Summary
프로토콜 cetacean 간 및 신장 조직에 Ag를 지역화 하려면 autometallography에 의해 제공 됩니다. 또한, cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설) 라는 새로운 분석 결과 그 조직에 Ag 농도 견적 하기 위하여 개발 된다.
Abstract
나노 (AgNPs) 섬유, 화장품, 그리고 그들의 강력한 항균 효과 인해 의료 항목을 포함 하 여 상용 제품에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그들은 또한 환경에 공개 될 수 있습니다 하 고 바다에 축적. 따라서, AgNPs는 Ag 오염의 주요 원천 및 Ag의 환경 독성에 대 한 대중의 인식을 증가. Ag의 (에서 소비자/육 식 동물) 확대 및 bioaccumulation (생산자)에 이전 학문은 설명 했다. 고래, 바다의 정점 육 식으로 수 있습니다 부정적인 영향 되었습니다 Ag/Ag 화합물에 의해. Cetacean 조직에 Ag/Ag 화합물의 농도 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학 (ICP-MS)에 의해 측정 될 수 있다, 비록 ICP MS를 사용 하 여 높은 자본 비용 및 조직 스토리지/준비에 대 한 요구 사항에 의해 제한 됩니다. 따라서, autometallography (AMG) 메서드를 사용 하 여 이미지 정량 분석 포 르 말린 고정, 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 조직 suborgan 수준에서 Ag 배포를 지역화 하 고 cetacean에 Ag 농도 추정 하는 보조 방법 있을 수 있습니다 조직입니다. AMG 긍정적인 신호 근 신장 관 상피, hepatocytes, Kupffer 세포의 세포질에 다양 한 크기의 검은 알갱이를 주로 갈색입니다. 때때로, 일부 비정 질 황금 노란색 갈색 AMG 긍정적인 신호는 루멘과 일부 근 신장 tubules의 지하실 막에 설명 되어 있습니다. Ag 농도 추정에 대 한 분석 결과 Cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설), AMG 방법 및 ICP-MS의 이미지 정량 분석에서 데이터에 의해 설립 하는 회귀 모델은 이름은입니다. AMG 지역화 CHAA와 반 계량 중 금속 사용 spatio 시간적 및 크로스-종 연구에 대 한 편리한 방법론을 제공 합니다.
Introduction
나노 (AgNPs) 섬유, 화장품, 그리고 그들의 위대한 항균 효과1,2인 의료 항목을 포함 하 여 상용 제품에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 따라서, AgNPs와 AgNP 포함 된 제품의 생산 시간이3,4증가 됩니다. 그러나, AgNPs 환경으로 공개 될 수 있습니다 그리고 바다5,6에 축적. 그들은 Ag 오염의 주요 소스 되 고 Ag의 환경 독성에 대 한 대중의 인식을 증가.
해양 환경에서 AgNPs Ag의 상태는 복잡 하 고 끊임없이 변화입니다. 이전 연구 AgNPs 입자, 집계, 분해, 반응 화학 종 또는+ Ag 이온7,8에서 다시 생성으로 남아 있을 수 있는 표시 했습니다. 여러 종류의 Ag, AgCl, 등 그들은 생물이 유기 체에 의해 섭취 될 수 있다 하 고 먹이 사슬9,10입력 해양 퇴적 물에서 발견 되었습니다. 대만의 남서 해안을 따라 치 구 라군 지역에서 실시 이전 연구, 해양 퇴적 물의 Ag 농도 매우 낮고 crustal 풍요에 유사한 그리고 그 생선 간 조직의 일반적으로 검출 아래 제한 (< 0.025 μ g/g 습식/습식)11. 그러나, 다른 국가에서 이전 연구는 간의 상대적으로 높은 Ag 농도 고래12,13의 설명 했다. 고래는 간은에서 Ag 농도 연령에 따라, 그들의 시체에 Ag의 소스는 대부분 그들의 먹이12제안 이다. 이 결과 더 높은 영양 수준에서 동물에 Ag의 biomagnification을 좋습니다. 고래, 바다에서 정점 육 식으로 수 있습니다 고통을 할 Ag/Ag 화합물12,,1314로 인 한 부정적인 건강에 미치는 영향. 가장 중요 한 것은, 고래, 처럼 인간은 포유동물, 및 부정적인 건강 영향 고래에 Ag/Ag 화합물으로 인 한 인간에서도 발생할 수 있습니다. 즉, 고래 해양 환경 및 인간 건강에 대 한 센 티 넬 동물 수 있습니다. 따라서, 건강 효과, 조직 분포 및 고래에 Ag의 농도 큰 관심사.
