Summary
Целью протокола является показать продольной прижизненной слежение в реальном времени тимоцитов, лазерной сканирующей микроскопии в тимуса имплантатов в передней камере глаза мыши. Прозрачность роговицы и васкуляризация трансплантат позволяет непрерывно записывать прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выхода.
Abstract
Представлен метод призвана показать, в первый раз, пересадка новорожденных thymi в передней глаз палаты isogenic взрослых мышей в vivo продольной реального времени мониторинга динамики thymocytes´ в пределах васкуляризированной Тимус сегмент. После трансплантации лазерной сканирующей микроскопии (МИС) через роговицу позволяет в vivo неинвазивной повторяющихся изображений на уровне клеточных резолюции. Важно отметить, что подход добавляет предыдущих прижизненной созревание Т-клеток, визуализации модели возможность непрерывного прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выход записи в то же самое животное. Дополнительные преимущества системы являются прозрачность привитые области, позволяющие макроскопических быстрого мониторинга имплантированных ткани, и доступность для имплантации, позволяя для локализованных в дополнение к системной терапии. Основным ограничением является объем ткани, вписывается в ограниченном пространстве глаз камеры, которая требует для обрезки лепестка. Целостности органа максимизируется путем рассечения тимуса лопастями в шаблоны, ранее показанный функциональным для зрелых Т-клеток производства. Техника потенциально подходит допросить окружение медицински соответствующих вопросов, связанных с тимуса функции, которые включают аутоиммунные заболевания, приобретенного иммунодефицита и центральной толерантности; процессы, которые остаются механистически плохо определены. Тонкой рассечение руководящих тимоцитов миграции, дифференциация и выбор механизмов должно привести к Роман терапевтические стратегии ориентации развивающихся Т-клеток.
Introduction
Intrathymic Т-клеточная дифференцировка и выбор субпопуляции Т-клеток являются ключевых процессов для развития и поддержания клеточного иммунитета в позвоночных1. Этот процесс включает в себя сложные последовательности плотно организованных мероприятий, включая вербовку прародителей от крови, пролиферации и миграции, дифференциальной выражение мембранных белков, и массивные запрограммированная смерть клетки для подмножества выбор. Результатом является освобождение зрелых Т-клетки реагируют на большой спектр иностранных антигены во время отображения свернутого ответы на self пептиды, которые конца вверх колонизировать периферических лимфоидных органов отдельных2,3. Аберрантное тимоцитов выбор репертуара αβTCR приводит к аутоиммунным заболеванием или иммунных дисбаланс4 , которые главным образом являются производными от дефектов во время процесса отбора положительное или отрицательное прекурсоров, соответственно.
Направления миграции тимоцитов через тимуса является неотъемлемой частью всех стадий созревания Т-клеток и это предусмотрено как серию одновременное или последовательное несколько стимулов, включая chemokines, клей, и снять клей внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия протеина3,5. Изучение фиксированных тканей оказывает крайне необходимую информацию о характере выражения для мигрирующих подсказки тимоцитов в определенных тимуса микросреды5,6, в то время как ex vivo исследований выявил два распространенных мигрирующие поведение тимоцитов в два гистологически различных областях органа: медленный Стохастический движений в коре и быстрый, ограничивается подвижность в продолговатого мозга-7,-8,9,10 , 11 , 12 , 13. увеличение миграционных ставки коррелируют с тимуса позитивного выбора13 и негативный выбор связан с поддерживая гипотезу, что кинетика путешествие через тимуса определяет правильное поведение при обходе созревания тимоцитов. Несмотря на их актуальности топология взаимодействия тимоцитов стромальных клеток и динамика тимоцитов моторики через орган микросреды во время созревания Т-клеток остаются плохо определены.
