Summary
Протокол представлен autometallography для локализации Ag в китообразных тканях печени и почек. Кроме того новый пробирного, названный китообразных Пробирной гистологического Ag (Чаа) разработана для оценки концентраций Ag в этих тканях.
Abstract
Наночастиц серебра (AgNPs) широко используются в коммерческих продуктов, включая текстиль, косметики и медицинских пунктов, их сильным антимикробным воздействием. Они также могут попадать в окружающую среду и накапливаются в океане. Таким образом AgNPs являются основным источником загрязнения Ag, и повышение осведомленности общественности о экологической токсичности Ag. Предыдущие исследования показали биоаккумуляции (в производителей) и масштаб (в потребителей/хищников) АГ. Китообразных, как Апекс хищников океана, может отрицательно сказались Ag/Ag соединений. Хотя концентрации соединений Ag/Ag в тканях китообразных могут быть измерены индуктивно связанной плазмы масс-спектроскопии (ICP-MS), использование ICP-MS ограничивается его высокие капитальные затраты и требования для хранения/Подготовка тканей. Таким образом autometallography (AMG) метод с количественный анализ изображений с помощью формалин исправлена, парафин врезанных тканей (FFPE) может быть методом адъювант для локализации Ag распределения на уровне скупщиков и оценки концентрации Ag в китообразных тканей. Позитивные сигналы AMG основном коричневый черный гранул различных размеров в цитоплазме проксимальных почечных трубчатых эпителия, гепатоцитов и клеток Купфера. Иногда некоторые аморфного золотисто-желтый коричневый AMG позитивные сигналы, отмечены в просвет и базальной мембраны некоторых проксимальных почечных канальцев. Анализа для оценки концентрации Ag называется Пробирной гистологического Ag китообразных (Чаа), который представляет собой модель регрессии, установленные данным изображения количественный анализ метода AMG и ИСП-МС. Использование AMG с Чаа локализовать и полу количественную оценку тяжелых металлов обеспечивает удобный методологии для исследования пространственно временных и кросс видов.
Introduction
Наночастиц серебра (AgNPs) широко используются в коммерческих продуктов, в том числе текстильных изделий, косметики и медицинских пунктов, из-за их большой антимикробным эффекты1,2. Таким образом производство AgNPs и количество продуктов, содержащих ССПС увеличиваются за время3,4. Однако AgNPs может быть выпущено в окружающую среду и накапливаются в океан5,6. Они стали основным источником загрязнения Ag, и повышение осведомленности общественности о экологической токсичности Ag.
Статус AgNPs и Ag в морской среды является сложной и постоянно меняющейся. Предыдущие исследования показали, что AgNPs могут оставаться, частицы, совокупные, распустить, реагируют с различных химических видов или регенерироваться из ионов Ag+ ,78. Несколько типов соединений Ag, например AgCl, были найдены в морских отложениях, где они могут быть ingested бентических организмов и ввести в пищевой цепи9,10. По словам предыдущего исследования, проведенного в районе лагуны Чи ку вдоль юго-западного побережья Тайваня Ag концентрации морских отложениях являются крайне низкими и похож на коре, и те из ткани печени рыб, как правило, ниже обнаружения ограничение (< 0,025 мкг/г мокрой/мокрый)11. Однако предыдущие исследования, проведенные в различных странах продемонстрировали относительно высокие концентрации Ag в печень китообразных12,13. Концентрация Ag в печень китообразных зависит от возраста, предполагая, что источник Ag в их тела, скорее всего их добычей12. Эти выводы далее предложить биоусиления Ag в животных на более высоких трофических уровнях. Китообразных, как Апекс хищников в океане, возможно, страдал негативных медицинских последствий, вызванных Ag/Ag соединений12,,1314. Самое главное как китообразных, люди являются млекопитающие и негативных медицинских последствий, вызванных Ag/Ag соединений в китообразных могут возникнуть также в организме человека. Другими словами китообразных могут быть дозорных животных для здоровья людей и морской среды. Таким образом воздействие на здоровье человека, тканей распределение и концентрация Ag в китообразных, большую озабоченность.
