات النسيجي المقايسة Ag (شا). وبالنظر إلى الصعوبات في قياس تركيزات Ag بتحليل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد في الحيتان أكثر الذين تقطعت بهم السبل، شا هو أسلوب adjuvant قيماً لتقدير Ag التركيزات في الأنسجة الحيتانيات، والتي لا يمكن أن يتحدد بتحليل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد بسبب الافتقار إلى تجميد عينات الأنسجة. وتصف هذه الورقة بروتوكول تقنية histochemical (أسلوب AMG) لإضفاء الطابع المحلي Ag على مستوى سبورجن والانزيم المسمى شا لتقدير تركيزات Ag في أنسجة الكبد والكلى للحيتان.
رقم 1: مخطط انسيابي تصور إنشاء وتطبيق من الحيتانيات النسيجي Ag المقايسة (شا) لتقدير تركيزات Ag- شا = الحيتانيات المقايسة Ag النسيجي، فب = الفورمالين ثابتة، وجزءاً لا يتجزأ البارافين، برنامج المقارنات الدولية-MS = بلازما الحث يقترن الشامل التحليل الطيفي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجرى الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية، وكان يسمح باستخدام عينات الأنسجة الحيتانيات "مجلس الزراعة من تايوان" (البحوث تسمح 104-07.1-س-62).
1-الأنسجة إعداد نموذج لتحليل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد
ملاحظة: تم جمع أنسجة الكبد والكلى من طازجة الميت واعتدال أوتوليزيد الذين تقطعت بهم السبل الحيتان24، بما في ذلك 6 الحيتان الذين تقطعت بهم السبل في الأنواع المختلفة 4، 1 غرامبوس غريس (Gg)، 2 كوجيا spp. (كو)، 2 Hosei لاجينوديلفيس (Lh)، 1 أتينواتا هناك (Sa). وكان كل للحيتانيات الذين تقطعت بهم السبل رقم حقل لتحديد الهوية الفردية. إعداد عينة الأنسجة لبرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد تحليل تتبع الطريقة المحددة في مختبر M.H. تشن، ومختبر M.H. تشين أجرى برنامج المقارنات الدولية-ماجستير تحليل11،13،25.
- جمع أنسجة الكبد والكلى لتحليل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد من الحيتان الذين تقطعت بهم السبل وتخزينها في −20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- جمع زوج متطابق الكبد وأنسجة الكلي من نفس الذين تقطعت بهم السبل الحيتان لتحليل AMG (راجع الخطوة 2).
- تقليم الطبقة الخارجية من عينات الأنسجة التي تم جمعها لتحليل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد مع مشرط الفولاذ المقاوم للصدأ. قص الجزء الداخلي من عينات الأنسجة إلى مكعبات صغيرة (حوالي 1 سم3) ووضعها في أكياس بلاستيكية قفل الرمز البريدي. عادة، كل كيس يحتوي على 10 جرام الأنسجة.
- تخزين الأكياس البلاستيكية التي تحتوي على عينات الأنسجة في −20 درجة مئوية للإجراءات اللاحقة.
- وضع مكعبات 1 سم3 عينات في تجميد جاف النظام (-50 درجة مئوية ومضخة فراغ مع تشريد مالا يقل عن 98 لتر في الدقيقة، 0.002 [مبر]) على الأقل 72 ح حتى يجف تماما قبل وزنها الثابت.
- مجانسة المكعبات المجففة إلى مسحوق مع الخالطون لهضم الأنسجة اللاحقة.
- وزن ز 0.3 من عينات المعصوفه المتجانس في زجاجات 30 مل تترافلوروايثيلين (PTFE) ومزجها مع 10 مل حامض النيتريك 65% w/w.
- وضع الإغلاق على زجاجات PTFE، ولكن ترك الإغلاق أونتايتينيد.
ملاحظة: يسمح هذا الدخان براون إلى النموذج في زجاجات PTFE والجزر داخل الزجاجة الهضم حتى يختفي الدخان البنى ويتحول واضحة. - الحرارة العينات هضمها مع لوحة الساخن، من 30 درجة مئوية إلى 110/120 درجة مئوية (وفقا للدخان البنى التي تشكل الشرط) في زجاجات PTFE لمدة 2 إلى 3 أسابيع حتى يصبح الغاز البنى في زجاجات PTFE عديم اللون ويصبح السائل في الزجاجات PTFE gree شفافة بالي نيش الأصفر أو واضحة تماما.
