Summary
Målet med protokollen er at vise langsgående intravital real-time tracking af thymocytter ved laser scanning mikroskopi i thymic implantater i mus øjet forkammeret. Gennemsigtigheden af hornhinden og vascularization af graften giver mulighed for uafbrudt optagelse stamfader celle rekruttering og modne T-celle udgang.
Abstract
Formålet med metoden fremlægges er at vise, for første gang, transplantation af nyfødte thymi i forreste øjet kammer af isogene voksne mus i vivo langsgående real-time overvågning af thymocytes´ dynamik inden for en vaskulariserede thymus segment. Efter transplantation giver laser scanning mikroskopi (LSM) gennem hornhinden i vivo noninvasive gentagne imaging på cellulære resolution niveau. Vigtigere, føjer fremgangsmåde til tidligere intravital T-celle modning imaging modeller mulighed for kontinuerlig stamfader celle rekruttering og modne T-celle egress optagelser i samme dyr. Yderligere fordele ved systemet er gennemsigtigheden af de podede område, tillader det makroskopiske hurtig overvågning af det implanterede væv, og adgangen til implantatet giver mulighed for lokaliseret ud over systemiske behandlinger. Den største begrænsning er volumen af væv, der passer i de reduceret plads øjet kammerets, som kræver for lap trimning. Orgel integritet er maksimeret ved at dissekere thymus lapper i mønstre tidligere vist sig at være funktionelle for modne T-celle produktion. Teknikken er potentielt velegnet til at afhøre en milieu af lægeligt relevante spørgsmål relateret til thymus funktion, der omfatter autoimmunitet, immundefekt og central tolerance; processer, som fortsat er mekanisk dårligt defineret. Den fine dissektion af mekanismer vejledende thymocyte migration, differentiering og udvalg bør føre til nye terapeutiske strategier rettet mod udviklingslandene T celler.
Introduction
Intrathymic T-celle differentiering og T-celle delpopulation udvalg udgør centrale processer til udvikling og vedligeholdelse af celle-medieret immunitet i hvirveldyr1. Denne proces indebærer en kompleks sekvens af stramt organiserede begivenheder, herunder ansættelse af stamfaderen fra blodbanen, celleproliferation og migration, differentierede udtryk af membranproteiner, og massive programmeret celledød for delmængder udvalg. Resultatet er udgivelsen af modne T-celler reaktiv til en rigelig spektrum af udenlandske antigener mens der vises minimeret svar til self-peptider, som ender op koloniserer de perifere lymfoide organer af individuelle2,3. Afvigende thymocyte udvalg af αβTCR repertoire fører til autoimmun sygdom eller immun ubalance4 der hovedsageligt stammer fra defekter under processerne af negative eller positive forløber udvalg, henholdsvis.
Retningsbestemt migration af thymocytter i thymus er iboende til alle faser af T-celle modning og det er planlagt som en serie af samtidige eller sekventiel flere stimuli, herunder kemokiner, selvklæbende, og de selvklæbende ekstracellulære matrix (ECM) protein interaktioner3,5. Studiet af faste væv har gjort vigtige oplysninger vedrørende mønstre af udtrykket for thymocyte vandrende stikord i definerede thymic microenvironments5,6, mens ex vivo undersøgelser har afsløret to fremherskende vandrende opførsel af thymocytter i to histologisk særskilte områder af orglet: langsom stokastiske bevægelser i cortex og hurtig, begrænset motilitet i medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. øget vandrende satser korrelerer med thymic positive valg13 og negative valg er forbundet med kravlende adfærd støtter den hypotese, at kinetik af rejsen gennem thymus bestemmer korrekt modning af thymocytter. Trods deres relevans fortsat topologi af thymocyte-stromale celle interaktioner og dynamikken i thymocyte motilitet på tværs af orgel microenvironments under T-celle modning er uklare.
