Summary
Een protocol wordt uitgereikt om te lokaliseren Ag in walvisachtigen weefsels van de lever en de nieren door autometallography. Bovendien is een nieuwe bepaling, genaamd de walvisachtigen histologische Ag assay (CHAA) ontwikkeld voor het inschatten van de concentraties van de Ag in deze weefsels.
Abstract
Zilveren nanodeeltjes (AgNPs) zijn uitgebreid gebruikt in commerciële producten, met inbegrip van textiel, cosmetica en gezondheidszorg items, als gevolg van hun sterke antimicrobiële effecten. Zij ook mogen vrijkomen in het milieu en zich ophopen in de Oceaan. Daarom, AgNPs zijn de belangrijkste bron van verontreiniging van de Ag en bewustmaking van de milieutoxiciteit van Ag groeit. Eerdere studies hebben aangetoond de bioaccumulatie (bij producenten) en vergroting (in consumenten/roofdieren) van Ag. Walvisachtigen, kunnen als de vijanden van de apex van de Oceaan, negatief getroffen zijn door de Ag/Ag-verbindingen. Hoewel de concentraties van Ag/Ag verbindingen in walvisachtigen weefsels kunnen worden gemeten door inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICP-MS), wordt het gebruik van ICP-MS beperkt door haar hoge kapitaalkosten en de eis voor weefsel opslag/voorbereiding. Dus, een autometallography (AMG) methode met een afbeelding kwantitatieve analyse met behulp van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) weefsel is wellicht een adjuvans methode te lokaliseren Ag distributie op het niveau van de suborgan en de raming van de concentratie van de Ag in walvisachtigen weefsels. De AMG positieve signalen zijn voornamelijk bruin aan zwarte korrels van verschillende grootte in het cytoplasma van proximale renale tubulaire epitheel, hepatocyten en Kupffer cellen. Af en toe, worden sommige amorf goudgeel tot bruin AMG positieve signalen in de lumen en kelder membraan van sommige proximale renale tubuli vermeld. De assay voor het schatten van de Ag-concentratie heet het Cetacean histologische Ag Assay (CHAA), oftewel een regressiemodel vastgesteld door de gegevens uit afbeelding kwantitatieve analyse van de AMG methode en ICP-MS. Het gebruik van AMG met CHAA te lokaliseren en semi-kwantificeren zware metalen biedt een handige methode voor spatio-temporele en cross-soorten studies.
Introduction
Zilveren nanodeeltjes (AgNPs) zijn uitgebreid gebruikt in commerciële producten, met inbegrip van textiel, cosmetica en gezondheidszorg items, als gevolg van hun grote antimicrobiële effecten1,2. De productie van AgNPs en het aantal AgNP-bevattende producten zijn dan ook toegenomen van tijd3,4. Echter, AgNPs kunnen worden vrijgegeven in het milieu en zich ophopen in de oceaan5,6. Zijn ze de belangrijkste bron van verontreiniging van de Ag, en de bewustwording van de milieutoxiciteit van Ag groeit.
De status van AgNPs en Ag in het mariene milieu is ingewikkeld en voortdurend veranderende. Eerdere studies hebben aangegeven dat de AgNPs blijven kunnen als deeltjes, statistische, ontbinden, met verschillende chemische soorten reageren of worden geregenereerd van Ag+ ionen7,8. Verschillende soorten Ag verbindingen, zoals AgCl, gevonden in mariene sedimenten, waar ze door benthische organismen ingenomen kunnen worden en geef de voedselketen9,10. Volgens een eerdere studie uitgevoerd in het Chi-ku lagune gebied langs de zuidwestelijke kust van Taiwan, de concentraties van de Ag van mariene sedimenten zijn uiterst lage en vergelijkbaar met de aardkorst overvloed, en die van de vis-lever weefsel zijn meestal onder de detectie beperken (< 0,025 μg/g NAT/NAT)11. Vorige onderzoeken in verschillende landen hebben echter aangetoond dat relatief hoge concentraties van de Ag in de levers van walvisachtigen12,13. De concentratie van de Ag in de levers van walvisachtigen is leeftijd afhankelijk, suggereert dat de bron van de Ag in hun lichaam waarschijnlijk hun prooi12 is. Deze bevindingen verder stellen voor de biomagnificatie van Ag in dieren op hogere trofische niveaus. Walvisachtigen, kunnen als de apex roofdieren in de Oceaan, hebben geleden negatieve gezondheidseffecten veroorzaakt door Ag/Ag verbindingen12,13,14. Belangrijkst, zoals walvisachtigen zijn mensen zoogdieren en de negatieve gezondheid gevolgen veroorzaakt door Ag/Ag verbindingen in walvisachtigen kunnen zich ook voordoen bij mensen. Met andere woorden, zou de walvisachtigen sentinel dieren voor de gezondheid van het mariene milieu en de mens. Effecten op de gezondheid, het weefsel distributie en concentratie van de Ag in walvisachtigen zijn daarom van groot belang.
