Summary
Lazer fare gözün ön odasında timik implantlar mikroskobu tarama timositleri boyuna intravital gerçek zamanlı izleme göstermek için protokol hedefidir. Kornea saydamlığını ve vaskülarizasyon greft sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kaydetmek için izin verir.
Abstract
Gösterilmek yöntemin amacı, ilk kez, yeni doğan thymi in vivo boyuna gerçek zamanlı thymocytes´ dinamiği içinde bir bozukluklarına izleme için isogenic yetişkin mice ön göz odasına nakli göstermektir timus kesimi. Ekimi mikroskobu (LSM) kornea ile tarama Lazer vivo içinde noninvaziv tekrarlanan düşsel vasıl hücresel çözümleme düzeyi sağlar. Önemlisi, yaklaşım modelleri görüntüleme önceki intravital T hücre olgunlaşma için aynı hayvan sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kayıtları için olasılığı ekler. Sistem Şeffaflık aşılı çevrenin makroskopik hızlı implante dokusunun izleme izin ek avantajları ve erişilebilirlik için izin implant için ek olarak sistemik tedaviler yerelleştirilmiş. Doku hacmi olmak ana sınırlama lob kırpma için talepleri göz odasının azaltılmış uzayda sığar. Organ bütünlük timus loblar olgun T-hücre üretimi için işlevsel olması için daha önce gösterilen şekillerindeki dissekan tarafından kaplamış. Otoimmünite, immün yetmezlik ve merkezi dayanıklılık içeren tıbben timus fonksiyonu ile ilgili sorular bir ortamın sorguya çekmek için potansiyel olarak uygun bir tekniktir; mechanistically kötü tanımlanmış kalır süreçleri. Thymocyte geçiş, farklılaşma ve seçim rehberlik mekanizmaları ince diseksiyon gelişmekte olan T hücreleri hedefleme roman tedavi stratejileri için götürür.
Introduction
İntrathymic T-hücre farklılaşma ve T-hücre subpopulation seçimini temel süreçleri geliştirme ve bakım hücre-aracılı bağışıklık omurgalıların1için oluşturur. Bu işlem sıkı bir şekilde organize olaylar ataları kan dolaşımına, hücre çoğalması ve geçiş alımı, zar proteinleri ve büyük programlanmış hücre ölümü alt kümeleri için fark ifade dahil olmak üzere karmaşık bir dizi içerir seçimi. Sonuç olgun T-hücreleri yabancı antijenleri geniş bir spektrum için reaktif öz-peptidler, simge durumuna küçültülmüş yanıt görüntülerken sürümüdür periferik lenfoid organlar bireysel2,3kolonileşmesi hangi sonuna kadar. Anormal thymocyte seçim αβTCR repertuar otoimmün hastalık veya esas olarak kusurları olumlu ya da olumsuz habercisi seçimi, işlemler sırasında sırasıyla türetmek bağışıklık dengesizlik4 yol açar.
Timositleri timus genelinde yönlü geçiş T-hücre olgunlaşma tüm aşamalarında içsel ve birden çok uyaranlara kemokinler, yapışkan-dahil olmak üzere, bir dizi eşzamanlı veya sıralı olarak öngörülen ve hücre dışı matriks (ECM) de-yapışkan protein etkileşimleri3,5. Ex vivo çalışmalar ortaya koymuştur iken iki çalışma sabit dokuların tanımlanmış timik microenvironments5,6, thymocyte göçmen yardımlar için ifade kalıpları ile ilgili kritik bilgi yaygın hale timositleri organ iki histolojik olarak ayrı alanda göç davranışlarını: yavaş Stokastik hareketleri korteks ve medulla7,8,9,10 hızlı, sınırlı hareketliliği , 11 , 12 , 13. artan göç oranları timik pozitif seçim13 ile ilişkilendirmek ve negatif seçim timus yolculuk kinetik uygun belirler hipotezi destekleyen gezinme davranışını ile ilişkili timositleri olgunlaşma. Kendi alaka rağmen thymocyte-stromal hücre etkileşimleri topoloji ve thymocyte hareketliliği arasında organ microenvironments T hücre olgunlaşma sırasında dinamikleri kötü tanımlanmış kalır.
