Summary
Syftet med protokollet är att Visa längsgående intravital realtidsspårning av tymocyter av laserscanning mikroskopi i thymic implantat i främre ögonkammaren på möss. Insyn i hornhinnan och vaskularisering av graften tillåter kontinuerligt inspelning progenitor cell rekrytering och mogna T-cell avstigning.
Abstract
Syftet med metoden som presenteras är att visa, för första gången, transplantation av nyfödda thymi in i främre öga kammaren av syngena vuxna möss för i vivo längsgående realtidsövervakning av thymocytes´ dynamik inom en simblåsa Thymus segment. Efter transplantation tillåter laserscanning mikroskopi (LSM) genom hornhinnan i vivo noninvasiv upprepade bildbehandling på cellulär resolution nivå. Ännu viktigare, lägger metoden till föregående intravital T-cell mognad imaging modeller möjligheten för kontinuerlig progenitor cell rekrytering och mogna T-cell avstigning inspelningar på samma djur. Ytterligare fördelar med systemet är insynen i ympade området, tillåter makroskopiska snabb övervakning av implanterade vävnad, och tillgängligheten till implantatet möjliggör lokaliserade förutom systemiska behandlingar. Den största begränsningen är volymen på vävnaden som passar i det reducera utrymmet öga avdelning som krav för LOB trimning. Orgel integritet maximeras genom att dissekera bräss lober i mönster som tidigare visat sig vara funktionell för mogna T-cell produktion. Tekniken är potentiellt lämpade att förhöra en miljö av medicinskt relevanta frågor som avser bräss funktion som omfattar autoimmunitet, immunbrist och centrala tolerans; processer som förblir slentrianmässigt dåligt definierade. Fina dissektion av mekanismer som styr thymocyte migration, differentiering och urval bör leda till nya terapeutiska strategier inriktning utveckla T-celler.
Introduction
Intrathymic T-cell differentiering och T-cell subpopulation urval utgör viktiga processer för utveckling och underhåll av cell-medierad immunitet i ryggradsdjur1. Denna process innefattar en komplicerad händelseförlopp tätt organiserade inklusive rekryteringen av stamfäder från blodomloppet, cellproliferation och migration, differentiell uttryck av membranproteiner, och massiva programmerad celldöd för undergrupper urval. Resultatet är frisättningen av mogna T-celler reagerar snabbt på ett stort spektrum av främmande antigener medan du visar minimerade Svaren till self-peptider, som slut upp kolonisera de perifera lymfoida organ av enskilda2,3. Avvikande thymocyte urval av αβTCR repertoaren leder till autoimmun sjukdom eller immuna obalans4 som främst härrör från defekter under processerna för negativ eller positiv föregångare urval, respektive.
Directional migration av tymocyter över tymus är inneboende på alla stadier av T-cell mognad och det är tänkt som en serie av simultana eller sekventiella flera stimuli, inklusive chemokiner, självhäftande, och de självhäftande extracellulär matrix (ECM) protein interaktioner3,5. Studien av fasta vävnader har återges kritisk information angående mönster av uttryck för thymocyte flyttande signaler definierade thymic mikromiljö5,6, medan ex vivo -studier har avslöjat två förhärskande flyttande beteenden av tymocyter två histologiskt distinkta områden av orgeln: slow stokastiska rörelser i cortex och snabb, trånga motilitet i medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. ökad flyttande priser korrelerar med thymic positiva urval13 och negativa urval är associerad med krypande beteende stödja hypotesen att kinetiken för resan genom bräss bestämmer rätt mognaden av tymocyter. Trots deras relevans fortfarande topologi thymocyte-stromal cell interaktioner och dynamiken i thymocyte motilitet över orgel mikromiljö under T-cell mognad oklara.