ICP-MS를 사용 하 여 높은 자본 비용 (악기 및 유지 관리) 및 조직 스토리지에 대 한 요구 사항에 의해 제한 cetacean 조직에 Ag/Ag 화합물의 농도 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학 (ICP-MS)에 의해 측정 될 수 있다, 비록 /preparation12,15. 또한, 그것은 일반적으로의 물류 어려움, 부족 인력, 관련된 리소스12의 부족으로 좌초 cetacean 경우 모든 조사에서 포괄적인 조직 샘플을 수집 어렵습니다. 냉동된 조직 샘플 ICP MS 분석에 대 한 제한 된 냉동 공간 때문에 쉽게 저장 되지 않습니다 그리고 냉동된 조직 샘플 깨진된 냉장 장비12인해 삭제 될 수 있습니다. 이러한 상기 장애물 ICP MS 분석 냉동된 조직 샘플을 사용 하 여 오염 수준 cetacean 조직에서의 수사를 방해. 반면, 포 르 말린 고정 조직 샘플은 상대적으로 죽은 좌초 고래의 검 시 동안 수집 하기 쉽다. 따라서, 그것은 포 르 말린 고정 조직 샘플을 사용 하 여 cetacean 조직에서 중 금속 검출/측정 하는 사용 하기 편한 하 고 저렴 한 방법을 개발 하는 데 필요한.
Suborgan 분포 및 농도의 알칼리 그리고 알칼리 성 지구 금속 포 르 말린 고정 하는 동안 변경 될 수 있습니다, 비록 파라핀 포함 (FFPE) 과정, 전이 금속, Ag에 낮은 효과 지적된16있다 합니다. 따라서, FFPE 직물 금속 현지화 및 측정16,17에 대 한 이상적인 샘플 자원으로 간주 되었습니다. Autometallography (AMG), 조직화 학적인 과정 FFPE 직물 단면도에 검은 AMG 긍정적인 신호를 변함없이 크기의 황금 노란색으로 중 금속을 증폭 수 있습니다 및 이러한 증폭 된 중 금속은 가벼운 현미경 검사 법18, 에서 구상 될 수 있다 19 , 20 , 21. 그러므로, AMG 메서드 중 금속의 suborgan 배포판에 정보를 제공 합니다. 그것은 ICP MS만 기관 레벨18에 중 금속의 농도 측정할 수 있기 때문에 생물 학적 시스템에서 중 금속의 대사 경로 공부에 대 한 중요 한 추가 정보를 제공할 수 있습니다. 또한, 디지털 이미지 분석 소프트웨어 ImageJ, 같은 조직학 조직 섹션22,23의 정량 분석에 적용 되었습니다. FFPE 직물 단면도의 검은 AMG 긍정적인 신호를 변함없이 크기의 황금 노란색 정량 고 중 금속의 농도 추정 하는 데 사용 될 수 있습니다. 회귀 모델 이미지 정량 분석 및 ICP-MS, cetacean 라는에서 얻은 데이터를 기반으로 예상할 수 있는 절대 Ag 농도 이미지 정량 분석 AMG 메서드에서 직접 결정 될 수 없다, 조직학 Ag 분석 결과 (욕설)입니다. ICP MS 분석 가장 좌초 고래에 의해 Ag 농도 측정에 어려움을 고려 하면 CHAA는 Ag 농도 cetacean 조직, ICP MS 분석의 부족에 의해 결정 될 수 없다 추정 하 귀중 한 보조 방법 냉동 조직 샘플입니다. 이 종이 suborgan 수준 및 고래의 간 및 신장 조직에 Ag 농도 추정 하는 욕설 이라는 분석 결과에서 Ag 지역화에 대 한 조직화 학적인 기법 (AMG 방법)의 프로토콜을 설명 합니다.
그림 1: Ag 농도 추정에 대 한 설립 및 cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설)의 응용 프로그램을 묘사 하는 순서도. CHAA cetacean 조직학 Ag 분석 결과, FFPE = = 포 르 말린 고정 파라핀 포함, ICP MS = 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Protocol
연구 국제 지침에 따라 수행 하 고 cetacean 조직 샘플의 사용은 위원회의 농업의 대만 (연구 허용 104-07.1-SB-62)에 의해 허용 되었다.
1. 조직 샘플 준비 ICP MS 분석
참고: 간, 신장 조직 수집에서 갓 죽은 고 적당히 autolyzed 좌초 고래24, 4 종, 1 그램퍼스 griseus (Gg), 6 좌초 된 고래를 포함 하 여 2 Kogia 종 (코), 2 Lagenodelphis 호세이 (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). 좌초 각 cetacean 개별 식별 필드 번호를 했다. ICP MS 분석용 조직 샘플 준비 따라 수소 첸의 연구소를 설립 하는 방법 그리고 수소 첸의 연구소 ICP MS 분석11,,1325실시.