Хотя концентрации соединений Ag/Ag в тканях китообразных могут быть измерены индуктивно связанной плазмы масс-спектроскопии (ICP-MS), использование ICP-MS ограничивается его высокие капитальные затраты (инструмент и содержание) и требования для хранения тканей /Preparation12,15. Кроме того обычно трудно собирать образцы всеобъемлющей тканей во всех расследованиях случаев мель китообразных из-за материально-технические трудности, нехватка людских ресурсов и нехватка соответствующих ресурсов12. Замороженные ткани проб для анализа ICP-MS хранятся не легко из-за ограниченного холодильного пространства, и образцы замороженные ткани может отказаться из-за сломанной холодильное оборудование12. Эти вышеупомянутые препятствия мешают исследования уровней загрязнения в тканях китообразных ICP-MS анализа с использованием образцов замороженные ткани. В отличие от фиксированной образцы тканей формалином сравнительно легко собирать в ходе патанатомия мертвых мель китообразных. Таким образом необходимо разработать простой в использовании и недорогой метод для обнаружения/мера тяжелых металлов в китообразных тканей с помощью фиксированной образцы тканей формалином.
Хотя скупщиков распределения и концентрации щелочных и щелочноземельных металлов могут быть изменены во время формалин исправлена, парафин врезанных (FFPE) процесс, только меньшее воздействие на переходных металлов, таких как Ag, было отмечено16. Следовательно FFPE ткани рассматривался как идеальный образец ресурс для металлических локализации и измерения16,17. Autometallography (AMG), гистохимические процесса, может усиливать тяжелых металлов как переменно размера золотисто-желтый черный AMG позитивные сигналы на разделах ткани FFPE, и эти усиленные тяжелые металлы могут быть визуализированы под световой микроскопии18, 19 , 20 , 21. Следовательно, метод AMG предоставляет информацию о скупщиков распределения тяжелых металлов. Он может обеспечить важную дополнительную информацию для изучения метаболических тяжелых металлов в биологических системах, потому что ICP-MS можно измерить только концентрация тяжелых металлов на уровне органов18. Кроме того программное обеспечение для анализа цифровых изображений, таких как ImageJ, был применен к анализу количественного гистологический ткани разделы22,23. Переменно размера золотисто-желтый черный AMG позитивные сигналы разделов ткани FFPE могут быть количественно и использованы для оценки концентраций тяжелых металлов. Хотя абсолютная концентрация Ag не может непосредственно определяется метод AMG с количественного анализа изображений, она может быть оценена путем регрессионной модели, основанные на данных, полученных от количественного анализа изображений и ICP-MS, которая называется китообразных Пробирной гистологического Ag (Чаа). Учитывая трудности измерения концентрации Ag путем анализа ICP-MS в наиболее затруднительном положении китообразных, Чаа является ценным адъювантной методом для оценки концентраций Ag в китообразных тканях, которые не могут быть определены ICP-MS анализа из-за отсутствия замороженная образцы тканей. Этот документ описывает протокол гистохимический метод (метод AMG) для локализации Ag на уровне скупщиков и assay именем Чаа для оценки концентраций Ag в тканях печени и почек китообразных.
Рисунок 1: схема, изображающие установление и применение китообразных Пробирной гистологического Ag (Чаа) для оценки концентрации Ag. Чаа = китообразных Пробирной гистологического Ag, FFPE = формалин исправлена, парафин врезанных, ИСП-МС = индуктивно связанной плазмы масс-спектроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование проводилось в соответствии с международными руководящими принципами, и разрешается использование образцов ткани китообразных Советом сельского хозяйства Тайваня (исследования позволяют 104-07.1-SB-62).
1. ткань пробоподготовки для анализа ICP-MS
Примечание: Тканей печени и почек были собраны из свеже мертвых и умеренно autolyzed мель китообразных24, включая 6 мель китообразных 4 различных видов, 1 Гремпус griseus (Gg), 2 похожую spp. (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (ЛГ), 1 оттянутая продельфины (Sa). Каждый мель китообразных имел номер поля для индивидуальной идентификации. Ткани пробоподготовки для анализа ICP-MS за метод создан в лаборатории м.х. Чэнь, и Чэнь м.х. Лаборатория провела ICP-MS анализ11,13,25.
