Summary
En protokoll presenteres for å lokalisere Ag i cetacean lever og nyre vev av autometallography. Videre, en ny analysen, kalt cetacean histologiske Ag analysen (CHAA) er utviklet for å beregne de Ag konsentrasjonene i de vev.
Abstract
Silver nanopartikler (AgNPs) har vært mye brukt i kommersielle produkter, inkludert tekstiler, kosmetikk og helsevesenet elementer, på grunn av sin sterke antimikrobielle effekter. De kan bli sluppet inn i miljøet og akkumuleres i havet. Derfor AgNPs er den viktigste kilden til Ag forurensning, og offentlig bevissthet om miljømessige toksisitet av Ag er økende. Tidligere studier har vist bioakkumulering (i produsenter) og forstørrelsen (i forbrukerne/rovdyr) AG. Cetaceans, kan som apex predators av havet, ha blitt negativt påvirket av Ag/Ag forbindelser. Men konsentrasjonen av Ag/Ag forbindelser i cetacean vev kan måles ved Induktivt kombinert plasma masse spektroskopi (ICP-MS), er bruk av ICP-MS begrenset av dens høy kapitalkostnad og kravet for tissue lagring/forberedelse. Derfor en autometallography (AMG) metode med en bilde kvantitativ analyse ved hjelp av formalin-fast, parafin-embedded (FFPE)-vev kan være en adjuvant metode for å lokalisere Ag distribusjon på suborgan nivå og beregne Ag konsentrasjonen i cetacean vev. AMG positive signaler er hovedsakelig brune til svarte granulater av ulike størrelser i cytoplasma av proksimale nyre rørformede epitel og hepatocytter Kupffer celler. Noen ganger, noen amorfe gyllengul til brun AMG positive signaler er oppført i lumen og kjelleren membran av noen proksimale nyre tubuli. Analysen for å estimere Ag konsentrasjonen kalles den Cetacean histologiske Ag analysen (CHAA), som er en regresjonsmodell etablert av dataene fra bildet kvantitativ analyse av AMG metode og ICP-MS. Bruk av AMG CHAA å lokalisere og semi kvantifisere tungmetaller gir en praktisk metode for spatio-temporale og cross-species studier.
Introduction
Silver nanopartikler (AgNPs) har vært mye brukt i kommersielle produkter, inkludert tekstiler, kosmetikk og helsevesenet elementer, på grunn av deres store antimikrobielle effekter1,2. Produksjon av AgNPs og antall AgNP inneholder produkter er derfor økt tid3,4. Men AgNPs kan bli sluppet inn i miljøet og akkumuleres i havet5,6. De har blitt den største kilden til Ag forurensning, og offentlige bevisstheten om miljømessige toksisitet av Ag er økende.
Statusen for AgNPs og Ag i det marine miljøet er innviklet og stadig skiftende. Tidligere studier har indikert at AgNPs kan forbli partikler, samlet, oppløse, reagere med ulike kjemiske arter, eller regenereres Ag+ ioner7,8. Flere typer Ag forbindelser, som AgCl, har blitt funnet i marine sedimenter, der de kan svelges av bunnlevende organismer og angi næringskjeden9,10. Ifølge en tidligere studie utført i Chi-ku lagune området langs sørvest kysten av Taiwan, Ag konsentrasjonen av marine sedimenter er svært lav og lik crustal overflod, og de av fisk leveren vev er vanligvis under gjenkjenning begrense (< 0.025 μg/g våt/våt)11. Tidligere studier i ulike land har imidlertid vist relativt høy Ag konsentrasjonene i lever cetaceans12,13. Ag konsentrasjonen i lever av cetaceans er alder-avhengige, antyder at kilden til Ag i kroppen er mest sannsynlig deres byttedyr12. Disse funnene videre foreslå biomagnification AG i dyr på høyere nivåer i næringskjeden. Barder kan som apex rovdyr i havet, ha lidd negative helseeffekter forårsaket av Ag/Ag forbindelser12,13,14. Viktigst, som cetaceans er mennesker pattedyr, og den negative helsemessige konsekvenser forårsaket av Ag/Ag forbindelser i cetaceans kan også forekomme i mennesker. Med andre ord, kunne cetaceans sentinel dyr for helse av marine miljø og mennesker. Derfor er helseeffektene, vev distribusjon og konsentrasjonen av Ag i cetaceans til stor bekymring.
