Summary
Ein Protokoll wird zum Ag in Wale Leber und Niere Geweben zu lokalisieren von Autometallography präsentiert. Darüber hinaus ist ein neue Assay, benannt die Wale histologischen Ag-Assay (CHAA) entwickelt, um die Ag-Konzentrationen in den Geweben zu schätzen.
Abstract
Silber-Nanopartikel (AgNPs) wurden ausgiebig in kommerziellen Produkten, einschließlich Textilien, Kosmetika und Gesundheitswesen Elemente aufgrund ihrer starken antimikrobiellen Wirkung eingesetzt. Sie auch in die Umwelt freigesetzt werden und reichern sich in den Ozean. Daher AgNPs sind die Hauptquelle der Ag Kontamination und Sensibilisierung der Umwelttoxizität von Ag steigt. Frühere Studien haben die Bioakkumulation (in Produzenten) und Vergrößerung (in Verbraucher/Raubtiere) der Ag gezeigt. Wale und Delfine, können als Spitzenprädatoren des Ozeans, negativ von der Ag/Ag-Verbindungen betroffen sind. Obwohl die Konzentrationen von Ag/Ag-Verbindungen in Wale Gewebe durch Massenspektroskopie induktiv gekoppelte Plasma (ICP-MS) gemessen werden können, ist der Einsatz von ICP-MS durch die hohen Investitionskosten und die Forderung nach Gewebe Lagerung/Vorbereitung begrenzt. Daher, eine Autometallography (AMG) Methode mit einer quantitativen Bildanalyse mit Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe möglicherweise eine adjuvante Methode Ag Vertrieb Ebene Unterorgan zu lokalisieren und schätzen die Ag-Konzentration im Wal Gewebe. Die positiven Signale von AMG sind vor allem braun bis schwarz Granulate in verschiedenen Größen im Zytoplasma der proximalen renale tubuläre Epithel, Hepatozyten und Kupffer Zellen. Gelegentlich sind einige amorphen goldgelb bis braun AMG positive Signale in das Lumen und Basalmembran von einigen proximalen Nierentubuli zur Kenntnis genommen. Der Assay für die Schätzung der Konzentration Ag ist die Cetacean histologischen Ag Assay (CHAA), benannt, die ein Regressionsmodell festgelegten Daten aus quantitativen Bildanalyse der AMG-Methode und ICP-MS ist. Die Verwendung von AMG mit CHAA lokalisieren und semi-Quantifizierung Schwermetalle bietet eine bequeme Methode für räumlich-zeitliche und Cross-Arten.
Introduction
Silber-Nanopartikel (AgNPs) wurden ausgiebig in kommerziellen Produkten, einschließlich Textilien, Kosmetika und Gesundheitswesen Elemente, aufgrund ihrer großen antimikrobiell1,2eingesetzt. Daher sind die Herstellung von AgNPs und die Anzahl der Psychopharmakologie-haltigen Arzneimitteln über Zeit3,4erhöht. Jedoch AgNPs in die Umwelt freigesetzt werden und reichern sich in den Ozean5,6. Sie sind die wichtigste Quelle der Verunreinigung Ag geworden, und das öffentliche Bewusstsein für die ökologische Toxizität der Ag steigt.
Der Status des AgNPs und der Ag in der Meeresumwelt ist kompliziert und verändert sich ständig. Früheren Studien ergaben, dass AgNPs bleiben kann, wie Partikel, Aggregat, auflösen, mit verschiedenen chemischen Spezies reagieren oder vom Ag+ -Ionen7,8regeneriert werden. Verschiedene Arten von Ag-Verbindungen, wie AgCl, wurden in marinen Sedimenten gefunden, wo sie können von benthischen Organismen aufgenommen werden und geben Sie die Nahrungskette9,10. Nach einer früheren Studie in der Chi-Ku-Lagune entlang der südwestlichen Küste von Taiwan Ag-Konzentrationen von marinen Sedimenten sind extrem niedrig und ähnlich wie die Erdkruste Fülle und denen der Fisch Leber Gewebe sind in der Regel unter den Nachweis begrenzen Sie (< 0,025 μg/g nass/nass)11. Frühere Studien, die in verschiedenen Ländern haben jedoch relativ hohe Ag-Konzentrationen in den Lebern von Walen12,13gezeigt. Die Ag-Konzentration in den Lebern von Walen ist altersabhängig, was darauf hindeutet, dass die Quelle AG in ihrem Körper am ehesten ihre Beute12. Diese Ergebnisse weiter deuten die Biomagnifikation Ag bei Tieren auf höheren trophischen Ebenen. Wale und Delfine, können als Spitzenprädatoren in den Ozean negative gesundheitliche Auswirkungen der Ag/Ag Verbindungen12,13,14erlitten haben. Am wichtigsten ist, wie Wale sind Menschen Säugetiere und die negativen gesundheitlichen Auswirkungen der Ag/Ag-Verbindungen in Walen auch beim Menschen auftreten können. Mit anderen Worten könnte Wale Sentinel Tiere für die Gesundheit der Meeresumwelt und der Menschen. Daher sind die Auswirkungen auf die Gesundheit, die Gewebeverteilung und Konzentration der Ag in Wale von großer Bedeutung.