Bugüne kadar gerçekleştirilen en ex vivo çalışmalar fetal eklemek veya timik organ kültürler14,15, dokusu dilimlerin veya nerede thymocyte hareketleri iki fotonlu lazer tarama tarafından görüntülenmiştir sağlam timik lob explants reaggregate mikroskobu (TPLSM)8, intravital bir görüntüleme tekniği mesafe çalışma ve doku uygun olarak 1 mm derinliği görüntüleme sınırlandırılmış maksimum16inceledi. Genişletilmiş kuluçka kez form 3D-yapılarına bağlıdır zahmetli timik organ kültürler aksine, timik dilim tekniği hem de belirli alt kümelerine sağlam timik lob yaklaşım kontrol izni getirilmesi önceden etiketli timositleri yerel doku Mimarlık ortamı içine. Ancak, kan akışı olduğundan yok bu modellerinde, onlar ataları (TSPs) timus parankimi veya olgun T-hücrelerinin timik egression dinamikleri yerleşme timus işe alım sürecinin eğitimi için açıkça sınırlıdır.
Vivo modelleri timik T-hücre olgunlaşma Fizyoloji farelerde incelenmesi için Greftler parçaları veya ya böbrek kapsül17 veya intradermally18içine yerleştirilen tüm organ loblar içerir. Bu seçenekler dokusunun sistemik fonksiyonel engraftment sorguya çekmek için onların yardımcı olsa da, timik Greftler derin içinde hayvan veya opak doku katmanları tarafından kapalı konumunu kullanımları vivo içinde implantlar tarafından incelenmesi için kısıtlar TPLSM.
Gözün ön odası kornea katman saydamlığını sayesinde aşılı herhangi bir doku doğrudan izlenmesi için kolayca erişilebilir bir alan sağlar. Avantajı, Iris tarafından kurulan odası Bankası kan damarları ve otonomik sinir uçları, olanaklı kılmak hızlı revaskülarizasyon ve greft19,20reinnervation zengindir. Dr Caicedo başarıyla anatomik bu alanı bakım ve son21pankreas adacıkları boyuna incelenmesi için kullandı. İşte, bu strateji sadece yerel organ yapısı içinde timositleri dynamics eğitim için geçerli bir yaklaşımı kabul ettiğiniz anlamına gelir, ama aynı zamanda benzersiz olarak vivo içinde yaratıcı işe alım çalışmanın boyuna kayıtları genişletmek için izin verir göstermektedir ve Olgun T-hücre egression adımda fare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Miami Üniversitesi IACUC esaslarına göre tüm deneylerin onayladı.
1. yalıtım ve yeni doğan Thymi Düzeltme
- Tüm reaktifler ve araçlar tarafından ısıyla ya da diğer yöntemlerle Steril koşullar sağlanması, hazır olun.
- Contaminations en aza indirmek için laminar akış başlık altında tüm cerrahi işlemler gerçekleştirmek.
- Donör fareler ötenazi önce steril prechilled 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, pH 7,4) x 60 mm Steril çanak doldurmak ve buz üzerinde yerleştirin. Durulama ve donör fareler nakli önce gelen eksize thymi saklamak için kullanılır.
- Etik kurallara uygun olarak işten çıkarma tarafından yeni doğan donör fareler ötenazi için devam edin.
- Steril emici kağıt havlu dorsal dik pozisyonda ve sprey üzerine fareyi getirin ve daha sonra silin, fare karın % 70 etanol ile.
- Göğüs boşluğuna alt karın düzeyinde bir yüzeysel V şeklinde kesi yaparak ortaya çıkarmak ve bir çift düz 10 cm bir açılış yaklaşık 0,5-1 bırakmak ventral bir orta hat takip makas diseksiyon ile deriyi kesme cm göğüs düzeyinde. Cilt göğüs boşluğuna ortaya çıkarmak için göğüs her iki tarafında katlayın.
- Yapmak iki derin 0,5-1 cm yanal insizyon diyafram ve göğüs kafesi makas ön göğüs boşluğuna üstün mediasten erişmek için aynı tip. Timus iki soluk loblar kalp üzerinde doğru olarak görüntülenmesi gerekir.
- Dikey olarak tam organ ayıklamak için bir yer eğri forseps timus ve çekme altında bir dizi. Göğüs kafesi foldback forseps bir çift ile önlemek. Gerekirse, iyi forseps organ organ çıkarma önce belgili tanımlık kapsül bozmadan çevreleyen bağ dokusu altını dikkatle kullanın.
Not: Bir diseksiyon kapsamı kullanarak bu adım kolaylaştırılmıştır. - İzole timus timik loblar ayırmak için daha önce bir 60 mm Steril tabak içine görüntülenen ve bağ berzah bir neşter ile kesme soğuk steril 1 x PBS (pH 7,4) daldırın. Herhangi bir enkaz yemek kapsül zarar vermeden kaldırmak. Thymi maruz süresini en aza indirmek için kekik loblar implant önce kırpın.