Большинство ex vivo исследования на сегодняшний день включают плода или reaggregate тимуса орган культур14,15, кусочки ткани или эксплантов нетронутыми доли тимуса, где тимоцитов движений визуализируются два фотона лазерного сканирования микроскопия (TPLSM)8, прижизненные изображения технику с ограниченным максимальное рабочее расстояние и визуализации глубиной 1 мм в соответствии с ткани изучены16. В отличие от кропотливого тимуса орган культур, которые зависят от расширенной инкубации раз в виде 3D-структуры, предварительно помечены как, тимуса ломтик технику, так и нетронутыми доли тимуса подход разрешение контроль введения определенных подмножеств тимоцитов в среду архитектуры родной ткани. Однако, так как поток крови отсутствует в этих моделях, они явно ограничены для изучения процесса набора персонала, урегулирования прародителями (ОТУ) тимуса паренхиме или динамика тимуса egression зрелых Т-лимфоцитов тимуса.
В естественных условиях модели для изучения тимуса Т-клеточной физиологии созревания в мышах включают графтов фрагментов или весь орган лопастями, размещены либо внутри почек капсула17 или intradermally18. Хотя эти варианты показал их полезности допросить системного функционального приживления ткани, позиция тимуса графтов глубоко внутри животного или охваченных слоев непрозрачной ткани ограничивает их использование для экспертизы в vivo имплантатов TPLSM.
Передней камеры глаза обеспечивает легкодоступными пространство для непосредственного мониторинга любых привитые ткани благодаря прозрачности роговицы слоя. Преимущество основание камеры, образованной радужки богат кровеносных сосудов и вегетативной нервных окончаний, позволяя быстрое реваскуляризации и Реиннервация графтов19,20. Д-р Caicedo успешно использовал это анатомические пространство для поддержания и продольной исследование панкреатических островков в прошлом21. Здесь мы показываем, что эта стратегия не только представляет собой допустимый подход к изучению тимоцитов динамика в структуре родной орган, но также однозначно разрешает продлить в vivo продольной записи к изучению прародитель вербовки и зрелых Т-клеточной egression шаги в мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты согласно рекомендациям IACUC одобрил институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Майами.
1. изоляция и обрезки новорожденных Thymi
- Подготовьте все реагенты и инструменты автоклавирования или других методов, обеспечение стерильных условий.
- Чтобы свести к минимуму загрязнений, выполняют все хирургические вмешательства под капотом ламинарного потока.
- До euthanizing доноров мышей, заполнить 60 мм стерильные блюдо с стерильных prechilled 1 x фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4) и поместите его на льду. Он будет использоваться для промывки и хранения подакцизным thymi от доноров мышей до трансплантации.
- Перейти к усыпить доноров новорожденных мышей, обезглавливание, в соответствии с руководящими принципами этики.
- Поместите курсор мыши на стерильные абсорбирующие бумажные полотенца в спинной вертикальном положении и спрей и позднее wipe, брюшко мыши с 70% этиловом спирте.
- Разоблачить грудной полости, делая поверхностный V-образный разрез на уровне нижней части живота и вырезать кожу с парой прямых 10 см, рассекает ножницы после вентральной срединной оставить отверстие около 0,5-1 см на уровне груди. Сложите кожи над каждой стороне груди подвергать грудной полости.
- Сделать два глубже 0,5-1 см боковые разрезы через диафрагму и грудную клетку с тем же типом ножницы для доступа к превосходной средостения в передней грудной полости. Тимуса должен появиться как два бледно лопастями прямо над сердцем.
- Место набор Изогнутый пинцет под тимуса и тянуть вертикально для извлечения полного орган. Предотвратить foldback грудной клетки с парой щипцов. При необходимости, использовать тонкой щипцами осторожно разорвать соединительной ткани, окружающие орган не нарушая капсулу перед извлечением орган.
Примечание: Этот шаг облегчается с использованием рассечения области. - Погружаться изолированных тимуса в холодного стерильного ПБС (рН 7,4) ранее отображается в стерильную посуду 60 мм и вырезать соединительной перешейка с помощью скальпеля отделить тимуса лопастями. Удалите любые инородные тела из блюдо не повреждая капсулу. Чтобы свести к минимуму время, подвергаются thymi, обрезать тимьян лопастями прямо перед имплантата.
Примечание: Обычно каждый изолированных новорожденных тимуса окажет шесть сегментов около 1 мм в ширину, максимум три узла мышей при получении имплантатов в обоих глазах. - Повторите шаги с 1,4-1,9 для каждой мыши доноров. Чтобы свести к минимуму время, подвергаются thymi, изолируйте один тимуса одновременно.