- 좌초 고래에서 간 및 신장 조직 ICP MS 분석에 대 한 수집 하 고 사용까지 그들을 −20 ° C에 저장.
- 일치 하는 쌍 간 수집 하 고 동일한에서 신장 조직 AMG 분석을 위한 고래 좌초 (2 단계 참조).
- 스테인리스 스틸 메스와 ICP MS 분석을 위해 수집 된 조직 샘플의 바깥 레이어를 정돈 한다. 작은 조각 (약 1 c m3)으로 조직 샘플의 안쪽 부분을 잘라내어 지퍼 잠금 비닐 봉투에 넣어. 일반적으로, 각 가방에는 조직의 10 g 포함 되어 있습니다.
- 후속 절차에 대 한 −20 ° C에서 조직 샘플을 포함 하는 비닐 봉지를 저장 합니다.
- 상수 무게에 의해 완전히 건조 1 cm3 큐브 샘플 동결 건조 시스템 (-50 ° C, 적어도 98 L/min, 0.002 mBar의 변위와 진공 펌프)까지 적어도 72 h에 넣어.
- 이후 조직 소화 균질 화기와 분말으로 건조 큐브를 균질.
- 30 mL 소계 (PTFE) 병에 무 균 동결 샘플 0.3 g의 무게와 65 %w / w 질소 산의 10 mL와 함께 그들을 섞는다.
- PTFE 병에 클로저를 넣어 하지만 untightened 폐쇄를 두고.
참고:이 수 수 PTFE 병과 역류 성 식도 염에서 형성 하는 갈색 연기 소화에 대 한 병 안에 갈색 연기 사라진다 고 분명 때까지. - PTFE 병에 갈색 가스 무색와 된다 PTFE 병에서 액체 반투명 초 때까지 2 ~ 3 주 위해 PTFE 병에서 (갈색 연기 조건 형성)에 따라 110/120 ° C에 30 ° C에서 핫 플레이트로 소화 샘플 열 노란색 또는 완전히 취소에 창백을 nish
참고: 화학 증기 두건에서 난방 과정을 수행 합니다. - 0.5-1까지 PTFE 병에 질 산 증발을 120 ° C에서 소화 샘플 열 mL 남아.
참고: 화학 증기 두건에서 난방 과정을 수행 하 고 항상 갈색 가스 PTFE 병 폐쇄에서 누수 확인을 증가 하는 온도 모니터링 합니다. - 폐쇄를 강화 하 고 약 1 시간에 대 한 실내 온도에 냉각.
- 장소 필터와 퍼 널 논문 25 mL 부피 플라스 크에 씻어 25 mL의 최종 볼륨을 1 M HNO3 남은 액체.
참고: 두 번 이상 세 번 및 폐쇄 병 세척. - 얼 뜨기-2 (dogfish 간) 및 기숙사-2 (dogfish 근육)을 포함 하 여 표준 참고 자료를 사용 하 여 ICP MS 분석의 분석 품질을 확인 합니다.
- 각 분석 샘플의 중복 및 ICP MS 분석을 위한 표준 참고 자료의 triplicates를 사용 합니다.
- 각 분석 샘플의 Ag 농도 평균 하 고 건조 중량 기준 농도 (μ g/g 건조 중량)으로 데이터를 제시.
2. 조직 AMG 분석을 위한 시료 준비
- AMG 분석에 대 한 일치 하는 쌍의 간 및 신장 조직 좌초 cetacean에서 수집 하 고 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 사용까지 그들을 수정.
참고: 24 ~ 48 시간 동안 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 (NBF, pH 7.0)에 플라스틱 병에서 조직 샘플을 저장 합니다. NBF의 볼륨은 적어도 10 배 이상의 조직 볼륨 이어야 한다. - 포 르 말린 고정 간 및 신장 조직 스테인리스 일회용 톰 블레이드와 함께 트림 하 고 트림된 조직 섹션 레이블 카세트에 넣어.
참고: 각 조직 단면도의 크기 대략 2 cm x 1 cm 고 각 조직 단면도의 두께 넘지 말아야 한다 3 m m. 간 및 신장 조직 같은 카세트에 동일한 개인에서에 넣어. - 탈수는 트림 조직 섹션 등급된 에탄올 (1 시간에 70%, 1 시간에 80%, 1 시간에 대 한 95%, 2 시간에 대 한 95%, 요리, 얼룩이 1 h x 2에 대 한 100% 및 2 h에 대 한 100%)의 시리즈를 통해 조직 프로세서 (1 h 및 다른 얼룩 요리에서 2 h)에 대 한 비-크 실 렌 (1 h 및 다른 얼룩 요리에서 2 h)에 대 한 paraffin에서 탈수 조직 샘플을 젖어.