Not: İzole her yeni doğan timus genellikle altı yaklaşık 1 mm en fazla üç ana bilgisayar fare için geniş kesimlerinin implantlar gözlerinden alırken hale getirecek. - 1.4-1.9 her donör fare için yineleyin. Thymi maruz süresini en aza indirmek için bir defada bir timus yalıtmak.
2. timus implantasyon gözün ön odasına
- Önce nakli, etiket ve her alıcı fare tartmak.
- Bir doz isofluorane buharlar alıcı fare anestezi % 1-2 arasında kullanın. Cerrahi işlem başlamadan önce refleks aşağıdaki ayak çimdik yokluğunda tarafından uygun anesthetization olun.
- Timus kesimleri nakli ile aşağıdakileri yapın:
- Bu bir göz yukarı bakacak şekilde fare yan yatay yatay konumda doğrudan diseksiyon kapsam lens maruz yerleştirin.
- Bir soğuk 1 x PBS (pH 7,4) yalan izole timik lob tüketim-60 mm çanak implant için en fazla 1 mm genişlik parçalar halinde dolu. Her kesimi timik korteks ve medulla içerir emin olmak için bir zikzak yol izler. Şekil 1A' sağlanan yönergelere göre düzeltme için kenasen makas kullanın.
Not: Kırpma timus doku engraftment optimize etmek için önce Şu implant yapılması gerekir. - Cerrahi alan karşılık gelen kornea Bankası başlayarak, böylece diseksiyon makası ipucu tanıttı dış kornea katmanları içine küçük bir kesi yapmak için 40 mm G18 iğne ucu tanıtmak.
- Kenasen makas kornea açılış tutarken sıkıca yeniden mühürlemeden önlemek için kullanırken kornea doğrudan tabanı etrafında kesi kanattan bir 5-10 mm olun. Forseps ile düz biter doku hasarı önlemek için kullanın.
- Kesme kornea epitel kavramak ve açılış delikten timik bir kesimi iterek sırasında kornea bir çift düz uçlu forseps ile tutarak bulaşmasına neden. Steril 1 x PBS (pH 7,4) veya Suni gözyaşları gözle manipülasyon tamamlanana kadar doku kuruma önlemek için gerektiği gibi ıslak.
- Usulca göz yüzeyinde yanal bir konuma eye´s işlevi korumak için öğrenci ile ilgili olarak tanıtılan doku segment slayt için tuşuna basın. Greft göz ters bir yerde arka görüntüleme ile lamamas tarafından etkilenmemesi için açılış yatıyor emin olun.
- Düz forseps yardımıyla, basın sıkıca, için hakkında 3-5 s, kornea açılış kendinden contalı tanıtmak için birbirlerine karşı iki yüzü. Ameliyat herhangi bir zımbalama veya dikiş gerektirmez.
- Nakilden her iki gözünü gerçekleştirilmesi durumunda fare doğrudan ikinci göz diseksiyon mikroskop objektif ortaya çıkarmak ve adımları 2.3.2-2.3.7 tekrar ters yan yan tarafa dönün.
- Ameliyat tamamlandıktan sonra fare ile a ısı lamba prewarmed boş bir kafes dönün.
- Transplante her fare tam taşınabilirlik ve bilinç diğer hayvanlar ile paylaşılan bir kafes içine yerleştirmeden önce kavuşur olduğunu emin olun. Bu genellikle ameliyattan sonra 1 saat içinde yer alır.
- Organ nakli, üzerine gerektiği gibi ağrı kesici ile fareler tedavi ve asetaminofen 1.6 mg/mL içme suyundaki bir konsantrasyon, fareler sağlayın.
- 2.2-2,9 her alıcı fare için yineleyin.
- Ameliyat sonrası hayvan etkinliğini izleme yanı sıra olası sağlık komplikasyonlar algılamak için implante gözleri görünümünü.
3. 3D tek foton floresan Confocal mikroskobu kullanılarak Thymi implante confocal görüntüleme
- Bir doz isofluorane buharı % 1-2 arasında kullanarak alıcı fare anestezi. Görüntüleme yordamına başlamadan önce refleks aşağıdaki ayak çimdik yokluğunda tarafından uygun anesthetization emin olmak
- Bir gözünü karşı karşıya olduğu bu yüzden bir yan yan yatay konumda sabit sahne mikroskop platformda fareyi getirin. Bir ısı yastık kayıtları sırasında fareler sürekli vücut sıcaklığını sağlamak için mikroskop platformda yer alıyor.
Not: Ayrıntılı bilgi için bkz. ek Şekil 1 . - Fare Başkanı stereotaksik headholder yerleştirin ve mikroskop amacın timus greft holding göz için doğrudan erişim sağlayan bir yan yan pozisyon fare kafasına tutmaya topuzu ayarlayın.