2. тимуса имплантации в переднюю камеру глаза
- До трансплантации тегов и весят каждого получателя мыши.
- Используйте дозу между 1-2% isofluorane паров чтобы анестезировать получателя мыши. Обеспечение надлежащего анестезии отсутствие рефлекс следующие мыс крайнем случае перед началом хирургической процедуры.
- Продолжите трансплантации тимуса сегментов следующим образом:
- Поместите курсор мыши в сторону боковое положение лежа так что один глаз вверх непосредственно подвержены объектив рассечения сферы.
- Акцизный один из изолированных тимуса лопастями, лежа в холодной ПБС (рН 7,4)-заполнены 60 мм блюдо на куски толщиной до 1 мм для имплантата. Следуйте шаблон Зиг заг, чтобы гарантировать, что каждый сегмент содержит тимуса коры и мозгового вещества. Использование беззаботными ножницы для обрезки согласно рекомендации, представленные на рисунке 1A.
Примечание: Обрезка тимуса должно быть сделано прямо перед имплантат для оптимизации приживления ткани. - Начиная с основания роговицы, соответствующий зоне хирургические, ввести кончик иглы 40 мм G18 сделать небольшой надрез в слои внешние роговицы, так, что кончик рассечения ножницы могут быть введены.
- Сделайте 5-10 мм фланка разрез непосредственно вокруг основания роговицы с помощью ножниц беззаботными удерживая роговицы открытия твердо для предотвращения запечатывания. Используйте щипцы с плоскими концами, чтобы избежать повреждения тканей.
- Возьмите отрезока эпителия роговицы и разоблачить открытия, удерживая толкая тимуса сегмент путем открытия роговицы, с парой плоским, закончившийся щипцов. Влажные глаза с стерильных 1 x PBS (рН 7,4) или искусственные слезы, необходимых для предотвращения высыхания ткани до завершения манипуляции.
- Нажмите мягко на поверхности глаза скользить сегмент представлен ткани на боковой позиции в отношении ученика для сохранения функции eye´s. Убедитесь, что трансплантат лежит на месте напротив глаза открытия для предотвращения задняя помехи изображений, Дедовщина.
- С помощью плоских щипцов, нажмите твердо, для около 3-5 s, обе стороны роговицы открытия против друг друга, содействовать самоуплотняющийся. Операции не требуют каких-либо сшивание или шитья.
- Если пересадки выполняются на обоих глазах, переверните мышь противоположной боковой разоблачить второй глаз для рассечения объектива микроскопа и повторите шаги 2.3.2-2.3.7 напрямую.
- После завершения операции, вернуть пустой клетке разогретую с тепла лампы мышь.
- Убедитесь, что каждый пересаженных мыши восстанавливает полную мобильность и сознание перед его размещением в клетке, совместно с другими животными. Это обычно происходит в течение 1 ч после операции.
- После пересадки лечить мышей с болеутоляющие, при необходимости и обеспечивают мышей с ацетаминофена в концентрации 1,6 мг/мл в питьевой воде.
- Повторите шаги с 2,2-2,9 для каждого получателя мыши.
- Послеоперационные животных на мониторе, а также вид имплантированных глаз для выявления потенциальных осложнений.
3. конфокальная томография имплантированных Thymi с использованием 3D один фотон флуоресценции Confocal микроскопии
- Анестезировать получателя мыши с помощью дозы 1-2% isofluorane паров. Обеспечение надлежащего анестезии отсутствие рефлекс следующие мыс крайнем случае перед началом процедуры обработки изображений
- Поместите курсор мыши на платформе фиксированной Этап микроскопа в стороне боковой лежачем положении, так что один глаз вверх. Площадку тепла помещается на платформе микроскоп для обеспечения постоянной тела температуры мышей во время записи.
Примечание: Подробная информация приведена дополнительная цифра 1 . - Вставьте головку мыши в стереотаксического headholder и отрегулируйте ручку удержать голову мыши на боковой позиции, позволяя прямой доступ Микроскоп цели для глаз, держа тимуса трансплантата.