- 강철 조직학 금형의 바닥에서 탈수 조직 샘플을 놓고 파라핀과 탈수 조직 샘플을 포함 합니다.
- 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 블록 찬 격판덮개에는 파라핀 굳은 때까지 침착 해. 조직 표면 노출 될 때까지 톰와 FFPE 블록을 잘라.
- 톰에 의해 −20 ° C 10 분 섹션 5 µ m에서 FFPE 블록 FFPE 블록을 진정.
- 45 ° c.에 이중 증 류 물으로 물을 욕조를 작성 조직 단면도의 리본 들어올리고 족집게와 브러쉬를 사용 하 여 따뜻한 물 표면에 떠 있도록 합니다.
- 핀셋으로 조직 단면도의 리본을 구분 합니다. 현미경 슬라이드에 섹션을 배치 합니다.
- 현미경 슬라이드 슬라이드에 따뜻한 고 37 ° c.에 건조 하룻밤 섹션 허용
- 현미경 슬라이드를 슬라이드 선반에 넣고 순수 비-크 실 렌 (약 200 ~ 250 mL) 8, 5, 및 3 분의 3 다른 얼룩 요리에서 그들을 몸을 담글 하 여 그들을 deparaffinize.
- 슬라이드 선반에서 조직 섹션 등급된 에탄올 솔루션 (100% 에탄올 두 번, 한 번 90% 에탄올 및 80% 에탄올 한번 [각 1 분])의 다른 얼룩 요리에서 그들을 몸을 담글 하 여 수 화 그리고 이중 증 류 물에서 그들을 씻어.
참고:이 솔루션은 다른 얼룩 요리에 약 200 ~ 250 mL. 각 씻어 30 초입니다. - 조직 섹션 인산 버퍼 (PBS) 염 0.5%에서 트라이 톤 X-100, 세척 그들에 PBS를 가진 시간, 그리고 이중 증 류 물에서 그들을 씻어 다음으로 하는 린스
참고:이 솔루션은 다른 얼룩 요리에 약 200 ~ 250 mL. 각은 30 초 정도입니다. - 어두운에서 은색 향상 키트에 의해 제공 세 가지 구성 요소 (초기자, 운영자, 및 활성 제)의 동일 금액을 준비 하 고 철저 하 게 그들을 믹스.
참고: 운영자 및 활성 솔루션 스티커, 사용 하시기 바랍니다 넓은 팁 채용과 플라스틱 (또는 넓은 구멍을 만드는 팁). 각 슬라이드에 대 한 (조직 섹션의 크기)에 따라서 혼합된 솔루션의 300 μ는 충분히 일반적으로. 따라서, 10 슬라이드를 사용 하는 경우 각 구성 요소 (초기자, 운영자, 및 활성 제)의 금액은 1000 μ (혼합된 솔루션은 10 슬라이드에 대 한 3000 μ). - 실 온에서 어둠 속에서 15 분 동안 혼합 솔루션에서 조직 단면도 품 어. 완전히 혼합 솔루션 슬라이드에 조직 단면도 커버. 장시간 보육 긍정 AMG 신호 발생할 수 있습니다.
- 슬라이드 이중 증 류 물으로 세척 하 고 10 hematoxylin에 얼룩으로 counterstain s.
- 수돗물을 실행 하 고 슬라이드를 세척 하 고 건조, 설치 매체와 함께 탑재.
- 가벼운 현미경 슬라이드를 검사 합니다.
- 무작위로 컴퓨터 이미징 소프트웨어와 연결 된 디지털 카메라를 사용 하 여 각 조직 섹션에서 40 X 객관적 렌즈 10 조직학 이미지를 캡처하십시오.
3. 반 정량적 분석 조직학 이미지의 AMG 양수 값에 대 한
참고: AMG 양수 값의 AMG 긍정적인 신호 영역 비율을 의미합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ)를 사용 하 여 조직학 이미지 분석.
- 파일을 눌러 조직학 이미지를 엽니다 | 오픈.
- 이미지를 눌러 선택한 그림 3 색 채널 (빨강, 파랑 및 녹색)으로 분할 | 유형 | RGB 스택.
- 파랑 채널을 사용 하 여 AMG 긍정적인 신호를 계량. 핵 거짓 긍정적인 신호는 핵 counterstain (그림 2)에 대 한 적용 되며 얼룩 파랑 채널 아래 일반적으로 감소 됩니다.
