Summary
Ett protokoll presenteras för att lokalisera Ag i valarnas lever och njure vävnader av autometallography. Dessutom är en ny analys, heter den cetacean histologiska Ag assay (CHAA) utvecklat för att uppskatta Ag halterna i dessa vävnader.
Abstract
Silvernanopartiklar (AgNPs) har i stor utsträckning används i kommersiella produkter, inklusive textil, kosmetika och vård poster, på grund av deras starka antimikrobiella effekter. De också kan släppas ut i miljön och ackumuleras i havet. Därför AgNPs är den huvudsakliga källan av Ag kontaminering, och allmänhetens medvetenhet om miljötoxicitet AG ökar. Tidigare studier har visat bioackumulering (i producenter) och förstoring (i konsumenter/rovdjur) AG. Valar, kan som toppkonsumenterna över oceanen, ha påverkats negativt av föreningarna som Ag/Ag. Även om koncentrationerna av Ag/Ag föreningar i valarnas vävnader kan mätas med induktivt kopplad plasma mass spektroskopi (ICP-MS), är användning av ICP-MS begränsat av dess höga kapitalkostnader och kravet på vävnad lagring/beredning. Därför, en autometallography (AMG) metod med en kvantitativ bildanalys med hjälp av formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) vävnad kan vara en adjuvant metod för att lokalisera Ag distribution på suborgan och uppskatta koncentrationen av Ag i valar vävnaderna. De positiva signalerna som AMG är främst bruna till svarta granulat i olika storlekar i cytoplasman i proximal renal tubulär epitel, hepatocyter och Kupffers celler. Ibland, vissa amorft gyllene gul till brun AMG positiva signaler är anges i lumen och basalmembranet av vissa proximala njurtubuli. Analysen för att uppskatta koncentrationen Ag heter den Cetacean histologiska Ag Assay (CHAA), som är en regressionsmodell som fastställts av data från kvantitativ bildanalys av AMG metod och ICP-MS. Användningen av AMG med CHAA att lokalisera och semi beräkna tungmetaller ger en bekväm metod för studier av plats och tid och mellan djurarter.
Introduction
Silvernanopartiklar (AgNPs) har i stor utsträckning används i kommersiella produkter, inklusive textil, kosmetika och vård poster, på grund av deras stora antimikrobiella effekter1,2. Produktionen av AgNPs och antalet AgNP-innehållande produkter är därför ökade över tid3,4. Dock AgNPs kan släppas ut i miljön och ackumuleras i ocean5,6. De har blivit den största källan till Ag kontaminering, och allmänhetens medvetenhet om miljötoxicitet AG ökar.
Status för AgNPs och Ag i den marina miljön är komplicerad och föränderlig. Tidigare studier har visat att AgNPs kan förbli som partiklar, aggregera, lös, reagerar med olika kemiska arter eller återskapas från Ag+ joner7,8. Flera typer av Ag föreningar, såsom Granulatfyllda, har hittats i Marina sediment, där de kan intas av bentiska organismer och ange de livsmedelskedja9,10. Enligt en tidigare studie på Chi-ku Lagoon området längs den sydvästra kusten i Taiwan, Ag koncentrationerna av Marina sediment är extremt låg och liknande till jordskorpans överflödet, och de fisk lever vävnad är oftast nedanför detektion begränsa (< 0,025 µg/g wet våt)11. Tidigare studier som utförts i olika länder har emellertid visat relativt höga Ag koncentrationer i levern av valar12,13. Ag koncentrationen i levern av valar är åldersberoende, tyder på att källan till Ag i sina kroppar är troligen deras byte12. Dessa rön ytterligare tyder biomagnifieringen av Ag i djur på högre trofiska nivåer. Valar, kan som havet, toppkonsumenterna ha drabbats av negativa hälsoeffekter orsakade av Ag/Ag föreningar12,13,14. Viktigast av allt, som valar är människor däggdjur och den negativa hälsomässiga konsekvenser som orsakas av Ag/Ag föreningar i valar kan också förekomma hos människor. Med andra ord, kunde valar vara sentinel djur för havsmiljön och människor hälsa. Hälsoeffekter, vävnadsdistribution och koncentrationen av Ag i valar är därför av stor oro.