Hoewel de concentraties van Ag/Ag verbindingen in walvisachtigen weefsels kunnen worden gemeten door inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICP-MS), wordt het gebruik van ICP-MS beperkt door haar hoge kapitaalkosten (instrument en onderhoud) en de vereisten voor opslag van weefsel /Preparation12,15. Bovendien is het gewoonlijk moeilijk uitgebreide weefselmonsters in alle onderzoeken van de gestrande walvisachtigen gevallen als gevolg van logistieke problemen, een tekort aan arbeidskrachten en een gebrek aan verwante bronnen12te verzamelen. De bevroren weefselmonsters voor ICP-MS-analyse zijn niet gemakkelijk opgeslagen vanwege beperkte koeling ruimte en bevroren weefselsteekproeven toe te schrijven aan gebroken koeling apparatuur12mag worden weggegooid. Deze bovengenoemde obstakels belemmeren onderzoek naar verontreinigingen in walvisachtigen weefsels door ICP-MS-analyse met behulp van bevroren weefselmonsters. Daarentegen formaline vaste weefselsteekproeven zijn relatief gemakkelijk te verzamelen tijdens de necropsie van dode-stranded walvisachtigen. Daarom is het nodig om een makkelijk te gebruiken en goedkope methode voor het detecteren/maatregel de zware metalen in walvisachtigen weefsels met behulp van formaline vaste weefselmonsters.
Hoewel de suborgan distributies en concentraties van alkali en alkaline earth metalen kunnen worden gewijzigd tijdens de formaline-vaste, geweest paraffine-ingebedde (FFPE) proces, alleen minder effecten op overgangsmetalen, zoals Ag, bekende16. Vandaar, FFPE weefsel heeft beschouwd als een ideale steekproef bron voor metalen lokalisatie en metingen16,17. Autometallography (AMG), een histochemische proces, zware metalen als variabel formaat goudgeel tot zwarte positieve signalen van de AMG op FFPE weefselsecties kunnen versterken, en deze versterkte zware metalen kunnen worden gevisualiseerd onder de lichte microscopie van18, 19 , 20 , 21. Vandaar, de AMG-methode geeft informatie over de verdelingen van de suborgan van zware metalen. Het kan belangrijke aanvullende informatie voor het bestuderen van de metabole routes van zware metalen in biologische systemen omdat ICP-MS kan alleen het meten van de concentratie van zware metalen in het orgel niveau18bieden. Bovendien is analysesoftware van digitaal beeld, zoals ImageJ, vereffend met de kwantitatieve analyse van histologische weefsel secties22,23. De variabel en middelgrote goudgeel met zwarte AMG positieve signalen van FFPE weefselsecties kan worden gekwantificeerd en methode voor het schatten van de concentraties van zware metalen. Hoewel de absolute Ag concentratie kan niet rechtstreeks worden bepaald volgens de methode van de AMG met afbeelding kwantitatieve analyse, kan worden geschat door een regressiemodel gebaseerd op de gegevens die zijn verkregen uit de kwantitatieve beeldanalyse en ICP-MS, die walvisachtigen heet histologische Ag assay (CHAA). Gezien de moeilijkheden bij de waardering van Ag concentraties door ICP-MS analyse in meest gestrande walvisachtigen, CHAA is een waardevol adjuvans methode te schatten Ag concentraties in walvisachtigen weefsels, die kunnen niet worden bepaald door analyse van de ICP-MS als gevolg van het ontbreken van bevroren weefselmonsters. Deze paper beschrijft het protocol van een histochemische techniek (AMG-methode) voor het lokaliseren van Ag op het niveau van de suborgan en een test met de naam CHAA te schatten van de Ag-concentraties in de lever en de nier weefsels van walvisachtigen.
Figuur 1: stroomdiagram beeltenis van de vaststelling en toepassing van walvisachtigen histologische Ag assay (CHAA) voor het inschatten van de Ag concentraties. CHAA = walvisachtigen histologische Ag assay, FFPE = formaline-vaste, paraffine-ingebedde, ICP-MS = inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd uitgevoerd overeenkomstig internationale richtsnoeren, en het gebruik van walvisachtigen weefselsteekproeven was toegestaan door de Raad landbouw van Taiwan (onderzoek toestaan 104-07.1-SB-62).