- 임계값 도구로 각 조직학 이미지에 AMG 긍정적인 신호 영역 비율 측정 (이미지 | 조정 | 임계값).
- 수동으로 (90 ~ 110)에서 조직학 각 이미지에 대 한 임계값의 컷오프 값 거짓 긍정적인 지역 핵 또는 적혈구의 존재에 따라 조정 합니다.
참고: 기본 설정, AMG 긍정적인 신호는 빨간색으로 강조 한다. - 보도 분석 | 설정 측정, 및 지역 일부 지역 분수 기록 됩니다 지정 하려면 확인란을.
- 보도 분석 | 측정. 조직학 각 이미지의 긍정적인 비율 영역 % 영역 결과 창의 열에 표시 됩니다.
- 각 조직 섹션에서 10 조직학 이미지의 긍정적인 비율 지역 평균 고 각 조직 섹션 AMG 양수 값으로 결과 정의 합니다.
그림 2: 다른 색상 채널에서 거짓 긍정적인 신호를 핵의 존재 (counterstain: hematoxylin 얼룩). 대표적인 핵 거짓 긍정적인 신호는 노란 화살표로 표시 됩니다. PPA 영역의 긍정적인 비율 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
4. Cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설) 회귀 모델에 의해 설립
참고: 다음과 같은 분석은 Windows 용 프리즘 6.01에서 수행 됩니다.
- ICP-MS의 결과 AMG 양수 값 사이의 상관 관계를 평가 합니다.
- 소프트웨어를 열고 새 프로젝트 파일을 만들고 XY 를 선택 하 고 상관.
- ICP-MS와 AMG 양수 값의 결과 포함 하 여 입력된 데이터입니다.
- 분석 을 눌러 고 피어슨 상관 분석에 의해 ICP-MS의 결과 AMG 양수 사이 협회의 강도 분석을 XY 분석 범주 상관 관계 를 선택 합니다.
참고: ICP-MS와 AMG 양수의 결과;와 긍정적으로 상관 될 필요가 그렇지 않으면, 후속 회귀 모델 개발 안 한다. - 선형 회귀, 이차 회귀, 입방 회귀 및 기원, 통계 소프트웨어12,,2627통해 통해 선형 회귀를 포함 한 회귀 모델을 비교 하 여 통계적으로.
참고: 회귀 모델에서 비현실적인 Ag 농도, 회귀 모델 버려진된12되어야 한다. - 데이터 테이블 (왼쪽된 패널)에 다시가 서 누르고 분석 | XY 분석 범주 비선형 회귀 (곡선 적합) | 확인합니다.
- 창에서 매개 변수: 비선형 회귀, 페이지 맞춤 에서 다른 회귀 모델을 선택 하 고 다음 비교페이지에서 다른 회귀 모델을 비교.
- 비교페이지에서 여분의 합계의 사각 F 테스트 및 아카이 케의 정보 기준 (AIC) 포함 하는 비교 방법을 선택 합니다. 비교 방법의 결과 욕설에 상대적으로 적절 한 회귀 모델을 사용 합니다.
- 욕설을 사용 하 여 알 수 없는 Ag 농도와 cetacean 간 및 신장 조직의 Ag 농도 견적 한다.
- 정확성과 간 및 신장 조직에 대 한 욕설의 정밀도 평가 합니다. 정밀도 정확도 차이점은 그림 3에 나와 있습니다.
- 정확도: 알려진 및 예상 Ag 농도 차이에서 평균 표준 편차 (SD)를 계산 합니다.
- 정밀도: 동일한 FFPE 직물에서 직렬 섹션의 AMG 양수 값의 (적어도 triplicate) 반복된 측정을 수행 합니다. 알려진 및 예상 Ag 농도 사이의 차이에서 간 또는 신장 조직에서 측정의 SD 평균 계산
참고: 정확도 및 정밀도 평가의 방법은 그림 4에 묘사 된다.
그림 3: 정확도 및 정밀도 차이. 정확도 의미 얼마나 가까운 측정 하는 것입니다 진정한 가치 (즉, Ag 농도 ICP MS에 의해 결정); 정밀 (즉, triplicate 조직 섹션에서 AMG 양수 값의 반복된 측정 간의 일관성) 측정의 반복성을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 정확성과 정밀도 평가의 방법을 묘사 계획. CHAA = cetacean 조직학 Ag 분석 결과; FFPE = 포 르 말린 고정 파라핀 포함; ICP MS = 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학; Ai 각 ICP-MS 각 쌍 일치 조직 샘플;의 의해 결정 Ag 농도 = 이중 각 각 일치 하는 쌍 조직 샘플;의 욕설에 의해 추정 Ag 농도 = Ci, 디, 그리고이 각 각 일치 하는 쌍 조직 샘플; triplicate 샘플의 욕설에 의해 추정은 Ag 농도 = 내가 n 1 =. 원시 데이터의 대표적인 결과 섹션에서 정확성과 정밀 테스트를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
5입니다. 욕설에 의해 Ag 농도의 추정입니다.