Obwohl die Konzentrationen von Ag/Ag-Verbindungen in Wale Gewebe durch Massenspektroskopie induktiv gekoppelte Plasma (ICP-MS) gemessen werden können, ist der Einsatz von ICP-MS durch seine hohe Kapitalkosten (Instrument und Wartung) und die Anforderungen für die Lagerung von Gewebe begrenzt. Definition-12,-15. Darüber hinaus ist es in der Regel schwierig, umfassende Gewebeproben bei allen Untersuchungen der gestrandete Wale Fälle aufgrund logistischer Schwierigkeiten, ein Mangel an Arbeitskräften und ein Mangel an verwandte Ressourcen12zu sammeln. Die gefrorene Gewebeproben für ICP-MS-Analyse liegen nicht einfach aus Platzgründen begrenzt Kältetechnik und gefrorene Gewebeproben können aufgrund der gebrochenen Kältetechnik Anlagen12verworfen werden. Diese vorgenannten Hindernisse erschweren Untersuchungen der Kontamination in Wale Geweben von ICP-MS-Analyse mit gefrorene Gewebeproben. Im Gegensatz dazu Formalin fixiert Gewebeproben sind relativ einfach, während der Autopsie der Toten-Stranded Wale zu sammeln. Daher ist es notwendig, eine benutzerfreundliche und kostengünstige Methode, um erkennen/Schwermetalle in Wale Geweben Messen mit Formalin fixiert Gewebeproben zu entwickeln.
Obwohl die Unterorgan Distributionen und Konzentrationen von Alkali- und Alkali-Erden-Metalle während der Formalin fixiert verändert werden können, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Prozess, nur weniger Auswirkungen auf die Übergangsmetalle wie Ag, wurden bekannte16. Daher galt als ideale Probe Ressource für Metall Lokalisierung und Messungen16,17FFPE Gewebe. Autometallography (AMG), eine histochemische Prozess können Schwermetalle als variabel Größe goldgelb bis schwarz AMG positive Signale auf FFPE Gewebe Abschnitte zu verstärken, und diese verstärkt Schwermetalle unter Lichtmikroskopie18, visualisiert werden 19 , 20 , 21. daher die AMG-Methode informiert über die Unterorgan Verteilungen von Schwermetallen. Es kann wichtige zusätzliche Informationen für das Studium der Stoffwechselwege von Schwermetallen in biologischen Systemen, weil ICP-MS nur, die Konzentration von Schwermetallen an der Orgel Level18 messen könnenbieten. Darüber hinaus hat die Quantitative Analyse der histologischen Gewebe Abschnitte22,23digitale Bildanalyse-Software, wie z. B. ImageJ, zugewiesen. Variabel-Größe goldgelb bis schwarz AMG positive Signale der FFPE Gewebe Abschnitte kann quantifiziert und verwendet, um die Konzentrationen von Schwermetallen zu schätzen. Obwohl die absolute Konzentration Ag direkt nach der AMG-Methode mit quantitativen Bildanalyse bestimmt werden kann, kann es geschätzt werden durch ein Regressionsmodell, basierend auf den Daten aus der quantitativen Bildanalyse und ICP-MS, die Cetacean benannt ist histologischen Ag-Assay (CHAA). Angesichts der Schwierigkeiten bei der Messung der Ag-Konzentrationen durch ICP-MS-Analyse in die meisten gestrandeten Walen, CHAA ist eine wertvolle adjuvante Methode zur Ag-Konzentrationen im Wal Gewebe zu schätzen, die von ICP-MS-Analyse aufgrund der fehlenden nicht ermittelbar eingefroren Gewebeproben. Dieses Papier beschreibt das Protokoll einer histochemische Technik (AMG-Methode) zur Lokalisierung Ag auf Unterorgan Ebene und ein Test namens CHAA, die Ag-Konzentrationen in der Leber und Niere Gewebe von Walen zu schätzen.
Abbildung 1: Flussdiagramm Darstellung der Einrichtung und Anwendung der Wale histologischen Ag-Assay (CHAA) für die Schätzung der Konzentration Ag. CHAA = Wal histologischen Ag-Assay, Proteinkinase = Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten, ICP-MS = induktiv gekoppelten Plasma Massenspektroskopie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die Studie wurde nach internationalen Richtlinien durchgeführt und die Verwendung von Cetacean Gewebeproben durfte durch den Rat der Landwirtschaft von Taiwan (Forschung erlauben 104-07.1-SB-62).