Men konsentrasjonen av Ag/Ag forbindelser i cetacean vev kan måles ved Induktivt kombinert plasma masse spektroskopi (ICP-MS), er bruk av ICP-MS begrenset av dens høy kapitalkostnad (instrument og vedlikehold) og kravene til vev lagring /Preparation12,15. I tillegg er det vanligvis vanskelig å samle omfattende vevsprøver i alle undersøkelser av strandet cetacean tilfeller logistiske problemer, mangel på arbeidskraft, og mangel på beslektede ressurser12. Frossent prøvene for ICP-MS analyse lagres ikke lett på grunn av begrenset kjøling plassen og frossent prøver kan bli forkastet på grunn av ødelagte kjøling utstyr12. Disse nevnte hindringene hemme undersøkelser av forurensning i cetacean vev av ICP-MS analyse frossent utvalg. Formalin fast vevsprøver er relativt enkelt å samle under obduksjon av døde-strandet cetaceans. Derfor er det nødvendig å utvikle en brukervennlig og rimelig metode for å oppdage/mål tungmetallene i cetacean vev ved hjelp av formalin fast vevsprøver.
Selv om suborgan distribusjoner og konsentrasjoner av lut og alkaliske metaller kan bli endret under formalin-faste, parafin-embedded (FFPE) prosessen, bare mindre effekter på overgangen metaller, som Ag, har vært kjent16. Derfor har FFPE vev vært ansett som en ideell eksempel ressurs for metall lokalisering og målinger16,17. Autometallography (AMG), en histochemical prosess, kan forsterke tungmetaller som ulik størrelse gyllengul til svart AMG positive signaler på FFPE vev seksjoner, og disse forsterket tungmetaller kan visualiseres under * lys18, 19 , 20 , 21. dermed metoden AMG gir informasjon om suborgan distribusjonen av tungmetaller. Det kan gi viktig tilleggsinformasjon for å studere metabolske veier av tungmetaller i biologiske systemer fordi ICP-MS kan bare måle konsentrasjonen av tungmetaller på orgel nivå18. Digitalt bilde analyseprogramvare, for eksempel ImageJ, er videre utlignet til kvantitativ analyse av histologiske vev deler22,23. Ulik størrelse gyllen gul til svart AMG positive signaler av FFPE vev kan være kvantifisert og brukes til å beregne konsentrasjonen av tungmetaller. Selv om absolutt Ag konsentrasjonen ikke kan direkte bestemmes av AMG metoden med bilde kvantitativ analyse, kan det estimeres ved en regresjonsmodell basert på dataene innhentet fra bildet kvantitativ analyse og ICP-MS, kalt cetacean histologiske Ag analysen (CHAA). Vanskelighetene måle Ag konsentrasjoner av ICP-MS analyse i mest strandet cetaceans, CHAA er en verdifull adjuvant metode for å beregne Ag konsentrasjonene i cetacean vev, som ikke kan bestemmes ved ICP-MS analyse på grunn av manglende frosset vevsprøver. Dette dokumentet beskriver protokollen for en histochemical teknikk (AMG-metoden) for lokalisere Ag på suborgan nivå og analysen kalt CHAA å anslå Ag konsentrasjonen i lever og nyre vev av cetaceans.
Figur 1: flytskjema som viser etablering og anvendelse av cetacean histologiske Ag analysen (CHAA) for å estimere Ag konsentrasjoner. CHAA = cetacean histologiske Ag analysen, FFPE = Formalin-fast parafin-innebygd, ICP-MS = Induktivt kombinert plasma masse spectroscopy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble utført i henhold til internasjonale retningslinjer, og bruk av cetacean ble tillatt av rådet av landbruk av Taiwan (forskning tillater 104-07.1-SB-62).
1. vev eksempel forberedelse for ICP-MS analyse
Merk: Lever og nyre vev ble Hentet fra ferske døde og moderate autolyzed strandet cetaceans24, inkludert 6 strandet cetaceans av 4 ulike arter, 1 Grampus griseus (Gg), 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Hver strandet cetacean hadde et Feltnummer for individuelle identifikasjon. Vev eksempel forberedelse til ICP-MS analyse fulgt metoden som er etablert i M.H. Chens lab og M.H. Chens lab gjennomført ICP-MS analyse11,13,25.