- 간 및 신장 조직 좌초 고래에서 수집 하 고 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정.
- 포 르 말린 고정 조직을 일상적으로 처리 (2 단계 참조).
- 욕설에 의해 알 수 없는 Ag 농도와 cetacean 간 및 신장 조직의 Ag 농도 추정 (3, 4 단계 참조).
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Representative Results
Cetacean 간 및 신장 조직에 AMG 긍정적인 신호의 대표 이미지는 그림 5에 나와 있습니다. AMG 긍정적인 신호 근 신장 관 상피, hepatocytes, Kupffer 세포의 세포질에 다양 한 크기의 검은 알갱이 변함없이 크기의 갈색을 포함합니다. 때때로, 아 몰 퍼스 황금 노란색 갈색 AMG 긍정적인 신호 루멘과 일부 근 신장 tubules의 지하실 막에 설명 되어 있습니다. ICP-MS의 결과 간 및 신장 조직, AMG 양성 값 사이 긍정적인 상관 관계 이며 원점 통과 선형 회귀 여분의 합계의 사각 F 테스트 및 AIC12,26, 선호 27. 정확도 테스트에서 SDs 간 및 신장에 대 한 욕설의 뜻은 3.24 및 0.16, 각각. 정밀 테스트에서 SDs 간 및 신장에 대 한 욕설의 뜻은 2.8과 0.35, 각각. 원시 데이터의 정확도 및 정밀도 테스트는 표 1에 요약 되어 있습니다. AMG 양수, Ag 농도 CHAA에 의해 추정 및 Ag 농도 6 좌초 고래가의 간 및 신장 조직에서 ICP MS에 의해 측정 표 2에 요약 되어 있습니다.
그림 5: 고래의 간 및 신장 조직에 AMG 긍정적인 신호의 대표 조직학 이미지 (counterstain: hematoxylin 얼룩). (A) cetacean 간 조직에 AMG 긍정적인 신호는 균등 하 게 분산 (그램퍼스 griseus (Gg), 사회복지 코드: TP20111116; Ag 농도 측정 byinductively 결합 플라즈마 질량 분광학 (ICP-MS): 21.82 μ g/g 건조 무게). (B)는 AMG 긍정적인 신호는 다양 한 sizesin hepatocytes (빨간색 화살표)의 세포질의 검은 알갱이에 갈색와 Kupffer 세포 (빨간색 화살표 머리) (Gg; 사회복지 코드: TP20111116). (C) 몇 가지 AMG 긍정적인 신호 검은 알갱이 브라운 hepatocytes (빨간색 화살표)의 세포질에 표시 됩니다 (Kogia 종 (코); 사회복지 코드: TC20110722; ICP MS에 의해 Ag 농도 측정: 3.86 μ g/g 건조 무게). (D) cetacean 신장 조직에 긍정적인 신호는 AMG 신장 피 질에 있는 주로 (Gg; 사회복지 코드: TP20111116; ICP MS에 의해 Ag 농도 측정: 0.42 μ g/g 건조 무게). 검은색 파선은 신장 피 질과 수 질 사이의 교차점에 배치 됩니다. (E) 그림 5D (빨간색 점선된 사각형)의 높은 magnification. 신장 피 질에 AMG 긍정적인 신호 근 신장 관 상피 (빨간색 화살표)의 세포질에 다양 한 크기의 검은 알갱이에 갈색입니다. 아 몰 퍼스 황금 노란색 갈색 AMG 긍정적인 신호는 루멘 (빨간색 화살표 머리)과 일부 근 신장 tubules의 지하실 막 (황색 화살표 머리)에 표시 됩니다. 아니 최소한의 AMG에 긍정적인 신호 glomeruli (녹색 화살표) 및 원심 신장 tubules에 표시 됩니다 (녹색 화살표 머리) (Gg; 사회복지 코드: TP20111116). (F) 다양 한 크기의 흩어진된 갈색과 립 근 신장 관 상피 (빨간색 화살표)의 thecytoplasm에 표시 됩니다 (코; 사회복지 코드: TC20110722; ICP MS에 의해 Ag 농도 측정: 0.05 μ g/g 건조 무게). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 정확도 테스트 | ||||||
| 필드 번호 | 간 | 신장 | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 16.82 | 21.82 | 4.99 | 0.64 | 0.42 | 0.22 |
| TC20110611 | 10.12 | 2.77 | 0.96 | 0.11 | 0.05 | 0.35 |
| TC20110722 | 2.70 | 3.86 | 1.15 | 0.01 | 0.05 | 0.04 |
| TD20110608 | 0.76 | 0.06 | 7.35 | 0.02 | 0.05 | 0.06 |
| TP20110830 | 13.97 | 14.93 | 4.28 | 0.69 | 1.04 | 0.24 |