De fleste ex vivo undersøgelser udført til dato inkluderer føtal eller reaggregate thymic orgel kulturer14,15, væv skiver eller intakt thymic lobe explants hvor thymocyte bevægelser er visualiseret ved to-foton laser scanning mikroskopi (TPLSM)8, en intravital imaging teknik med begrænset maksimalt arbejde afstand og imaging dybde af 1 mm i overensstemmelse med vævet undersøges16. I modsætning til de besværlige thymic orgel kulturer, som afhænger af udvidede inkuberingstider til at danne 3D-strukturer, både thymic skive teknik og intakt thymic lap tilgang tillader kontrolleres indførelsen af særlige delmængder af forud mærket thymocytter i en native væv arkitektur miljø. Men, da blod flow er fraværende i disse modeller, de er klart begrænset til at studere rekrutteringsprocessen af thymus afregning stamfaderen (TSPs) til thymus parenkym eller dynamikken i thymic egression af modne T-celler.
In vivo modeller for studiet af thymic T-celle modning fysiologi i mus omfatter grafts fragmenter eller hele orgel lapper placeret enten inde i nyre kapsel17 eller intradermalt18. Selv om disse muligheder viste deres nytte at afhøre systemisk funktionel engraftment af væv, begrænser placeringen af thymic grafts dybt i dyret eller dækket af lag af uigennemsigtige væv deres brug i vivo undersøgelse af implantater af TPLSM.
Den forreste kammer i øjet giver en let tilgængelig plads til direkte overvågning af podede væv i kraft af gennemsigtighed af cornea lag. Fordel er bunden af salen dannet af iris rig på blodkar og autonome nerveender, muliggør hurtig revaskularisering og reinnervation grafts19,20. Dr. Caicedo har med held brugt denne anatomiske plads til vedligeholdelse og langsgående undersøgelse af pancreas Holme i de sidste21. Her, vi viser, at denne strategi udgør ikke kun en gyldig tilgang for at studere thymocytter dynamikken i native organ strukturen, men også unikt tillader for at udvide i vivo langsgående indspilninger i studiet af stamfader rekruttering og modne T-celle egression trin i musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Miami godkendt alle eksperimenter ifølge IACUC retningslinjer.
1. isolering og trimning af nyfødte Thymi
- Forberede alle reagenser og instrumenter ved autoklavering eller andre metoder, sikrer sterile forhold.
- For at minimere kontaminering, udføre alle kirurgiske procedurer under en laminar flow hætte.
- Forud for euthanizing donor mus, udfylde en 60 mm sterile parabol med steril prechilled 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4) og placere den på is. Det vil blive brugt til skylning og opbevaring af skåret thymi fra donor mus før transplantation.
- Fortsæt til euthanize nyfødte donor mus ved halshugning, i overensstemmelse med etiske retningslinjer.
- Placer musen på sterile absorberende papirhåndklæder i en dorsal oprejst stilling og spray, og senere tørre mus maven med 70% ethanol.
- Udsætte brysthulen ved at lave en overfladisk V-formet snit på niveau med underlivet og skære huden med et par lige 10 cm dissekere saks efter en ventrale midterlinjen at efterlade en åbning på omkring 0,5-1 cm på brystet-niveau. Fold huden over hver side af brystet til at udsætte brysthulen.
- Gøre to dybere 0,5-1 cm lateral snit gennem mellemgulvet og brystkassen med den samme type af saks til at få adgang til den overlegne mediastinum i den forreste brysthulen. Thymus skal vises som to bleg lapper lige over hjertet.
- Placere en række buet pincet nedenunder thymus og træk lodret hen til uddrag den fuldstændigt organ. Forhindre foldback af brystkassen, med et par pincet. Hvis det er nødvendigt, bruge bøde tang til at forsigtigt rive fra hinanden bindevæv omkring orglet uden at forstyrre kapslen før udvinding orgel.
Bemærk: Dette trin er lettes ved hjælp af en dissekere omfang. - Dykke isolerede thymus ind i kold sterile 1 x PBS (pH 7,4) tidligere vises i en 60 mm sterile skål, og skære det bindevæv Næs med en skalpel til at adskille de thymic fliger. Fjerne eventuelle rester fra skålen uden at skade kapslen. For at minimere den tid thymi udsættes, trim timian lapper lige før implantat.