De flesta ex vivo studier hittills inkluderar fostrets eller reaggregate thymic orgel kulturer14,15, vävnad skivor eller intakt thymic LOB bladsticklingar där thymocyte rörelser visualiseras av två-photon laserskanning mikroskopi (TPLSM)8, en intravital bildteknik med högst begränsade arbetsavstånd och imaging djup av 1 mm i enlighet med vävnaden undersöks16. I motsats till den mödosamma thymic orgel-kulturer som beror på längre inkubationstider att bilda 3D-strukturer, både thymic slice tekniken och intakt thymic LOB strategi tillstånd kontrolleras införandet av särskilda grupper av pre märkt tymocyter i en miljö med infödda vävnad i arkitekturen. Men eftersom blodflödet är frånvarande i dessa modeller, de är klart begränsade för att studera rekryteringsprocessen av tymus lösa stamfäder (TSP) till tymus parenkymet eller dynamiken i thymic egression av mogna T-celler.
In vivo modeller för att studera thymic T-cell mognad fysiologi hos möss inkluderar grafterna av fragment eller hela orgel lober placeras antingen inuti njuren kapsel17 eller intradermalt18. Även om alternativen visade deras verktyg för att förhöra systemisk funktionell engraftment av vävnad, begränsar positionen för thymic ympkvistar djupt inom djuret eller omfattas av lager av ogenomskinlig vävnad deras användning i vivo undersökning av implantat av TPLSM.
Den främre kammaren i ögat ger en lättillgänglig plats för direkt övervakning av någon ympade vävnad genom insyn i hornhinnans lager. Fördel är basen av kammaren bildas av iris rik på blodkärl och autonoma nervändar, vilket möjliggör snabb revaskularisering och reinnervation av ympkvistar19,20. Dr. Caicedo har framgångsrikt använt denna anatomiska utrymme för underhåll och longitudinell studie av Langerhanska i tidigare21. Här visar vi att denna strategi inte bara utgör en giltig metod för att studera tymocyter dynamics inom infödda orgel struktur, men också unikt tillstånd för att förlänga den i vivo längsgående inspelningar till studien av stamceller rekrytering och mogna T-cell egression steg i musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Miami godkända alla experimenten enligt IACUC riktlinjer.
1. isolering och trimning av nyfödda Thymi
- Förbereda alla reagens och instrument genom autoklavering eller andra metoder, att säkerställa sterila förhållanden.
- För att minimera föroreningar, utföra alla kirurgiska ingrepp under en LAF.
- Innan euthanizing givare möss, fylla en 60 mm steril maträtt med sterila prechilled 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) och placera den på isen. Det kommer att användas för sköljning och lagra den exciderad thymi från givare möss före transplantation.
- Fortsätt till eutanasi nyfödda givare möss genom halshuggning, i enlighet med etiska riktlinjer.
- Placera musen på sterila absorberande pappershanddukar i en dorsal upprätt och spraya och senare torka, mus buken med 70% etanol.
- Exponera brösthålan genom att göra en ytlig V-formade snitt i nivå med nedre delen av buken och skära huden med ett par rak 10 cm dissekera saxen efter en ventrala mittlinjen att lämna en öppning på ca 0,5-1 cm på bröstnivå. Vik huden över varje sida av bröstet för att exponera brösthålan.
- Gör två djupare 0,5-1 cm laterala snitt genom mellangärdet och bröstkorgen med samma typ av sax för att få tillgång till den överlägsna mediastinum i främre brösthålan. Tymus ska visas som två blek loberna precis ovanför hjärtat.
- Placera en uppsättning böjda pincetten under den bräss och dra vertikalt för att extrahera komplett orgeln. Förhindra foldback av bröstkorgen med en pincett. Om det behövs, Använd fin pincett att noggrant slita isär bindväv kring orgeln utan att störa kapseln innan utvinna orgeln.
Obs: Detta steg underlättas med hjälp av en dissekera omfattning. - Dränka isolerade bräss i kallt sterilt 1 x PBS (pH 7,4) tidigare visas i en 60 mm steril skålen och skär bindväv näset med en skalpell att separera thymic loberna. Ta bort eventuellt skräp från skålen utan att skada kapseln. För att minimera den tid thymi utsätts, trimma timjan lober precis innan implantatet.