| IL20110101 | 6.00 | 1.73 | 0.72 | 0.38 | 0.14 | 0.03 |
| SD를 의미 | 3.24 | SD를 의미 | 0.16 | |||
| 정밀도 테스트 | ||||||
| 필드 번호 | 간 | 신장 | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 20.90 | 21.82 | 4.08 | 0.21 | 0.42 | 0.44 |
| 16.11 | 0.22 | |||||
| 17.75 | 0.14 | |||||
| TD20110608 | 1.52 | 0.06 | 1.71 | 0.00 | 0.05 | 0.02 |
| 2.40 | 0.00 | |||||
| 1.12 | 0.00 | |||||
| TP20110830 | 13.12 | 14.93 | 2.70 | 0.45 | 1.04 | 0.59 |
| 12.50 | 0.26 | |||||
| 11.35 | 0.33 | |||||
| SD를 의미 | 2.83 | SD를 의미 | 0.35 | |||
| * 간 및 신장에 대 한 욕설의 회귀 방정식은 Y 각각 2.249 × X = (R2 조정 = 0.74)와 Y = 0.07288 × X (R2 조정 = 0.69). | ||||||
표 1: cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설)에 대 한 정확성과 정밀 테스트의 대표적인 결과. CHAA cetacean 조직학 Ag 분석 결과, ICP MS = = 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학, SD = 표준 편차.
| 필드 번호 | 종 | 간 | 신장 | ||||
| AMG | CHAA * | ICP-MS | AMG | CHAA * | ICP-MS | ||
| TP20111116 | Gg | 7.48 | 16.82 | 21.82 | 8.82 | 0.64 | 0.42 |
| TC20110611 | 코 | 4.50 | 10.12 | 2.77 | 1.52 | 0.11 | 0.05 |
| TC20110722 | 코 | 1.20 | 2.70 | 3.86 | 0.11 | 0.01 | 0.05 |
| TD20110608 | Lh | 0.34 | 0.76 | 0.06 | 0.21 | 0.02 | 0.05 |
| TP20110830 | Lh | 6.21 | 13.97 | 14.93 | 9.43 | 0.69 | 1.04 |
| IL20110101 | Sa | 2.67 | 6.00 | 1.73 | 5.26 | 0.38 | 0.14 |
| * 간 및 신장에 대 한 욕설의 회귀 방정식은 Y 각각 2.249 × X = (R2 조정 = 0.74)와 Y = 0.07288 × X (R2 조정 = 0.69). | |||||||
표 2:는 AMG 양수, Ag 농도 (μ g/g, 건조 중량) cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설)에 의해 추정 및 Ag 농도 (μ g/g, 건조 무게)에 의해 측정 ICP-MS 간 및 신장에서 6 좌초 고래의 조직. Gg 그램퍼스 griseus, 코 = Kogia 종, Lh = = Lagenodelphis 호세이, Sa Stenella attenuata=.
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Discussion
문서 연구의 목적은 suborgan 수준에서 Ag 배포를 평가 하 고 cetacean 조직에 Ag 농도 추정 하는 보조 메서드를 설정 하는 것입니다. 현재 프로토콜 ICP-MS, 2) AMG 분석 알려진된 Ag 농도와 일치 하는 쌍 조직 샘플의 3) Ag 농도 추정에 대 한 회귀 모델 (욕설)의 설립에 의해 cetacean 조직에 Ag 농도의 결정 1) 포함 AMG 양수 값, 4)에 의해 평가의 정확성과 정밀도 CHAA, 및 5의) 욕설에 의해 Ag의 추정 농도.
이 연구에서 ICP-MS의 데이터 했다 크게 하 고 긍정적으로 상관의 AMG 양수, amg가 양수 값 cetacean 조직에 Ag 농도 예상할 수 있는 제안. 따라서, amg가 양수 값과 회귀 모델에 근거 하는 욕설 고래의 간 및 신장 조직에 Ag 농도 추정에 대 한 개발 되었습니다. 일반적으로, 더 많은 매개 변수 (즉, 더 복잡 한 회귀 모델)을 사용 하 여 회귀 모델, 데이터에 잘 맞는 하지만 그것은 더 복잡 한 것은 실제로 간단 하 게 하나 보다 더 나은 결정. 따라서, 최고의 회귀 모델 통계 분석26,27. 에 의해 선택 되어야 한다 통계 분석의 결과 선형 회귀 모델은 AMG 양수 값12에 따라 Ag 농도 추정 하는 충분 한 나타냅니다.