Även om koncentrationerna av Ag/Ag föreningar i valarnas vävnader kan mätas med induktivt kopplad plasma mass spektroskopi (ICP-MS), begränsas användning av ICP-MS av dess höga kapitalkostnader (instrument och underhåll) och kraven för vävnad lagring /Preparation12,15. Dessutom är det oftast svårt att samla in omfattande vävnadsprover i alla utredningar av strandade valar fall på grund av logistiska problem, brist på arbetskraft och brist relaterade resurser12. De frysta vävnadsproverna för ICP-MS analys lagras inte lätt på grund av begränsad kyl utrymme och djupfrysta vävnadsprover kan kasseras på grund av trasig kyl utrustning12. Dessa ovan nämnda hinder hämmar utredningar av kontamineringen i valarnas vävnader av ICP-MS analys med frysta vävnadsprover. Däremot formalinbeständiga vävnadsprover är relativt enkelt att samla under obduktion av döda-strängat valar. Det är därför nödvändigt att utveckla en lättanvänd och billig metod för att upptäcka/åtgärd tungmetallerna i valarnas vävnader med hjälp av formalinbeständiga vävnadsprover.
Även om den suborgan distributioner och halterna av alkalimetaller och alkaliska jord metaller ändras under det formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE), endast mindre effekter på övergången metaller, såsom Ag, har varit noterade16. FFPE-vävnad har därför ansetts som en idealisk prov resurs för metall lokalisering och mätningar16,17. Autometallography (AMG), en histochemical process, kan förstärka tungmetaller som steglöst storlek gyllene gul till svart AMG positiva signaler på FFPE vävnadssnitt och dessa förstärkta tungmetaller kan visualiseras under ljusmikroskop18, 19 , 20 , 21. därför metoden AMG ger information om de suborgan distributionerna av tungmetaller. Det kan ge ytterligare viktig information för att studera de metaboliska vägarna av tungmetaller i biologiska system eftersom ICP-MS kan endast mäta koncentrationen av tungmetaller på orgel nivå18. Dessutom har digital bild analys programvara, såsom ImageJ, tillämpats på kvantitativ analys av histologiska vävnad avsnitt22,23. Den steglöst medelstora gyllene gul till svart AMG positiva signaler av FFPE vävnadssnitt kan kvantifieras och används för att uppskatta koncentrationerna av tungmetaller. Även om den absoluta Ag koncentrationen inte kan fastställas direkt av AMG metod med kvantitativ bildanalys, kan det beräknas genom en regressionsmodell baserad på uppgifter som erhållits från kvantitativ bildanalys och ICP-MS, som heter valprodukter histologiska Ag assay (CHAA). Med tanke på svårigheterna att mäta Ag koncentrationer av ICP-MS analys i mest strandade valar, CHAA är ett värdefullt adjuvant metod för att uppskatta Ag koncentrationer i valarnas vävnader, som inte kan fastställas med ICP-MS analys på grund av fryst vävnadsprover. Detta dokument beskriver protokollet av en histochemical teknik (AMG-metoden) för att lokalisera Ag på nivån suborgan och ett test som heter CHAA att uppskatta Ag koncentrationerna i lever och njure vävnader av valar.
Figur 1: flödesschema som skildrar den inrättandet och tillämpningen av småvalar histologiska Ag assay (CHAA) för att uppskatta Ag koncentrationer. CHAA = småvalar histologiska Ag assay, FFPE = Formalin-fast, paraffin-inbäddat, ICP-MS = induktivt kopplad plasma mass spektroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien utfördes i enlighet med internationella riktlinjer, och användningen av småvalar vävnadsprover till5Ats av rådet jordbruk av Taiwans (forskning tillåta 104-07.1-SB-62).
1. vävnad provberedning för ICP-MS analys
Obs: Lever och njure vävnader samlades från färsk död och måttligt autolyserat strandade valar24, inklusive 6 strandade valar av 4 olika arter, 1 Grampus griseus (Gg), 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Varje strandade valar hade ett Fältnummer för individuell identifiering. Provberedningen vävnad för ICP-MS analys följde metoden etablerades M.H. Chens lab och M.H. Chens lab genomfördes i ICP-MS analys11,13,25.