- Fare burun yordam anestezi hayvan tutmak için bir gaz maskesi içine koyun. Bu gerektiği gibi isofluorane buharlar ayarlanmasını sağlar.
- Göz kapaklarının retraksiyon kaçınırken göz istikrar kayıtları sırasında kolaylaştırmak için geri çekmek için bağlı olan bir çift polietilenler tüp tarafından kapalı onların ipuçları var cımbız ile kornea kenar boşluğunda göz tutarken göz kapakları bir UST-2 katı evrensel ortak. Bu düzenleme kafa ve göz sabit bir fiksasyon izin verir ve yukarıda açıklanan22olarak kan akımı gözde, kesinti olmadan esneklik sağlar.
Not: Ek Şekil 1B, C tam derleme göster. - Mikroskop objektif fare göz kulak yerleştirmeden önce kornea ve objektif arasında daldırma sıvı olarak steril serum fizyolojik veya Suni gözyaşları birkaç damla ekleyin.
Not: ek damla mikroskop yolu tutmak ve göz kurutma önlemek için bu yordamı boyunca gereği reçete. - İlk düşük büyütme (5 X) lens timus içinde mikroskop alanı bulmak için kullanabilirsiniz. O zaman daha yüksek çözünürlük (10, 20 ve 40 X) su daldırma objektif kadar çalışma mesafesi ile daldırma geçin. LSM duyarlilik ve en az lazer güç uygulayarak timik implantın ağartma önlemek ve scanning zaman mümkün olduğu kadar azaltmak. Bu mikroskop rezonans tarayıcı kullanılarak elde edilir.
Not: kullandığımız confocal mikroskop rezonans tarama ayna görüntü 25 kare/s hızında toplayabilir bulunuyor. Diğer markalar kendi mikroskoplar rezonans tarayıcılar ile var. - Belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak satın alma modunu seçin ve rezonans tarayıcı modunda başlatın. O zaman XYZT görüntüleme modunu seçin ve aşağıdaki gibi satın alma ayarlarını yapılandırın:
- Argon lazer açmak ve floresan uyarma için % 30 iktidara ayarlayın.
- Bir uyarma lazer çizgi seçin ve farklı emisyon dalga boylarında acousto optik ışın splitter (AOBS) denetimi ayarlayın. Buna ek olarak, backscatter algılamak ve doku yapısı betimlemek için yansıma algılama aynı anda kullanabilir.
Not: renkleri uyarma (GFP ve RFP) için seçilmesi üzerine, AOBS otomatik olarak bu uyarma satırları örnek üzerine yönlendirmek ve aralarında emisyon iletmek için programlanmıştır. Örneğin, GFP ve RFP için dar yansıma bantları için uyarma ışık civarında 488 kullandığımız nm ve 561 nm, anılan sıraya göre. Bu geniş bant verilmiş floresans fotonlar, böylece lazer güç ve satın alma zaman ihtiyacını azaltarak toplanması için bırakır. Yansıma modunda AOBS bir 50/50 ışın ayırıcı herhangi bir dalga boyu olanlar floresans emisyon algılama için kullanılan uzak yansıyan ışık görüntü için kullanılır. - Seçili dalga boyu, emisyon toplamak sonra 512 × 512 piksel çözünürlüğü seçin ve gerektiği gibi kazanç düzeylerini ayarlamayla Live düğmesine basarak Imaging canlı (tipik kazanç ise yaklaşık 600 V).
- Başında ve sonunda z yığının üst kısmında timik implant odaklanarak tanımlamak ve başlamakseçin, ardından son implante timus içinde odaklanmış ve Endselect uçak gider. 5 mikron z-adım boyutunu kullanın. Yazılım otomatik olarak confocal uçak sayısını hesaplar.
- Her z-yığın (genellikle 1.5 2 saniye) edinimi için zaman aralığı seçin ve sürekli görüntüleme durdurulana kadar elde seçeneğini belirleyin.
- Başlatmak için Başlat düğmesine basın.
- Greftler tekrar tekrar aynı hayvandan farklı zamanlarda 3.1-3,9 adımları tekrar ederek görüntü.
Not: hayvan her iki gözünü Greftler tutuyorsa, her iki göz kayıtları adımları 3.2-3,9 fare kafası dik pozisyonda tarafına geçtikten sonra tekrar ederek alınabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yeni doğan farelere timus B6 izole edildi. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas bu Protokolü (adım 1.1-1.9) açıklandığı gibi fareler. Bu transgenik farelerde tavuk beta aktin organizatörü kırmızı floresan protein değişken DsRed ifade yönlendirir. MST implantlar izlenmesini kolaylaştırmak sitomegalovirüs (CMV) hemen erken artırıcı etkisi altında.