1. de weefsels de bereiding van de monsters voor analyse van de ICP-MS
Opmerking: De weefsels van de lever en nieren werden verzameld uit vers dood en matig autolyzed strandde walvisachtigen24, met inbegrip van 6 gestrande walvissen in 4 verschillende soorten, 1 Grampus griseus (GW), 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Elke gestrande walvisachtigen had een veldnummer voor individuele identificatie. De bereiding van de monsters van het weefsel voor ICP-MS analyse volgde de methode opgericht in M.H. Chen's lab, en M.H. Chen's lab verricht de ICP-MS analyse11,13,25.
- Weefsels van de lever en de nier voor ICP-MS analyse van gestrande walvisachtigen verzamelen en bewaren ze op −20 ° C tot gebruik.
- Verzamelen van paar-matched lever en nier weefsels uit hetzelfde strandde walvisachtigen AMG p.a. (zie stap 2).
- Trim de buitenste laag van de weefselmonsters verzameld voor ICP-MS analyse met een scalpel roestvrij staal. Het binnenste deel van de weefselmonsters snijd in kleine blokjes (ongeveer 1 cm3) en plaats hen in zip lock plastic tassen. Normaal gesproken bevat elke zak 10 g van de weefsels.
- Opslaan van de plastic zakken met weefselsteekproeven op −20 ° C voor latere procedures.
- Zet de 1 cm3 kubussen monsters in een bevriezing droog systeem (-50 ° C, vacuümpomp met een cilinderinhoud van ten minste 98 L/min, 0,002 mBar) voor ten minste 72 uur tot volledig gedroogd door weging aan de constante.
- Meng de gedroogde kubussen tot poeder met een homogenizer voor latere weefsel spijsvertering.
- Weeg 0,3 g van gehomogeniseerde gevriesdroogd monsters in 30 mL polytetrafluorethyleen (PTFE) flessen en meng ze met 10 mL salpeterzuur van 65% w/w.
- Sluitingen zetten de PTFE-flessen, maar laat de sluitingen untightened.
Opmerking: Hierdoor de bruin rook naar formulier in de PTFE flessen en reflux in de fles voor de spijsvertering tot de bruin rook verdwijnt en duidelijk wordt. - Verwarm de verteerd monsters met een warmhoudplaat, van 30 ° C tot 110/120 ° C (volgens de bruin fume voorwaarde vormen) in de PTFE-flessen voor 2 tot 3 weken tot het bruin gas in de flessen van PTFE kleurloos wordt en de vloeistof in de PTFE flessen helder doorzichtig gree Nish bleke geel of volledig duidelijk.
Opmerking: Voer het verhittingsproces in chemische zuurkast. - Verwarm de verteerd monsters bij 120 ° C te verdampen de salpeterzuur in de PTFE-flessen tot slechts 0,5-1 mL blijft.
Opmerking: Het verhittingsproces in een chemische zuurkast uitvoeren en volgen altijd de temperatuurstijging om ervoor te zorgen dat geen bruinachtig gas van de PTFE-flessen sluitingen lekken. - Draai de sluitingen en koel ze bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 1 uur.
- Plaats de trechters met filter papers over volumetrische maatkolven van 25 mL en wassen de resterende vloeistof met 1 M HNO3 tot een eindvolume van 25 mL.
Opmerking: Wassen tweemaal de fles voor ten minste drie keer en de sluiting. - Het valideren van de analytische kwaliteit van ICP-MS-analyse met behulp van de standaard referentiematerialen, waaronder DOLT-2 (dogfish lever) en DORM-2 (dogfish spier).
- Duplicaten van elke steekproef analytische en triplicates standaard referentie materialen voor ICP-MS-analyse gebruiken.
- Gemiddelde van de Ag-concentraties van elk analytische samples en presenteren van de gegevens als drooggewicht basis concentratie (μg/g droge gewicht).
2. de weefsels de bereiding van de monsters voor analyse van de AMG
- Paar-matched lever en nier weefsels AMG p.a. van een gestrande walvisachtigen verzamelen en corrigeren in 10% neutraal gebufferde formaline tot gebruik.
Opmerking: Bewaar de weefselmonsters in plastic flessen in 10% neutraal gebufferde formaline (NBF, pH 7,0) voor 24 tot 48 uur. Het volume van de NBF moet ten minste 10 keer groter is dan het volume van weefsel. - Trim de formaline vaste lever en nier weefsels met RVS wegwerp microtoom bladen en zet de bijgesneden weefselsecties in cassettes met labels.