- Собирать ткани печени и почек для анализа ICP-MS от мель китообразных и хранить их в −20 ° C до использования.
- Собирать пара согласованная печени и почечной ткани из того же затруднительном положении китообразных AMG анализа (см. шаг 2).
- Трим наружный слой ткани образцов, собранных для ICP-MS анализа с помощью скальпеля из нержавеющей стали. Внутренняя часть образцов ткани нарезать мелкими кубиками (около 1 см3) и поместите их в zip lock пластиковые мешки. Как правило каждый пакет содержит 10 г тканей.
- Храните пластиковые мешки, содержащие образцы тканей −20 ° C для последующих процедур.
- Положите 1 см3 кубов, образцы в заморозке сухой системы (-50 ° C, вакуумный насос с перемещением по крайней мере 98 Л/мин, 0,002 мбар) для по крайней мере за 72 часа до полностью высох путем взвешивания к константе.
- Однородный сушеные кубов в порошок с гомогенизатор для последующих ткани пищеварения.
- Весят 0,3 г гомогенизированные лиофилизированной образцов в 30 мл бутылки из политетрафторэтилена (ПТФЭ) и смешайте их с 10 мл 65% w/w азотной кислоты.
- Положить закрытия на PTFE бутылки, но оставлять untightened закрытия.
Примечание: Это позволяет коричневый дыма в форме бутылки PTFE и рефлюкс внутри бутылки для пищеварения до коричневого дыма исчезает и становится ясно. - Тепло переваривается образцы с горячей плите, от 30 ° C до 110/120 ° C (в соответствии с коричневой дыма, формируя условие) в бутылках PTFE для 2-3 недели до коричневатого газ в бутылках PTFE становится бесцветным и жидкости в бутылки PTFE становится полупрозрачным gree НИСМ бледно желтого или совершенно ясно.
Примечание: Выполните процесс нагрева в химической зонта. - Тепло переваривается образцы на 120 ° C для испарения азотной кислоты в бутылках PTFE до только 0,5-1 мл останков.
Примечание: Выполните процесс нагрева в Химический вытяжной шкаф и всегда контролировать увеличение температуры для обеспечения что газ не коричневатые утечки из ПТФЭ бутылки закрытия. - Затяните затворы и охладить их при комнатной температуре около 1 часа.
- Место воронки с фильтром документы на 25 мл объемные колбы и мыть оставшуюся жидкость с 1 М HNO3 окончательный объем 25 мл.
Примечание: Мыть бутылки для по крайней мере три раза и закрытие дважды. - Проверка аналитическое качество ICP-MS анализа с помощью стандартных справочных материалов, включая «отморозком»-2 (dogfish печени) и ОБЩЕЖИТИЯ-2 (dogfish мышцы).
- Используйте дубликаты каждого аналитической пробы и triplicates стандартных справочных материалов для анализа ICP-MS.
- Средние концентрации Ag каждого аналитических образцов и представить данные как основы концентрации сухого веса (мкг/г сухого веса).
2. ткань пробоподготовки для анализа AMG
- Собирать пара согласованная тканей печени и почек для анализа AMG мель китообразных и исправить их в нейтральных буферизации формалина 10% до использования.
Примечание: Храните образцы тканей в пластиковых бутылках в нейтральных буферизации формалина 10% (NBF, pH 7.0) за 24-48 часов. Объем NBF должно быть по крайней мере в 10 раз больше, чем объем тканей. - Трим формалин фиксированной печень и почки тканей с одноразовые микротомных лезвий из нержавеющей стали и разделах обрезанной ткани в видеокассет с лейблами.
Примечание: Размер каждого из разделов ткани должен быть около 2 см x 1 см и толщина каждого раздела ткани не должна превышать 3 мм., положить тканей печени и почек от того же лица в том же кассету. - Обезвоживает обрезанной ткани разделы с процессором ткани через серию градуированных этанола (70% за 1 ч, 80% за 1 ч, 95% за 1 ч, 95% за 2 ч, 100% для 1 h x 2 окрашивания блюда и 100% для 2 h), не ксилол (за 1 час и 2 h в различных блюдах окрашивание) и погружать образцы обезвоженной тканей в paraffin (за 1 час и 2 h в различных блюдах окрашивание).