Bemærk: Hver isolerede nyfødte thymus vil typisk gøre seks segmenter af omkring 1 mm bred i højst tre vært mus ved modtagelse af implantater i begge øjne. - Gentag trin 1.4-1.9 for hver donor mus. For at minimere den tid thymi udsættes, isolere én thymus ad gangen.
2. thymus Implantation i det forreste kammer i øjet
- Før transplantation, tag og vejer hver recipient mus.
- Brug en dosis mellem 1-2% af isofluorane dampe til bedøver den modtagende mus. Sikre ordentlig anesthetization ved fravær af refleks følgende tå knivspids før du starter den kirurgiske procedure.
- Fortsæt med thymus segmenter transplantation som følger:
- Placere musen i en side lateral liggende stilling, så det ene øje er opad på direkte udsat for linsen af dissekere anvendelsesområdet.
- Punktafgifter en af de isolerede thymic lapper liggende i koldt 1 x PBS (pH 7,4)-fyldt 60 mm parabol i stykker med op til 1 mm bredde til implantatet. Følg en zig-zag mønster for at sikre, at hvert segment indeholder thymic cortex og medulla. Bruge markriyor Sakse til trimning efter retningslinjer fastsat i figur 1A.
Bemærk: Trimning af thymus bør gøres lige før implantat til at optimere væv engraftment. - Starter i bunden af hornhinden svarende til det kirurgiske område, indføre spidsen af en 40 mm G18 nål til at lave et lille snit i eksterne hornhinden lag så at dissekere saks spids kan indføres.
- Gøre en 5-10 mm flanke indsnit direkte rundt i bunden af hornhinden ved hjælp markriyor saks mens du holder hornhinden åbningen fast for at undgå lukning. Bruge pincet med flade ender til at undgå vævsskader.
- Forstå klip hornhindens epitel og udsætte indledningen af holding hornhinden med et par flade-ended pincet mens skubbe en thymic segment gennem åbningen. Våd øjet med steril 1 x PBS (pH 7,4) eller kunstige tårer, som skulle forhindre væv udtørring indtil manipulation er fuldført.
- Tryk på sagte på øjet overflade til at glide indførte væv segment til en lateral position med hensyn til elev at bevare eye´s funktion. Sikre, at transplantatet ligger på en beliggenhed overfor øjet åbning at forhindre posterior interferens med billedbehandling af ydmygelse.
- Med hjælp af flad pincet, tryk fast, for omkring 3-5 s, de to sider af cornea åbningen mod hinanden for at fremme selvstændig forsegling. Kirurgi kræver ikke nogen hæftning eller syning.
- Hvis transplantationer udføres på begge øjne, vend musen den modsatte laterale side direkte udsætte det andet øje at dissekere mikroskop linsen og gentage trin 2.3.2-2.3.7.
- Efter operationen er afsluttet, skal du returnere musen til et tomt bur forvarmet med en varmelampe.
- Sørg for, at hver transplanterede mus genvinder komplet mobilitet og bevidsthed før du placerer det i et bur, deles med andre dyr. Dette tager normalt sted inden for 1 time efter operationen.
- Efter transplantation, behandling af musene med smertestillende medicin efter behov og give musene acetaminophen ved en koncentration på 1,6 mg/mL i drikkevandet.
- Gentag trin 2.2-2,9 for hver modtager mus.
- Overvåge postoperativ dyr aktivitet samt udseendet af de implanterede øjne til at opdage potentielle sundhedsmæssige komplikationer.
3. Konfokal billeddannelse af implanteret Thymi ved hjælp af 3D enkelt foton fluorescens konfokalmikroskopi
- Bedøver modtager musen ved hjælp af en dosis mellem 1-2% af isofluorane dampe. Sikre ordentlig anesthetization ved fravær af refleks følgende tå knivspids før du begynder proceduren billedbehandling
- Placer musen på et fast tidspunkt mikroskop platform i en side liggende sideleje, så det ene øje er opad. En varme-pad er placeret på mikroskop-platformen til at sikre konstant kropstemperaturen på mus under optagelser.