Opmerking: De grootte van elke weefselsecties moet ongeveer 2 x 1 cm en de dikte van elk weefselsectie mag niet hoger zijn dan 3 mm. Leg de weefsels van de lever en de nier van dezelfde persoon in de dezelfde cassette. - Uitdrogen van de schoongemaakte weefsel afdelingen met een processor van weefsel door middel van een reeks graded ethanol (70% voor 1 h, 80% gedurende 1 uur, 95% gedurende 1 uur, 95% voor 2 h, 100% voor 1 h x 2 kleuring gerechten en 100% voor 2 h), niet-xyleen (voor 1 h en 2 h in verschillende kleuring gerechten) , en dompel de gedehydrateerde weefselmonsters in paraffin (voor 1 h en 2 h in verschillende kleuring gerechten).
- Plaats de gedehydrateerde weefselmonsters in de bodems van stalen histologie mallen en embed de gedehydrateerde weefselsteekproeven met paraffine.
- Chill de formaline vaste paraffine-ingebedde (FFPE) weefsel blokken op koude plaat totdat de paraffine stolt. Trim de FFPE blokken met de microtoom totdat het oppervlak van het weefsel wordt blootgesteld.
- Chill de FFPE blokken op −20 ° C gedurende 10 minuten sectie de FFPE blokken in 5 µm door microtoom.
- Vul een waterbad met tweemaal gedestilleerd water bij 45 ° C. Til de linten van weefselsecties en laten drijven op het oppervlak van het warme water met behulp van pincet en borstels.
- Scheid de linten van weefselsecties met een pincet. Plaats een sectie op een microscoopglaasje.
- Plaats de Microscoop dia's op een dia warmer en laat secties te droge overnachting bij 37 ° C.
- Zet de Microscoop dia's in dia rekken en deparaffinize hen door inweken hen in 3 verschillende gerechten van de kleuring van pure niet-xyleen (ongeveer 200 tot 250 mL) voor 8, 5 en 3 min.
- Hydrateren de weefselsecties in dia rekken door inweken hen in verschillende kleuring gerechten van oplossingen van de gesorteerde ethanol (100% ethanol tweemaal, 90% ethanol eenmaal en 80% ethanol eenmaal [1 min elke]), en spoel ze af in tweemaal gedestilleerd water.
Opmerking: Deze oplossingen zijn ongeveer 200 tot 250 mL in verschillende kleuring gerechten. Voor elke wassen is 30 sec genoeg. - Spoelen het weefsel in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,5% Triton X-100, wassen met PBS voor verschillende tijden afdelingen, en spoel ze vervolgens af in tweemaal gedestilleerd water.
Opmerking: Deze oplossingen zijn ongeveer 200 tot 250 mL in verschillende kleuring gerechten. Voor elk was, is 30 sec genoeg. - Bereiden van gelijke hoeveelheden van de drie onderdelen (initiatiefnemer, moderator, en activator) geboden door verhoging van de zilveren kit in donker en meng ze.
Opmerking: De oplossingen van moderator en activator zijn kleverige, reserveringskalender Pipetteer met brede uiteinde openingen (of snijd de tips voor het maken van bredere openingen). Voor elke dia is 300 μL van de gemengde oplossing (afhankelijk van de grootte van de weefselsectie) meestal genoeg. Daarom, als 10 dia's worden gebruikt, het bedrag van elke component (initiatiefnemer, moderator, en activator) is 1000 μL (de gemengde oplossing is 3000 μL voor 10 dia's). - Incubeer de weefselsecties in de gemengde oplossing gedurende 15 min. in het donker bij kamertemperatuur. De weefselsecties op de dia's met de gemengde oplossing volledig te dekken. Een langere incubatietijd kan leiden tot vals-positieve AMG signalen.
- De dia's met tweemaal gedestilleerd water wassen en de vlek hen in Haematoxyline voor 10 s als een counterstain.
- Wassen van de dia's met stromend kraantjeswater, droog ze en mount ze met montage medium.
- De dia's onder een lichte Microscoop te onderzoeken.
- Willekeurig tien histologische beelden met een 40 X objectief van elk weefselsectie vastleggen met behulp van een aangesloten digitale camera met computer imagingsoftware.
3. semi-kwantitatieve analyse voor AMG positieve waarden van histologische beelden
Opmerking: AMG positieve waarde betekent dat het percentage van het gebied met AMG positieve signalen.
- Afbeelding analysesoftware (ImageJ) gebruiken om te analyseren de histologische beelden.
- Open de histologische afbeelding door te drukken op bestand | Open.
- De gekozen afbeelding splitsen in drie kleurkanalen (rood, blauw en groen) door te drukken op de afbeelding | Type | RGB Stack.
- Kwantificeren van de AMG positieve signalen met behulp van het blauwe kanaal. Nucleaire valse positieve signalen zijn meestal daalde onder het blauwe kanaal wanneer de Haematoxyline vlek wordt toegepast voor nucleaire counterstain (Figuur 2).