- Samle lever og nyre vev for ICP-MS analyse fra strandet cetaceans og lagre dem på −20 ° C før bruk.
- Samle par-matchet leveren og nyre vev fra samme strandet cetaceans for AMG analyse (se trinn 2).
- Klippe det ytterste laget av vevsprøver samlet for ICP-MS analyse med rustfritt stål skalpell. Den indre delen av de skjære små terninger (ca 1 cm3) og plassere dem i zip lock plastposer. Normalt, inneholder hver pose 10 g av vev.
- Lagre plastposer inneholder vevsprøver på −20 ° C for senere prosedyrer.
- Sett 1 cm3 kuber prøver en fryse tørke systemet (-50 ° C, vakuum pumpe med en forskyvning av minst 98 L/min, 0.002 mBar) minst 72 h til helt tørket ved veiing til konstanten.
- Homogenize tørket kubene til pulver med en homogenizer for påfølgende vev fordøyelsen.
- Veie 0,3 g av homogenisert frysetørket prøver i 30 mL polytetrafluoroethylene (PTFE) flasker og bland dem med 10 mL av 65% w/w salpetersyre.
- Sette nedleggelser på PTFE flasker, men la nedleggelser untightened.
Merk: Dette gjør det brune røyk skjemaet i PTFE flasker og reflux inne i flasken for fordøyelsen før den brune røyk forsvinner og blir klart. - Varme fordøyd prøvene med en kokeplate, fra 30 ° C til 110/120 ° C (i henhold det brune røyk danner tilstand) i PTFE flasker for 2 til 3 uker til brun gass i PTFE flaskene blir fargeløs og flytende inne PTFE flaskene blir gjennomsiktig Grée Nish blek gul eller helt klart.
Merk: Utføre varme-prosessen i kjemisk avtrekksvifte. - Varme fordøyd prøvene ved 120 ° C til å fordampe salpetersyre i PTFE flasker til bare 0,5-1 mL restene.
Merk: Utføre varme-prosessen i kjemisk avtrekksvifte, og alltid overvåke temperaturøkningen for å sikre at ingen brun gass lekker fra PTFE flaskene nedleggelser. - Snurp nedleggelser og avkjøle dem ved romtemperatur i ca 1 time.
- Sted trakter filter papirer på 25 mL volumetriske flasker og vask gjenværende væske med 1 M HNO3 til et endelig antall 25 mL.
Merk: Vask flasken for minst tre ganger og nedleggelse to ganger. - Validere analytisk kvaliteten på ICP-MS analyse ved hjelp av standard referanse materialer, inkludert DOLT-2 (dogfish lever) og DORM-2 (dogfish muskel).
- Bruke kopier av hver analytisk prøve og triplicates av standard referansemateriale for ICP-MS analyse.
- Gjennomsnittlig Ag konsentrasjonen av hver analytiske prøver og presentere dataene som tørr vekt basis konsentrasjon (μg/g tørr vekt).
2. vev eksempel forberedelse til AMG analyse
- Samle par-matchet lever og nyre vev for AMG analyse fra en strandet cetacean og fikse dem i 10% nøytral bufrede formalin før bruk.
Merk: Lagre vevsprøver i plastflasker i 10% nøytral bufrede formalin (NBF, pH 7.0) for 24-48 timer. Volumet av NBF bør være minst 10 ganger større enn vev. - Trim formalin fast leveren og nyre vev med rustfritt stål disponibel mikrotomen og sette delene trimmet vev i kassetter med etiketter.
Merk: Størrelsen på hver vev delene skal være ca 2 cm x 1 cm og tykkelsen på hver vev del bør ikke overstige 3 mm. sette lever og nyre vev fra samme individ i samme kassetten. - Tørke trimmet vev seksjoner med vevsprosessor gjennom en rekke gradert etanol (70% 1t, 80% 1t, 95% 1t, 95% 2 h, 100% 1 h x 2 flekker retter og 100% for 2t), ikke-xylen (for 1t og 2 h i ulike flekker retter) , og fordype dehydrert vevsprøver i paraffin (for 1t og 2 h i ulike flekker retter).