Obs: Varje isolerad nyfödda thymus kommer vanligtvis återge sex segment av ca 1 mm bred för högst tre värd möss när mottagande implantat i båda ögonen. - Upprepa steg 1,4-1,9 för varje givare mus. För att minimera den tid thymi utsätts, isolera en bräss i taget.
2. thymus implantering i den främre kammaren i ögat
- Före transplantationen, tagga och väga varje mottagare mus.
- Använda en dos mellan 1-2% av isofluorane ångor att söva mottagarens musen. Säkerställa korrekt anesthetization genom avsaknad av reflex följande tå nypa innan det kirurgiska ingreppet.
- Fortsätt med bräss segment transplantation enligt följande:
- Att placera musen i en sida laterala recumbent position så att ena ögat är uppåt direkt utsatta för linsen dissekera räckvidd.
- Punktskatt en av isolerade thymic loberna liggande i kallt 1 x PBS (pH 7,4)-fyllda 60 mm maträtt i bitar med upp till 1 mm bredd för implantat. Följ ett sicksack-mönster för att säkerställa att varje segment innehåller thymic cortex och medulla. Använd Vännäs sax för klippning enligt riktlinjerna i figur 1A.
Obs: Trimning av tymus bör göras precis innan implantatet att optimera vävnad engraftment. - Start i basen av hornhinnan motsvarande kirurgiska området, införa en 40 mm G18 nålspetsen att göra ett litet snitt i externa hornhinnan lager så att dissekera saxen spetsen kan införas.
- Göra en 5-10 mm flank snitt direkt runt basen av hornhinnan med Vännäs sax medan du håller hornhinnan öppningen ordentligt för att förhindra återförslutning. Använd tången med plana ändar för att undvika vävnadsskada.
- Förstå den skurna hornhinneepitelet och exponera öppningen genom att hålla hornhinnan med ett par flat ände pincett och trycka ett thymic segment genom öppningen. Fukta ögat med steril 1 x PBS (pH 7,4) eller konstgjorda tårar som behövs för att förhindra vävnad uttorkning tills manipulation är klar.
- Tryck mjukt på ögats yta att glida segmentet introducerade vävnad till en lateral position med avseende på eleven för att bevara eye´s funktion. Se till att transplantatet ligger på ett läge mittemot ögat öppning att förhindra bakre störning med imaging av Fördunklingen.
- Med hjälp av platt tång, tryck på ordentligt, för ca 3-5 s, de två sidorna av hornhinnans öppningen mot varandra för att främja självtätande. Operationen kräver inte någon häfta eller sy.
- Om transplantationerna utförs på båda ögonen, vänd på musen laterala motsatssidan direkt avslöja det andra ögat att dissekera Mikroskop linsen och upprepa steg 2.3.2-2.3.7.
- Efter operationen är klar, återgå musen till en tom bur föruppvärmd med en värmelampa.
- Kontrollera att varje transplanterade mus återfår full rörlighet och medvetande innan du placerar den i en bur som delas med andra djur. Detta sker oftast inom 1 h efter operationen.
- Vid transplantation, behandla möss med smärtstillande medel som behövs, och ge mössen med paracetamol vid en koncentration på 1,6 mg/mL i dricksvattnet.
- Upprepa steg 2.2-2,9 för varje mottagare mus.
- Övervaka postoperativ djurens aktivitet samt uppkomsten av de implanterade ögon att upptäcka potentiella komplikationer.
3. confocal avbildning av implanteras Thymi använder 3D Single Photon fluorescens konfokalmikroskopi
- Söva mottagarens musen använder en dos mellan 1-2% av isofluorane ångor. Säkerställa korrekt anesthetization genom avsaknad av reflex följande tå nypa innan du startar imaging proceduren
- Placera musen på en fast scen Mikroskop plattform i en sida laterala recumbent position så att ena ögat är vänd uppåt. En hetta madrassera placeras på Mikroskop plattform för att säkerställa konstant kroppstemperatur på möss under inspelningar.
Obs: Se kompletterande Figur1 för detaljer. - Infogar en stereotaxic headholder chef för musen och justera vredet för att hindra musen huvudet på laterala sidan möjlighet att direkt nå Mikroskop målet för ögat holding bräss graften.