- Meten van het percentage van het gebied met de positieve signalen van de AMG in elke histologische afbeelding met het gereedschap drempel (afbeelding | Aanpassen | Drempel).
- Pas handmatig de licht-donkerscheiding tegenwaarde van de drempel voor elk histologisch beeld (van 90 tot 110) op basis van de aanwezigheden van valse positieve gebieden in de kernen en/of rode bloedcellen.
Opmerking: In de standaard instelling, moeten de AMG positieve signalen worden rood gemarkeerd. - Druk op analyseren | Instellen van metingen, en vink het vakje van Gebied fractie om aan te geven dat het gebied deel wordt vastgelegd.
- Druk op analyseren | Maatregel. Het positief percentage gebied van elke histologische afbeelding wordt weergegeven in de kolom % gebied van het resultaatvenster .
- Gemiddelde van de positieve percent gebieden van 10 histologische beelden van elke weefselsectie en het resultaat definiëren als de AMG positieve waarde voor elke weefselsectie.
Figuur 2: de aanwezigheid van nucleaire valse positieve signalen onder verschillende kleurkanalen (counterstain: Haematoxyline vlek). Representatieve nucleaire valse positieve signalen worden aangeduid met gele pijlen. PPA = positief percentage van gebieden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
4. oprichting van de walvisachtigen histologische Ag Assay (CHAA) door regressiemodel
Opmerking: De volgende analyse is uitgevoerd in Prism 6.01 voor Windows.
- Evalueren van de correlatie tussen de resultaten van het ICP-MS en AMG positieve waarden.
- De software niet openen, een nieuw projectbestand maken en kies XY en correlatie.
- Input gegevens met inbegrip van de resultaten van het ICP-MS en AMG positieve waarden.
- Druk op analyse en kies correlatie onder de categorie XY-analyse te analyseren van de sterkte van de associatie tussen de resultaten van het ICP-MS en AMG positieve waarden door Pearson correlatie analyse.
Opmerking: De resultaten van het ICP-MS en AMG positieve waarden moeten worden positief gecorreleerd met elkaar; anders, de latere regressiemodel niet moet worden ontwikkeld. - Statistisch vergelijken de regressiemodellen, zoals lineaire regressie, kwadratische regressie, kubieke regressie en lineaire regressie door oorsprong, door middel van statistieken software12,26,27.
Opmerking: Als het regressiemodel een onrealistisch Ag concentratie genereert, het regressiemodel moet verlaten12. - Ga terug naar de gegevenstabel (linkerdeel) en druk op analyse | Niet-lineaire regressie (kromme passen) onder de categorie XY analyse | OK.
- In het venster Parameters: niet-lineaire regressie, kiezen voor verschillende regressiemodel in de pagina- aanpassing en vergelijk verschillende regressiemodellen op de vergelijkpagina.
- Kies in de pagina vergelijken, de methoden van vergelijking, met inbegrip van het extra bedrag van-kwadraten F test- en Akaike van informatie criterium (AIC). Volgens de resultaten van de vergelijking-methoden, een relatief geschikt regressiemodel in de CHAA te gebruiken.
- Ag concentraties van de walvisachtigen weefsels van de lever en de nier met onbekende Ag concentraties schatten met behulp van de CHAA.
- Evalueren van de nauwkeurigheid en precisie van de CHAA voor lever en nier weefsels. Het verschil tussen precisie en nauwkeurigheid wordt geïllustreerd in Figuur 3.
- Nauwkeurigheid: Bereken de gemiddelde standaarddeviatie (SD) van de verschillen tussen bekende en geschatte Ag concentraties.
- Precisie: Uitvoeren herhaalde meting (op zijn minst drievoudige) van AMG positieve waarden van seriële secties van de dezelfde FFPE weefsels. Berekent het gemiddelde SD van metingen van lever- of nierziekte weefsels van verschillen tussen bekende en geschatte Ag concentraties
Opmerking: De methoden voor de evaluatie van de nauwkeurigheid en precisie zijn afgebeeld in Figuur 4.
Figuur 3: het verschil tussen nauwkeurigheid en precisie. Nauwkeurigheid betekent hoe dicht de meting en de werkelijke waarde (dat wil zeggen, Ag-concentratie bepaald door ICP-MS); precisie betekent de herhaalbaarheid van de metingen (dat wil zeggen, de consistentie tussen de herhaalde metingen van AMG positieve waarden uit de drievoudige weefselsecties). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: de beeltenis van de methoden voor de evaluatie van de nauwkeurigheid en precisie regeling. CHAA = walvisachtigen histologische Ag assay; FFPE = formaline-vaste, paraffine-ingebedde; ICP-MS = inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie; AI = elk van de concentraties van de Ag bepaald door ICP-MS van elk paar-matched weefsel monster; Bi = elk van de concentraties van de Ag geschat door CHAA van elk paar-matched weefsel monster; CI, Di en Ei = elk van de Ag concentraties geschat door CHAA drievoudige monsters van elk paar-matched weefsel monster; Ik = 1 tot n. Raadpleeg de ruwe gegevens voor de nauwkeurigheid en precisie tests in de sectie van representatieve resultaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
5. schatting van Ag concentraties door CHAA.