(1) Gewebe Probenvorbereitung für ICP-MS-Analyse
Hinweis: Die Leber und Niere Gewebe wurden gesammelt von frisch Tote und mäßig Autolysierte gestrandete Wale24, darunter 6 gestrandete Wale und Delfine von 4 verschiedenen Arten, 1 Grampus früh (Gg), 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis Hosei (Lh), 1 Stenella Attenuata (Sa). Jede gestrandeten Wal hatte eine Feldnummer für individuelle Kennung. Die Gewebe-Probenvorbereitung für ICP-MS-Analyse folgte die Methode M.H. Chens Lab gegründet, und M.H. Chen Labor durchgeführt der ICP-MS-Analyse11,13,25.
- Leber und Niere Gewebe für ICP-MS-Analyse von gestrandeten Walen zu sammeln und bei −20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
- Sammeln Sie paar passende Leber und Niere Gewebe aus dem gleichen gestrandeten Walen für AMG-Analyse (siehe Schritt 2).
- Schneiden Sie die äußere Schicht der Gewebeproben für ICP-MS-Analyse mit einem Edelstahl-Skalpell gesammelt. Schneiden Sie den inneren Teil der Gewebeproben in kleine Würfel (ca. 1 cm3) und legen Sie sie in Zip-Lock Beutel aus Kunststoff. Normalerweise enthält jede Tasche 10 g der Gewebe.
- Speichern Sie die Plastiktüten mit Gewebeproben −20 ° C für nachfolgende Verfahren.
- Setzen Sie die 1 cm3 Würfel, die Proben in ein Einfrieren System (-50 ° C, Vakuumpumpe mit einem Hubraum von mindestens 98 L/min, 0.002 mBar) für mindestens 72 Stunden bis zum Trocknen vollständig getrocknet durch wiegen auf die Konstante.
- Die getrockneten Würfel zu Pulver mit einem Homogenisator für nachfolgende Gewebe Verdauung zu homogenisieren.
- Wiegen Sie 0,3 g homogenisierte gefriergetrocknet Proben in 30 mL Polytetrafluorethylen (PTFE) Flaschen und mischen sie mit 10 mL Salpetersäure 65 % w/w.
- Die PTFE-Flaschen anziehen Sie Verschlüsse, aber lassen Sie die Verschlüsse aufdreht.
Hinweis: Dadurch den braunen Rauch in der PTFE-Flaschen und Reflux zu bilden in der Flasche für die Verdauung bis braunen Rauch verschwindet und wird klar. - Erwärmen Sie die verdauten Proben mit einer Heizplatte von 30 ° C bis 110/120 ° C (nach der braunen Rauch bilden Zustand) in der PTFE-Flaschen für 2 bis 3 Wochen bis bräunliche Gas in den Flaschen PTFE farblos wird und die Flüssigkeit in der PTFE-Flaschen durchscheinend Gree wird Nish blass gelb oder ganz klar.
Hinweis: Führen Sie den Erwärmungsprozess in chemischen Dampfhaube. - Erhitzen Sie die verdauten Proben bei 120 ° C zu verdampfen der Salpetersäure in der PTFE-Flaschen bis nur 0,5-1 mL bleibt.
Hinweis: Durchführen Sie der Aufheizvorgang in einem chemischen Abzug, und immer überwachen Sie die Temperaturerhöhung um sicherzustellen, dass keine bräunliche Gas aus der PTFE-Flaschen-Verschlüsse entweicht. - Ziehen Sie die Verschlüsse und kühlen sie bei Raumtemperatur für ca. 1 h.
- Stelle den Trichter mit Filter Papiere auf 25 mL Volumetrische Fläschchen und waschen die restliche Flüssigkeit mit 1 M Druckaufschluss3 zu einem Endvolumen von 25 mL.
Anmerkung: Waschen Sie die Flasche für mindestens dreimal und die Schließung zweimal. - Überprüfen Sie die analytische Qualität der ICP-MS-Analyse mithilfe der standard-Referenz-Materialien, einschließlich DOLT-2 (Dogfish Leber) und Wohnheim-2 (Dogfish Muskel).
- Verwenden Sie Duplikate jeder analytische Probe und Triplicates von standard Referenzmaterialien für ICP-MS-Analyse.
- Im Durchschnitt der Ag-Konzentrationen von jedem analytischen Proben und präsentieren der Daten als Trockengewicht Grundlage Konzentration (μg/g Trockengewicht).
(2) Gewebe Probenvorbereitung für die AMG-Analyse
- Paar passende Leber und Niere Gewebe für AMG Analyse von einem gestrandeten Wal zu sammeln und bis zum Gebrauch in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixieren.
Hinweis: Bewahren Sie die Gewebeproben in Plastikflaschen in 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF, pH 7.0) für 24 bis 48 Stunden. Das Volumen der NBF sollte mindestens 10-mal größer als die Gewebevolumens. - Trimmen Sie der Formalin fixiert Leber und Niere Gewebe mit Einweg-Mikrotom Klingen aus rostfreiem Stahl und die getrimmten Gewebeschnitte in Kassetten mit Etiketten.