- Placera musen nosen i en gasmask att hålla djuret bedövas genom hela förfarandet. Detta tillåter justering av isofluorane ångor som behövs.
- För att underlätta stabiliseringen av ögat under inspelningar samtidigt undvika indragning av ögonlocken, dra tillbaka ögonlocken medan du håller ögat på hornhinnan marginalen med en pincett som har sina tips som omfattas av ett polyeten rör som är kopplade till en UST-2 fast kardanknut. Detta arrangemang tillåter en stadig fixering av huvudet och ögonen och ger flexibilitet utan avbrott av blodflödet i ögat, som tidigare beskrivits22.
Observera: Kompletterande siffror 1B, C Visa komplett montering. - Tillsätt några droppar av steril koksaltlösning eller konstgjorda tårar som nedsänkning vätskan mellan hornhinnan och linsen, innan du placerar syftet mikroskopet på möss.
Obs: extra droppar är förpackat på behov under hela förfarandet att hålla mikroskopet sökvägen och förhindra ögat uttorkning. - Först använda låg förstoring (5 X) lins för att lokalisera bräss i fältet mikroskopet. Växla sedan till högre upplösning (10, 20 och 40 X)-nedsänkning i vatten doppning mål med långa arbetsavstånd. Undvika LSM photodamage och blekning av thymic implantatet genom att tillämpa minimal lasereffekt och minska skanning tid så mycket som möjligt. Detta uppnås genom att använda resonant skannern av mikroskopet.
Obs: Mikroskopet confocal vi använder är utrustad med resonant skanning speglar kan samla bilder på 25 bildrutor/s. Andra märken har sina egna Mikroskop med resonant skannrar. - Välj förvärv läge med hjälp av mikroskopet programvaran och starta resonant scanner läge. Sedan välja XYZT imaging läge och konfigurera förvärv inställningar enligt följande:
- Aktivera Argon laser och justera makt att 30% för fluorescens excitation.
- Välj en magnetisering laserlinje och ange kontrollen acousto-optisk beam splitter (AOBS) för olika utsläpp våglängder. Dessutom, för att upptäcka backscatter och avgränsa vävnadsstrukturen, använda reflektion upptäckt samtidigt.
Obs: Vid val av en uppsättning färger för magnetisering (GFP och RFP), programmeras automatiskt i AOBS att rikta dessa magnetiseringen fodrar på preparatet och överföra utsläpp mellan dem. Exempelvis för god Jordbrukarsed och RFP, använder vi smala speglar band för magnetisering ljus omkring 488 nm och 561 nm, respektive. Detta lämnar breda band för insamling av utsläppta fluorescens fotoner, vilket minskar behovet av laser power och förvärv tid. I reflektion läge används AOBS som en 50/50 stråldelare till bild reflekterade ljuset i någon våglängd från de som används för fluorescens utsläpp upptäckt. - Samla utsläpp vid valda våglängd, Välj en upplösning på 512 × 512 pixlar och starta live imaging genom att trycka på knappen Live , justering av vinst nivåerna som behövs (typisk vinst är omkring 600 V).
- Definierar början och slutet av z-stacken genom att fokusera på toppen av thymic implantatet och välj påbörja, sedan flytta till den sista planet som kan fokuseras i implanterade brässen och välj Avsluta. Använda en z-steg storlek av 5 µm. Programvaran kommer automatiskt beräkna antalet confocal flygplan.
- Välj tidsintervall för förvärvet av varje z-stack (vanligtvis 1,5 till 2 sekunder) och välj alternativet förvärva tills slutat för kontinuerlig avbildning.
- Tryck på Starta för att initiera.
- Bild grafterna upprepade gånger vid olika tidpunkter från samma djur genom att upprepa steg 3.1-3,9.
Obs: Om djuret innehar transplantat på båda ögonen, inspelningar från antingen öga kan tas genom att upprepa steg 3,2-3,9 efter byte i upprätt läge sida av mus huvudet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thymus från nyfödda möss var isolerade från B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas möss som beskrivs i detta protokoll (steg 1.1-1,9). I dessa transgena möss instruerar kyckling beta aktin arrangören uttrycket av den röda fluorescerande protein varianten DsRed. MST under inflytande av den cytomegalovirus (CMV) omedelbara tidiga förstärkare att underlätta spårning av implantat.