- De weefsels van de lever en de nier van gestrande walvisachtigen verzamelen en corrigeren in 10% neutraal gebufferde formaline.
- Verwerken van de weefsels van formaline-vaste routinematig (zie stap 2).
- Schatten van de concentraties van de Ag van de walvisachtigen weefsels van de lever en de nier met onbekende Ag concentraties door CHAA (zie stap 3 en 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve beelden van de AMG positieve signalen in de walvisachtigen weefsels van de lever en nieren zijn afgebeeld in Figuur 5. De AMG positieve signalen zijn variabel en middelgrote bruin tot zwart granulaat in verschillende grootten in het cytoplasma van proximale renale tubulaire epitheel, hepatocyten en Kupffer cellen. Af en toe, amorf goudgeel tot bruin AMG positieve signalen worden vermeld in de lumen en kelder membraan van sommige proximale renale tubuli. Er is een positieve correlatie tussen de resultaten van het ICP-MS en AMG positiviteit waarden in lever en nier weefsels en lineaire regressie door oorsprong is aangewezen volgens het extra bedrag van-kwadraten F toets en AIC12,26, 27. In de nauwkeurigheid test, het gemiddelde SDs van de CHAA voor lever en nieren zijn 3.24 0.16, respectievelijk en. In de precisie-test, het gemiddelde SDs van de CHAA voor lever en nieren zijn 2.8 en 0.35, respectievelijk. De ruwe gegevens van de nauwkeurigheid en precisie tests worden samengevat in tabel 1. De AMG positieve waarden, Ag concentraties geschat door CHAA en Ag concentraties gemeten door ICP-MS vanaf de weefsels van de lever en nieren van deze zes gestrande walvisachtigen zijn samengevat in tabel 2.
Figuur 5: vertegenwoordiger histologische beelden van de AMG positieve signalen in de weefsels van de lever en de nier van walvisachtigen (counterstain: Haematoxyline vlek). (A) de AMG positieve signalen in walvisachtigen leverweefsel zijn gelijkmatig verdeeld (Grampus griseus (Gg); museumlab code: TP20111116; AG-concentratie gemeten byinductively gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICP-MS): 21,82 μg/g droog gewicht). (B) de AMG positieve signalen zijn bruin aan zwarte korrels van verschillende sizesin het cytoplasma van hepatocyten (rode pijlen) en Kupffer (rode pijl hoofden) cellen (Gg; museumlab code: TP20111116). (C) een paar AMG positieve signalen van bruin tot zwart korrels worden weergegeven in het cytoplasma van hepatocyten (rode pijlen) (Kogia spp. (Ko); museumlab code: TC20110722; AG-concentratie gemeten door ICP-MS: 3.86 μg/g droog gewicht). (D) de AMG positieve signalen in walvisachtigen nierweefsel bevinden zich voornamelijk in de renale cortex (Gg; museumlab code: TP20111116; AG-concentratie gemeten door ICP-MS: 0.42 μg/g droog gewicht). De zwarte stippellijn wordt geplaatst op de kruising tussen de renale cortex en de medulla. (E) hogere magnification van figuur 5D (rode onderbroken rechthoek). De AMG positieve signalen in de renale cortex zijn bruin tot zwart granulaat in verschillende grootten in het cytoplasma van de proximale renale tubulaire epitheel (rode pijlen). Amorf goudgeel tot bruin AMG positieve signalen worden weergegeven in de lumen (rode pijl hoofd) en kelder membraan (gele pijl hoofd) van sommige proximale renale tubuli. Geen minimale AMG positieve signalen zijn getoond in de glomeruli (groene pijl) en distale renale tubuli (groene pijl hoofd) (Gg; museumlab code: TP20111116). (F) verspreide bruine korrels van verschillende grootte worden getoond in de thecytoplasm van de proximale renale tubulaire epitheel (rode pijlen) (Ko; museumlab code: TC20110722; AG-concentratie gemeten door ICP-MS: 0,05 μg/g droog gewicht). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Nauwkeurigheid test | ||||||
| Veldnummer | Lever | Nier | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 16.82 | 21.82 | 4.99 | 0.64 | 0,42 | 0.22 |