- Plasser de dehydrert vevsprøver i bunnen av stål histology muggsopp og legge de dehydrert vevsprøver med parafin.
- Chill formalin fast parafin-embedded (FFPE) vev blokker på kjøleplate før parafinen stivner. Trim FFPE blokker med mikrotomen til vevet overflaten er utsatt.
- Chill FFPE blokkene på −20 ° C for 10 min. delen FFPE blokkene på 5 µm ved mikrotomen.
- Fylle et vannbad med dobbel-destillert vann på 45 ° C. Løft bånd av vev deler og gjøre dem flyter på overflaten av det varme vannet ved hjelp av pinsett og børster.
- Skill bånd av vev deler med pinsett. Plass en på en microscope skyve.
- Plasser objektglass på et lysbilde varmere og tillate å tørr overnatting på 37 ° C.
- Satt mikroskop lysbilder i objektglasstativ og deparaffinize dem ved å nyte dem i 3 forskjellige flekker retter av ren ikke-xylen (ca 200 til 250 mL) for 8, 5 og 3 min.
- Hydrat avsnittene vev i objektglasstativ av soaking dem i ulike flekker retter av gradert etanol løsninger (100% etanol to ganger, 90% etanol gang og 80% etanol når [1 min hver]), og skyll i dobbel-destillert vann.
Merk: Disse løsningene er ca 200 til 250 mL i ulike flekker retter. For hver vask er 30 sek nok. - Skyll vevet seksjoner i fosfat-bufret saltvann (PBS) med 0,5% Triton X-100, vask dem med PBS for flere ganger, og deretter skyll i dobbel-destillert vann.
Merk: Disse løsningene er ca 200 til 250 mL i ulike flekker retter. Hver var, er 30 sek nok. - Forberede like mengder av de tre komponentene (initiatoren, moderator og Aktivator) levert av sølv ekstrautstyr kit i mørket og bland dem godt.
Merk: Løsninger av moderator og aktivator er klissete, så vennligst bruk Pipetter med bredt tips åpninger (eller klipp tips for å lage større åpninger). 300 μL av blandet løsningen (avhengig av størrelsen på delen vev) er vanligvis nok for hvert lysbilde. Derfor hvis 10 lysbildene, er hvor mye hver komponent (initiatoren, moderator og Aktivator) 1000 μL (blandet løsningen er 3000 μL for 10 lysbildene). - Inkuber delene vev i blandet løsningen i 15 min i mørket ved romtemperatur. Fullt ut dekk delene vev på lysbildene med blandet løsning. Lengre inkubasjon tid føre til falske positive AMG signaler.
- Vask lysbildene med dobbel-destillert vann og stain dem i hematoxylin for 10 s som en counterstain.
- Vask lysbildene med rennende vann, tørk dem og montere dem med montering medium.
- Undersøke lysbildene under en lys mikroskop.
- Tilfeldig ta ti histologiske bilder med en 40 X linsen fra hver vev-delen ved hjelp av et koblet digitalt kamera med tenkelig programvare.
3. semi-kvantitativ analyse for AMG Positive verdier av histologiske bilder
Merk: AMG positiv verdi betyr prosentandelen av området med AMG positive signaler.
- Bruk analyseprogramvare (ImageJ) til å analysere histologiske bildene.
- Åpne histologiske bildet ved å trykke fil | Åpne.
- Delt valgte bildet i tre fargekanaler (rød, blå og grønn) ved å trykke bilde | Type | RGB stabel.
- Kvantifisere AMG positive signaler ved hjelp av den blå kanalen. Kjernefysisk falske positive signaler er vanligvis redusert under den blå kanalen når hematoxylin flekken brukes for kjernefysiske counterstain (figur 2).
- Måle andelen området med AMG positive signaler i hver histologiske bilde med verktøyet terskelen (bilde | Justere | Terskelen).
- Manuelt justere cut-off verdien av terskelen for hvert histologiske bilde (fra 90 til 110) basert på tilstedeværelsen av falske positive områder i kjerner og/eller røde blodlegemer.