- Место мыши мордой в противогаз, чтобы сохранить животных, под наркозом на протяжении всей процедуры. Это позволяет регулировать isofluorane паров при необходимости.
- Для содействия стабилизации глаза во время записи избегая Ретракция век, тянуть обратно веки пока держащ глаза на периферии роговицы с парой пинцет, которые имеют их советы, охватываемых полиэтиленовые трубки, которые прилагаются к Усть-2 твердых Карданное соединение. Этот механизм позволяет устойчивый фиксации головы и глаз и обеспечивает гибкость без нарушения потока крови в глаза, как описано выше22.
Примечание: Дополнительные цифры 1B, C показывают полную сборку. - Добавьте несколько капель стерильным физиологическим или искусственные слезы как погружения жидкости между роговицы и хрусталика, перед размещением Микроскоп цель на мышь глаз.
Примечание: дополнительные капли обойтись на потребность во всей процедуре держать путь микроскоп и предотвращения высыхания глаз. - Сначала используйте малое увеличение (5 X) объектив для поиска тимуса в поле микроскопа. Затем переключиться на более погружения в воду (10, 20 и 40 X) окунать целей с большим рабочим расстоянием. Избегайте LSM фотоповреждения и отбеливания тимуса имплантата путем применения минимальной лазерной энергии и сократить время сканирования как можно больше. Это достигается с помощью резонансный сканер микроскопа.
Примечание: Конфокального микроскопа, мы используем оснащен резонансного сканирования зеркала, способных сбора изображений на 25 кадров/сек. Другие бренды имеют свои собственные Микроскопы с резонансной сканеров. - Выберите режим приобретения с помощью микроскопа программного обеспечения и начать режим резонансный сканер. Затем выберите режим визуализации XYZT и настройте параметры приобретения следующим образом:
- Включите Аргонового лазера и отрегулировать мощность до 30% для возбуждения флуоресценции.
- Выберите линию лазерного возбуждения и задайте Акусто оптический луч (AOBS) разделителя для выбросов различных длинах волн. Кроме того для выявления обратного рассеяния и разграничить структуры тканей, обнаружения отражение одновременно.
Примечание: При выборе набора цветов для возбуждения (GFP и ППП), AOBS автоматически программируется направлять эти линии возбуждения на образец и передавать выбросов между ними. Например, для GFP и ППП, мы используем отражения узких полос для возбуждения свет около 488 нм и 561 Нм, соответственно. Это оставляет широкие полосы для коллекции Фотоны испускаемого флуоресценции, таким образом уменьшая потребность для лазерной энергии и приобретение время. В режиме отражения AOBS используется как равного пучка сплиттер для изображения отраженного света в любого волны от тех, которые используются для флуоресценции обнаружения выбросов. - Собирать выбросов на выбранной длине волны, а затем выберите разрешение 512 × 512 пикселей и начать жить изображений, нажав на кнопку Live , регулируя уровни усиления, при необходимости (типичный прирост составляет около 600 V).
- Определить начало и конец z-стека, сосредоточив внимание на вершине тимуса имплантата и выберите начать, а затем перейти к последнему плоскость, которая может быть направлена в имплантированных тимуса и выберите конец. Используйте размер z шаг 5 мкм. Программное обеспечение автоматически рассчитает количество конфокальный самолетов.
- Выберите временной интервал для приобретения каждого z-стека (обычно 1,5 до 2 секунд) и выберите опцию приобрести до остановки для непрерывной обработки изображений.
- Нажмите кнопку Пуск для инициализации.
- Неоднократно изображения графтов в разное время от же животное, повторив шаги 3.1-3.9.
Примечание: Если животное держит графтов на обоих глазах, записи из обоих глаз может принять, повторив шаги 3.2-3.9 после переключения вертикальном положении стороне мыши головы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тимус от новорожденных мышей были изолированы от B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Жас мышей, как описано в настоящем Протоколе (шаги 1,1-1,9). В этих трансгенных мышей промоутер актина курица бета направляет выражение Красного флуоресцирующего белка вариант DsRed. MST под влиянием цитомегаловирусом (CMV) немедленно усилитель ранних облегчения отслеживания имплантатов.