Bemærk: Se tillægs figur 1 for detaljer. - Indsæt hoved med musen i et stereotaxisk headholder og justere knop for at begrænse musen hovedet på en lateral side position giver direkte adgang til mikroskop mål for øjet holding thymus graft.
- Placer musen snude i en gas maske for at holde dyret bedøvede i hele proceduren. Dette giver mulighed for justering af isofluorane dampe efter behov.
- For at lette stabilisering af øjet under optagelser samtidig undgå sammentrækning af øjenlåg, trække sig tilbage øjenlåg mens du holder øje i cornea margen med et par pincet, der har deres tips er omfattet af en polyethylen rør, som er knyttet til en UST-2 solid universal joint. Dette arrangement tillader en stabil fiksering af hoved og øjne og giver fleksibilitet uden afbrydelser af blodgennemstrømningen i øjet, som tidligere beskrevet22.
Bemærk: Supplerende tal 1B, C viser samlingen komplet. - Tilføj et par dråber sterilt saltvand eller kunstige tårer som fordybelse væsken mellem hornhinden og linsen, før du placerer mikroskop mål på musen øjet.
Bemærk: ekstra dråber udleveres på behovet for under hele proceduren at holde stien mikroskop og forhindre øje udtørring. - Først bruge lav forstørrelse (5 X) linse til at lokalisere brissel i feltet mikroskop. Derefter skifte til højere opløsning (10, 20 og 40 X) vand fordybelse dypning mål med lange arbejde afstand. Undgå LSM solskader og blegning af thymic implantatet ved at anvende minimal laser power og reducere scanning tid så meget som muligt. Dette opnås ved hjælp af mikroskop resonant scanneren.
Bemærk: Konfokal mikroskop vi bruger er udstyret med resonant scanning spejle i stand til at indsamle billeder på 25 billeder/s. Andre mærker har deres egen mikroskoper med resonant scannere. - Vælg tilstanden erhvervelse ved hjælp af mikroskop software og starte tilstanden resonant scanner. Derefter vælge tilstanden XYZT billeddannelse og konfigurere erhvervelse indstillingerne på følgende måde:
- Tænd Argon laser og justere magt til 30% for fluorescens excitation.
- Vælg en excitation laser linje, og Angiv kontrolelementet akustisk-optisk beam splitter (AOBS) for forskellige emission bølgelængder. Derudover for at opdage backscatter og afgrænse væv struktur, bruge refleksion opdagelse samtidigt.
Bemærk: Ved at vælge et sæt af farver for excitation (normal god landbrugspraksis og RFP), AOBS er automatisk programmeret til at dirigere disse excitation linjer på modellen og overføre emission mellem dem. For eksempel, for normal god landbrugspraksis og RFP, vi bruger smalle refleksion bands for excitation lys omkring 488 nm og 561 nm, henholdsvis. Dette efterlader bred bands til indsamling af udsendte fluorescens fotoner, hvilket reducerer behovet for laser power og erhvervelse tid. I refleksion tilstand bruges AOBS som en 50/50 stråledeler for at billede reflekterede lys i enhver bølgelængde fra dem, der bruges til registrering af fluorescens emission. - Indsamle emission på udvalgte bølgelængde, så vælg en opløsning af 512 × 512 pixel og starte live imaging ved at trykke på knappen Live , justere gevinst niveauer efter behov (typisk gevinst er omkring 600 V).
- Definere begyndelsen og slutningen af z-stakken ved at fokusere på toppen af thymic implantatet og vælge begynder, derefter flytte til den sidste fly, der kan være fokuseret på den indopererede thymus og vælge afslutningen. Bruge en z-trin størrelse på 5 µm. Softwaren vil automatisk beregne antallet af Konfokal fly.
- Vælg tidsintervallet for erhvervelse af hvert z-stak (typisk 1,5 til 2 sekunder) og vælg indstillingen erhverve indtil stoppet for kontinuerlig imaging.
- Tryk på knappen Start for at initialisere.