Merk: I standard innstilling, skal AMG positive signaler være uthevet i rødt. - Trykk analysere | Angi mål, og Merk Området brøkdel å angi at området brøkdel er registrert.
- Trykk analysere | Tiltak. Positiv prosent området hvert histologiske bilde vises i kolonnen % området av resultatvinduet .
- Gjennomsnittlig positiv prosent områdene 10 histologiske bilder fra avsnittene vev og definere resultatet som AMG positiv verdi for hver vev del.
Figur 2: tilstedeværelsen av kjernefysiske falske positive signaler under forskjellige fargekanaler (counterstain: hematoxylin flekk). Representant kjernefysiske falske positive signaler angis av gule piler. PPA = positiv prosent av områdene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. etablering av Cetacean histologiske Ag analysen (CHAA) av regresjonsmodell
Merk: Følgende analyse er utført i prisme 6.01 for Windows.
- Vurdere sammenhengen mellom resultatene av ICP-MS og AMG positive verdier.
- Åpne programvaren, Opprett en ny prosjektfil, og velg XY og korrelasjon.
- Inndataene inkludert resultatene av ICP-MS og AMG positive verdier.
- Trykk analyse og velg korrelasjon under kategorien XY analyse å analysere styrken i mellom resultatene av ICP-MS og AMG positive verdier av Pearson korrelasjon analyse.
Merk: Resultatene av ICP-MS og AMG positive verdier må være positivt korrelert med hverandre; ellers bør ikke påfølgende regresjonsmodellen utvikles. - Statistisk sammenligne regression modeller, inkludert lineær regresjon, kvadratisk regresjon, kubikk regresjon og lineær regresjon gjennom opprinnelse, gjennom statistikk programvare12,26,27.
Merk: Hvis regresjonsmodellen genererer en urealistisk Ag konsentrasjon, regresjonsmodellen være forlatt12. - Gå tilbake til tabellen (venstre panel) og trykk analyse | Lineær regresjon (kurve) under kategorien XY analyse | OK.
- I vinduet Parametere: ikke-lineær regresjon, velge forskjellige regresjonsmodell i sidetilpassingen og Sammenlign ulike regression modeller i siden sammenligne.
- På Sammenlign-siden velger du sammenligning metoder, inkludert ekstra summen av kvadrater F testen og Akaikes informasjon kriterium (AIC). Ifølge resultatene av sammenligningen metoder, kan du bruke en relativt passer regresjonsmodell i CHAA.
- Anslå Ag konsentrasjoner av cetacean lever og nyre vev med ukjent Ag konsentrasjoner ved hjelp av CHAA.
- Evaluere nøyaktighet og presisjon av CHAA for leveren og nyre vev. Forskjellen på presisjon og nøyaktighet er illustrert i Figur 3.
- Nøyaktighet: Beregne mener standardavviket (SD) fra forskjellene mellom kjent og anslått Ag konsentrasjoner.
- Presisjon: Utføre gjentatte måling (minst tre eksemplarer) av AMG positive verdier av føljetong deler fra samme FFPE vev. Beregne gjennomsnittet SD av målinger fra lever eller nyre vev fra forskjeller mellom kjent og anslått Ag konsentrasjoner
Merk: Metoder for å evaluere nøyaktighet og presisjon er avbildet i Figur 4.
Figur 3: forskjellen mellom nøyaktighet og presisjon. Nøyaktighet betyr hvor nær målene er den sanne verdien (dvs. Ag konsentrasjon bestemmes av ICP-MS); presisjon innebærer repeatability av måling (dvs. konsekvensen mellom gjentatte målinger av AMG positive verdier fra delene tre eksemplarer vev). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: ordningen viser metodene av å evaluere nøyaktighet og presisjon. CHAA = cetacean histologiske Ag analysen; FFPE = Formalin-fast parafin-innebygd. ICP-MS = Induktivt kombinert plasma masse spectroscopy; AI = hver av Ag-konsentrasjonene som er fastsatt av ICP-MS av hver matchende par Vevsprøve; Bi = hver av Ag konsentrasjonen anslått av CHAA av hver matchende par Vevsprøve; CI, Di og Ei = hver for The Ag anslått av CHAA med tre eksemplarer prøver fra hver matchende par Vevsprøve; Jeg = 1 n. Se rådata om nøyaktighet og presisjon testene i delen av representant resultater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. estimering av Ag konsentrasjoner av CHAA.