Для предотвращения отторжения тканей, isogenic людей с генотип: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J были выбраны в качестве хозяев. В этих трансгенных мышей промоутер человека убиквитин C направляет выражение расширенной зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) во всех тканях, обеспечивающие четкое различие между бенефициарами и донорами ткани. Действия человека убиквитин C промоутер приводит к дифференциальной GFP выражений шаблонов в некоторых типах гемопоэтических клеток. В частности, Т-клетки представляют два раза выше экспрессия гена GFP уровней чем CD19+B220+ B клетки или другие периферийные клетки крови, которые могут облегчить их идентификации путем количественного чувствительных методов таких как проточная цитометрия, без каких-либо потребности в дополнительной маркировки. Кроме того флуоресцентный выражение в этих мышей наблюдается у взрослых животных, а также на всех этапах эмбрионального и единообразных в пределах ячейки типа линии выдачи маркера стабильности.
Шаблон для обрезки тимуса, показан на рисунке 1A следует предыдущие описания функциональных тимуса фрагментов, имплантированные в почках отолярингология23. Эта процедура усечения для сокращения общего объема ткани позволяет быть имплантированы при сохранении функциональной гистологические основных подразделений органа (коры, Продолговатый мозг и cortico Медуллярная Джанкшен (CMJ) кровеносных сосудов). Заметные разница в размерах между новорожденными тимуса (рис. 1A, слева) и тимуса от одного - неделя старый мышей (рис. 1A, право) должны приниматься во внимание для обрезки, как пространство, доступное для имплантатов в передней камере мыши глаз является ограниченным. Представленные здесь результаты включают в себя имплантатов, полученные от новорожденных только. Рисунок 1B показывает макроскопических образ сегмент тимуса, имплантированные в передней камере глаза мыши GFP, приспособлено для сохранения животных видения. Гистологические детали имплантата со ссылкой на роговице (GFP ткани рядом с ЗП имплантата) можно наблюдать в 3D-реконструкции Конфокальный изображений в дополнительных видео 1. Приживления для радужки показано в видео 1 и на рисунке 2.
Рисунок 1 c и 1 D соответственно иллюстрируют светлые области и флуоресценции изображения из той же области, которые могут служить для двойной макроскопических следить роста тканей и инволюция в продолжение исследований. Рисунок 1 c также иллюстрирует васкуляризации имплантированных ткани, которая позволит уникально для изучения физиологии вилочковой железы зависит от органа кровоснабжение вдоль время.
Васкуляризация вставленных фрагментов тимуса произошли в течение 72 ч после имплантации. Процесс быстрого васкуляризации находится в хорошем согласии с большим количеством кровеносных сосудов радужки и богатство тимуса в производство цитокинов. Эти характеристики позволяют быстро приживления вставленных thymi. Васкуляризация имплантатов проиллюстрирован в видео 2показаны отдельные приживления тимуса кровеносных сосудов с iris´ узел (GFP ткани рядом с ЗП имплантата), поэтому, подтверждающий, что модель, представленная здесь, в самом деле, позволяет Неинвазивный непрерывной мониторизации васкуляризированной тимуса на микроскопическом уровне. Использование LSM визуализировать эндогенного тимуса или тимус, ранее имплантирован в различных анатомических местах ограничивается непрозрачность ткани и ткани толщиной более 1 мм. Передняя камера глаза рассматривается как «окна» для облегчения наблюдения имплантированных тканей на микроскопическом уровне организма.
Здесь показано, что модель, разработанная нашей группы позволяет визуализацию трансмиграции клеток из крови торрент (2 видео) в имплантированных тимуса (предположительно прародителями); для отслеживания контактов GFP прогениторных клеток входящих в тимуса имплантата с эпителия и стромальных тимуса житель клетки (ЗП меченых) во время процессов дифференциации и отбора (видео 3 и 4) и, Кроме того, для выхода клеток (предположительно зрелых Т-клетки) в кровеносных сосудов (5 видео).