Att förhindra avstötning, syngena individer med genotyp: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J valdes som värdar. I dessa transgena möss riktar promotorn mänskliga ubiquitin C uttrycket av förbättrad grönt fluorescerande protein (GFP) i alla vävnader vilket möjliggör en klar differentiering mellan mottagaren och givaren vävnaden. Handlingen av promotorn mänskliga ubiquitin C leder till differential GFP uttrycksmönster i vissa typer av hematopoetiska celler. Särskilt T-celler presentera ett uttryck i GFP med 2-faldigt högre nivåer än CD19+B220+ B eller andra perifera blodkroppar som kan underlätta deras identifiering av kvantitativa känsliga tekniker såsom flödescytometri, utan någon behov för ytterligare märkning. Dessutom fluorescerande uttryck i dessa möss som observerats hos vuxna djur, liksom i alla embryonala stadier och är enhetlig inom en cell typ härstamning beviljande markör stabilitet.
Mönstret för tymus trimning visas i figur 1A följer tidigare beskrivningar av funktionella bräss fragment implanteras i njure capsula23. Proceduren trimning möjliggör en minskning av den totala volymen av vävnad att implanteras samtidigt bevara de funktionella histologiska grundläggande enheterna av orgeln (cortex och medulla cortico-medullär junction (CMJ) blodkärl). Den märkbara skillnaden i storlek mellan nyfödda tymus (figur 1A, vänster) och bräss från en - vecka gamla möss (figur 1A, höger) bör beaktas vid trimning som utrymmet som är tillgänglig för att passa implantat i främre ögonkammaren på musen ögat är begränsad. Resultaten presenteras här inkluderar de implantat som erhållits från nyfödda endast. Figur 1B visar en makroskopisk bild av ett thymic segment som implanteras i den främre ögonkammaren på en god Jordbrukarsed mus, hyst för att bevara djurs vision. Histologiska Detaljer av implantatet med hänvisning till hornhinnan (GFP vävnad intill RFP implantat) kan observeras i 3D återuppbyggnaden av confocal bilder i kompletterande Video 1. Engraftment på Iris visas i Video 1 och figur 2.
Figur 1 c och 1 D illustrerar respektive ljusa fält och fluorescens bilder av samma område som kan fungera för en dubbel-makroskopiska som uppföljning av vävnadstillväxt och involution i fortsatta studier. Figur 1 c illustrerar också vascularization av implanterade vävnad vilket unikt bör möjliggöra för att studera bräss fysiologi beroende av orgel blodtillförsel längs tid.
Vascularization infogade thymic fragment inträffade inom 72h efter implantatet. Snabb vaskularisering processen är i god överensstämmelse med den stora mängden blodkärl som finns i iris och rikedomen av bräss i cytokin produktion. Dessa egenskaper möjliggör snabb engraftment av infogade thymi. Vascularization av implantat illustreras i Video 2, visar engraftment av thymic blodkärl med iris´ värdens enskilda (GFP vävnad intill RFP implantat), därför, bekräftar att den modell som presenteras här, i själva verket möjliggör noninvasiv kontinuerlig monitorization av simblåsa tymus på mikroskopisk nivå. Användning av LSM att visualisera endogena brässen eller thymus tidigare implanteras i olika anatomiska platser begränsas av vävnad opacitet och vävnad tjocklek över 1 mm. Den främre kammaren i ögat är ansedd som ett ”fönster” till organismen att underlätta observation av implanterade vävnader på mikroskopisk nivå.
Här, visas det att den modell som utvecklats av vår grupp tillåter visualisering av transmigration av celler från blodet torrent (Video 2) till implanterade tymus (förmodligen föräldraparets); för spårning av kontakter av GFP stamceller inkommande i thymic implantatet med epitelial och stromal thymic bosatt celler (RFP-märkt) under differentiering och urval processer (videor 3 och 4) och även för avstigning celler (förmodligen mogna T-celler) i blodkärl (Video 5).