- Samla och njure vävnader för ICP-MS analys från strandade valar och lagra dem vid −20 ° C fram till användning.
- Samla par matchade levern och njurarna vävnader från samma strandade valar för AMG analys (se steg 2).
- Trimma det yttre lagret av vävnadsproverna insamlade för ICP-MS analys med rostfritt stål skalpell. Skär den inre delen av vävnadsproverna i små tärningar (ca 1 cm3) och placera dem i zip lock plast påsar. Varje påse innehåller normalt 10 g av vävnader.
- Förvara plastpåsar som innehåller vävnadsprover vid −20 ° C för efterföljande förfaranden.
- Sätta 1 cm3 kuber prover i en frysning torrt system (-50 ° C, vakuumpump med ett deplacement på minst 98 L/min, 0,002 mBar) för minst 72 h tills helt torkat genom vägning till konstant.
- Homogenisera torkad kuber till pulver med en Homogenisatorer för efterföljande vävnad matsmältningen.
- Väger 0,3 g av homogeniserad frystorkade prover i 30 mL polytetrafluoreten (PTFE) flaskor och blanda dem med 10 mL salpetersyra 65% w/w.
- Pålagda PTFE flaskorna nedläggningar, men lämna de nedlagda untightened.
Obs: Detta tillåter den bruna rök till form i PTFE flaskor och reflux inuti flaskan för matsmältningen tills brun röken försvinner och blir tydlig. - Värma smält proverna med en värmeplatta, från 30 ° C till 110/120 ° C (enligt brun röken bildar skick) i PTFE flaskorna för 2 till 3 veckor tills brunaktig gasen i PTFE flaskorna blir färglös och vätskan i PTFE flaskorna blir genomskinlig gree Nish blek gul eller helt klart.
Obs: Utför uppvärmningen i kemiska dragskåp. - Värma smält proverna vid 120 ° C avdunsta i salpetersyra i PTFE flaskorna tills endast 0,5-1 mL återstår.
Obs: Utför uppvärmningen i dragskåp kemiska och alltid övervaka temperaturökningen för att säkerställa att ingen brun gas läcker från PTFE flaskorna nedläggningar. - Spänn nedläggningarna och kyl dem i rumstemperatur i ca 1 h.
- Plats trattarna med filter papers på 25 mL mätkolvar och tvätta den återstående vätskan med 1 M HNO3 till en slutlig volym av 25 mL.
Obs: Tvätta flaskan för minst tre gånger och stängning två gånger. - Validera analytiska kvaliteten på ICP-MS analys med hjälp av standard referensmaterial, inklusive DOLT-2 (dogfish levern) och DORM-2 (dogfish muskel).
- Använd dubbletter av varje analysprov och exemplar av standard referensmaterial för ICP-MS analys.
- Genomsnittet av Ag koncentrationerna av varje analytic prover och presentera data som torr vikt grund koncentration (µg/g torrvikt).
2. vävnad provberedning för AMG analys
- Samla par matchade lever och njure vävnader för AMG analys från en strandade valar och fixa dem i 10% neutral buffrad formalin fram till användning.
Obs: Förvara vävnadsproverna i plastflaskor i 10% neutral buffrad formalin (NBF, pH 7,0) i 24 till 48 timmar. Volymen av NBF bör vara minst 10 gånger större än volymen vävnad. - Trimma de formalinbeständiga levern och njurarna vävnader med blad i rostfritt stål disponibla mikrotomen och sätta de trimmade vävnadssnitt i kassetter med etiketter.
Obs: Storleken på varje vävnadssnitt bör vara ca 2 cm x 1 cm och tjockleken på varje vävnad avsnitt bör inte överstiga 3 mm. sätta i lever och njure vävnad från samma individ i samma kassett. - Torka den trimmade vävnad avsnitt med en vävnadsprocessor genom en serie av graderade etanol (70% för 1 h, 80% för 1 h, 95% för 1 h, 95% för 2 h, 100% för 1 h x 2 färgning rätter och 100% för 2 h), icke-xylen (för 1 h och 2 h i olika färgning rätter) , och fördjupa de uttorkad vävnadsproverna i paraffin (för 1 h och 2 h i olika färgning rätter).