Подход, который мы описываем таким образом представляет собой «доказательство принципа», основываясь на записи, снятых между 72 h и один месяц после имплантации из шести лиц, пересаженные с сегментами из трех независимых новорожденных доноров, для животных модель разрешения в естественных условиях реального времени отслеживать созревания тимоцитов в фрагмент васкуляризированной тимуса неинвазивной процедуры вместе время, и таким образом, протокол может требуют дальнейшего уточнения. Эта модель может быть далее проработан использования трансгенных животных, укрывательство помечены тимоцитов молекулярных маркеров, например, как люминесцентные фьюжн продуктов, таким образом позволяя прямой визуализации промежуточных созревание Т-клеток. Система может помочь в разрешении споров и ответить incognitas, связанных с тимоцитов дифференциации и выбор событий среди других.
Рисунок 1. Резания доноров новорожденных тимуса лопастями и трансплантации в переднюю камеру глаза мышей. (A) новорожденных (слева) и одной недели после родов (справа) thymi изображения. Тире линии на новорожденных тимуса представляют руководства для подготовки разделов для трансплантации в камеру переднего глаз мышей, чтобы оценить максимальное количество трансплантатов от одного донора. (B) представитель изображением недавно имплантированных тимуса. (C) представитель образ привитые, васкуляризированной тимуса 2 недель после имплантации. (D) изображение флуоресценции тимуса трансплантата, показан на (C). (1 мм) отображается индикатор масштаба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Конфокальный изображения показаны детали тимуса сегмента (красный) приживления в радужной оболочке (зелёный). Изображения, полученные с помощью микроскопа, используя следующие параметры: 488 и 561 Нм возбуждения/500 и 575 Нм выбросов длин волн, 512 x 512 пикселей и 40 X погружения цель с рабочим расстоянием. Линейки шкалы показано (40 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительная цифра 1. Установки для конфокальная томография тимуса трансплантата, с использованием 3D одиночных фотонов флуоресценции лазерная конфокальная микроскопия. (A) Heatpad, стереотаксическая headholder и противогаз детали. (B) Настройка мыши холдинга тимуса трансплантата для LSM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1. В естественных условиях изображений тимуса имплантатов в передней камере глаза мыши. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 2. Набор предположительный тимуса, урегулирование прародителями (TSP) из потока крови (ГПУП) в тимуса паренхимы (RFP). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 3. Стохастического движения тимоцитов (ранние прародители тимуса или ПСВТ) в коре. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 4. Взаимодействие тимоцитов (ГПУП) с стромальные клетки тимуса (RFP) cTECs (коры тимуса эпителиальные клетки) или mTECs (медуллярного тимуса эпителиальные клетки). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 5. Реальном времени выхода изображений потенциальных зрелых Т-клеток. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Дополнительные видео 1. 3D -в vivo изображений тимуса имплантатов в передней камере глаза мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ввиду важности процесса созревания Т-клеток для индивидуальной иммунной компетентности4 и предполагаемого воздействия прекурсоров клеток динамики на зрелых Т-клетки, производимые тимуса2,3инвестировали значительные усилия разработать альтернативы подходу снимок классической фиксированной ткани.
Хотя фрагменты тканей и другие эксплантов явно превосходит в воспроизводя архитектуру ткани чем монослои или совокупных тимуса орган культур14,15, отсутствие подключения к сосудистую ограничивает их использование для изучения шаги входа или TSP (транслокации прародителями через барьер эндотелиальных клеток кровеносных сосудов) и выхода (транслокации зрелых Т-клеток через барьер эндотелиальных клеток кровеносных сосудов) от органа. Как это можно предположить, что динамика Т-клеток контакты с другими клеток, включая клетки тимуса стромы и их подвижность через микросреды в пределах коры и мозгового вещества определить статус их дифференциации и процесс субпопуляции Выбор (положительные и отрицательные)2,3,4,5, и поскольку эти процессы могут зависеть TSP и зрелых Т-клеток выход события, модель, которая включает в себя подключение к individual´s кровотока система будет желательным.