ملاحظة: إجراء عملية تدفئة في غطاء الأبخرة الكيميائية. - الحرارة العينات هضمها على 120 درجة مئوية تتبخر حمض النيتريك في زجاجات PTFE حتى فقط 0.5-1 مل الرفات.
ملاحظة: إجراء عملية تدفئة في غطاء الأبخرة كيميائية، ورصد دائماً زيادة درجة الحرارة التأكد من أن تسرب أي غاز البنى من إغلاق الزجاجات PTFE. - تشديد عمليات الإغلاق وبارد لهم في درجة حرارة الغرفة لحوالي 1 ساعة.
- مكان للمداخل مع تصفية ورقات في قوارير الحجمي 25 مل والغسيل السائل المتبقية مع HNO 1 م3 لوحدة تخزين نهائي من 25 مل.
ملاحظة: أغسل الزجاجة لثلاث مرات على الأقل، والإغلاق مرتين. - التحقق من الجودة التحليلية لتحليل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام المواد المرجعية القياسية، بما في ذلك غالبي-2 (dogfish في الكبد) والنوم-2 (dogfish العضلات).
- استخدام تكرارات لكل عينة تحليلية وتريبليكاتيس من المواد المرجعية القياسية لتحليل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد.
- متوسط تركيزات Ag كل العينات التحليلية وتقديم البيانات كأساس الوزن الجاف تركيز (ميكروغرام/غرام وزن جاف).
2-الأنسجة إعداد نموذج لتحليل AMG
- جمع زوج متطابق أنسجة الكبد والكلى لتحليل AMG من للحيتانيات الذين تقطعت بهم السبل وإصلاحها في 10% فورمالين مخزنة محايدة حتى الاستخدام.
ملاحظة: تخزين عينات الأنسجة في زجاجات بلاستيكية في 10% من الفورمالين مخزنة محايدة (NBF، درجة الحموضة 7.0) لمدة 24 إلى 48 ساعة. وينبغي أن يكون حجم NBF على الأقل 10 مرات أكبر من حجم الأنسجة. - تقليم الفورمالين الثابتة الكبد وأنسجة الكلي مع شفرات مبضع المتاح الفولاذ المقاوم للصدأ ووضع الأجزاء المشذبة الأنسجة في أشرطة الكاسيت مع التسميات.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم كل مقاطع الأنسجة حوالي 2 سم × 1 سم ويجب أن لا يتجاوز سمك كل قسم الأنسجة مم 3. وضع أنسجة الكبد والكلى من نفس الشخص في نفس الكاسيت. - يذوي قلص أقسام الأنسجة مع معالج أنسجة من خلال سلسلة من الإيثانول متدرج (70% ح 1 80% ح 1، 95% ح 1, 95% ح 2، 100% لح 1 × 2 تلطيخ الأطباق و 100 ٪ ح 2)، غير زيلين نفط (ح 1 وح 2 في الأطباق المصبوغة مختلفة) ، وتزج عينات الأنسجة المجففة في paraffin (على ح 1 وح 2 في مختلف الأطباق المصبوغة).
- وضع عينات الأنسجة المجففة في القيعان من قوالب الصلب علم الأنسجة وتضمين عينات الأنسجة المجففة مع البارافين.
- البرد الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين كتل الأنسجة (FFPE) على لوحة الباردة حتى يتصلب البارافين. تقليم كتل فب مع مبضع حتى يتعرض سطح النسيج.
- البرد كتل فب في −20 درجة مئوية للحد الأدنى 10 القسم كتل فب في 5 ميكرومتر مبضع.
- ملء حمام مائي مع الماء المقطر مزدوج عند 45 درجة مئوية. رفع الشرائط أقسام النسيج وجعلها تطفو على سطح الماء الدافئ باستخدام الملقط والفرش.
- فصل الشرائط أقسام الأنسجة بالملقط. ضع مقطع إلى شريحة مجهر.