Hinweis: Die Größe der einzelnen Gewebeschnitte sollte ca. 2 cm x 1 cm und die Dicke der einzelnen Gewebe sollte höchstens 3 mm. Legen Sie die Leber und Niere Gewebe von der gleichen Person in der gleichen Kassette. - Austrocknen der getrimmte Gewebe Abschnitte mit einem Gewebe-Prozessor durch eine Reihe von abgestuften Ethanol (70 % für 1 h, 80 % für 1 h, 95 % 1 h, 95 % für 2 h, 100 % für 1 h x 2 Färbung Gerichte und 100 % für 2 h), nicht-Xylol (für 1 h und 2 h in verschiedenen befleckenden Gerichte) , und Tauchen Sie die dehydrierte Gewebeproben in Paraffin (für 1 h und 2 h in verschiedenen befleckenden Gerichten).
- Legen Sie die dehydrierte Gewebeproben in den Böden von Stahl Histologie Formen und Betten Sie dehydrierte Gewebeproben mit Paraffin ein.
- Kühlen Sie die Formalin Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe Blöcke auf kalte Platte fest, bis das Paraffin erstarrt. Schneiden Sie die Proteinkinase-Blöcke mit Mikrotom, bis die Gewebeoberfläche ausgesetzt ist.
- Entspannen Sie die Proteinkinase Blöcke −20 ° C für 10 min. Abschnitt die Proteinkinase-Blöcke bei 5 µm Mikrotom.
- Füllen Sie ein Wasserbad mit bidestilliertem Wasser bei 45 ° C. Heben Sie die Bänder von Gewebeschnitten und machen sie auf der Oberfläche des warmen Wassers Schwimmen mit Pinzette und Pinsel.
- Trennen Sie die Bänder der Gewebeschnitte mit einer Pinzette. Legen Sie einen Abschnitt auf einen Objektträger.
- Legen Sie den Objektträger auf einer Folie wärmer und lassen Sie Abschnitte über Nacht trocknen bei 37 ° C.
- Setzen Sie den Objektträger in Folie-Racks und deparaffinize sie durch Einweichen in 3 verschiedenen befleckenden Gerichte der reine nicht-Xylol (ca. 200 bis 250 mL) für 8, 5 und 3 min.
- Hydrat die Gewebeschnitte in Folie-Racks durch Einweichen in verschiedenen befleckenden Gerichten abgestufte Ethanol Lösungen (100 % Äthanol zweimal, einmal 90 % Ethanol und 80 % Ethanol einmal [1 min]), und spülen Sie sie in bidestilliertem Wasser.
Hinweis: Diese Lösungen sind etwa 200 bis 250 mL in verschiedenen befleckenden Gerichten. Bei jedem Waschgang reicht 30 sec. - Das Gewebe in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,5 % Triton x-100, Waschen mit PBS für mehrere Male Abschnitten, und spülen Sie sie dann in bidestilliertem Wasser spülen.
Hinweis: Diese Lösungen sind etwa 200 bis 250 mL in verschiedenen befleckenden Gerichten. Für jeden war, reicht 30 sec. - Bereiten Sie gleiche Mengen der drei Komponenten (Initiator, Moderator und Aktivator) zur Verfügung gestellt vom Silber Erweiterung Kit in Dunkelheit und mischen Sie gründlich.
Hinweis: Die Lösungen der Moderator und Aktivator sind klebrig, so benutzen Sie bitte pipette mit Breite Spitze Öffnungen (oder schneiden Sie die Tipps für größere Öffnungen zu erstellen). Für jede Folie ist in der Regel genug 300 μL der gemischten Lösung (abhängig von der Größe des Abschnitts Gewebe). Wenn 10 Folien verwendet werden, also die Menge der einzelnen Komponenten (Initiator, Moderator und Aktivator) 1000 μL (gemischte Lösung ist 3000 μl für 10 Folien). - Inkubieren Sie die Gewebeschnitte in der gemischten Lösung für 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Decken Sie vollständig die Gewebeschnitte auf den Folien mit der gemischten Lösung. Eine längere Inkubationszeit kann zu falsch-positiven AMG Signale führen.
- Der Objektträger mit bidestilliertem Wasser waschen und Färben sie in Hämatoxylin für 10 s als eine gegenfärbung.
- Der Objektträger mit fließendem Leitungswasser waschen, abtrocknen und mit Eindeckmittel zu montieren.
- Untersuchen Sie die Folien unter einem Lichtmikroskop.
- Nach dem Zufallsprinzip erfassen Sie zehn histologische Bilder mit einem 40 X Objektiv von jedem Gewebe Abschnitt mithilfe einer angeschlossenen Digitalkameras mit Bildbearbeitungssoftware Computer.
(3) Semi-Quantitative Analyse für AMG Positive Werte der histologische Bilder
Hinweis: AMG positiver Wert bedeutet den Prozentsatz des Bereichs mit AMG positive Signale.
- Die histologische Bilder analysieren mittels Bildanalyse-Software (ImageJ).
- Das histologische Bild durch Drücken Datei öffnen | Offene.
- Das ausgewählte Bild in drei Farbkanäle (rot, blau und grün) aufgeteilt, durch Drücken der Bild | Typ | RGB-Stack.