Для этого обновления17,18позволяют внутрикожных и почек капсула имплантатов тимуса. Однако они представляют инвазивные методы с ограничений для изображений, TPLSM из-за глубокой положение импланта в теле или наличие Непрозрачные слои ткани выше трансплантата. Адаптация мыши передней глаз камеры, ранее использовался как «окна»21,22 для продольно наблюдения за производительностью нескольких тканей, как сайт для отслеживания Т-клеток в пределах васкуляризированной тимуса предоставляет несколько преимуществ по сравнению с другими стратегиями трансплантации. С одной стороны операции проще, потому что нет швов требуются, приводит к быстрому восстановлению хост животных. С другой стороны наблюдения имплантатов не требуют дополнительные операции, как это происходит для капсула почек имплантатов, позволяя для повторяющихся записей из же животного. Кроме того анатомические особенности глаза позволяют легко модулировать нормативные материалы на имплантированный ткани не только системно, но также локально. Как описывалось ранее, с этим подходом вещества может быть применен местно на глаз или впрыскивается в камеру переднего глаза. Он также представляет легкий вариант введения вещества или клетки непосредственно в вилочковой железы (т.е., прародителями или созревания полуфабрикатов маркировкой ex vivo и восприимчивую переданы), который традиционно был весьма сложная процедура из-за тимуса анатомическое расположение24,25. Кроме того перфузии передней камеры позволяет обмен водянистой или погрузку трансплантат путем диффузии с люминесцентные Индикаторы, как ранее показанный для других видов имплантатов26.
Подход, который позволяет более точно исследование физиологии тимуса обеспечивается прижизненной визуализации трансгенных оризии рыбы, выражая дневно обозначенные лимфоцитов маркеров. Прозрачность оризии во время разработки и во всей жизни во многих штаммов оризии делает этот организм выгодно для мониторинга сотовых динамика в естественных условиях21. Низкое количество подвижных тимоцитов, наблюдается в18 оризии (29%), со ссылкой на mouse´s (95%)13, помимо различия в подвижности между этими двумя организмов, однако, свидетельствует о том, что холодная кровь мельчайших позвоночных с адаптивной иммунной системы может быть ограничена на выявление конкретных механистический кинетики высших позвоночных событий созревание Т-клеток.
Одно ограничение использования передней камеры глаза мыши как сайт для трансплантации тимуса является ограничение пространства. Может быть таким образом, под угрозу долгосрочные исследования; особенно для новорожденного или эмбриональных тканей с увеличенной потенциалом роста. В этом смысле мы должны заявить, что хотя новорожденных имплантатов с очевидной ткани расширения после первой недели после имплантата в мышь глаз (данные не показаны), расширения, по-видимому, не до риску целостность глаз двух месяцев после имплантации. Тем не менее она должна представлять интерес для оценки ли ткани окружающей среды имплантата (камеру глаза, капсула почек или дермы) влияет на рост implant´s и/или васкуляризации перед адекватности подхода могут быть установлены для определенных приложения.
Большие разрезы на роговице необходимо разрешить прохождение тимуса фрагмент передней глаз камеры приводит иногда к некоторым неуставные отношения на этом уровне (данные не показаны), наиболее вероятно, относящиеся к определенной степени фиброза, связанные для процесса заживления. Внимания требует на шаге 2.3.6 протокола, чтобы убедиться, что, если неуставные отношения происходит будет минимально вмешиваться течению изображений шаги. Как делается надрез на боковой уровне, имплантат ни неуставные отношения должны значительно повлиять на производительность зрение животных.
Необходимость для обрезки ткани сделать тимуса вписываются в камеру глаза, как представляется, быть недостатком, если по сравнению с другими анатомические сайты, которые не требуют изменения анатомической целостности органа. Тем не менее подход капсулу почки показал, что фрагменты тимуса, содержащие, оба, коры и мозгового вещества, получаемые аналогичные руководящие принципы рассечение, показанным на рисунке 1, стать полностью функциональной, как они могут восстановить Т-клеток опосредованный иммунитет в иммунодефицитных thymeless хостов18. Это приводит доводы в пользу нетронутыми функциональные черты этого типа тимуса сегментов. Кроме того протокол описано здесь подчеркивает, что изолированные тимуса должны храниться в холодной (шаг 1.9) и только подстрижены прямо перед имплантата (шаг 2.3.2) для минимизации холодной ишемии и ткани к оптимизации приживления ткани.