- ضع الشرائح المجهر على شريحة الأكثر دفئا ويسمح بوجود مقاطع للمبيت الجافة في 37 درجة مئوية.
- وضع الشرائح المجهر في رفوف الشريحة وديبارافينيزي لهم التي نقع عليها في 3 أطباق مختلفة المصبوغة من نقية غير-زيلين نفط (حوالي 200 إلى 250 مل) عن 8, 5 و 3 دقيقة.
- هيدرات مقاطع الأنسجة في رفوف الشريحة التي نقع عليها في مختلف الأطباق المصبوغة الحلول الإيثانول متدرج (الإيثانول 100% مرتين، الإيثانول 90% مرة واحدة والإيثانول 80% مرة واحدة [1 دقيقة في كل])، وشطف لهم في الماء المقطر مزدوجة.
ملاحظة: هذه الحلول ما يقرب من 200 إلى 250 مل في مختلف الأطباق المصبوغة. لكل غسل، كفى 30 ثانية. - شطف أقسام الأنسجة في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) مع 0.5% X-100 تريتون، يغسل لهم مع برنامج تلفزيوني لعدة مرات، ومن ثم شطف لهم في الماء المقطر مزدوجة.
ملاحظة: هذه الحلول ما يقرب من 200 إلى 250 مل في مختلف الأطباق المصبوغة. لكل 30 ثانية ما يكفي. - إعداد كميات متساوية من المكونات الثلاثة (البادئ والوسيط والمنشط) المقدمة من مجموعة أدوات تعزيز الفضة في الظلام ومزجها جيدا.
ملاحظة: الحلول من الوسيط والمنشط لزجة، لذا يرجى استخدام "الماصة؛" مع نصيحة واسعة الفتحات (أو قطع نصائح لخلق فرص أوسع). لكل شريحة، 300 ميكروليتر من الحل المختلط (تبعاً لحجم المقطع الأنسجة) عادة ما فيه الكفاية. ولذلك، إذا كان يتم استخدام شرائح 10، هو كمية كل مكون (البادئ والوسيط والمنشط) 1000 ميكروليتر (الحل المختلط ميكروليتر 3000 للشرائح 10). - احتضان مقاطع الأنسجة في الحل المختلط لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. تغطي أقسام الأنسجة على الشرائح مع الحل مختلطة تماما. وقتاً أطول في حضانة قد يؤدي إلى إشارات إيجابية كاذبة AMG.
- يغسل الشرائح مع الماء المقطر مزدوجة ووصمة عار لهم في توضع 10 s كونتيرستين.
- يغسل الشرائح مع تشغيل مياه الحنفية وتجفيفها، وجبل لهم مع تصاعد المتوسطة.
- دراسة الشرائح تحت مجهر خفيفة.
- عشوائياً التقاط الصور النسيجي عشرة مع عدسة هدف X 40 من كل قسم الأنسجة باستخدام كاميرا رقمية متصلة بالكمبيوتر برامج التصوير.
3-شبه كمي تحليل للقيم الموجبة AMG الصور النسيجي
ملاحظة: تعني القيمة الإيجابية AMG النسبة المئوية للمنطقة مع إشارات إيجابية AMG.
- استخدم برنامج تحليل الصور (إيماجيج) لتحليل الصور النسيجي.
- فتح الصورة النسيجي بالضغط على الملف | فتح.
- تقسيم الصورة المختارة إلى قنوات الألوان الثلاثة (الأحمر والأزرق والأخضر) بالضغط على الصورة | نوع | مكدس RGB.
- قياس الإشارات الإيجابية AMG باستخدام القناة الزرقاء. عادة يتم تخفيضها النووية إشارات إيجابية كاذبة تحت القناة الزرقاء عندما يتم تطبيق الهيماتوكسيلين وصمة عار كونتيرستين النووي (الشكل 2).
- قياس النسبة المئوية للمنطقة مع AMG إشارات إيجابية في كل صورة النسيجي باستخدام أداة عتبة (الصورة | ضبط | عتبة).
- يدوياً ضبط قيمة الوقف للحد الأدنى لكل صورة نسيجية (من 90 إلى 110) استناداً إلى وجود مجالات إيجابية كاذبة في نوى و/أو خلايا الدم الحمراء.