- Placera de uttorkad vävnadsproverna i bottnarna av stål histologi formar och bädda in de uttorkad vävnadsproverna med paraffin.
- Chill på formalinbeständiga paraffin-inbäddat (FFPE) vävnad block på kall tallrik tills paraffinet stelnar. Trimma de FFPE-block med mikrotomen tills vävnadsytan är utsatt.
- Chill FFPE block på −20 ° C i 10 min. avsnitt FFPE block på 5 µm av mikrotomen.
- Fyll ett vattenbad med dubbeldestillerat vatten vid 45 ° C. Lyft band av vävnadssnitt och få dem att flyta på ytan av det varma vattnet med hjälp av pincett och borstar.
- Separata band av vävnadssnitt med pincett. Placera ett avsnitt på ett objektglas.
- Placera objektglas i en bild varmare och låt sektioner att torka över natten vid 37 ° C.
- Sätta objektglas i objektglashållare och deparaffinize dem genom att blötlägga dem i 3 olika färgning rätter av ren icke-xylen (cirka 200-250 mL) för 8, 5 och 3 min.
- Återfukta avsnitten vävnad i objektglashållare genom att blötlägga dem i olika färgning rätter av graderade etanol lösningar (100% etanol två gånger, 90% etanol en gång och 80% etanol en gång [1 min varje]), och skölj dem i dubbeldestillerat vatten.
Obs: Dessa lösningar är cirka 200 till 250 mL i olika färgning rätter. För varje tvätt räcker 30 SEK. - Skölj vävnaden avsnitt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,5% Triton x-100, tvätta dem med PBS för flera gånger, och skölj dem sedan i dubbeldestillerat vatten.
Obs: Dessa lösningar är cirka 200 till 250 mL i olika färgning rätter. För varje var, räcker 30 SEK. - Förbereda lika mängder de tre komponenterna (initiativtagare, moderator och aktivator) som tillhandahålls av silver enhancement kit i mörkret och blanda dem väl.
Obs: Lösningar av moderator och aktivator är klibbig, så Använd en pipett med bred spets öppningar (eller skär tips för att skapa bredare öppningar). För varje bild är 300 μL av den blanda lösningen (beroende på storleken på avsnittet vävnad) oftast tillräckligt. Om 10 bilder används, därför beloppet för varje komponent (initiativtagare, moderator och aktivator) 1000 μl (den blanda lösningen är 3000 μL 10 bilder). - Inkubera i vävnaden avsnitt i den blanda lösningen för 15 min i mörker vid rumstemperatur. Helt täcka vävnadssnitt på bilderna med den blanda lösningen. En längre inkubationstid kan leda till falskt positiva AMG signaler.
- Tvätta i bilderna med dubbeldestillerat vatten och färga dem i hematoxylin för 10 s som en motfärg.
- Tvätta i bilderna med rinnande vatten, torka dem och montera dem med monteringsmedium.
- Granska bilderna under ett ljusmikroskop.
- Slumpmässigt ta tio histologiska bilder med ett 40 X-objektiv från varje vävnad avsnitt med en ansluten digital kamera med dator avbildningsprogrammet.
3. semikvantitativ analys för AMG positiva värden av histologiska bilder
Obs: AMG positivt värde innebär en procentandel av området med AMG positiva signaler.
- Använd bild analys programvara (ImageJ) för att analysera de histologiska bilderna.
- Öppna den histologiska bilden genom att trycka fil | Öppna.
- Dela den valda bilden i tre färgkanaler (röd, blå och grön) genom att trycka på bild | Typ | RGB-Stack.
- Kvantifiera de AMG positiva signalerna med hjälp av den blå kanalen. Nukleära falska positiva signaler är vanligtvis minskade under den blå kanalen när hematoxylin fläcken används för nukleära motfärg (figur 2).
- Mäta procentandelen av arealen med AMG positiva signaler i varje histologiska bild med verktyget tröskel (bild | Justera | Tröskelvärde för).