- Image graftene gentagne gange på forskellige tidspunkter fra de samme dyr ved at gentage trin 3.1-3.9.
Bemærk: Hvis dyret holder podninger på begge øjne, optagelser fra enten øjet kan tages ved at gentage trin 3.2-3,9 efter skift i oprejst position side af musen hovedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thymus fra nyfødte mus blev isoleret fra B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas mus som beskrevet i denne protokol (trin 1.1-1.9). I disse Transgene mus dirigerer kylling beta actin promotor udtryk for rødt fluorescerende proteiner variant DsRed. MST under indflydelse af de cytomegalovirus (CMV) øjeblikkelig tidlige enhancer lette sporingen af implantater.
At forhindre væv afvisning, isogene individer med genotype: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/Jørgensen blev valgt som værter. I disse Transgene mus dirigerer menneskelige ubiquitin C promotor udtryk for forbedrede grøn fluorescerende proteiner (NGL) i alle væv giver mulighed for en klar skelnen mellem modtager og donor væv. Handlingen af menneskelige ubiquitin C promotor fører til differentieret normal god landbrugspraksis udtryk mønstre i visse hæmatopoietisk celletyper. Især T celler præsentere en 2-fold højere normal god landbrugspraksis udtryk niveauer end CD19+B220+ B celler eller andre perifere blodceller, som kan lette deres identifikation af kvantitative følsomme teknikker såsom flow flowcytometri, uden nogen behov for yderligere mærkning. Derudover fluorescerende udtryk i disse mus er observeret hos voksne dyr, samt i alle vorden og er ensartet inden for en celle type lineage ydelse markør stabilitet.
Mønster til thymus trimning vist i figur 1A følger tidligere beskrivelser af funktionelle thymus fragmenter implanteret i nyre capsula23. Denne afpudsning procedure giver mulighed for en reduktion af den samlede mængde af væv til at blive implanteret samtidig bevare de funktionelle histologiske grundlæggende enheder af orglet (cortex, medulla og cortico-medullær junction (CMJ) blodkar). Den bemærkelsesværdige forskel i størrelse mellem nyfødte thymus (figur 1A, venstre) og thymus fra én - uge gamle mus (figur 1A, højre) bør tages hensyn til trimning, som den plads til at passe implantater i forkammeret af musen øjet er begrænset. Resultaterne præsenteres her omfatter implantater fra nyfødte kun. Figur 1B viser et makroskopiske billede af en thymic segment implanteret i forkammeret af en normal god landbrugspraksis mus øje, indkvarteret for at bevare animalske vision. Histologiske detaljer af implantatet med henvisning til hornhinden (normal god landbrugspraksis væv ved siden af RFP implantat) kan iagttages i den 3D rekonstruktion af Konfokal billeder i supplerende Video 1. Engraftment på iris er vist i Video 1 og figur 2.
Figur 1 c og 1 D illustrere henholdsvis lysfelt og fluorescens billeder af det samme område, som kan tjene til en dobbelt-makroskopisk følge op af væv vækst og involution i fortsættelse undersøgelser. Figur 1 c viser også vascularization af den implanterede væv, som bør entydigt giver mulighed for at studere thymus fysiologi afhængig af orgel blodforsyning langs tid.
Vascularization af de indsatte thymic fragmenter opstod inden for 72h efter implantat. Den hurtige vascularization proces er i god aftale med den store mængde af blodkar findes i iris og rigdommen af thymus i cytokin produktion. Disse karakteristika aktiverer hurtig engraftment af indsatte thymi. Vascularization af implantater er illustreret i Video 2, viser engraftment af thymic blodkar med iris´ af værten individuelle (normal god landbrugspraksis væv ved siden af RFP implantat), derfor, bekræfter, at den model præsenteres her, faktisk giver mulighed for noninvasiv kontinuerlig monitorization af vaskulariserede thymus på det mikroskopiske niveau. Anvendelsen af LSM at visualisere endogene thymus eller thymus tidligere implanteret i forskellige anatomiske steder er begrænset af væv opacitet og væv tykkelse af mere end 1 mm. Den forreste kammer i øjet er betragtes som et "vindue" for at lette observation af implanterede væv på det mikroskopiske niveau.