Metoden beskriver vi således representerar ”bevis på principen”, baserat på mätningar gjorda mellan 72 h och en månad efter implantat från sex personer som transplanterats med segmenten från tre oberoende nyfödda givare, för ett djur modell som tillstånd i vivo realtid spårning av thymocyte mognad i ett simblåsa thymic fragment av noninvasiv förfaranden längs tid, och som sådan, protokollet kan behöva ytterligare förbättringar. Denna modell kunde vara ytterligare arbetat ut att använda sig av transgena djur härbärgerat märkta thymocyte molekylära markörer, exempelvis som fluorescerande fusion produkter, således tillåter direkt visualisering av T-cell mognad intermediärer. Systemet kan hjälpa till att lösa kontroverser och svara incognitas kopplade till thymocyte differentiering och urval evenemang bland annat.
Figur 1. Snittning av givare nyfödda thymic lober och transplantation in i den främre ögonkammaren på möss. (A) nyfödda (vänster) och en vecka efter förlossning (höger) thymi bilder. Dash linjerna nyfödda bräss representerar guider att förbereda sektioner för transplantation in i främre öga kammaren av möss att uppskatta det maximala antalet transplantationer från en givare. (B) representativ bild visar nyligen implanterad tymus. (C) representativ bild av ympade, vaskulariserad bräss 2 veckor efter implantatet. (D) fluorescens bild av tymus transplantat visas på (C). Skalstapeln visas (1 mm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Confocal bilden visar detaljerna i tymus segment (röd) engraftment i iris (grön). Bild erhålls med Mikroskop, med följande inställningar: 488 och 561 nm excitation/500 och 575 nm utsläpp våglängder, 512 x 512 pixlar och 40 X doppning mål med långa arbetsavstånd. Skalstapeln visas (40 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Installationsprogrammet för confocal avbildning av thymic transplantat använder 3D single photon fluorescens laser konfokalmikroskopi. (A) Heatpad, stereotaxic headholder och gasmask Detaljer. (B) ställa in musens holding bräss transplantat för LSM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1. In vivo imaging av tymus implantat i främre ögonkammaren på möss. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2. Rekrytering av förmodad tymus flyttade stamfäder (TSP) från blodet (GFP) in thymic parenkymet (RFP). Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 3. Stokastiska rörelse av tymocyter (tidig thymic föräldraparets eller ETPs) i cortex. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 4. Interaktion av tymocyter (GFP) med thymic stromaceller (RFP) antingen CTEC (kortikal thymic epitelceller) eller mTECs (medullär thymic epitelceller). Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 5. Realtid avstigning avbildning av potentiella mogna T-cellerna. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Kompletterande Video 1. 3D -i vivo imaging av tymus implantat i främre ögonkammaren på möss. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av vikten av T-cell mognadsprocessen för enskilda immun kompetensen4 och förmodade effekterna av föregångare cell dynamics på mogna T-celler produceras av tymus2,3, har omfattande ansträngningar investerats att utveckla alternativ till den klassiska fasta vävnad snapshot strategin.
Även om vävnad skivor och andra bladsticklingar är klart överlägsen i reproducera vävnad arkitektur än enskiktslager eller aggregerade thymic orgel kulturer14,15, avsaknad av en anslutning till vaskulatur begränsar deras användning att studera den steg för inresa eller TSP (flyttning av föräldraparets över blodkärlens endotelceller hinder) och utresa (flyttning av mogna T-celler i blodkärlens endotelceller barriär) från orgeln. Eftersom det är en hypotes om att dynamiken i T-cell kontakterna med andra avgöra celler, inklusive thymic stromaceller och deras motilitet över mikromiljö inom cortex och medulla deras differentiering status och processen för subpopulationen urval (positiva och negativa)2,3,4,5, och eftersom dessa processer kan bero på TSP och mogna T-cell avstigning händelser, en modell som innehåller anslutningen till minimumnivå blodflödet systemet skulle vara önskvärt.