- Quantifizieren Sie die AMG positive Signale mit den Blau-Kanal. Nukleare falsche positive Signale sind in der Regel unter den blauen Kanal verringert, wenn Hämatoxylin Fleck für nukleare gegenfärbung (Abbildung 2) angewendet wird.
- Messen Sie den Prozentsatz des Bereichs mit AMG positive Signale in jeder histologischen Bild mit dem Schwellenwert-Werkzeug (Bild | Anpassen | Schwelle).
- Manuell anpassen der Grenzwert des Schwellenwerts für jedes histologischen Bild (von 90 bis 110) basierend auf das Vorhandensein der falschen positive Bereiche in Kerne und/oder roten Blutkörperchen.
Hinweis: In Verzug zu setzen, sollte die AMG positive Signale in rot hervorgehoben werden. - Presse analysieren | Legen Sie Messungen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bereich Bruchteil angeben, dass der Bereich Bruchteil erfasst wird.
- Presse analysieren | Maßnahme. Die positive Prozent Bereich jedes histologischen Bildes wird in der Spalte % Bereich des Ergebnisfensters angezeigt.
- Im Durchschnitt die positive prozentuale Bereiche 10 histologische Bilder von jedem Gewebe-Abschnitt und definieren Sie das Ergebnis als der AMG positive Wert für jeden Abschnitt des Gewebes.
Abbildung 2: das Vorhandensein von nuklearen falsche positive Signale unter verschiedenen Farbkanäle (gegenfärbung: Hämatoxylin Fleck). Repräsentative nuklearen falsche positive Signale sind durch gelbe Pfeile angedeutet. PPA = positiven Prozentwert der Bereiche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
4. Einrichtung der Wale histologischen Ag-Assay (CHAA) durch Regressionsmodell
Hinweis: Die folgende Analyse wird im Prisma 6.01 für Windows durchgeführt.
- Die Korrelation zwischen den Ergebnissen der ICP-MS und AMG positive Werte zu bewerten.
- Öffnen Sie die Software, erstellen Sie eine neue Projektdatei enthält, und wählen Sie XY und Korrelation.
- Input-Daten einschließlich der Ergebnisse der ICP-MS und AMG positive Werte.
- Presseschau und Korrelation zu wählen, unter der Kategorie XY-Analyse , die Stärke der Verbindung zwischen den Ergebnissen der ICP-MS und AMG bei positiven Werten von Pearson Korrelationsanalyse zu analysieren.
Hinweis: Die Ergebnisse der ICP-MS und AMG positive Werte müssen positiv miteinander korreliert werden. Andernfalls sollten die nachfolgenden Regressionsmodell nicht entwickelt werden. - Vergleichen Sie statistisch die Regressionsmodelle, einschließlich lineare Regression, quadratische Regression, kubische Regression und lineare Regression über Origin, durch Statistiken Software12,26,27.
Hinweis: Wenn das Regressionsmodell eine unrealistische Ag Konzentration erzeugt, sollte das Regressionsmodell verlassenen12sein. - Zurück in der Datentabelle (links) und Presseschau | Nicht-lineare Regression (Kurvenanpassung) unter der Kategorie XY Analyse | "OK".
- Im Fenster Parameter: nicht-lineare Regression, wählen Sie verschiedene Regressionsmodell in der Seite passen und dann vergleichen verschiedene Regressionsmodelle auf der Seite vergleichen.
- Wählen Sie auf der Seite vergleichendie Vergleichsmethoden, einschließlich der Summe der Quadrate extra F-Test und Akaikes Information Kriterium (AIC). Verwenden Sie nach den Ergebnissen der Vergleichsmethoden eine relativ angemessene Regressionsmodell in der CHAA.
- Schätzen Sie Ag-Konzentrationen der Wale Leber und Niere Gewebe mit unbekannten Ag Konzentrationen mithilfe der CHAA.
- Die Genauigkeit und Präzision von CHAA für Leber und Niere Gewebe zu bewerten. Der Unterschied zwischen Präzision und Genauigkeit ist in Abbildung 3dargestellt.
- Genauigkeit: Berechnen Sie die mittlere Standardabweichung (SD) aus den Unterschieden zwischen bekannten und geschätzten Ag-Konzentrationen.
- Präzision: Führen Sie wiederholte Messung (mindestens dreifacher) AMG positive Werte von Schnittserien aus dem gleichen FFPE-Gewebe. Berechnen Sie den Mittelwert SD der Messungen von Leber oder Niere Gewebe aus Unterschieden zwischen bekannten und geschätzten Ag-Konzentrationen
Hinweis: Die Methoden zur Bewertung der Genauigkeit und Präzision sind in Abbildung 4dargestellt.