Her, er det vist, at modellen udviklet af vores gruppe giver mulighed for visualisering af transmigration af celler fra blod torrent (Video 2) i de implanterede thymus (formentlig stamfaderen); til sporing af kontakter af normal god landbrugspraksis stamceller indgående ind i thymic implantatet med epitel og stromale thymic resident celler (RFP-mærket) under differentiering og udvalg processer (videoer 3 og 4) og også for udgang af celler (formentlig modne T-celler) i blodkar (Video 5).
Den tilgang, vi beskriver således repræsenterer "bevis for princippet", baseret på optagelser taget mellem 72 h og en måned efter implantat fra seks personer transplanteret med segmenter fra tre uafhængige nyfødte donorer, for en dyr model tillader i vivo realtid sporing af thymocyte modning i et vaskulariserede thymic fragment af noninvasive procedurer langs tid, og som sådan protokollen muligvis yderligere justeringer. Denne model kunne blive yderligere bearbejdet ud at gøre brug af transgene dyr husly mærket thymocyte molekylære markører, for eksempel, så fluorescerende fusion produkter, hvilket gør det muligt direkte visualisering af T-celle modning mellemprodukter. Systemet kan hjælpe med at løse kontroverserne og reagere incognitas knyttet til thymocyte differentiering og udvalg begivenheder blandt andre.
Figur 1. Skæring af donor nyfødte thymic lapper og transplantation i forkammeret af mus øje. (A) nyfødte (venstre) og en uge efter fødslen (højre) thymi billeder. Dash linjer på nyfødte thymus repræsenterer guider til at forberede sektioner til transplantation ind i anterior øje salen af mus til at vurdere den maksimale antal transplantationer fra en donor. (B) repræsentative billede viser nyligt implanteret thymus. (C) repræsentativt billede af podede, vaskulariserede thymus 2 uger efter implantat. (D) Fluorescens billede af thymus graft vist på (C). Skalalinjen er vist (1 mm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Konfokal billede viser detaljerne i thymus segment (rød) engraftment i iris (grøn). Billede opnås med et mikroskop, ved hjælp af følgende indstillinger: 488 og 561 nm excitation/500 og 575 nm emission bølgelængder, 512 x 512 pixel opløsning og 40 X dypning mål med lange arbejde afstand. Skalalinjen er vist (40 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 1. Installationsprogrammet til Konfokal billeddannelse af thymic graft ved hjælp af 3D enkelt foton fluorescens laser konfokalmikroskopi. (A) Heatpad, stereotaxisk headholder og gasmaske detaljer. (B) sæt musen holder thymus graft for LSM. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1. In vivo billeddannelse af thymus implantater i mus øjet forkammeret. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 2. Rekruttering af formodede thymus afregning stamfaderen (TSP) fra blodet (NGL) i det thymic parenkym (RFP). Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 3. Stokastiske bevægelse af thymocytter (tidlig thymic ophav eller ETP) i cortex. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 4. Samspillet mellem thymocytter (normal god landbrugspraksis) og thymic stromale celler (RFP) enten CTEC (kortikale thymic epitelceller) eller mTECs (medullær thymic epitelceller). Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 5. Realtid egress billeddannelse af potentielle modne T-celler. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Supplerende Video 1. 3D -i vivo billeddannelse af thymus implantater i mus øjet forkammeret. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af betydningen af T-celle modning processen for individuel immun kompetencevurdering4 og den formodede virkning af forløber celle dynamics på modne T-celler produceret af thymus2,3, er omfattende indsats blevet investeret at udvikle alternativer til den klassiske faste væv snapshot tilgang.