- Samle lever og nyre vev fra strandet cetaceans og fikse dem i 10% nøytral bufrede formalin.
- Behandle formalin-fast vev rutinemessig (se trinn 2).
- Beregne Ag konsentrasjonen av cetacean lever og nyre vev med ukjent Ag konsentrasjoner av CHAA (se trinn 3 og 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant bilder av AMG positive signaler i cetacean lever og nyre vev er vist i figur 5. AMG positive signaler inkluderer ulik størrelse brunt til svart granulater av ulike størrelser i cytoplasma av proksimale nyre rørformede epitel og hepatocytter Kupffer celler. Noen ganger amorfe gyllengul til brun AMG positive signaler er oppført i lumen og kjelleren membran av noen proksimale nyre tubuli. Det er en positiv korrelasjon mellom resultatene av ICP-MS og AMG positivitet verdier i leveren og nyre vev, og lineær regresjon gjennom opprinnelse er foretrukket i henhold til ekstra summen av kvadrater F test og AIC12,26, 27. I nøyaktighet testen, gjennomsnittet SDs av CHAA for lever og nyre er 3.24 og 0,16, henholdsvis. I presisjon testen, gjennomsnittet SDs av CHAA for lever og nyre er 2,8 og 0,35, henholdsvis. Rådata om nøyaktighet og presisjon testene oppsummeres i tabell 1. Den Ag konsentrasjoner målt ved ICP-MS fra lever og nyre vev av disse seks strandet cetaceans med AMG positive verdier og Ag konsentrasjoner anslått av CHAA oppsummeres i tabell 2.
Figur 5: representant histologiske bilder av AMG positive signaler i lever og nyre vev av cetaceans (counterstain: hematoxylin flekk). (A) AMG positive signaler i cetacean leveren vev er jevnt fordelt (Grampus griseus (Gg), landerpûasammefeltetsomhanselv kode: TP20111116; AG konsentrasjon målt byinductively kombinert plasma masse spektroskopi (ICP-MS): 21.82 μg/g vekt). (B) The AMG positive signaler er brun til svarte granulater av ulike sizesin cytoplasma av hepatocytter (røde piler) og Kupffer celler (rød pil hoder) (Gg; landerpûasammefeltetsomhanselv kode: TP20111116). (C) noen AMG positive signaler av brunt til svart granulater vises i cytoplasma av hepatocytter (røde piler) (Kogia spp. (Ko), landerpûasammefeltetsomhanselv kode: TC20110722; AG konsentrasjon målt ved ICP-MS: 3.86 μg/g vekt). (D) The AMG positive signaler i cetacean nyre vev er hovedsakelig lokalisert i nyre cortex (Gg, landerpûasammefeltetsomhanselv kode: TP20111116; AG konsentrasjon målt ved ICP-MS: 0.42 μg/g vekt). Den svarte stiplede linjen er plassert på krysset mellom nyre cortex og forlengede. (E) høyere magnification av figur 5 d (rød stiplet rektangel). AMG positive signaler i nyre cortex er brun til svarte granulater av ulike størrelser i cytoplasma av proksimale nyre rørformede epitel (røde piler). Amorfe gyllengul til brun AMG positive signaler vises i lumen (rød pil leder) og kjelleren membran (gul pil leder) av noen proksimale nyre tubuli. Ikke til minimal AMG positive signaler vises i glomeruli (grønn pil) og distale nyre tubules (grønn pil hodet) (Gg; landerpûasammefeltetsomhanselv kode: TP20111116). (F) spredt brun granulater av ulike størrelser vises i thecytoplasm av proksimale nyre rørformede epitel (røde piler) (Ko, landerpûasammefeltetsomhanselv kode: TC20110722; AG konsentrasjon målt ved ICP-MS: 0,05 μg/g vekt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Test av nøyaktighet | ||||||