ملاحظة: الإعداد الافتراضي، وينبغي إبراز إشارات إيجابية AMG باللون الأحمر. - تحليل صحفي | تعيين قياسات، والتحقق من مربع جزء المجال لتعيين أن يتم تسجيل جزء المجال.
- تحليل صحفي | قياس. يتم عرض منطقة المئة إيجابية لكل صورة نسيجية في العمود % مساحة من إطار النتائج .
- متوسط المناطق نسبة إيجابية من الصور نسيجية 10 من كل قسم الأنسجة وتحديد النتيجة كقيمة إيجابية AMG لكل قسم الأنسجة.
الشكل 2: وجود إشارات إيجابية زائفة النووية تحت قنوات الألوان المختلفة (كونتيرستين: توضع وصمة عار)- يتم الإشارة إلى الممثل النووية إشارات إيجابية زائفة بالأسهم الصفراء. PPA = نسبة إيجابية من المناطق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4-إنشاء المقايسة Ag النسيجي الحيتانيات (شا) بنموذج الانحدار
ملاحظة: يتم إجراء التحليل التالي في المنشور 6.01 ل Windows.
- تقييم العلاقة بين القيم الإيجابية AMG ونتائج برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد.
- افتح البرنامج وقم بإنشاء ملف مشروع جديد اختر س وص و الارتباط.
- إدخال البيانات بما في ذلك نتائج برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد و AMG القيم الإيجابية.
- اضغط على تحليل واختيار الربط تحت فئة التحليل س وص لتحليل قوة الرابطة بين القيم الإيجابية AMG ونتائج برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد من خلال تحليل الارتباط بيرسون.
ملاحظة: نتائج برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد والقيم الإيجابية للبوسنة والهرسك يجب أن يكون ارتباطاً إيجابيا مع بعضها البعض؛ خلاف ذلك، ينبغي عدم وضع نموذج الانحدار اللاحقة. - إحصائيا مقارنة نماذج الانحدار، بما في ذلك الانحدار الخطي، والانحدار التربيعية، الانحدار مكعب، والانحدار الخطي من خلال الأصل، من خلال إحصائيات البرنامج12،،من2627.
ملاحظة: إذا كان نموذج الانحدار يولد بتركيز Ag غير واقعية، ينبغي أن يكون نموذج الانحدار المهجورة12. - نعود إلى "جدول البيانات" (اللوحة اليمنى) واضغط على تحليل | الانحدار غير الخطية (منحنى تناسب) تحت فئة التحليل س ص | موافق.
- في الإطار المعلمات: الانحدار غير الخطية، اختر نموذج الانحدار مختلفة في الصفحة تناسب وثم قارن بين نماذج مختلفة من الانحدار في صفحة مقارنة.
- في صفحة مقارنة، اختيار أساليب المقارنة، بما في ذلك الاختبار و مجموع المربعات الإضافية والمعلومات المعيار أكايكي (AIC). وفقا لنتائج المقارنة بين الأساليب، استخدام نموذج انحدار مناسبة نسبيا في شا.
- تقدير تركيزات Ag من الحيتانيات أنسجة الكبد والكلى مع تركيزات Ag مجهولة باستخدام شا.
- تقييم دقة ودقة شا للكبد وأنسجة الكلي. ويتضح الفرق بين الدقة والدقة في الشكل 3.
- الدقة: حساب متوسط الانحراف المعياري (SD) من الاختلافات بين تركيزات Ag المعروفة والمقدرة.
- الدقة: تنفيذ القياس المتكررة (ثلاث على الأقل) AMG القيم الإيجابية لمقاطع المسلسل من الأنسجة FFPE نفسه. حساب متوسط SD من قياسات من أنسجة الكبد أو الكلي من الاختلافات بين تركيزات Ag المعروفة والمقدرة
ملاحظة: يتم تصور أساليب تقييم دقة والدقة في الشكل 4.