Intradermalt och njure kapsel implantat i tymus möjliggör denna uppgradering17,18. Dock utgör de invasiva metoder med införde begränsningar för avbildning av TPLSM på grund av den djupa ståndpunkten av implantat inom kroppen eller förekomsten av ogenomskinliga lager av vävnad ovanför graften. Anpassning av mus främre öga kammaren, tidigare använt som ett ”fönster”21,22 till längdriktningen övervaka prestanda för flera vävnader, eftersom en webbplats att spåra T-celler inom en simblåsa bräss ger flera fördelar jämfört med andra strategier för transplantation. Å ena sidan är operationen enklare eftersom inga suturer krävs, vilket leder till snabbare återhämtning av värddjur. På andra sidan kräver observation av implantat inte en ytterligare kirurgi när det händer för njure kapsel implantat, möjliggör upprepade inspelningar från samma djur. Dessutom Låt ögat anatomiska särdrag lätt modulera reglerande ingångar på implanterade vävnad inte bara systemiskt men också lokalt. Som tidigare beskrivits, med detta synsätt, kan ämnen appliceras på ögat lokalt eller injiceras in i främre öga kammaren. Den utgör också ett enkelt alternativ att införa ämnen eller celler direkt in i brässen (dvs., stamfäder eller mognad intermediärer märkt ex vivo och adoptively överförs), som har traditionellt varit en mycket komplicerad procedur på grund av bräss anatomiska läge24,25. Dessutom tillåter perfusionen i främre kammaren utbyte av kammarvatten eller lastning av transplantatet genom diffusion med fluorescerande indikatorer, som tidigare visat för annan typ av implantat26.
Den strategi som mer troget tillåter studier av tymus fysiologi tillhandahålls av intravital bildtagning av transgena medaka fisk att uttrycka fluorescently märkt lymfocyter markörer. Insyn i medaka under utveckling och under hela livet i många medaka stammar gör att denna organism är fördelaktiga för övervakning av cellulära dynamics i vivo21. Det låga antalet rörliga tymocyter observerats i medaka (29%)18 med hänvisning till mouse´s (95%)13, utöver skillnaderna i motilitet mellan dessa två organismer, men antyder att kallt blod minsta ryggradsdjur med en adaptiva immunsystemet kan vara begränsad på avslöjar särskilt mekanistiska kinetik av högre ryggradsdjur T-cell mognad händelser.
En begränsning av användningen av främre ögonkammaren på möss som platsen för tymus transplantation är space begränsning. Långsiktiga studier, därför missbrukats; särskilt för nyfödda eller embryonala vävnader med utvidgade tillväxtpotential. I denna mening måste vi konstatera att även om nyfödda implantat presenteras med uppenbara vävnadsexpansion efter första veckan efter implantatet i mus ögat (inga data anges), utvidgningen inte verkade sätta integriteten för ögat riskerar upp till två månader efter implantat. Det bör dock av intresse att utvärdera huruvida vävnad miljön av implantatet (ögat kammare, njure kapsel eller dermis) påverkar implant´s tillväxt och/eller vaskularisering innan lämpligheten av metoden kan upprättas för definieras applikationer.
Den stora snitt krävs på hornhinnan för att tillåta passage av thymic fragmentet till främre öga kammaren leder ibland till några Fördunklingen på denna nivå (inga data anges), sannolikt relaterade till viss grad av fibros i samband att läkningsprocessen. Uppmärksamhet krävs på steg 2.3.6 i protokollet att säkerställa som om Fördunklingen inträffar kommer minimalt störa nedströms imaging stegen. Snittet görs på laterala nivå, bör varken implantatet eller den Fördunklingen avsevärt påverka djur syn prestanda.
Behovet av vävnad trimning att göra bräss passar in i ögat kammaren verkar vara en nackdel om man jämför med andra anatomiska platser som inte kräver att ändra anatomiska integriteten av orgeln. Dock har metoden njure kapsel visat att fragment av tymus innehållande, båda, cortex och medulla erhålls genom liknande dissektion riktlinjer till de som visas i figur 1, bli fullt funktionella som de kan rekonstruera T-cell medierad immunitet i nedsatt immunförsvar thymeless värdar18. Detta argumenterar till förmån för intakt funktionella egenskaper av denna typ av tymus segment. Även protokollet beskrivs här betonar att isolerade bräss måste hållas i kyla (steg 1,9) och bara trimmas precis innan implantatet (steg 2.3.2) att minimera kall ischemi och vävnad exponering mot optimera vävnad engraftment.