Selvom væv skiver og andre explants er klart overlegen i at gengive væv arkitektur end encellelag eller samlede thymic orgel kulturer14,15, fraværet af en forbindelse til Vaskulaturen begrænser deres brug til at studere den trin til indrejse eller TSP (translokation af stamfaderen over blodkar endotelceller barrieren) og exit (translokation af modne T-celler på tværs af blodkar endotelceller barriere) fra orglet. Da det er en hypotese at dynamics af T-celle kontakter med andre celler, herunder thymic stromale celler, og deres motilitet på tværs af microenvironments i cortex og medulla bestemme deres differentiering status og processen med delpopulation udvalg (positive og negative)2,3,4,5, og da disse processer kan afhænge af TSP og modne T-celle egress begivenheder, en model, der omfatter forbindelsen til individual´s blodgennemstrømningen systemet ville være ønskeligt.
Intradermal og nyre kapsel implantater af thymus tillade for denne opgradering17,18. Dog udgør de invasive metoder med pålagte begrænsninger til billeddannelse af TPLSM på grund af den dybe position af implantat i kroppen eller tilstedeværelsen af uigennemsigtige lag af væv over graften. Tilpasning af musen forreste øjet kammer, tidligere blev anvendt som et "vindue"21,22 til langs Dataskærm arbejdsindsats i flere væv, som et websted til at spore T-celler i en vaskulariserede thymus giver flere fordele versus andre transplantation strategier. På den ene side er kirurgi enklere, fordi ingen suturer er påkrævet, fører til hurtigere helbredelse af vært dyr. Observation af implantater kræver på anden siden, ikke en yderligere kirurgi, som det sker for nyre kapsel implantater, giver mulighed for gentagen optagelser fra de samme dyr. Desuden de særlige anatomiske forhold ved øjet gør det muligt at nemt modulere regulerende input på det transplanterede væv ikke kun systemisk men også lokalt. Som tidligere beskrevet, med denne tilgang, kan stoffer appliceres på øjet eller injiceres i den forreste øje kammer. Det udgør også en nem mulighed for at indføre stoffer eller celler direkte i thymus (dvs., stamfaderen eller modning mellemprodukter mærket ex vivo og adoptively overført), som traditionelt har været en meget kompliceret procedure på grund af thymus anatomiske placering24,25. Derudover tillader perfusion af forkammeret udveksling af den vandige humor eller indlæsning af graften ved diffusion med fluorescerende indikatorer, som tidligere vist for andre slags implantater26.
Den tilgang, der mere trofast giver mulighed for undersøgelse af thymus fysiologi er fastsat af den intravital billeddannelse af transgene medaka fisk at udtrykke fluorescently mærket lymfocyt markører. Gennemsigtighed i medaka under udvikling og hele livet i mange medaka stammer gør denne organisme fordelagtige for overvågning af cellulære dynamics i vivo21. Det lave antal motile thymocytter observeret i medaka (29%)18 med henvisning til mouse´s (95%)13, ud over forskelle i motilitet priser mellem disse to organismer, dog, tyder på, at koldt blod mindste hvirveldyr med en adaptive immunsystem kan begrænses på afslørende bestemt mekanistiske kinetik af højere hvirveldyr T-celle modning begivenheder.
En begrænsning af brugen af forkammeret af musen øjet som stedet for thymus transplantation er plads begrænsning. Langsigtede undersøgelser kan være, derfor kompromitteret; især for nyfødte eller embryonale væv med udvidede vækstpotentiale. I denne forstand, må vi sige, at selv om nyfødte implantater præsenteret med tilsyneladende væv udvidelse efter det første uge efter implantat i mus øjet (data ikke vist), udvidelsen ikke syntes at sætte integriteten af øjet risikerer op til to måneder efter implantat. Ikke desto mindre, det bør være af interesse at vurdere om væv miljø af implantatet (øjet kammer, nyre kapsel eller dermis) indflydelse på implant´s vækst og/eller vascularization før tilstrækkeligheden af tilgangen kan etableres defineret applikationer.
Den store indsnit kræves på hornhinden at tillade passage af thymic fragmentet til forreste øjet kammer fører undertiden til nogle ydmygelse på dette niveau (data ikke vist), sandsynligvis i forbindelse med visse graden af fibrose forbundet til den helbredende proces. Opmærksomhed er krævet på trin 2.3.6 af protokollen til at sikre, at hvis ydmygelse opstår vil minimalt interferere med de downstream imaging trin. Da snit er lavet på en tværgående plan, bør hverken implantatet eller den ydmygelse betydeligt påvirke dyr synet ydeevne.