الشكل 3: الفرق بين الدقة والدقة. يعني دقة القياس مدى قرب من القيمة الحقيقية (أي تركيز Ag يحدده برنامج المقارنات الدولية-MS)؛ الدقة يعني التكرار للقياس (أي التناسق بين القياسات المتكررة AMG القيم الإيجابية من أقسام الأنسجة ثلاث). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مخطط تصور أساليب تقييم دقة والدقة. شا = الحيتانيات المقايسة Ag نسيجية؛ فب = الفورمالين ثابتة، وجزءاً لا يتجزأ البارافين؛ برنامج المقارنات الدولية-MS = بلازما الحث يقترن الطيفي الشامل؛ منظمة العفو الدولية = كل من التركيزات Ag التي يحددها برنامج المقارنات الدولية-مرض التصلب العصبي المتعدد لكل عينة الأنسجة زوج المطابقة؛ Bi = كل من تركيزات Ag تقدر شا كل عينة الأنسجة زوج المطابقة؛ Ci، دي، والصناعات الاستخراجية = كل من تركيزات Ag تقدر شا ثلاث عينات من كل عينة الأنسجة زوج المطابقة؛ أنا = 1 إلى n. يرجى الاطلاع على البيانات الخام للاختبارات والدقة في مقطع نتائج الممثل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5-تقدير تركيزات Ag من شا.
- جمع أنسجة الكبد والكلى من الحيتان الذين تقطعت بهم السبل وإصلاحها في 10% فورمالين مخزنة محايدة.
- معالجة الأنسجة الثابتة الفورمالين بشكل روتيني (راجع الخطوة 2).
- تقدير تركيزات Ag الحيتانيات أنسجة الكبد والكلى مع تركيزات Ag غير معروف من شا (راجع الخطوتين 3 و 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر الصور التمثيلية من إشارات إيجابية AMG في أنسجة الكبد والكلى الحيتانيات في الشكل 5. تتضمن إشارات إيجابية AMG براون الحجم مغايرة لحبيبات سوداء من مختلف الأحجام في السيتوبلازم من ظهارة الأنبوبي الكلوي الدانية، وخلايا الكبد، وخلايا كوبفر. في بعض الأحيان، تتم الإشارة إلى متبلور أصفر ذهبي إلى بني AMG إشارات إيجابية في التجويف والغشاء من بعض الكلوية الدانية. هناك علاقة إيجابية بين القيم الإيجابية AMG في الكبد وأنسجة الكلي ونتائج برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد، والانحدار الخطي من خلال الأصل المفضل وفقا لمجموع المربعات إضافية و الاختبار و AIC12،26، 27. في اختبار دقة، يعني الحزب الديمقراطي الصربي شا للكبد والكلى هي 3.24 و 0.16، على التوالي. في اختبار الدقة، يعني الحزب الديمقراطي الصربي شا للكبد والكلى هي 2.8 و 0.35، على التوالي. ويرد في الجدول 1البيانات الخام للاختبارات والدقة. ويرد في الجدول 2القيم الإيجابية AMG، وتركيزات Ag المقدر من شا، وتركيزات Ag تقاس ببرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد من أنسجة الكبد والكلى لهذه الحيتان الستة الذين تقطعت بهم السبل.