| TC20110611 | 10.12 | 2,77 | 0.96 | 0.11 | 0,05 | 0.35 |
| TC20110722 | 2.70 | 3.86 | 1.15 | 0,01 | 0,05 | 0.04 |
| TD20110608 | 0.76 | 0,06 | 7,35 | 0.02 | 0,05 | 0,06 |
| TP20110830 | 13.97 | 14.93 | 4.28 | 0.69 | 1.04 | 0,24 |
| IL20110101 | 6,00 | 1,73 | 0.72 | 0.38 | 0.14 | 0.03 |
| Bedoel SD | 3.24 | Bedoel SD | 0.16 | |||
| Precison test | ||||||
| Veldnummer | Lever | Nier | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 20.90 | 21.82 | 4.08 | 0.21 | 0,42 | 0.44 |
| 16.11 | 0.22 | |||||
| 17,75 | 0.14 | |||||
| TD20110608 | 1.52 | 0,06 | 1.71 | 0,00 | 0,05 | 0.02 |
| 2,40 | 0,00 | |||||
| 1.12 | 0,00 | |||||
| TP20110830 | 13.12 | 14.93 | 2.70 | 0,45 | 1.04 | 0.59 |
| 12,50 | 0.26 | |||||
| 11,35 | 0,33 | |||||
| Bedoel SD | 2.83 | Bedoel SD | 0.35 | |||
| * De vergelijkingen van de regressie van de CHAA voor lever en nieren waren respectievelijk Y = 2.249 × X (aangepast R2 = 0.74) en Y = 0.07288 × X (aangepast R2 = 0,69). | ||||||
Tabel 1: de representatieve resultaten van de tests van de nauwkeurigheid en precisie voor walvisachtigen histologische Ag assay (CHAA). CHAA = walvisachtigen histologische Ag assay, ICP-MS = inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie, SD = standaardafwijking.
| Veldnummer | Soorten | Lever | Nier | ||||
| AMG | CHAA * | ICP-MS | AMG | CHAA * | ICP-MS | ||
| TP20111116 | GG | 7,48 | 16.82 | 21.82 | 8,82 | 0.64 | 0,42 |
| TC20110611 | Ko | 4,50 | 10.12 | 2,77 | 1.52 | 0.11 | 0,05 |
| TC20110722 | Ko | 1.20 | 2.70 | 3.86 | 0.11 | 0,01 | 0,05 |
| TD20110608 | LH | 0.34 | 0.76 | 0,06 | 0.21 | 0.02 | 0,05 |
| TP20110830 | LH | 6.21 | 13.97 | 14.93 | 9,43 | 0.69 | 1.04 |
| IL20110101 | Sa | 2,67 | 6,00 | 1,73 | 5.26 | 0.38 | 0.14 |
| * De vergelijkingen van de regressie van de CHAA voor lever en nieren waren respectievelijk Y = 2.249 × X (aangepast R2 = 0.74) en Y = 0.07288 × X (aangepast R2 = 0,69). | |||||||
Tabel 2: The AMG positieve waarden, Ag concentraties (μg/g, drooggewicht) geschat door walvisachtigen histologische Ag assay (CHAA), en Ag (μg/g, drooggewicht) gemeten concentraties door ICP-MS van de lever en de nier weefsels van zes gestrande walvisachtigen. GG = Grampus griseus, Ko = Kogia spp., Lh = Lagenodelphis hosei, Sa = Stenella attenuata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van het onderzoek van het artikel is een adjuvans-methode, de verdeling van de Ag op suborgan niveaus wilt evalueren en te schatten Ag concentraties in walvisachtigen weefsels vast te stellen. De huidige protocollen bevatten 1) bepaling van de concentratie van de Ag in walvisachtigen weefsels door ICP-MS, 2) AMG analyse van paar-matched weefselsteekproeven met bekende Ag concentraties, 3) vaststelling van het regressiemodel (CHAA) voor het inschatten van de Ag-concentraties door AMG positieve waarden, 4) evaluatie van de nauwkeurigheid en precisie van CHAA en 5) schatting van Ag concentraties door CHAA.
In deze studie, waren de gegevens voor ICP-MS aanzienlijk en positief gecorreleerd met die van AMG positieve waarden, wat suggereert dat de concentratie van de Ag in walvisachtigen weefsels kan worden geraamd door de AMG positieve waarde. Daarom is de CHAA, die is gebaseerd op de AMG positieve waarde en het regressiemodel, ontwikkeld voor het inschatten van de Ag-concentraties in de lever en de nier weefsels van walvisachtigen. In het algemeen een regressiemodel met meer parameters (dat wil zeggen, een meer complexe regressiemodel) past goed in de gegevens, maar het is onbepaald dat de meer complexe eigenlijk beter dan degene die eenvoudiger is. Daarom moet het beste regressiemodel worden gekozen door statistische analyse26,27. De resultaten van de statistische analyse blijkt dat de lineaire regressiemodel voldoende te schatten van de concentratie van de Ag op basis van de AMG positieve waarde12.