Abbildung 3: der Unterschied zwischen Genauigkeit und Präzision. Genauigkeit bedeutet, wie nah die Messung an den wahren Wert (d. h. Ag Konzentration bestimmt durch ICP-MS); Präzision bedeutet die Reproduzierbarkeit der Messung (d. h., die Konsistenz zwischen der wiederholten Messungen von AMG positive Werte von dreifacher Gewebeschnitte). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: das Schema, die Darstellung der Methoden zur Bewertung der Genauigkeit und Präzision. CHAA = Wal histologischen Ag Assay; Proteinkinase = Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten; ICP-MS = induktiv gekoppelten Plasma Massenspektroskopie; AI = jeweils der Ag Konzentrationen bestimmt durch ICP-MS von jedem Paar abgestimmt Gewebeprobe; BI = jeweils der Ag Konzentrationen geschätzt von CHAA jedes Paar abgestimmt Gewebeprobe; CI, Di und Ei = jeweils der Ag-Konzentrationen geschätzt von CHAA dreifacher Proben aus jedem Paar abgestimmt Gewebeprobe; Ich = 1 bis n. Finden Sie die Rohdaten der Genauigkeit und Präzision Tests im Bereich der repräsentative Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
5. Abschätzung der Ag-Konzentrationen von CHAA.
- Die Leber und Niere Gewebe von gestrandeten Walen zu sammeln und in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixieren.
- Das Formalin fixiert Gewebe routinemäßig zu verarbeiten (siehe Schritt 2).
- Die Ag-Konzentrationen der Wale Leber und Niere Gewebe mit unbekannten Ag-Konzentrationen von CHAA zu schätzen (siehe Schritte 3 und 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repräsentative Bilder der AMG positive Signale in den Wal Geweben Leber und Niere sind in Abbildung 5dargestellt. Die AMG positive Signale sind variabel große braune bis schwarze Granulate in verschiedenen Größen im Zytoplasma der proximalen renale tubuläre Epithel, Hepatozyten und Kupffer Zellen. Gelegentlich sind amorphe goldgelb bis braun AMG positive Signale in das Lumen und Basalmembran von einigen proximalen Nierentubuli zur Kenntnis genommen. Es gibt eine positive Korrelation zwischen den Ergebnissen der ICP-MS und AMG Positivität Werte in Leber und Niere Gewebe und linearer Regression über Origin bevorzugt entsprechend der Summe der Quadrate extra F-Test und AIC12,26, 27. In den Genauigkeitstest die SDs von CHAA für Leber und Niere sind 3.24 und 0,16, beziehungsweise. In der Präzisions-Test die SDs von CHAA für Leber und Niere sind 2,8 und 0,35, bzw.. Die Rohdaten der Genauigkeit und Präzision Tests sind in Tabelle 1zusammengefasst. Die AMG positive Werte, Ag-Konzentrationen von CHAA geschätzt und Ag-Konzentrationen gemessen von ICP-MS aus dem Leber und Niere Gewebe von diesen sechs gestrandete Wale und Delfine sind in Tabelle 2zusammengefasst.
Abbildung 5: Repräsentative histologische Bilder der AMG positive Signale in der Leber und Niere Geweben von Walen (gegenfärbung: Hämatoxylin Fleck). (A) der AMG positive Signale in Wale Lebergewebe sind gleichmäßig verteilt (Grampus früh (Gg), Feld-Code: TP20111116; AG Konzentration gemessen Byinductively gekoppelten Plasma Massenspektroskopie (ICP-MS): 21.82 μg/g Trockengewicht). (B) die AMG positive Signale sind braun bis Schwarz Granulat von verschiedenen Sizesin Zytoplasma der Hepatozyten (rote Pfeile) und Kupffer Zellen (roter Pfeil Köpfe) (Gg; Feld Code: TP20111116). (C) ein paar AMG positive Signale der braune bis schwarze Körnchen im Zytoplasma der Hepatozyten (rote Pfeile) gezeigt werden (Kogia spp. (Ko), Feld-Code: TC20110722; AG-Konzentration gemessen von ICP-MS: 3,86 μg/g Trockengewicht). (D) die AMG positive Signale in Wale nierengewebe befinden sich hauptsächlich in der Nierenrinde (Gg; Feld Code: TP20111116; AG-Konzentration gemessen von ICP-MS: 0,42 µg/g Trockengewicht). Die schwarz gestrichelte Linie befindet sich auf der