En ytterligare potentiell begränsning av metoden är bosatt i sammansättning skillnaderna mellan kammarvattnet i främre kammaren i ögat och blodplasma, problem som måste hållas i åtanke när tolka observationer gjorda på denna anatomiska läge . Tidigare studier med andra vävnader, dock har inte rapporterat några uppenbara effekter på normala transplantatfunktion av den lokala öga miljö22. Även om erfarenheterna med den modell som presenteras här är begränsad till ett fåtal individer (N = 6 och N = 3 för mottagare & givare, respektive) närvarande, vi inte observera några större förändringar associerade för att implantatet webbplats när det gäller thymic implantat i någon av de individer antingen.
Det protokoll som presenteras här utgör en bevis-av princip för studien av intravital längsgående avbildning av thymocyte dynamics av implantera thymic vävnad till främre ögonkammaren på möss. På grund av valet av immunkompetenta mottagare tillät systemet inte förhör den systemiska funktionen av graften. Framtida studier kan bygga på detta synsätt genom att välja olika givare eller mottagare och/eller genom att utsätta värdarna att bestrålning och benmärgstransplantation (BM) enligt särskilt studiedesigner. Till exempel valet av SCID (svår kombinerad immunbrist) möss som mottagare eliminerar störningar av endogena T-celler, och valet av transgena möss givare (thymic implantatet eller BM) presentera T-cells markörer, DC markörer, thymic stromal cell-markörer, osv., enskilt eller i kombinationer bör tillåta direkt i vivo spårning av cellulära subpopulations. Alternativt, subpopulations av celler i främre öga kammare möss kunde spåras, som tidigare beskrivits, av i vivo fluorescens cytolabeling26.
En stor fördel med den modell som presenteras här är att det tillåter för att studera stamceller och mogna T-cellerna translokation från och mot blodkärl. Således bör det vara relevant att avgöra om den snabbt förvärvade vaskularisering av tymus efter att implanteras i främre öga kammaren recapitulates den endogena kärlsystemet. Till förmån för denna möjlighet, bör det nämnas att kärlnybildning i främre mus kammaren verkar dikteras av transplantat18,20 snarare än av mottagaren och därför anslutningarna till den iris vaskulatur bör bevara integriteten hos endogena bräss cortico-medullär junction (CMJ) domän.
En ytterligare fördel kommer från det faktum att systemet tillåter utvärdering av två oberoende implantat (två främre öga kammare) på identiska individuella bakgrund (en enstaka värddator). Studier som kräver kombinationer av vävnader kan också finna det fördelaktigt att använda detta system.
Eftersom tymus spelar en viktig roll i autoimmuna och immun bristfällig patologier, kunde detta tillvägagångssätt användas för att ta itu med en myriad av potentiella frågor. I synnerhet bör systemet tillåta makroskopiska förutom intra-orgel tänkbar för utvecklingen av tymus involution. Det kan också fungera att studera transplantation tolerans händelser och immundysfunktioner relaterade till infektioner. Det är troligt att fina dissektion av mekanismer som styr thymocyte mognad kommer att ge nya ledtrådar för utformningen av ytterligare terapeutiska strategier inriktning utveckla T-celler.
Transplantation av tymus att den främre kammaren i ögat tar mindre än 45 min, inklusive neonatal bräss isolering och trimning för varje värd enskilda med implantat i antingen öga. In vivo imaging inspelningar kräver 1-5 h, beroende på övervakade funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd genom NIH grants R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) och R21ES025673 (AC) och bästa/2015/043 bidraget (Consellería de Educació, cultura jag esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spanien) (EO). Författarna vill tacka skickat laget vid Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanien och Alberto Hernandez på Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanien för hjälp med video filmning och redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