- Manuellt justera cut-off värdet av tröskeln för varje histologiska bild (från 90 till 110) baserat på närvaro av falska positiva områden i kärnor och/eller röda blodkroppar.
Obs: I standard inställning, ska de positiva signalerna som AMG markeras i rött. - Tryck analysera | Ange mått, och markera rutan i Området bråk att ange att det område bråket registreras.
- Tryck analysera | Mått. Det positiva procentiga området av varje histologiska bild visas i kolumnen % område i fönstret resultat .
- Genomsnitt 10 histologiska bilder från varje vävnad avsnitt positiv procent områdena och definiera resultatet som AMG positivt värde för varje vävnad avsnitt.
Figur 2: förekomsten av kärnvapen falska positiva signaler under olika färgkanaler (motfärg: hematoxylin fläcken). Representativa nukleära falska positiva signaler indikeras med gula pilar. PPA = positiv procentsats av områden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. upprättande av regressionsmodell småvalar histologiska Ag analysens (CHAA)
Obs: Följande analys utförs i prisma 6,01 för Windows.
- Utvärdera korrelationen mellan resultaten av ICP-MS och AMG positiva värden.
- Öppna programvaran, skapa en ny projektfil och välja XY och korrelation.
- Dataunderlaget omfattar resultaten av ICP-MS och AMG positiva värden.
- Tryck på analys och välja korrelation under kategorin XY analys analysera styrkan i sambandet mellan resultaten av den ICP-MS och AMG positiva värden av Pearson korrelation analys.
Obs: Resultaten av ICP-MS och AMG positiva värden behöver vara positivt korrelerade med varandra; Annars borde den efterföljande regressionsmodellen inte utvecklas. - Statistiskt jämför de regressionsmodeller, inklusive linjär regression, kvadratisk regression, kubisk regression och linjär regression genom ursprung, genom statistik programvara12,26,27.
Obs: Om regressionsmodellen genererar en orealistisk Ag koncentration, regressionsmodellen bör vara övergivna12. - Gå tillbaka till tabellen (vänster) och tryck på analys | Icke-linjär regression (kurvanpassning) under kategorin XY analys | OK.
- I fönstret Parametrar: Nonlinear regression, välja olika regressionsmodell i sidanpassning och sedan jämföra olika regressionsmodeller sidan Jämför.
- Sidan Jämför, Välj jämförelse metoderna, inklusive extra summan-av-torg F test och Akaike's information kriterium (AIC). Enligt resultaten av jämförelsen metoder, använda en relativt lämplig regressionsmodell i CHAA.
- Beräkna Ag koncentrationer av valarnas lever och njure vävnad med okänd Ag koncentrationer genom att använda CHAA.
- Utvärdera den noggrannhet och precision av CHAA för levern och njurarna vävnader. Skillnaden mellan precision och noggrannhet illustreras i figur 3.
- Noggrannhet: Beräkna den genomsnittliga standardavvikelsen (SD) från skillnader mellan kända och uppskattade Ag koncentrationer.
- Precision: Utföra upprepad mätning (minst tre exemplar) av AMG positiva värden seriell avsnitt från samma FFPE vävnader. Beräkna medelvärdet SD av mätningar från lever eller njure vävnad från skillnader mellan kända och uppskattade Ag koncentrationer
Obs: Metoder för utvärdering av noggrannhet och precision avbildas i figur 4.
Figur 3: skillnaden mellan noggrannhet och precision. Noggrannheten innebär hur nära mätning är det sanna värdet (dvs. Ag koncentration bestäms av ICP-MS); precision innebär repeterbarheten av mätningen (dvs. överensstämmelsen mellan upprepade mätningar av AMG positiva värden från de tre exemplar vävnadssnitt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: stödordningen som skildrar metoderna för utvärdering av noggrannhet och precision. CHAA = småvalar histologiska Ag analys; FFPE = Formalin-fast, paraffin-inbäddat; ICP-MS = induktivt kopplad plasma mass spektroskopi; AI = var och en av de Ag koncentrationerna bestäms av ICP-MS för varje par matchade vävnadsprov; BI = var och en av de Ag koncentrationerna beräknad av CHAA av varje par matchade vävnadsprov; CI, Di och Ei = var och en av The Ag koncentrationer beräknad av CHAA tre exemplar prover från varje par matchade vävnadsprov; Jag = 1 till n. Vänligen se rådata av noggrannhet och precision tester i avsnittet i representativa resultat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. uppskattning av Ag koncentrationer av CHAA.