Дополнительные потенциальные ограничения подхода проживает в состав различия между водянистой влаги в передней камере глаза и плазмы крови, вопрос, который необходимо иметь в виду, когда устного замечания, сделанные в этом месте анатомического . Предыдущие исследования с другими тканями, однако, не представили каких-либо очевидных влияния на функции нормальной трансплантата местных глаз среды22. Хотя опыт работы с модели, представленные здесь ограничивается несколькими лицами (N = 6 и N = 3 для получателей и доноров, соответственно) в настоящее время, мы не выявили каких-либо крупных изменений, связанных с имплантата сайта в случае тимуса имплантатов в любом из люди либо.
Протокола, представленные здесь представляет собой подтверждение принципа для изучения прижизненной продольной томографии тимоцитов динамики по имплантации вилочковой железы ткани в переднюю камеру глаза мыши. Из-за отбора иммунокомпетентных получателей система не допускает допроса системные функции трансплантата. Будущие исследования могут опираться на этот подход путем выбора различных доноров и получателей и/или подвергая хозяева облучения и трансплантация костного мозга (БМ) согласно конструкции конкретного исследования. Например, выбор SCID (тяжелый комбинированный иммунодефицит) мышах как получатели устраняет помехи эндогенного Т-клеток, и выбор доноров трансгенных мышей (тимуса имплантата или БМ) представляя Т-клеток маркеры, маркеры DC, тимуса стромы клетки маркеры и т.д., индивидуально или в комбинации следует разрешить прямой в vivo отслеживания клеточной субпопуляций. Кроме того могут отслеживаться субпопуляции клеток в зале передней глаз мышей, как описано ранее, в естественных условиях флуоресценции cytolabeling26.
Одним из основных преимуществ модели, представленные здесь, что он позволяет для изучения прародителем и зрелые транслокации T-клетки от и к кровеносных сосудов. Таким образом должно быть соответствующим для определения, если быстро приобретенного васкуляризации тимуса после имплантированных в глаза в передней камере резюмирует эндогенного сосудистую. Пользу эта возможность следует отметить, что неоваскуляризация в зале передней мыши, как представляется, быть продиктованы трансплантата18,20 , а не получателя и, следовательно, подключения к Ирис сосудистую следует сохранить целостность домена cortico Медуллярная Джанкшен (CMJ) эндогенного тимуса.
Дополнительным преимуществом происходит из того факта, что система позволяет оценки двух независимых имплантатов (два передних глаз камеры) на фоне одинаковых отдельных (один узел). Исследований, требующих сочетания тканей могут также счесть целесообразным использовать эту систему.
Как тимус играет важную роль в иммунной и аутоиммунных несовершенным патологий, этот подход может использоваться для решения множества потенциальных вопросов. В частности система должна позволять макроскопических Помимо изображений внутри орган для прогрессирования инволюция тимуса. Он также может служить для изучения событий трансплантации терпимости и иммунной дисфункции, связанных с инфекциями. Вполне вероятно, что штраф рассечение механизмов, регулирующих созревания тимоцитов обеспечит новые ключи для разработки дополнительных терапевтических стратегий ориентации развивающихся клеток T.
Трансплантации тимуса в передней камере глаза занимает менее 45 минут, включая новорожденных тимуса изоляции и обрезки для каждого узла отдельных с имплантатами в обоих глаз. В естественных условиях изображений записи требуют 1 до 5 часов, в зависимости от наблюдаемых функций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грантов R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) и R21ES025673 (AC) и лучшие/2015/043 Грант (Consellería де Educació, cultura я киберспорта, Женералитата valenciana, Валенсия, Испания) (ЭО). Авторы благодарят команду отправлено в Universidad Católica де Валенсия Сан Висенте Мартир, Валенсия, Испания и Альберто Эрнандес в Centro de Investigación Принсипе Фелипе, Валенсия, Испания, за их помощь с видео съемки и редактирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