Kreuzung zwischen der Nierenrinde und Medulla. (E) höhere Vergrößerung der Abbildung 5 (rote gestrichelte Rechteck). Die AMG positive Signale in der Nierenrinde sind braun bis schwarz Granulate in verschiedenen Größen im Zytoplasma der proximalen renale tubuläre Epithel (rote Pfeile). Amorphe goldgelb bis braun AMG positive Signale werden in das Lumen (roter Pfeilspitze) und Basalmembran (gelbe Pfeilspitze) von einigen proximalen Nierentubuli angezeigt. Nein zu minimalen AMG sind positive Signale in den Glomeruli (grüner Pfeil) und distalen Nierentubuli angezeigt (grüner Pfeil) (Gg; Feld Code: TP20111116). (F) verstreut braune Granulate in verschiedenen Größen werden in Thecytoplasm der proximalen renale tubuläre Epithel (rote Pfeile) angezeigt (Ko; Feld Code: TC20110722; AG-Konzentration gemessen von ICP-MS: 0,05 µg/g Trockengewicht). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Genauigkeitstest | ||||||
| Feldnummer | Leber | Niere | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 16.82 | 21.82 | 4.99 | 0.64 | 0,42 | 0,22 |
| TC20110611 | 10.12 | 2,77 | 0,96 | 0,11 | 0.05 | 0,35 |
| TC20110722 | 2.70 | 3.86 | 1.15 | 0,01 | 0.05 | 0,04 |
| TD20110608 | 0,76 | 0,06 | 7,35 | 0.02 | 0.05 | 0,06 |
| TP20110830 | 13.97 | 14,93 | 4.28 | 0.69 | 1.04 | 0,24 |
| IL20110101 | 6,00 | 1,73 | 0,72 | 0,38 | 0,14 | 0,03 |
| Meine SD | 3.24 | Meine SD | 0,16 | |||
| PRECISON test | ||||||
| Feldnummer | Leber | Niere | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 20.90 | 21.82 | 4.08 | 0.21 | 0,42 | 0,44 |
| 16.11 | 0,22 | |||||
| 17,75 | 0,14 | |||||
| TD20110608 | 1.52 | 0,06 | 1.71 | 0.00 | 0.05 | 0.02 |
| 2.40 | 0.00 | |||||
| 1.12 | 0.00 | |||||
| TP20110830 | 13.12 | 14,93 | 2.70 | 0,45 | 1.04 | 0,59 |
| 12.50 | 0.26 | |||||
| 11,35 | 0,33 | |||||
| Meine SD | 2,83 | Meine SD | 0,35 | |||
| * Die Regressionsgleichungen CHAA für Leber und Nieren wurden bzw. Y = 2.249 × X (R2 eingestellt = 0.74) und Y = 0.07288 × X (R2 eingestellt = 0,69). | ||||||
Tabelle 1: die repräsentativen Ergebnisse der Genauigkeit und Präzision Tests für Wale histologischen Ag-Assay (CHAA). CHAA = Wal histologischen Ag-Assay, ICP-MS = induktiv gekoppelten Plasma Massenspektroskopie, SD = Standardabweichung.
| Feldnummer | Arten | Leber | Niere | ||||
| AMG | CHAA * | ICP-MS | AMG | CHAA * | ICP-MS | ||
| TP20111116 | GG | 7.48 | 16.82 | 21.82 | 8,82 | 0.64 | 0,42 |
| TC20110611 | Ko | 4.50 | 10.12 | 2,77 | 1.52 | 0,11 | 0.05 |
| TC20110722 | Ko | 1.20 | 2.70 | 3.86 | 0,11 | 0,01 | 0.05 |
| TD20110608 | LH | 0,34 | 0,76 | 0,06 | 0.21 | 0.02 | 0.05 |
| TP20110830 | LH | 6.21 | 13.97 | 14,93 | 9.43 | 0.69 | 1.04 |
| IL20110101 | Sa | 2.67 | 6,00 | 1,73 | 5.26 | 0,38 | 0,14 |
| * Die Regressionsgleichungen CHAA für Leber und Nieren wurden bzw. Y = 2.249 × X (R2 eingestellt = 0.74) und Y = 0.07288 × X (R2 eingestellt = 0,69). | |||||||
Tabelle 2: die AMG positive Werte, Ag-Konzentrationen (μg/g, Trockengewicht) von Cetacean histologischen Ag-Assay (CHAA) geschätzt, und Ag-Konzentrationen (μg/g, Trockengewicht) gemessen von ICP-MS von Leber und Niere Gewebe von sechs gestrandeten Walen. GG = Grampus früh, Ko = Kogia spp., Lh = Lagenodelphis Hosei, Sa = Stenella Attenuata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der Zweck der Artikel Studie soll eine adjuvante Methode, Ag Quantil Unterorgan Ebenen und Ag-Konzentrationen im Gewebe Wale abzuschätzen. Die aktuellen Protokolle umfassen (1) Ermittlung der Ag-Konzentrationen in Wale Geweben von ICP-MS, (2) AMG Analyse von paar abgestimmt Gewebeproben mit bekannten Ag Konzentrationen (3) Einrichtung des Regressionsmodells (CHAA) für die Schätzung der Ag-Konzentrationen von AMG positive Werte, 4) Bewertung der Genauigkeit und Präzision von CHAA und 5) Schätzung der Ag-Konzentrationen von CHAA.