Doku reddi, isogenic bireylerin genotip ile önlemek için: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J ev sahibi olarak seçilmiştir. Bu transgenik farelerde tüm dokularda bırakmak alıcı ve verici doku arasında açık bir ayırt etme için geliştirilmiş yeşil flüoresan protein (GFP) ifade insan Ubikuitin C organizatörü yönlendirir. İnsan Ubikuitin C düzenleyici eylem belirli hematopoietik hücre tipleri farklı GFP ifade desenleri yol açar. Özellikle, T hücreleri logosuna 2 kat daha yüksek GFP ifade düzeyleri CD19 daha mevcut+B220+ B hücreleri veya kendi kimlik gibi nicel hassas teknikleri tarafından kolaylaştırabilir diğer periferik kan hücreleri akış sitometresi, herhangi olmadan ihtiyaçlarını ek etiketleme için. Ayrıca, bu farelerde floresan ifade yetişkin hayvanların yanı sıra tüm embriyonik aşamaları görülmektedir ve marker istikrar sağlayan bir hücre türü silsilesi içinde üniforma.
Böbrek capsula23' implante fonksiyonel timus parçaları önceki açıklamaları timus düzeltme Şekil 1A ' gösterildiği için uyar. Bu kesme yordamı organ (korteks, medulla ve kortiko-medüller Kavşağı (CMJ) kan damarları) işlevsel histolojik temel birimler koruyarak implante olması doku hacmi bir azalma sağlar. Sığdırmak kullanılabilir alanı farenin ön odasında implantları sıra önemli boyutu arasındaki farkı yeni doğan timus (Şekil 1A, sol) ve timus bir - hafta eski fare (Şekil 1A, sağ) üzerinden kırpma için dikkate alınması gereken göz sınırlıdır. Burada sunulan sonuçlar sadece yenidoğan elde edilen implantlar içerir. Şekil 1B hayvan vizyon korumak için ağırladı GFP fare göz ön odasında implante timik kesimini makroskopik bir görüntüsünü gösterir. Kornea (GFP doku RFP implant için bitişik) referans implantın histolojik Ayrıntılar ek Video1 confocal görüntüleri 3D yeniden inşası görülebilmektedir. Engraftment gözü için Video 1 ve Şekil 2' gösterilir.
Şekil 1 c ve 1 D sırasıyla parlak alan göstermek ve doku büyüme ve gözlenmemistir devamı çalışmalarda bir çift-makroskopik için hizmet edebilir aynı alanda floresan görüntülerini takip. Şekil 1 c da benzersiz olarak timus Fizyoloji organ kan akımı saat boyunca bağımlı çalışmak için izin vermelidir implante dokusunun vaskülarizasyon göstermektedir.
Eklenen timik parçaları vaskülarizasyon 72 h sonrası implant içinde oluştu. Hızlı vaskülarizasyon iyi sözleşmede kan damarları, iris ve sitokin üretiminde timus zenginliği bulunan büyük miktarda işlemidir. Bu özelliklere eklenen thymi hızlı engraftment etkinleştirin. İmplantlar vaskülarizasyon timik kan damarları engraftment ana iris´ ile bireysel gösterilen Video 2' de, (RFP implant için bitişik GFP doku), burada anlatılan modeli aslında, için verir onaylayan bu nedenle, gösterilmiştir mikroskobik düzeyde bozukluklarına timus noninvaziv sürekli monitörizasyonu. Endojen timus veya daha önce farklı anatomik yerlerde implante timus görselleştirmek için LSM kullanımı doku opaklık ve doku kalınlığı 1 mm tarafından sınırlandırılmıştır. Gözün ön odası mikroskobik düzeyde implante dokuların gözlem kolaylaştırmak organizmaya bir "pencere" olarak kabul edilir.
Burada, bizim grubu tarafından geliştirilen model kan sel (Video 2) hücrelerden hicret içine yerleştirilmiş timus (muhtemelen ataları); görselleştirme sağlar gösterilir GFP progenitör hücre gelen kişiler epitel ve stromal timik ikamet ile izleme içine timik implant için sırasında farklılaşma ve seçim işlemleri (videoları 3 ve 4) ve aynı zamanda, çıkış için (RFP etiketli) hücreleri hücreleri (muhtemelen olgun T-hücreleri) kan damarları (Video 5) içine.