الرقم 5: الصور النسيجي الممثل من إشارات إيجابية AMG في أنسجة الكبد والكلى للحيتان (كونتيرستاين: توضع وصمة عار). (أ) AMG إشارات إيجابية في أنسجة الكبد الحيتانيات وتوزع بالتساوي (غرامبوس غريس (جغ)؛ ومدونة كئيب: TP20111116؛ Ag بييندوكتيفيلي إلى جانب قياس تركيز البلازما الشامل الطيفي (برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد): 21.82 ميكروغرام/غرام من الوزن الجاف). (ب) إشارات إيجابية AMG البنى إلى حبيبات سوداء من مختلف سيزيسين السيتوبلازم من خلايا الكبد (الأسهم الحمراء) وخلايا كوبفر (رؤساء سهم أحمر) (زز؛ رمز كئيب: TP20111116). (ج) عدد قليل AMG إشارات إيجابية من براون إلى حبيبات سوداء تظهر في السيتوبلازم من خلايا الكبد (الأسهم الحمراء) (كوجيا spp. (كو)؛ ومدونة كئيب: TC20110722؛ قياس تركيز Ag ببرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد: 3.86 ميكروغرام/غرام من الوزن الجاف). (د) AMG إشارات إيجابية في أنسجة الكلي الحيتانيات تقع أساسا في القشرة الكلوية (Gg; رمز كئيب: TP20111116؛ قياس تركيز Ag ببرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد: 0.42 ميكروغرام/غرام من الوزن الجاف). يتم وضع خط أسود متقطع على مفترق طرق بين القشرة الكلوية ولب. (ه) magnification أعلى من الرقم 5 (مستطيل متقطع أحمر). إشارات إيجابية AMG في قشرة الكلي البنى إلى حبيبات سوداء من مختلف الأحجام في السيتوبلازم ظهارة الأنبوبي الكلوي الدانية (الأسهم الحمراء). غير متبلور أصفر ذهبي إلى بني AMG إشارات إيجابية تظهر في لومن (رأس السهم الأحمر) والغشاء (رأس السهم الأصفر) لبعض الكلوية الدانية. لا ترد إشارات إيجابية إلى AMG الحد الأدنى في جلوميرولي (السهم الأخضر) والكلوية البعيدة (رأس السهم الأخضر) (زز؛ رمز كئيب: TP20111116). (و) ترد حبيبات البنى متفرقة من مختلف الأحجام في ثيسيتوبلاسم ظهارة الأنبوبي الكلوي الدانية (الأسهم الحمراء) (كو؛ رمز كئيب: TC20110722؛ قياس تركيز Ag ببرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد: 0.05 ميكروغرام/غرام من الوزن الجاف). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اختبار دقة | ||||||
| رقم الحقل | الكبد | الكلي | ||||
| شا * | مرض التصلب العصبي المتعدد-برنامج المقارنات الدولية | التنمية المستدامة | شا * | مرض التصلب العصبي المتعدد-برنامج المقارنات الدولية | التنمية المستدامة | |
| TP20111116 | 16.82 | 21.82 | 4.99 | 0.64 | 0.42 | 0.22 |
| TC20110611 | 10.12 | 2.77 | 0.96 | 0.11 | 0.05 | 0.35 |
| TC20110722 | 2.70 | 3.86 | 1.15 | 0.01 | 0.05 | 0.04 |
| TD20110608 | 0.76 | 0.06 | 7.35 | 0.02 | 0.05 | 0.06 |
| TP20110830 | 13.97 | 14.93 | 4.28 | 0.69 | 1.04 | 0.24 |
| IL20110101 | 6.00 | 1.73 | 0.72 | 0.38 | 0.14 | 0.03 |
| يعني SD | 3.24 | يعني SD | 0.16 | |||
| اختبار بريسيسون | ||||||
| رقم الحقل | الكبد | الكلي | ||||
| شا * | مرض التصلب العصبي المتعدد-برنامج المقارنات الدولية | التنمية المستدامة | شا * | مرض التصلب العصبي المتعدد-برنامج المقارنات الدولية | التنمية المستدامة | |
| TP20111116 | 20.90 | 21.82 | 4.08 | 0.21 | 0.42 | 0.44 |
| 16.11 | 0.22 | |||||
| 17.75 | 0.14 | |||||
| TD20110608 | 1.52 | 0.06 | 1.71 | 0.00 | 0.05 | 0.02 |
| 2.40 | 0.00 | |||||
| 1.12 | 0.00 | |||||
| TP20110830 | 13.12 | 14.93 | 2.70 | 0.45 | 1.04 | 0.59 |
| 12.50 | 0.26 | |||||
| 11.35 | 0.33 | |||||
| يعني SD | 2.83 | يعني SD | 0.35 | |||
| * معادلات الانحدار شا للكبد والكليتين وكانت على التوالي Y = 2.249 × X (تعديل R2 = 0.74) و Y = 0.07288 × X (تعديل R2 = 0.69). | ||||||
الجدول 1: نتائج الاختبارات والدقة للمقايسة Ag النسيجي الحيتانيات (شا) الممثل. شا = الحيتانيات المقايسة Ag النسيجي، برنامج المقارنات الدولية-MS = بلازما الحث يقترن الشامل التحليل الطيفي، SD = الانحراف المعياري.