| Feltnummer | Leveren | Nyre | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 16.82 | 21.82 | 4.99 | 0.64 | 0.42 | 0.22 |
| TC20110611 | 10.12 | 2,77 | 0,96 | 0,11 | 0,05 | 0,35 |
| TC20110722 | 2.70 | 3.86 | 1.15 | 0,01 | 0,05 | 0,04 |
| TD20110608 | 0.76 | 0,06 | 7.35 | 0,02 | 0,05 | 0,06 |
| TP20110830 | 13.97 | 14.93 | 4.28 | 0.69 | 1.04 | 0.24 |
| IL20110101 | 6.00 | 1,73 | 0.72 | 0,38 | 0.14 | 0,03 |
| Mener SD | 3.24 | Mener SD | 0,16 | |||
| Utrolig test | ||||||
| Feltnummer | Leveren | Nyre | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 20.90 | 21.82 | 4.08 | 0,21 | 0.42 | 0.44 |
| 16.11 | 0.22 | |||||
| 17.75 | 0.14 | |||||
| TD20110608 | 1.52 | 0,06 | 1,71 | 0,00 | 0,05 | 0,02 |
| 2,40 | 0,00 | |||||
| 1.12 | 0,00 | |||||
| TP20110830 | 13.12 | 14.93 | 2.70 | 0.45 | 1.04 | 0,59 |
| 12,50 | 0.26 | |||||
| 11.35 | 0,33 | |||||
| Mener SD | 2.83 | Mener SD | 0,35 | |||
| * Regresjon likningene av CHAA for lever og nyrer ble henholdsvis Y = 2.249 × X (justert R2 = 0.74) og Y = 0.07288 × X (justert R2 = 0.69). | ||||||
Tabell 1: representant resultatene av nøyaktighet og presisjon testene for cetacean histologiske Ag analysen (CHAA). CHAA = cetacean histologiske Ag analysen, ICP-MS = Induktivt kombinert plasma masse spektroskopi, SD = standardavvik.
| Feltnummer | Arter | Leveren | Nyre | ||||
| AMG | CHAA * | ICP-MS | AMG | CHAA * | ICP-MS | ||
| TP20111116 | GG | 7.48 | 16.82 | 21.82 | 8.82 | 0.64 | 0.42 |
| TC20110611 | Ko | 4,50 | 10.12 | 2,77 | 1.52 | 0,11 | 0,05 |
| TC20110722 | Ko | 1.20 | 2.70 | 3.86 | 0,11 | 0,01 | 0,05 |
| TD20110608 | LH | 0,34 | 0.76 | 0,06 | 0,21 | 0,02 | 0,05 |
| TP20110830 | LH | 6.21 | 13.97 | 14.93 | 9.43 | 0.69 | 1.04 |
| IL20110101 | Sa | 2,67 | 6.00 | 1,73 | 5.26 | 0,38 | 0.14 |
| * Regresjon likningene av CHAA for lever og nyrer ble henholdsvis Y = 2.249 × X (justert R2 = 0.74) og Y = 0.07288 × X (justert R2 = 0.69). | |||||||
Tabell 2: The AMG positive verdier, Ag konsentrasjoner (μg/g, tørr vekt) beregnet av cetacean histologiske Ag analysen (CHAA), og Ag konsentrasjoner (μg/g, tørr vekt) målt ved ICP-MS fra lever og nyre vev av seks strandet cetaceans. GG = Grampus griseus, Ko = Kogia spp., Lh = Lagenodelphis hosei, Sa = Stenella attenuata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hensikten med artikkelen studien er å etablere en adjuvant metode å evaluere Ag distribusjonen på suborgan nivåer og beregne Ag konsentrasjonene i cetacean vev. Gjeldende protokollene inkluderer 1) bestemme Ag konsentrasjoner i cetacean vev av ICP-MS, 2) AMG analyse av par-matchet med kjente Ag konsentrasjoner, 3) etablering av regresjonsmodellen (CHAA) for å estimere Ag konsentrasjonen av AMG positive verdier, 4) evaluering av nøyaktighet og presisjon CHAA og 5) estimering av Ag konsentrasjoner av CHAA.