Biz böylece tarif yaklaşım "prensibi kanıtı" temsil eder, 72 h ile bir ay arasında altı bireylerin üç bağımsız yeni doğan bağışçılardan parçalarla nakli sonrası implant alınan kayıtları bağlı olarak, bir hayvan için bu model thymocyte olgunlaşma bozukluklarına timik parçadaki vivo içinde gerçek zamanlı izleme boyunca zaman, noninvaziv yordamlar tarafından izin verir ve bu nedenle, iletişim kuralı daha da iyileştirme ihtiyacı olabilir. Bu model daha fazla etiketli thymocyte moleküler işaretleyiciler, örneğin, yataklık transjenik hayvanlar böylece doğrudan görsel T-hücre olgunlaşma ara ürün olarak erişimine izin verme olarak flüoresan füzyon ürünleri kullanımı yapma çalıştı. Sistem tartışmalar çözme yardım ve incognitas thymocyte farklılaşma ve seçim olayları aralarında bağlantılı yanıt.
Şekil 1. Fareler göz ön odasına donör yenidoğan timik loblar ve nakli parça. (A)yeni doğan (solda) ve bir hafta Doğum sonrası (sağda) thymi görüntüleri. Yeni doğan timus satırlarında çizgi fare bir donörden nakli en fazla sayısını tahmin etmek için ön göz odasına nakli için bölümler hazırlamak için kılavuzları temsil eder. (B) temsilcisi görüntü yeni gösterilen timus implante. (C) temsilcisi görüntüsünü aşılı, timus 2 hafta sonrası implant skarların. (D) (C) gösterilen timus greft floresan görüntü. Ölçek çubuğu (1 mm) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Confocal görüntü iris (yeşil) timus kesimi (kırmızı) engraftment detay gösterilen. Görüntü elde aşağıdaki ayarları kullanarak bir mikroskopla: 488 ve 561 nm uyarma/500 ve 575 nm Emisyon dalga boylarında, 512 x 512 piksel çözünürlük ve amacı uzun çalışma mesafesi ile daldırma X 40. Ölçek çubuğu (40 µm) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek resim 1. Kurulum için 3D tek foton floresans kullanarak timik greft confocal düşsel lazer confocal mikroskobu. (A)Heatpad, stereotaksik headholder ve gaz maskesi ayrıntıları. (B) timus greft için LSM tutarak fare tuzak kurdu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Video 1. Timus içinde vivo görüntüleme fare göz ön odasında implantları. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 2. Tahminen timus ataları (TSP) (GFP) kan akışından timik parankimi (RFP) yerleşme alımı. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 3. Stokastik hareketi kortekste timositleri (erken timik ataları veya ETPs). Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 4. Timositleri (GFP) etkileşim timik stromal hücreler (RFP) ile CTEC'ler (kortikal timik epitel hücreleri) veya mTECs (medüller timik epitel hücreleri). Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 5. Gerçek zamanlı çıkış görüntü potansiyel olgun T-hücreleri. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Ek Video 1. 3D -vivo içinde görüntüleme timus fare göz ön odasında implantları. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T-hücre olgunlaşma sürecinin bireysel bağışıklık yetkinlik4 için önemi ve öncü hücre dinamikleri üzerinde timus2,3tarafından üretilen olgun T-hücreleri tahmin ediliyor etkisi nedeniyle yoğun çabaları yatırım seçimli-e doğru klasik sabit doku anlık görüntü yaklaşım geliştirmek için.
Dokusu dilimlerin ve diğer explants doku mimari monolayers veya toplama timik organ kültürler14,15daha üreyen açıkça üstün olmakla birlikte, damarlara bağlantısı yokluğunda hudut onların kullanma-eğitim için giriş veya çay kaşığı (damar endotel hücreleri bariyer arasında ataları translocation) ve çıkış (translocation olgun T-hücreleri damar endotel hücreleri bariyer arasında) organ dan adımlardan. T-hücre dinamiği diğer hücreleri ile bağlantı kurduğunda onaylanmadığına karar gibi timik stromal hücreler ve onların hareketliliği arasında microenvironments korteks ve medulla içinde dahil olmak üzere kendi farklılaşma durumu ve subpopulation süreci belirlemek seçim (pozitif ve negatif)2,3,4,5, ve bu işlemlerin çay kaşığı ve olgun T hücreli çıkış olaylara bağlı olabilir beri individual´s bağlantısı içeren bir modeli kan akışı Sistem istenen olurdu.