- Samla och njure vävnader från strandade valar och fixa dem i 10% neutral buffrad formalin.
- Bearbeta formalin-fasta vävnader rutinmässigt (se steg 2).
- Uppskatta Ag koncentrationerna av valarnas lever och njure vävnader med okänd Ag koncentrationer av CHAA (se steg 3 och 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa bilder av AMG positiva signaler i valarnas lever och njure vävnader visas i figur 5. De positiva signalerna som AMG inkluderar steglöst medelstora bruna till svarta granulat i olika storlekar i cytoplasman i proximal renal tubulär epitel, hepatocyter och Kupffers celler. Ibland noteras amorft gyllene gul till brun AMG positiva signaler i lumen och basalmembranet av vissa proximala njurtubuli. Det finns ett positivt samband mellan resultaten av ICP-MS och AMG positivitet värden i levern och njurarna vävnader och linjär regression genom origin är att föredra enligt den extra summan-av-torg F test och AIC12,26, 27. I noggrannhet test, medelvärdet säkerhetsdatabladet för CHAA för lever och njure är 3,24 0,16, respektive. I precision test, medelvärdet säkerhetsdatabladet för CHAA för lever och njure är 2,8 0,35, respektive. Rådata av noggrannhet och precision testerna sammanfattas i tabell 1. Den AMG positiva värden och Ag koncentrationer beräknad av CHAA Ag koncentrationer mätt med ICP-MS från lever och njure vävnad av dessa sex strandade valar sammanfattas i tabell 2.
Figur 5: representativa histologiska bilder av AMG positiva signaler i lever och njure vävnader av valar (motfärg: hematoxylin fläcken). (A) AMG positiva signaler i valarnas levervävnad är jämnt fördelade (Grampus griseus (Gg); område kod: TP20111116; AG koncentration mätt byinductively kopplad plasma mass spektroskopi (ICP-MS): 21.82 μg/g torrvikt). (B) The AMG positiva signaler är bruna till svarta granulat av olika sizesin cytoplasman i hepatocyter (röda pilar) och Kupffers celler (röda pilen huvuden) (Gg; område kod: TP20111116). (C) ett par AMG positiva signaler av brunt till svart granulat visas i cytoplasman i hepatocyter (röda pilar) (Kogia spp. (Ko); område kod: TC20110722; AG koncentration mätt med ICP-MS: 3.86 μg/g torrvikt). (D) The AMG positiva signaler i valarnas njure vävnad är huvudsakligen belägna i nedsatt cortex (Gg; område kod: TP20111116; AG koncentration mätt med ICP-MS: 0,42 μg/g torrvikt). Den svart streckad linjen är placerad i korsningen mellan nedsatt cortex och medulla. (E) högre magnification av figur 5 d (röd streckad rektangel). AMG positiva signaler i nedsatt cortex är bruna till svarta granulat i olika storlekar i cytoplasman av proximal renal tubulär epitel (röda pilar). Amorfa gyllene gul till brun AMG positiva signaler visas i lumen (röd pil) och basalmembranet (gul pil) av vissa proximala njurtubuli. Ingen till minimal AMG positiva signaler visas i glomeruli (grön pil) och distala njurtubuli (grön pil) (Gg; område kod: TP20111116). (F) spridda brunt granulat av olika storlekar visas i thecytoplasm av proximal renal tubulär epitel (röda pilar) (Ko; område kod: TC20110722; AG koncentration mätt med ICP-MS: 0,05 μg/g torrvikt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Precisionstest | ||||||