In CHAA voor nierweefsel was de gemiddelde SD (0.35) van de test van de precisie groter dan dat van de nauwkeurigheid test (0.16). Omgekeerd, in CHAA voor leverweefsel, de gemiddelde SD (2.8) van de precisie-test was kleiner dan die van de nauwkeurigheid test (3.24). Op basis van dit resultaat, is het gesuggereerd dat de ongelijke verdeling van de AMG positieve signalen en de relatief lage concentraties van de Ag in walvisachtigen nierweefsel negatief interfereren met de precisie van CHAA voor nierweefsel. Derhalve kunnen de CHAA voor nierweefsel nauwkeurig maar onnauwkeurig zijn. De gelijkmatige verdeling van de AMG positieve signalen en de relatief hoge concentraties van de Ag in walvisachtigen lever weefsels suggereren echter dat de CHAA voor leverweefsel is een betrouwbare methode voor het schatten van de Ag-concentraties in walvisachtigen lever weefsels. Bovendien, als meer weefsels met bekende Ag concentraties bepaald door ICP-MS beschikbaar zijn, kan een meer nauwkeurige en precieze regressiemodel worden ontwikkeld voor het inschatten van de Ag-concentratie.
Hoewel de huidige protocollen een adjuvans methode om te onderzoeken Ag in dierlijke weefsels bieden, moeten enkele beperkingen op de AMG-methode worden opgemerkt. Eerste, vals-positieve signalen van de AMG kunnen presenteren als gevolg van interferentie van andere zware metalen, zoals kwik, bismut en zink28. Daarom moeten de resultaten van de AMG-methode worden geïnterpreteerd met andere specifieke methoden, zoals ICP-MS, om te controleren de werkelijke samenstelling van zware metalen28. Ten tweede, is het moeilijk op te sporen van een homogeen verdeelde zwaar metaal, omdat het helderder amorf AMG positieve signalen, die niet kunnen worden geïdentificeerd door visualisatie onder microscopisch onderzoek kan genereren. Bovendien, het amorfe en helderder AMG positieve signalen zijn moeilijk te analyseren met de software van de analyse van het beeld, omdat de kleur van de AMG positieve signalen vergelijkbaar met die van de achtergrond worden kan (bijv., de amorfe positieve signalen van de AMG gevonden de lumen van proximale renale tubuli). Daarom kunnen niet de AMG positieve signalen worden gemarkeerd na de aanpassing van de licht-donkerscheiding tegenwaarde van de drempel in de software van de analyse van de afbeelding. Ten derde omdat de AMG positieve waarden zijn gebaseerd op het percentage van de ruimte van AMG positieve signalen, is het mogelijk dat de waarden van de sterk geconcentreerde zware metalen kunnen worden onderschat.
FFPE monsters zijn relatief gemakkelijk te verzamelen en opslaan, en onze eerdere studie heeft aangetoond dat de huidige methode van de AMG FFPE monsters opgeslagen voor meer dan 15 jaar12met succes kan versterken. Het mechanisme van AMG wordt niet beïnvloed door verschillende diersoorten, want het wild in verschillende diersoorten20,29,30,31 gebruikt is. Hoewel het huidige artikel is gericht op de walvisachtigen, kunnen de hier beschreven protocollen ook worden gebruikt in verschillende diersoorten. Bovendien, de kosten van de AMG-methode met ICP-MS is relatief laag (in vergelijking met laser Ablatie-ICP-MS), en aldus de huidige protocollen zijn waardevol voor onderzoekers of landen ontbreekt voldoende onderzoek financiering om te onderzoeken van de distributie en de concentratie van zware metalen in dierlijke weefsels. Kortom, voorziet het gebruik van AMG met kwantitatieve analyse te lokaliseren en semi-kwantificeren zware metalen in een handige methode spatio-temporele en cross-soorten studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken het Taiwan Cetacean Stranding netwerk voor sample collectie en opslag, met inbegrip van de Taiwan Cetacean Society, Taipei; De walvisachtige onderzoekslaboratorium (Prof. Lien-Siang Chou), het Instituut voor ecologie en evolutiebiologie, National Taiwan University, Taipei; het Nationaal Museum van natuurwetenschappen (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; en de mariene biologie & Cetacean Research Center, nationale Cheng-Kung Universiteit. Wij danken ook de bosbouw Bureau, de Raad van landbouw, de uitvoerende Yuan voor hun verblijfsvergunning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | --- | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers? Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , In Press (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).
- Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