- Образцы тканей обезвоженной в днища стальных гистология формы и внедрить образцы обезвоженной ткани с парафином.
- Холод формалин, фиксированной парафин врезанных блоков ткани (FFPE) на холодную тарелку до парафин застывает. Обрежьте FFPE блоков с микротома до тех пор, пока поверхность ткани подвергается.
- Холод FFPE блоков на −20 ° C в течение 10 минут в разделе FFPE блоков на 5 мкм, микротома.
- Заполните ванну с водой с двойной дистиллированной воды при температуре 45 ° C. Поднимите ленты разделов ткани и сделать их плавать на поверхности теплой воды с помощью пинцета и щетки.
- Отдельные ленты разделов ткани с помощью пинцета. Поместите на слайд микроскопа.
- Место Микроскоп слайды на слайде теплее и позволяют разделы для высыхания на ночь при 37 ° C.
- Микроскоп слайды в слайд стойки и deparaffinize их путем замачивания их в 3 различных окрашивание блюда чистого номера ксилола (примерно 200-250 мл) для 8, 5 и 3 мин.
- Гидрата ткани разделы в слайд стойки путем замачивания их в разные блюда окрашивания растворов градуированных этанола (100% этанола дважды, 90% этанола раз и 80% этанола раз [по 1 мин]) и промойте их в двойной дистиллированной воды.
Примечание: Эти решения являются примерно 200-250 мл на различных блюдах окрашивание. Для каждого мытья 30 секунд вполне достаточно. - Промыть ткани разделы в фосфат амортизированное saline (PBS) с 0,5% Тритон X-100, мыть их с PBS для несколько раз и затем промойте их в двойной дистиллированной воды.
Примечание: Эти решения являются примерно 200-250 мл на различных блюдах окрашивание. Для каждого, 30 секунд вполне достаточно. - Подготовить равные суммы трех компонентов (инициатор, модератор и активатор) предоставляемые Серебряный расширение kit в темноте и тщательно перемешать.
Примечание: Решения модератора и активатор липким, поэтому, пожалуйста, используйте Пипетка с широкий кончик отверстия (или вырезать советы для создания более широких отверстий). Для каждого слайда 300 мкл раствора смешанного (в зависимости от размера в разделе ткани), как правило, достаточно. Таким образом при использовании 10 слайдов, количество каждого компонента (инициатор, модератор и активатор) составляет 1000 мкл (комбинированное решение – 3000 мкл 10 слайдов). - Инкубируйте разделов ткани в смешанного решения для 15 мин в темноте при комнатной температуре. Полностью охватывают разделов ткани на слайдах с смешанного решения. Длиннее время инкубации может привести к ложно положительных сигналов AMG.
- Вымойте слайды с двойной дистиллированной водой и выведение их в гематоксилином 10 s как изображение.
- Вымойте слайды с проточной водой, высушить их и смонтировать их с монтажа средних.
- Просмотрите слайды под микроскопом света.
- Случайно захватить десять гистологические изображения с 40 X объектив от каждой секции ткани с помощью подключенной цифровой камеры с компьютером изображений программное обеспечение.
3. полуколичественного анализа для положительных значений AMG гистологические изображений
Примечание: AMG положительное значение означает процент от области с AMG позитивные сигналы.
- Используйте программное обеспечение для анализа изображений (ImageJ) для анализа гистологические изображения.
- Откройте гистологические изображение, нажав файл | Открытые.
- Разделить на три цветовых каналов (красный, синий и зеленый) выбранного изображения, нажав изображение | Тип | Стек RGB.
- Количественно AMG позитивные сигналы с помощью синего канала. Ядерные ложных положительных сигналов обычно снизилась под синего канала, когда пятно гематоксилином применяется для ядерных изображение (Рисунок 2).