| Fältnummer | Lever | Njure | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 16,82 | 21,82 | 4,99 | 0,64 | 0,42 | 0,22 |
| TC20110611 | 10.12 | 2,77 | 0,96 | 0,11 | 0,05 | 0,35 |
| TC20110722 | 2,70 | 3.86 | 1.15 | 0,01 | 0,05 | 0,04 |
| TD20110608 | 0,76 | 0,06 | 7,35 | 0,02 | 0,05 | 0,06 |
| TP20110830 | 13,97 | 14,93 | 4.28 | 0,69 | 1,04 | 0,24 |
| IL20110101 | 6,00 | 1,73 | 0,72 | 0,38 | 0,14 | 0,03 |
| Menar SD | 3.24 | Menar SD | 0,16 | |||
| Precisions test | ||||||
| Fältnummer | Lever | Njure | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 20,90 | 21,82 | 4.08 | 0,21 | 0,42 | 0,44 |
| 16.11 | 0,22 | |||||
| 17,75 | 0,14 | |||||
| TD20110608 | 1.52 | 0,06 | 1,71 | 0.00 | 0,05 | 0,02 |
| 2,40 | 0.00 | |||||
| 1.12 | 0.00 | |||||
| TP20110830 | 13.12 | 14,93 | 2,70 | 0,45 | 1,04 | 0,59 |
| 12,50 | 0,26 | |||||
| 11,35 | 0,33 | |||||
| Menar SD | 2,83 | Menar SD | 0,35 | |||
| * CHAA för lever och njurar regression ekvationer var respektive Y = 2.249 × X (justerat R2 = 0,74) och Y = 0.07288 × X (justerat R2 = 0,69). | ||||||
Tabell 1: representativa resultaten av de noggrannhet och precision testerna för småvalar histologiska Ag assay (CHAA). CHAA = småvalar histologiska Ag assay, ICP-MS = induktivt kopplad plasma mass spektroskopi, SD = standardavvikelse.
| Fältnummer | Arter | Lever | Njure | ||||
| AMG | CHAA * | ICP-MS | AMG | CHAA * | ICP-MS | ||
| TP20111116 | Gg | 7,48 | 16,82 | 21,82 | 8.82 | 0,64 | 0,42 |
| TC20110611 | Ko | 4,50 | 10.12 | 2,77 | 1.52 | 0,11 | 0,05 |
| TC20110722 | Ko | 1,20 | 2,70 | 3.86 | 0,11 | 0,01 | 0,05 |
| TD20110608 | LH | 0,34 | 0,76 | 0,06 | 0,21 | 0,02 | 0,05 |
| TP20110830 | LH | 6,21 | 13,97 | 14,93 | 9,43 | 0,69 | 1,04 |
| IL20110101 | Sa | 2,67 | 6,00 | 1,73 | 5,26 | 0,38 | 0,14 |
| * CHAA för lever och njurar regression ekvationer var respektive Y = 2.249 × X (justerat R2 = 0,74) och Y = 0.07288 × X (justerat R2 = 0,69). | |||||||
Tabell 2: The AMG positiva värden, Ag koncentrationer (μg/g, torrvikt) uppskattas av småvalar histologiska Ag assay (CHAA) och Ag koncentrationer (μg/g, torrvikt) mätt med ICP-MS från lever och njure vävnader av sex strandade valar. Gg = Grampus griseus, Ko = Kogia spp., Lh = Lagenodelphis hosei, Sa = Stenella attenuata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med artikel studien är att upprätta en adjuvant metod att utvärdera Ag fördelningen på suborgan nivåer och uppskatta Ag koncentrationer i valarnas vävnader. De aktuella protokollen inkludera 1) bestämning av Ag koncentrationer i valarnas vävnader av ICP-MS, 2) AMG analys av par-matchade vävnadsprover med kända Ag koncentrationer, 3) inrättandet av regressionsmodellen (CHAA) för att uppskatta koncentrationerna som Ag av AMG positiva värden, 4) utvärdering av noggrannhet och precision av CHAA, och 5) uppskattning av Ag koncentrationer av CHAA.