Timus Intradermal ve böbrek kapsül implantlar izin vermek için bu yükseltme17,18. Ancak, onlar implant vücut içinde derin konumunu veya doku greft yukarıda opak katmanları varlığı nedeniyle TPLSM tarafından görüntüleme için dayattığı kısıtlamaları ile invaziv yöntemler oluşturmaktadır. T-hücreleri bozukluklarına timus içinde izlemek için bir site birçok avantaj sağladığından daha önce "pencere"21,22 boyuna çeşitli dokular, performansını izlemek için kullanılan fare ön göz odası uyarlaması diğer nakli stratejileri karşı. Bir yanda, ameliyat dikiş yok, ana bilgisayar hayvanlar daha hızlı iyileşme için önde gelen gerektiğinden kolaydır. Yinelenen kayıtlar için aynı hayvandan izin böbrek kapsül implantları için böyle olduğundan diğer tarafta ek bir cerrahi implantlar gözlenmesi gerektirmez. Buna ek olarak, özellikle anatomik özelliklere göz kolayca implante doku üzerindeki düzenleyici girişlerinin sadece sistemik ama aynı zamanda yerel olarak modüle olanak sağlar. Daha önce açıklandığı gibi bu yaklaşım ile maddeler olabilir göz topikal uygulanan veya ön göz odanın içine enjekte. Ayrıca maddeler veya hücreleri doğrudan timus tanıtmak için kolay bir seçenek temsil eder (i.e., ataları veya olgunlaşma intermediates ex vivo etiketli ve adoptively transfer), geleneksel olarak son derece karmaşık bir prosedür olmuştur timus anatomik yeri24,25nedeniyle. Ayrıca, ön odası perfüzyon sulu mizah exchange veya dokuları yükleme tarafından difüzyon implantlar26diğer tür için daha önce gösterilen floresan göstergeler ile izin verir.
Daha sadakatle timus Fizyoloji çalışmanın sağlar yaklaşım fluorescently etiketli lenfosit işaretleri ifade transgenik medaka balık intravital görüntüleme tarafından sağlanır. Medaka geliştirme sırasında ve birçok medaka suşları hayat boyunca saydamlığını bu organizma hücre dinamiği içinde vivo21izleme için avantajlı yapar. Hareketli timositleri medaka (% 29)18 mouse´s (% 95)13, yanı sıra motilite oranları, ancak, bu iki organizmalar arasındaki farkları referans olarak gözlenen az sayıda soğuk ile en küçük omurgalılar kan öneriyor bir edinilmiş bağışıklık sistemi belirli mekanik kinetik daha yüksek omurgalı T-hücre olgunlaşma olayların açığa sınırlı olabilir.
Bir fare göz ön TMMOB timus nakli için site olarak kullanmak yer kısıtlama kısıtlamasıdır. Uzun vadeli çalışmalar bu nedenle, güvenliği tehlikeye girebilir ve; özellikle yeni doğan veya embriyonik kurcalayarak için genişletilmiş büyüme potansiyeli. Bu anlamda, biz iki ay sonrası belirgin doku genişletme sonra ilk hafta sonrası implant fare göz (veri) gösterilmez, genişleme ile sunulan yeni doğan implantlar kadar göz bütünlüğünü tehlikeye değildi rağmen implant devlet gerekir. Yine de, doku çevre (göz odası, böbrek kapsülü veya DermIS) implant implant´s büyüme etkiler ve/veya yaklaşım yeterliliği için kurulmadan önce vaskülarizasyon tanımlı olup olmadığını değerlendirmek için ilgi olması gerektiği uygulamaları.
Belgili tanımlık büyük kesme kornea üzerinde timik parçası geçit ön göz odası için zaman zaman bazı için neden izin vermek için gerekli bu düzeyde (veri gösterilmez) lamamas, büyük olasılıkla belirli ölçüde iyileşme süreci için ilişkili fibrozis ile ilgili. Dikkat lamamas oluşursa bu en az aşağı akım görüntüleme adımlara engel olacaktır emin olmak için adım 2.3.6 protokolü üzerinde talep etti. Belgili tanımlık kesme yanal düzeyinde yapılan gibi ne implant ne de lamamas önemli ölçüde hayvanlar görme performans etkiler.
Timus göz odanın içine sığacak yapmak doku düzeltme ihtiyacını organ anatomik bütünlük değiştirmeyi gerektirmez anatomik diğer sitelere göre eğer bir dezavantaj gibi görünüyor. Yine de, böbrek kapsül yaklaşım bu parçaları içeren, her ikisi de, korteks ve medulla benzer diseksiyon yönergeleri bu onlar T hücreli sulandırmak gibi tamamen işlevsel hale Şekil 1' de gösterilen elde timus göstermiştir immünyetmezligi thymeless ana18aracılı bağışıklık. Bu timus kesimleri bu tür olduğu gibi işlevsel özelliklerin lehine savunuyor. Ayrıca, protokol burada açıklanan izole timus (adım 1.9) soğukta tutulmalı vurguluyor ve sadece doku engraftment en iyi duruma getirme doğru soğuk iskemi ve doku pozlandırmayı en aza indirmek için hemen implant (adım 2.3.2) önce kesilmiş.