- Измерить процент области с AMG позитивные сигналы в каждом гистологические изображения с инструментом «порог» (изображения | Отрегулируйте | Порог).
- Вручную настройте порогового значения порога для каждого гистологические изображения (от 90 до 110) на основании присутствия ложных положительных областей в ядрах и/или красных кровяных клеток.
Примечание: по умолчанию настройки, AMG позитивные сигналы должны быть выделены красным цветом. - Пресс анализировать | Задать размерыи Часть области для указания, что фракция области записи установите флажок.
- Пресс анализировать | Мера. Позитивные процент область каждого гистологические изображения отображается в столбце % площади окна результатов .
- Средняя позитивные процент области 10 гистологические изображений из каждого раздела ткани и определить результат как AMG положительное значение для каждого раздела ткани.
Рисунок 2: наличие ядерных ложных положительных сигналов под различные цветовые каналы (изображение: гематоксилином пятно). Представитель ядерной ложных положительных сигналов обозначается желтой стрелки. PPA = позитивные процент районов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
4. Создание китообразных Пробирной гистологического Ag (Чаа) по модели регрессии
Примечание: Приводимый ниже анализ выполняется в 6.01 Призма для Windows.
- Оцените взаимосвязь между результатами ICP-MS и AMG положительные значения.
- Открытое программное обеспечение, создать новый файл проекта и выберите XY и корреляции.
- Входные данные, включая результаты ICP-MS и AMG положительных значений.
- Нажмите кнопку анализ и выберите корреляции под категорию XY анализ для анализа прочности ассоциации между результатами ICP-MS и положительных значений AMG, анализ корреляции Пирсона.
Примечание: Результаты ICP-MS и AMG положительных значений должны положительно коррелироваться друг с другом; в противном случае не будут разработаны последующие регрессионная модель. - Статистически Сравните модели регрессии, включая линейной регрессии, квадратичных регрессии, кубической регрессии и линейной регрессии через происхождения, путем статистического программного обеспечения12,,2627.
Примечание: Если модель регрессии порождает нереалистичные концентрация Ag, регрессионная модель должна быть брошенных12. - Вернуться к таблице данных (левая панель) и нажмите кнопку анализ | Нелинейная регрессия (кривой) под категорию XY анализ | ОК.
- В окне Параметры: нелинейной регрессии, выбрать различные регрессионной модели на странице Fit и затем сравнить различные регрессионных моделей на странице Сравнение.
- На странице, сравнитьвыберите методы сравнения, включая дополнительную сумму квадратов F тест и критерии Akaike в информации (AIC). По результатам сравнения методов используйте в Чаа относительно подходящую модель регрессии.
- Оцените с помощью Чаа Ag концентрации китообразных тканей печени и почек с неизвестной концентрации Ag.
- Оценка точности и точности Чаа для печени и почечной ткани. На рисунке 3показана разница между точностью и точностью.
- Точность: Вычислить среднее стандартное отклонение (SD) от различия между концентрациями Ag известны и оценены.
- Точность: Выполните повторные измерения (по крайней мере в трех экземплярах) AMG положительные значения последовательных секций из же FFPE тканей. Вычислить среднее SD измерений из тканей печени или почек от различия между концентрациями известны и оценены Ag
Примечание: Методы оценки точности и точности изображены на рисунке 4.
Рисунок 3: разница между точность и повторяемость. Точность означает, насколько близко измерения в значение true (т.е., концентрация Ag определяется ИСП-МС); точности означает воспроизводимости измерения (т.е. согласованность повторные измерения AMG положительные значения из разделов тройные ткани). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: схема, изображающие методы оценки точности и точности. Чаа = китообразных Пробирной гистологического Ag; FFPE = формалин исправлена, парафин врезанных; ICP-MS = индуктивно связанной плазмы масс-спектроскопии; AI = каждый из концентрации Ag, определяется ICP-MS каждого образца соответствует паре ткани; BI = каждый из концентрации Ag, по оценкам Чаа каждого образца соответствует паре ткани; CI, ди и Ei = каждый из концентрации Ag, по оценкам Чаа тройные проб из каждого образца соответствует паре ткани; я = 1 до n. Пожалуйста, смотрите необработанные данные точность и повторяемость тестов в разделе представительных результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
5. Оценка концентрации Чаа Ag.