I denna studie var data för ICP-MS påtagligt och positivt korrelerade med de av AMG positiva värden, vilket tyder på att koncentrationen av Ag i valarnas vävnader kan uppskattas av AMG positiva värdet. CHAA, som bygger på AMG positivt värde och regressionsmodell, har därför utvecklats för att uppskatta Ag koncentrationerna i lever och njure vävnader av valar. I allmänhet en regressionsmodell med fler parametrar (dvs. en mer komplex regressionsmodell) passar väl in data, men det är obestämd att den mer komplexa är faktiskt bättre än den enklare. Därför, bästa regressionsmodellen måste väljas av statistisk analys26,27. Resultaten av den statistiska analysen visar att den linjära regressionsmodellen är tillräcklig för att uppskatta den Ag koncentration baserat på AMG positivt värde12.
CHAA för njure vävnad var menar SD (0,35) av precision testet större än det korrekta testet (0,16). Omvänt, i CHAA för levervävnad, menar SD (2,8) av precision testet var mindre än precisionstest (3,24). Baserat på detta resultat, föreslås det att den ojämna fördelningen av AMG positiva signaler och relativt låg Ag koncentrationer i valarnas njure vävnad negativt stör CHAA precision för njure vävnad. CHAA för njure vävnad kan därför korrekt men otydliga. En jämn fördelning av AMG positiva signaler och Ag relativt höga koncentrationer i valarnas levern vävnader tyder emellertid på att CHAA för levervävnad är en tillförlitlig metod för att uppskatta Ag koncentrationerna i valarnas levern vävnader. Dessutom om det finns fler vävnader med kända Ag koncentrationer bestäms av ICP-MS, kan en mer noggrann och exakt regressionsmodell utvecklas för att uppskatta den Ag-koncentrationen.
Även om de aktuella protokollen ger en adjuvant metod för att undersöka Ag i djurvävnader, bör vissa begränsningar på AMG-metoden noteras. Första, falskt positiva AMG signaler kan presentera på grund av störningar från andra tungmetaller, såsom kvicksilver, vismut och zink28. Därför har resultaten av metoden AMG tolkas med andra specifika metoder, såsom ICP-MS, att övervaka den faktiska sammansättningen av tungmetaller28. Andra, det är svårt att upptäcka en likartad distribuerade tungmetall eftersom det kan generera ljusare amorft AMG positiva signaler, som inte kan identifieras genom visualisering under mikroskopisk undersökning. De amorfa och ljusare AMG positiva signalerna är dessutom svåra att analysera med bild analys programvara eftersom färgen på AMG positiva signaler kan vara liknande den i bakgrunden (t.ex., de amorfa AMG positiva signalerna finns i den proximala njurtubuli lumen). Därför inte kan AMG positiva signalerna lyftas efter justeringen av cut-off värdet av tröskelvärdet i analys bildbehandlingsprogram. För det tredje eftersom AMG positiva värdena är baserade på procentandelen av området av AMG positiva signaler, är det möjligt att värdena av högkoncentrerad tungmetaller kan underskattas.
FFPE-prov är relativt enkelt att samla in och lagra, och vår tidigare studie har visat att den nuvarande AMG-metoden framgångsrikt kan förstärka FFPE prover lagras för över 15 år12. Mekanismen av AMG påverkas inte av olika djurarter, för det vilt har använts i olika djurarter20,29,30,31. Även den nuvarande artikeln är inriktat på valar, kan de protokoll som beskrivs här också användas i olika djurarter. Dessutom kostnaden för metoden AMG med ICP-MS är relativt låga (jämfört med laser ablation-ICP-MS), och därmed de aktuella protokollen är värdefulla för forskare eller länder som saknar tillräcklig forskningsfinansiering för att undersöka fördelningen och koncentrationen av tungmetaller i djurvävnader. Sammanfattningsvis, ger användningen av AMG med kvantitativ analys att lokalisera och semi beräkna tungmetaller en bekväm metod för studier av plats och tid och mellan djurarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Taiwan Cetacean strandning nätverket för provtagning och förvaring, inklusive Taiwan Cetacean Society, Taipei; Valarnas forskningslaboratoriet (Prof. Lien-Siang Chou), Institutet för ekologi och evolutionsbiologi, National Taiwan University, Taipei; National Museum of Natural Science (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; och marinbiologi & Cetacean Research Center, National Cheng-Kung University. Vi tackar även de skogsbruk Bureau, rådet för jordbruk, Executive Yuan för deras tillstånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | --- | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers? Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , In Press (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).
- Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