| رقم الحقل | الأنواع | الكبد | الكلي | ||||
| للبوسنة والهرسك | شا * | مرض التصلب العصبي المتعدد-برنامج المقارنات الدولية | للبوسنة والهرسك | شا * | مرض التصلب العصبي المتعدد-برنامج المقارنات الدولية | ||
| TP20111116 | زز | 7.48 | 16.82 | 21.82 | 8.82 | 0.64 | 0.42 |
| TC20110611 | كو | 4.50 | 10.12 | 2.77 | 1.52 | 0.11 | 0.05 |
| TC20110722 | كو | 1.20 | 2.70 | 3.86 | 0.11 | 0.01 | 0.05 |
| TD20110608 | ناحية اليسار | 0.34 | 0.76 | 0.06 | 0.21 | 0.02 | 0.05 |
| TP20110830 | ناحية اليسار | 6.21 | 13.97 | 14.93 | 9.43 | 0.69 | 1.04 |
| IL20110101 | Sa | 2.67 | 6.00 | 1.73 | 5.26 | 0.38 | 0.14 |
| * معادلات الانحدار شا للكبد والكليتين وكانت على التوالي Y = 2.249 × X (تعديل R2 = 0.74) و Y = 0.07288 × X (تعديل R2 = 0.69). | |||||||
الجدول 2: AMG القيم الإيجابية، تركيزات Ag (ميكروغرام/غرام، بالوزن الجاف) المقدر بمقايسة Ag النسيجي الحيتانيات (شا)، وقياس تركيزات Ag (ميكروغرام/غرام، بالوزن الجاف) ببرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد من الكبد والكلى أنسجة الحيتانيات الستة الذين تقطعت بهم السبل. زز = غرامبوس غريس، كو = كوجيا spp., Lh = hosei لاجينوديلفيس، Sa = أتينواتا هناك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والغرض من هذه الدراسة المادة إنشاء أسلوب adjuvant لتقييم التوزيع Ag على الصعيدين سبورجن وتقدير Ag التركيزات في الأنسجة الحيتانيات. تتضمن البروتوكولات الحالية 1) تحديد Ag التركيزات في الأنسجة الحيتانيات ببرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد، 2) AMG تحليل عينات الأنسجة زوج متطابق مع تركيزات Ag المعروفة، 3) إنشاء نموذج الانحدار لتقدير تركيزات Ag (شا) قبل AMG القيم الإيجابية، 4) تقييم دقة والدقة من شا، و 5) تقدير Ag تركيزات من شا.
في هذه الدراسة، البيانات الخاصة ببرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد كان كبيرا وإيجابياً يرتبط بتلك القيم الإيجابية AMG، مما يوحي بأن تركيز Ag في الأنسجة الحيتانيات يمكن أن تقدر بقيمة إيجابية AMG. ولذلك، وضعت شا، الذي يستند إلى قيمة إيجابية AMG ونموذج الانحدار، لتقدير تركيزات Ag في أنسجة الكبد والكلى للحيتان. عموما، نموذج انحدار مع معلمات أخرى (أي، نموذج انحدار أكثر تعقيداً) يناسب جيدا في البيانات، ولكن ومحدد في أن واحد أكثر تعقيداً في الواقع أفضل من أبسط. ولذلك، يجب اختيار أفضل نموذج الانحدار بالتحليل الإحصائي26،27. نتائج التحليل الإحصائي تشير إلى أن نموذج الانحدار الخطي كافية لتقدير تركيز Ag استناداً إلى قيمة إيجابية AMG12.
في شا لانسجة الكلي، كان يعني SD (0.35) لاختبار دقة أكبر من دقة الاختبار (0.16). على العكس من ذلك، كان SD يعني (2.8) لاختبار دقة في شا لانسجة الكبد، أصغر من أن اختبار دقة (3.24). وبناء على هذه النتيجة، ويقترح أن التوزيع المتفاوت للإشارات الإيجابية AMG وتركيزات منخفضة نسبيا Ag في أنسجة الكلي الحيتانيات تتداخل سلبا مع دقة شا لانسجة الكلي. ولذلك، قد تكون شا لانسجة الكلي دقيقة ولكن غير دقيقة. ومع ذلك، حتى توزيع إشارات إيجابية AMG وتركيزات عالية نسبيا Ag في أنسجة الكبد الحيتانيات تشير إلى أن شا لانسجة الكبد طريقة موثوقة لتقدير تركيزات Ag في أنسجة الكبد الحيتانيات. وعلاوة على ذلك، في حالة توفر الأنسجة أكثر مع تركيزات Ag المعروفة يحدده برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد، يمكن وضع نموذج انحدار أكثر دقة وأكثر دقة لتقدير تركيز Ag.