- Собирать ткани печени и почек от мель китообразных и исправить их в нейтральных буферизации формалина 10%.
- Обработки тканей формалином Исправлена регулярно (см. шаг 2).
- Оценки концентраций Ag китообразных тканей печени и почек с неизвестной концентрации Ag Чаа (см. шаги 3 и 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель образов AMG позитивных сигналов в китообразных тканях печени и почек показано на рисунке 5. AMG позитивные сигналы включают переменно размера коричневый черный гранул различных размеров в цитоплазме проксимальных почечных трубчатых эпителия, гепатоцитов и клеток Купфера. Иногда аморфные золотисто-желтый коричневый AMG позитивные сигналы, отмечены в просвет и базальной мембраны некоторых проксимальных почечных канальцев. Существует позитивная корреляция между результатами ICP-MS и значения позитивности AMG в печени и почечной ткани, и линейной регрессии через происхождения является предпочтительным согласно дополнительная сумма квадратов F тест и АПК12,26, 27. В точность теста среднее SDs Чаа для печени и почек являются 3.24 и 0,16, соответственно. В точности испытания среднее SDs Чаа для печени и почек являются 2.8 и 0,35 соответственно. Необработанные данные испытаний, точность и повторяемость резюмируются в таблице 1. В таблице 2кратко AMG позитивные ценности, концентрации Ag, по оценкам Чаа и концентрации Ag, ИСП-МС из тканей печени и почек этих шести мель китообразных.
Рисунок 5: представитель гистологические образов AMG позитивных сигналов в тканях печени и почек китообразных (изображение: гематоксилином пятно). (A) AMG позитивные сигналы в китообразных печеночной ткани равномерно распределены (Гремпус griseus (Gg); код поля: TP20111116; AG концентрации byinductively сочетании плазменной масс-спектроскопии (ИСП-МС): 21.82 мкг/г сухого веса). (B) AMG позитивные сигналы коричневый черный гранул различных sizesin цитоплазме гепатоцитов (красные стрелки) и клеток Купфера (красная стрелка головки) (Gg; поля Код: TP20111116). (C) несколько AMG позитивные сигналы от коричневого до черного гранулы указаны в цитоплазме гепатоцитов (красные стрелки) (похожую spp. (Ko); код поля: TC20110722; AG концентрация измеряется ICP-MS: 3.86 мкг/г сухого веса). (D) AMG позитивные сигналы в ткани китообразных почки расположены в основном в почечной коре (Gg; код поля: TP20111116; AG концентрация измеряется ICP-MS: 0,42 мкг/г сухого веса). Черная пунктирная линия находится на стыке между почечной коры и мозгового вещества. (E) выше magnification Рисунок 5 d (Красный пунктирный прямоугольник). AMG позитивные сигналы в почечной коре коричневый черный гранул различных размеров в цитоплазме эпителия проксимальных почечных трубчатые (красные стрелки). Аморфные золотисто-желтый коричневый AMG позитивные сигналы отображаются в люмен (красная стрелка голова) и базальной мембраны (желтая стрелка голова) некоторых проксимальных почечных канальцев. Не к минимальным AMG позитивные сигналы отображаются в клубочков (зеленая стрелка) и дистальных почечных канальцев (зеленая стрелка голова) (Gg; поля Код: TP20111116). (F) в thecytoplasm эпителия проксимальных почечных трубчатые (красные стрелки) показаны рассеянного коричневый гранул различных размеров (Ko; код поля: TC20110722; AG концентрация измеряется ICP-MS: 0,05 мкг/г сухого веса). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Тест точности | ||||||