In dieser Studie wurden die Daten der ICP-MS deutlich und positiv korreliert, mit denen der AMG positive Werte, was darauf hindeutet, dass die Ag-Konzentration im Wal Gewebe von AMG ein positiver Wert geschätzt werden kann. Daher entwickelte CHAA, basierend auf den positiven Wert AMG und Regressionsmodell für die Schätzung der Ag-Konzentrationen in der Leber und Niere Geweben von Walen. In der Regel ein Regressionsmodell mit mehreren Parametern (z. B. ein komplexer Regressionsmodell) passt gut in die Daten, aber es ist unbestimmt, dass die komplexeren tatsächlich besser als die einfacher ist. Daher muss das beste Regressionsmodell gewählt werden, durch statistische Analyse26,27. Die Ergebnisse der statistischen Analyse zeigen, dass das lineare Regressionsmodell ausreicht, um die Ag Konzentration anhand der AMG positiver Wert12zu schätzen.
CHAA für nierengewebe war die mittlere SD (0,35) des Tests Präzision größer als die von den Genauigkeitstest (0,16). Dagegen war in CHAA für Lebergewebe, die mittlere SD (2,8) von der Präzision-Test kleiner als die von den Genauigkeitstest (3.24). Basierend auf diesem Ergebnis, wird vorgeschlagen, dass die ungleiche Verteilung der AMG positive Signale und der relativ niedrigen Konzentrationen Ag in Wale nierengewebe negativ auf die Präzision der CHAA für nierengewebe stören. Daher möglicherweise die CHAA für nierengewebe präzise aber ungenau. Jedoch die gleichmäßige Verteilung der AMG positive Signale und die relativ hohen Konzentrationen Ag in Wale Leber Gewebe legen nahe, dass die CHAA für Lebergewebe ist eine zuverlässige Methode, die Ag-Konzentrationen in Wale Leber Gewebe zu schätzen. Wenn mehr Gewebe mit bekannten Ag-Konzentrationen von ICP-MS bestimmt verfügbar sind, kann darüber hinaus eine genaue und präzise Regressionsmodell entwickelt werden, um die Konzentration der Ag zu schätzen.
Obwohl die aktuellen Protokolle eine adjuvante Ag in tierischen Geweben untersuchen zu bieten, einige Einschränkungen für die AMG-Methode hinzuweisen. Erste, falsch-positiv-AMG-Signale können präsentieren aufgrund von Interferenzen von anderen Schwermetallen wie Quecksilber, Wismut und Zink28. Daher müssen die Ergebnisse der AMG-Methode mit anderen spezifischen Methoden, wie z. B. ICP-MS, überwachen die tatsächliche Zusammensetzung der Schwermetalle28interpretiert werden. Zweitens ist es schwierig, ein homogen verteilten Schwermetall zu erkennen, weil es heller amorphen AMG positive Signale, erzeugen kann, die nicht durch Visualisierung unter mikroskopische Untersuchung identifiziert werden kann. Darüber hinaus die amorph und heller AMG positive Signale sind schwer mit Bildanalyse-Software zu analysieren, da die Farbe der AMG positive Signale möglicherweise ähnlich dem des Hintergrunds (zB., die amorphe AMG positiven Signale gefunden der Lumen des proximalen Nierentubuli). Daher können nicht der AMG positive Signale nach der Einstellung des Cut-Off-Wertes der Schwelle in die Bildanalyse-Software hervorgehoben werden. Drittens, weil die positiven Werte von AMG auf den Prozentsatz des Bereichs AMG positive Signale basieren, ist es möglich, dass die Werte der hochkonzentrierten Schwermetalle unterschätzt werden können.
FFPE-Proben sind relativ leicht zu sammeln und zu speichern, und unsere früheren Studie hat gezeigt, dass die aktuelle AMG-Methode erfolgreich FFPE-Proben, die für mehr als 15 Jahre12gespeichert verstärken kann. Der Mechanismus der AMG ist verschiedene Tierarten, nicht betroffen, denn es Wild in verschiedenen Tierarten20,29,30,31verwendet worden ist. Obwohl der aktuelle Artikel zum Wale ausgerichtet ist, können die hier beschriebenen Protokolle auch bei verschiedenen Tierarten verwendet werden. Darüber hinaus die Kosten für die AMG-Methode mit ICP-MS ist relativ gering (im Vergleich zu Laser-Ablation-ICP-MS), und somit die aktuellen Protokolle sind wertvoll für Forscher oder Ländern fehlen ausreichende Forschungsförderung um die Verteilung zu untersuchen und Konzentration von Schwermetallen in tierischen Geweben. Abschließend bietet die Verwendung von AMG mit Quantitative Analyse zu lokalisieren und semi-Quantifizierung Schwermetalle eine bequeme Methode für räumlich-zeitliche und Cross-Arten Studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken dem Taiwan Cetacean Verseilung Netzwerk für Probenentnahme und Lagerung, einschließlich der Taiwan Cetacean Society, Taipei; Das Cetacean Research Laboratory (Prof. Lien-Siang Chou), das Institut für Ökologie und Evolutionsbiologie, National Taiwan University, Taipei; das National Museum of Natural Science (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; und die Meeresbiologie und Cetacean Research Center, National Cheng-Kung University. Wir danken auch der Forestry Bureau, Rat für Landwirtschaft, Exekutiv-Yuan für ihre Genehmigung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | --- | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers? Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , In Press (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).
- Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