على الرغم من أن البروتوكولات الحالية توفير أسلوب adjuvant للتحقيق Ag في الأنسجة الحيوانية، ينبغي ملاحظة بعض القيود على أسلوب AMG. قد يقدم بسبب تدخل من المعادن الثقيلة الأخرى، مثل الزئبق، والبزموت إشارات AMG أولاً، إيجابية كاذبة والزنك28. ولذلك، نتائج أسلوب AMG يجب أن تفسر بطرق أخرى معينة، مثل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد، لرصد التكوين الفعلي للمعادن الثقيلة28. وثانيا، من الصعب للكشف عن معادن الثقيلة موزعة المتجانسة لأنها قد تولد أكثر إشراقا متبلور AMG الإشارات الإيجابية، التي قد لا تحدد بالتصور تحت الفحص المجهري. وعلاوة على ذلك، يصعب إشارات إيجابية AMG غير متبلور وأكثر إشراقا من تحليل مع برمجيات تحليل الصورة لأن لون AMG الإشارات الإيجابية قد تكون مماثلة لتلك التي الخلفية (على سبيل المثال.، إشارات إيجابية غير متبلور AMG العثور عليها في التجويف الدانية الكلوية). ولذلك، لا يمكن تسليط الضوء على الإشارات الإيجابية AMG بعد تعديل قيمة العتبة في برمجيات تحليل الصورة وقف إنتاج المواد الانشطارية. ثالثا، لأن القيم الإيجابية AMG تستند إلى النسبة مئوية مساحة AMG إشارات إيجابية، فمن الممكن أن يجوز الاستهانة بقيم عالية التركيز من المعادن الثقيلة.
عينات فب سهلة نسبيا لجمع وتخزين، وقد أظهرت الدراسة السابقة أن الطريقة الحالية للبوسنة والهرسك بنجاح يمكن تضخيم FFPE العينات المخزنة لأكثر من 15 سنة12. إليه AMG لا يتأثر بمختلف الأنواع الحيوانية، لأنها قد استخدمت بعنف في مختلف الأنواع الحيوانية20،،من2930،31. على الرغم من أن المادة الحالية تركز بالحيتان، كما يمكن استخدام البروتوكولات المذكورة هنا في الأنواع الحيوانية المختلفة. وباﻹضافة إلى ذلك، تكلفة أسلوب AMG مع برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد منخفضة نسبيا (بالمقارنة مع الليزر التذرية-برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد)، وهكذا البروتوكولات الحالية قيمة بالنسبة للباحثين أو البلدان التي تفتقر إلى كافية بحوث التمويل للتحقيق في التوزيع و تركيز المعادن الثقيلة في الأنسجة الحيوانية. وفي الختام، يوفر استخدام AMG مع التحليل الكمي لتعريب وشبه قياس المعادن الثقيلة منهجية ملائمة للدراسات الزمانية والصليب-الأنواع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر "شبكة شتت للحيتانيات تايوان" لجمع العينات، والتخزين، بما في ذلك "المجتمع للحيتانيات تايوان"، تايبي؛ مختبر بحوث الحيتانيات (الأستاذ سيانغ ليان تشو)، معهد علم البيئة وعلم الأحياء التطوري، جامعة تايوان الوطنية، تايبيه؛ المتحف الوطني للعلوم الطبيعية (الدكتور ياو شيو-جو)، تايشونج؛ وعلم الأحياء البحرية & للحيتانيات مركز البحوث، جامعة تشينغ كونغ الوطنية. ونشكر أيضا مكتب الغابات، ومجلس الزراعة، اليوان التنفيذي للحصول على تصريح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | --- | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers? Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , In Press (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).
- Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