| Номер поля | Печень | Почка | ||||
| ЧАА * | ICP-MS | SD | ЧАА * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 16.82 | 21,82 | 4.99 | 0,64 | 0.42 | 0,22 |
| TC20110611 | 10.12 | 2.77 | 0,96 | 0,11 | 0.05 | 0,35 |
| TC20110722 | 2.70 | 3.86 | 1.15 | 0.01 | 0.05 | 0,04 |
| TD20110608 | 0,76 | 0,06 | 7.35 | 0.02 | 0.05 | 0,06 |
| TP20110830 | 13.97 | 14.93 | 4.28 | 0,69 | 1.04 | 0,24 |
| IL20110101 | 6.00 | 1.73 | 0,72 | 0,38 | 0,14 | 0,03 |
| Значит, SD | 3.24 | Значит, SD | 0.16 | |||
| Precison тест | ||||||
| Номер поля | Печень | Почка | ||||
| ЧАА * | ICP-MS | SD | ЧАА * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 20,90 | 21,82 | 4.08 | 0,21 | 0.42 | 0.44 |
| 16.11 | 0,22 | |||||
| 17.75 | 0,14 | |||||
| TD20110608 | 1.52 | 0,06 | 1.71 | 0.00 | 0.05 | 0.02 |
| 2.40 | 0.00 | |||||
| 1.12 | 0.00 | |||||
| TP20110830 | 13.12 | 14.93 | 2.70 | 0,45 | 1.04 | 0,59 |
| 12,50 | 0.26 | |||||
| 11.35 | 0,33 | |||||
| Значит, SD | 2,83 | Значит, SD | 0,35 | |||
| * Регрессионного уравнения Чаа печень и почки были, соответственно, Y = 2.249 × X (скорректированы R2 = 0,74) и Y = 0.07288 × X (скорректированы R2 = 0,69). | ||||||
Таблица 1: представитель результаты точность и повторяемость тестов для китообразных Пробирной гистологического Ag (Чаа). Чаа = китообразных Пробирной гистологического Ag, ICP-MS = индуктивно связанной плазмы масс-спектроскопии, SD = стандартное отклонение.
| Номер поля | Виды | Печень | Почка | ||||
| AMG | ЧАА * | ICP-MS | AMG | ЧАА * | ICP-MS | ||
| TP20111116 | GG | 7.48 | 16.82 | 21,82 | 8,82 | 0,64 | 0.42 |
| TC20110611 | Ko | 4,50 | 10.12 | 2.77 | 1.52 | 0,11 | 0.05 |
| TC20110722 | Ko | 1.20 | 2.70 | 3.86 | 0,11 | 0.01 | 0.05 |
| TD20110608 | LH | 0,34 | 0,76 | 0,06 | 0,21 | 0.02 | 0.05 |
| TP20110830 | LH | 6.21 | 13.97 | 14.93 | 9.43 | 0,69 | 1.04 |
| IL20110101 | SA | 2.67 | 6.00 | 1.73 | 5.26 | 0,38 | 0,14 |
| * Регрессионного уравнения Чаа печень и почки были, соответственно, Y = 2.249 × X (скорректированы R2 = 0,74) и Y = 0.07288 × X (скорректированы R2 = 0,69). | |||||||
Таблица 2: AMG положительные значения, концентрации Ag (мкг/г, сухого веса) оценены китообразных Пробирной гистологического Ag (Чаа), и измеряется концентрация Ag (мкг/г, сухого веса) в ICP-MS из печени и почек тканей шести мель китообразных. GG = Гремпус griseus, Ko = похожую spp., Lh = Lagenodelphis hosei, Sa = оттянутая продельфины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель статьи исследования является установить метод адъювантной оценить распределение Ag на уровнях скупщиков и оценить Ag концентрации в тканях китообразных. Текущий протоколы включают в себя 1) определение концентраций Ag в китообразных тканей ICP-MS, 2) AMG анализ образцов тканей, пара согласованная с известной концентрацией Ag, 3) создание модели регрессии (Чаа) для оценки концентрации Ag AMG позитивные ценности, 4) Оценка точности и точности Чаа и 5) оценки Ag концентрации Чаа.