Sulu mizah göz ve kan plazması, yorumlama gözlemler yaparken bu anatomik konumda göz önünde tutulması gereken sorun ön odasında kompozisyonu farklılıkları yaklaşım ek bir potansiyel sınırlaması bulunan . Önceki çalışmalar ile diğer dokular, ancak, yerel göz çevre22tarafından herhangi bir bariz etkisi normal greft işlevi rapor değil. Burada sunulan modeli ile deneyim için bir kaç kişi sınırlı olmasına rağmen (N = 6 ve N = 3 alıcılar & bağışçılar için sırasıyla) Şu anda, biz site durumunda herhangi bir timik İmplantlar implant ile ilişkili herhangi bir önemli değişiklik gözlemlemek değildir bireyler ya.
Burada sunulan Protokolü timik doku fare göz ön odanın içine yerleştirerek tarafından thymocyte dynamics intravital boyuna görüntüleme çalışması için bir kanıt prensibi kabul ettiğiniz anlamına gelir. İmmün alıcılar yelpazesi nedeniyle, greft sistemik işlevi sorgulama sistemi izin vermedi. Gelecekteki çalışmalar bu yaklaşımın farklı bağış ve/veya alıcı seçerek ve/veya radyoterapi ve kemik iliği (BM) nakli göre belirli çalışma tasarımlar için hosts yığma tabi tarafından inşa edebilir. Örneğin, seçtiğiniz alıcılar olarak SCID (ağır kombine immün yetmezlik) fareler bir girişim endojen T-hücreleri, ortadan kaldırır ve transgenik fareler bağış (timik implant ve/veya BM) seçimi sunma T hücreli işaretleri, DC işaretleri, timik stromal hücre-işaretleri vb.., tek tek veya kombinasyonları hücresel altgrupları doğrudan vivo izlenmesine izin. Alternatif olarak, daha önce in vivo floresan cytolabeling26tarafından açıklandığı gibi hücreleri farelerin ön göz odasında altgrupları izlenebilir.
Burada sunulan model bir büyük avantajı bu yaratıcı ve olgun T-hücreleri translocation gelen ve kan damarları doğru çalışmak için izin vermektedir. Böylece, ön göz odasında implante sonra hızla edinsel vaskülarizasyon timus endojen damarlara beyannamedir belirlemek alakalı olmalıdır. Bu olasılığı lehine ön fare odasında neovaskülarizasyon greft18,20 yerine alıcının ve bu nedenle Iris damarlara bağlantıları tarafından dikte edildiği gibi görünüyor belirtilmelidir endojen timus kortiko-medüller Kavşağı (CMJ) etki alanı bütünlüğünü korumak.
Ek bir avantaj sistemin iki bağımsız implantları (iki ön göz chambers) değerlendirilmesi sağlar aslında aynı bireysel arka planı üzerinde (tek bir ana bilgisayar) gelir. Kombinasyonları dokuların gerektiren çalışmalar da bu sistemi kullanmak için avantajlı bulabilirsiniz.
Timus otoimmün ve bağışıklık eksik patolojileri önemli bir rol oynar gibi bu yaklaşımın potansiyel sorular sayısız gidermek için kullanılan. Özellikle, sistem içi organ görüntüleme timus gözlenmemistir ilerleme için ek olarak makroskopik izin vermelisiniz. Ayrıca ekimi tolerans olaylar ve bağışıklık bozuklukları enfeksiyonlara karşı ilgili çalışmaya hizmet verebilir. Bu thymocyte olgunlaşma yönetim mekanizmaları ince diseksiyon gelişmekte olan T hücreleri hedefleme ek tedavi stratejileri tasarımı için yeni ipuçları sağlayabilir muhtemeldir.
Timus gözün ön odasına nakli az 45 dk yenidoğan timus yalıtımı da dahil olmak üzere ve her ana bilgisayar için düzeltme, her iki gözüne implantlarda bireysel alır. Vivo görüntüleme kayıtları 1-5 h, bağlı olarak izlenen özellikleri gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser NIH hibe R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) ve R21ES025673 (AC) ve en iyi/2015/043 grant tarafından desteklenmiştir (Consellería de Educació, cultura ben esport, Generalitat valenciana, Valencia, İspanya) (EO). Yazarlar gönderilen takım Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, İspanya ve Alberto Hernandez Centro de Investigación Principe Felipe, Valencia, İspanya için video filme ve düzenleme ile onların yardım etmek, teşekkür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