신장 조직에 대 한 욕설, 말은 SD (0.35) 정밀 테스트의 정확도 테스트 (0.16) 보다 큰 했다. 반대로, 간 조직에 대 한 욕설, 말은 SD (2.8) 정밀 테스트의 정확도 테스트 (3.24) 보다 작은 했다. 이 결과 바탕으로, 그것은 좋습니다 AMG 긍정적인 신호 및 cetacean 신장 조직에 상대적으로 낮은 Ag 농도의 고르지 못한 배급을 부정적으로 신장 조직에 대 한 욕설의 정밀도와 방해. 따라서, 신장 조직에 대 한 욕설은 정확 하지만 정확 하지 않은 수 있습니다. 그러나, AMG 긍정적인 신호 및 cetacean 간 조직에 상대적으로 높은 Ag 농도의 동등한 배급 간 조직에 대 한 욕설 신뢰할 수 있는 방법은 cetacean 간 조직에 Ag 농도 추정 하는 것이 좋습니다. 또한, 알려진된 Ag 농도 ICP MS에 의해 결정으로 더 많은 조직을 사용할 수 있다면, 더 정확 하 고 정밀한 회귀 모델 Ag 농도 예측을 개발할 수 있습니다.
현재 프로토콜은 동물 조직에 Ag를 조사 하는 보조 방법 제공, 비록 AMG 방법에 몇 가지 제한 사항이 지적 한다. 첫째, 거짓 양성 AMG 신호 비스무트, 수은 같은 다른 중 금속에서 간섭으로 인해 현재 고28아연 수 있습니다. 따라서, AMG 메서드의 결과 ICP-MS, 중 금속28의 실제 구성 모니터링 등 특정 다른 방법으로 해석 될 필요가 있다. 둘째, 밝게 비정 질 AMG 긍정적인 신호, 시각화 현미경 검사에 의해 발견 되지 않을 수 있습니다를 생성할 수 있습니다 그것 때문에 homogenously 분산된 중 금속 검출 하기 어렵습니다. 또한, 비정 질 및 밝은 AMG 긍정적인 신호는 AMG 긍정적인 신호의 색상 배경와 비슷한 수 있습니다 때문에 이미지 분석 소프트웨어와 함께 분석 하기 어려운 (예., 비정 질 AMG 긍정적인 신호에서 발견 된 근 위 신장 tubules의 루멘)입니다. 따라서, 이미지 분석 소프트웨어에서 임계값의 컷오프 값의 조정 후 AMG 긍정적인 신호를 강조 수 없습니다. 셋째, AMG 양수의 AMG 긍정적인 신호 영역 비율을 바탕으로, 때문에 그것이 매우 집중 중 금속의 값 과소 평가 될 수 있습니다 가능 합니다.
FFPE 샘플은 상대적으로 쉽게 수집 하 고 저장, 그리고 우리의 이전 연구는 현재 AMG 메서드 FFPE 샘플 15 년 이상12저장 증폭 성공적으로 수 있습니다 설명 했다. AMG의 메커니즘은 다양 한 동물 종의20,,2930,31에 격렬 하 게 사용 된 다른 동물 종에 의해 영향을 받지. 현재 문서는 고래에 초점을 맞추고, 비록 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 동물 종에도 사용할 수 있습니다. 더하여, ICP-MS와 amg가 메서드의 비용 (레이저 절제-ICP-MS),이 비해 상대적으로 낮은 고 따라서 현재 프로토콜은 연구자에 대 한 귀중 한 또는 충분 한 부족 국가 연구 자금 분포를 조사 하 고 동물의 조직에서 중 금속의 농도입니다. 결론적으로, 지역화를 정량 분석 및 중 금속 반 계량 AMG의 사용 spatio 시간적 및 크로스-종 연구에 대 한 편리한 방법론을 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 대만 Cetacean 좌초 네트워크 샘플 수집 및 저장, 대만 Cetacean 사회, 타이페이;를 포함 하 여에 대 한 감사 Cetacean 연구 실험실 (교수 선취 Siang Chou), 연구소의 생태학 및 진화 생물학, 국립 대만 대학, 타이 페이; 자연 과학 (박사 Chiou-주 야 오), 타이중;의 국립 박물관 그리고 해양 생물학 & Cetacean 연구 센터, 국립 쳉 쿵 대학. 우리 또한 그들의 허용에 대 한 임업 국, 농업 위원회, 행정원을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | --- | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
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