В этом исследовании данные ICP-MS значительно и положительно коррелировали с тех позитивных ценностей AMG, предполагая, что концентрация Ag в китообразных тканей может быть оценена путем AMG положительное значение. Таким образом Чаа, которая основана на положительное значение AMG и модель регрессии, был разработан для оценки Ag концентрации в тканях печени и почек китообразных. Как правило модель регрессии с больше параметров (то есть, более сложную модель регрессии) хорошо вписывается в данных, но это не определено, что более сложные из них на самом деле лучше, чем проще. Таким образом лучшая модель регрессии должна выбираться статистического анализа26,27. Результаты статистического анализа показывают, что модель линейной регрессии является достаточным для оценки концентрации Ag, основанный на AMG положительное значение12.
В Чаа для почечной ткани средняя SD (0,35) точность теста был больше, чем точность теста (0.16). И наоборот в Чаа для ткани печени, средняя SD (2.8) точность теста был меньше, чем точность теста (3,24). Исходя из этого, предлагается, что неравномерное распределение AMG позитивные сигналы и относительно низких концентрациях Ag в ткани китообразных почки препятствовать с точностью Чаа для почечной ткани. Таким образом Чаа для почечной ткани может быть точной, но неточным. Однако равномерное распределение AMG позитивные сигналы и относительно высокой концентрации Ag в китообразных тканях печени предположить, что Чаа для ткани печени является надежным методом для оценки концентраций Ag в китообразных тканях печени. Кроме того если доступны более тканей с известными концентрациями Ag определяется ICP-MS и более точное модель регрессии могут быть разработаны для оценки концентрации Ag.
Хотя текущий протоколы обеспечивают метод адъювантной расследовать Ag в тканях животных, следует отметить некоторые ограничения на метод AMG. Во-первых, ложно положительных AMG сигналы могут представить из-за помех от других тяжелых металлов, как ртуть, висмута и цинка28. Таким образом результаты метода AMG должны интерпретироваться с других конкретных методов, таких как ICP-MS, чтобы контролировать фактический состав тяжелых металлов28. Во-вторых это трудно обнаружить содержанием однородно распределенных хэви-метал, так как он может генерировать ярче аморфного AMG позитивные сигналы, которые не могут быть определены путем визуализации при микроскопическом исследовании. Кроме того, аморфные и ярче AMG позитивные сигналы трудно анализировать с программное обеспечение для анализа изображений, потому что цвет AMG позитивные сигналы могут быть аналогичны фона (например., аморфные AMG позитивные сигналы нашли в просвет проксимальных почечных канальцев). Таким образом AMG позитивные сигналы не выделены после регулировки порогового значения порога в программное обеспечение для анализа изображения. В-третьих потому что AMG положительные значения основаны на процент области AMG позитивные сигналы, вполне возможно, что значения высокой концентрации тяжелых металлов может быть недооценена.
FFPE образцы сравнительно легко собирать и хранить, и наши предыдущие исследования показали, что текущий метод AMG успешно может усиливать FFPE образцы хранятся для более чем 15 лет12. Механизма AMG не подвержен воздействию различных видов животных, ибо он дико использовался в различных видов животных20,,2930,31. Хотя нынешняя статья ориентирована на китообразных, протоколы, описанные здесь, также могут использоваться в различных видов животных. Кроме того, стоимость метода AMG с ИСП-МС относительно низкой (по сравнению с лазерной абляции ИСП-МС) и таким образом текущие протоколы являются ценным для исследователей или стран, не имеющих достаточных исследований, финансирование для изучения распределения и концентрация тяжелых металлов в животных тканях. В заключение использование AMG с количественного анализа для локализации и полу количественную оценку тяжелых металлов обеспечивает удобный методологии для исследования пространственно временных и кросс видов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Тайвань китообразных мель сети для сбора и хранения, в том числе китообразных общество Тайвань, Taipei; Китообразных научно-исследовательская лаборатория (профессор Лянь Сян Chou), Институт экологии и эволюционной биологии, Национальный университет Тайваня, Тайбэй; Национальный музей естественных наук (доктор Chiou Цзюй Яо), Тайчжун; и морской биологии и китообразных научно-исследовательский центр, Национальный университет Ченг Кунг. Мы также благодарим бюро лесного хозяйства, Советом сельского хозяйства, Исполнительный юань для их разрешения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | --- | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers? Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , In Press (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).
- Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