I denne studien var data ICP-MS betydelig og positivt korrelert med de av AMG positive verdier, antyder at Ag konsentrasjonen i cetacean vev kan estimeres ved AMG positiv verdi. Derfor er CHAA, som er basert på AMG positiv verdi og regresjonsmodell, utviklet for å estimere Ag konsentrasjonen i lever og nyre vev av cetaceans. Vanligvis en regresjonsmodell med flere parametere (dvs. en mer kompleks regresjonsmodell) passer godt inn dataene, men det er ikke fastslått at mer sammensatt er faktisk bedre enn den enklere. Derfor må den beste regresjonsmodellen velges av statistisk analyse26,27. Resultatene av den statistiske analysen viser at den lineære regresjonsmodellen er tilstrekkelig til å beregne Ag konsentrasjonen basert på AMG positiv verdi12.
I CHAA for nyre vev var mener SD (0,35) av presisjon testen større enn nøyaktighet testen (0,16). Derimot i CHAA for leveren vev var mener SD (2.8) av presisjon testen mindre enn nøyaktighet testen (3.24). Basert på dette resultatet, er det foreslått at den ujevne fordelingen av AMG positive signaler og de relativt lave Ag konsentrasjonene i cetacean nyre vev negativt påvirke presisjonen av CHAA for nyre vev. Derfor kan CHAA for nyre vev være riktig, men upresis. Men selv distribusjon av AMG positive signaler og de relativt høye Ag konsentrasjonene i cetacean leveren vev foreslår at CHAA for leveren vev er en pålitelig metode for å beregne de Ag konsentrasjonene i cetacean leveren vev. Hvis det finnes flere vev med kjente Ag-konsentrasjonene som er fastsatt av ICP-MS, kan dessuten en mer nøyaktig og presis regresjonsmodell utvikles for å beregne Ag konsentrasjonen.
Selv om gjeldende protokollene gir en adjuvant metode for å undersøke Ag i dyr vev, bemerkes noen begrensninger på metoden AMG. Første, falske positive AMG signaler kan vise på grunn av forstyrrelser fra andre tungmetaller som kvikksølv, Vismut og sink28. Resultatene av metoden AMG må derfor tolkes med andre bestemte metoder, for eksempel ICP-MULTIPLE Sclerosis, overvåke selve sammensetningen av tungmetaller28. Det andre, er det vanskelig å oppdage homogenously distribuert heavy metal fordi det kan generere lysere amorfe AMG positive signaler, som ikke kan bli identifisert av visualisering under mikroskopisk undersøkelse. Videre amorfe og lysere AMG positive signaler er vanskelig å analysere med analyseprogramvare fordi fargen på AMG positive signaler kan være lik som bakgrunnen (f.eks., amorf AMG positive signaler funnet i den lumen av proksimale nyre tubules). Derfor kan AMG positive signaler ikke utheves etter justering av cut-off verdien av terskelen i bildet analyseprogramvare. Tredje, fordi AMG positive verdiene er basert på hvor mange prosent av AMG positive signaler, er det mulig at verdiene av svært konsentrert tungmetaller kan være undervurdert.
FFPE prøver er relativt enkelt å samle og lagre, og vår tidligere studie har vist at metoden for gjeldende AMG vellykket kan forsterke FFPE prøver lagret for over 15 år12. Mekanismen av AMG påvirkes ikke av forskjellige dyrearter, for det vill er brukt i ulike dyrearter20,29,30,31. Selv om gjeldende artikkelen er fokusert på cetaceans, kan protokollene beskrevet her også brukes i forskjellige dyrearter. I tillegg AMG metoden med ICP-MS er relativt lav (sammenlignet med laser ablasjon-ICP-MS), og dermed gjeldende protokollene er verdifull for forskere eller land som mangler tilstrekkelig forskning finansiering for å undersøke fordelingen og konsentrasjon av tungmetaller dyr vev. Avslutningsvis gir bruken av AMG med kvantitativ analyse å lokalisere og semi kvantifisere tungmetaller en praktisk metode for spatio-temporale og cross-species studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Taiwan Cetacean Stranding nettverket for prøvetaking og oppbevaring, inkludert Taiwan Cetacean samfunnet, Taipei; Cetacean Research Laboratory (Prof Lien-Siang Chou), Institutt for økologi og evolusjonsbiologi, National Taiwan University, Taipei; National Museum of Natural Science (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; og marinbiologi & Cetacean Research Center, National Cheng Kung University. Vi takker også skogbruk Bureau, Council of Agriculture, Executive Yuan om deres tillatelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | --- | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers? Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , In Press (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).
- Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