Behovet for væv trimning at gøre thymus passer ind i øjet kammer synes at være en ulempe i forhold til andre anatomiske steder, der ikke kræver at ændre den anatomiske integritet af orglet. Ikke desto mindre har nyre kapsel tilgang vist, at fragmenter af thymus der indeholder både, cortex og medulla fremstillet ved lignende dissektion retningslinjer til dem vist i figur 1, er nu fuldt funktionsdygtigt som de kan rekonstruere T-celle medieret immunitet i immundefekte thymeless værter18. Det argumenterer for intakt funktionelle træk ved denne type af thymus segmenter. Også, protokollen beskrevet her understreger, at den isolerede thymus skal holdes i kolde (trin 1.9) og kun trimmet lige før implantat (trin 2.3.2) at minimere kolde iskæmi og væv eksponering til optimering væv engraftment.
En yderligere potentielle begrænsning af tilgangen er bosat i sammensætning forskelle mellem den vandige humor i det forreste kammer i øjet og blodplasma, spørgsmål, der skal holdes for øje når tolkning observationer foretaget på denne anatomiske placering . Tidligere undersøgelser med andre væv, men har ikke rapporteret nogen oplagte effekter på normale graft funktion af lokale øje miljø22. Selv om erfaringerne med den model, der præsenteres her er begrænset til et par personer (N = 6 og N = 3 for modtagere og donorer, henholdsvis) i øjeblikket, vi ikke har overholdt alle væsentlige ændringer tilknyttet implantat site for thymic implantater i nogen af de enkeltpersoner enten.
Protokollen præsenteres her udgør et bevis-af princippet for studiet af intravital i længderetningen billeddannelse af thymocyte dynamics af implanterer thymic væv i den forreste kammer af musen øjet. Systemet tillod på grund af udvalg af immunkompetente modtagere ikke spørgsmålstegn ved den systemiske funktion af graften. Fremtidige studier kan bygge videre på denne tilgang ved at vælge forskellige donorer og/eller modtagere og/eller ved at underkaste værter til bestråling og knoglemarv (BM) transplantation efter særlig undersøgelse designs. For eksempel, valget af SCID (svær kombineret immundefekt) mus som modtagere eliminerer interferens af endogene T-celler, og valget af Transgene mus donorer (thymic implantat og/eller BM) præsenterer T-celle markører, DC markører, thymic stroma celle-markører, osv., enkeltvis eller i kombinationer bør tillade direkte i vivo spore cellulære delpopulationer. Alternativt, kunne blive sporet delpopulationer af celler i den forreste øjet kammer af mus, som tidligere beskrevet, i vivo fluorescens cytolabeling26.
En væsentlig fordel ved modellen præsenteres her er, at det giver mulighed for at studere Stamform og modne T-celler translokation fra og mod blodkar. Det bør således være relevante til at bestemme, hvis de hurtigt erhvervede vascularization af thymus efter at være implanteret i forreste øjet kammer sammenfatter den endogene Vaskulaturen. Til fordel for denne mulighed, skal det nævnes at neovascularization i forreste mus salen synes at være dikteret af transplantat18,20 ikke af modtageren og derfor forbindelser til iris Vaskulaturen skal bevare integriteten af endogene thymus cortico-medullær junction (CMJ) domæne.
En yderligere fordel kommer fra det faktum, at systemet giver mulighed for evaluering af to uafhængige implantater (to forreste øje kamre) på identiske individuelle baggrund (en enkelt vært). Undersøgelser kræver kombinationer af væv kan også finde det fordelagtigt at bruge dette system.
Thymus spiller en vigtig rolle i autoimmune og immune mangelfuld patologier, kunne denne fremgangsmåde anvendes til at løse et utal af potentielle spørgsmål. Navnlig bør systemet tillade makroskopisk ud over intra-orgel imaging for progression af thymus involution. Det kan også tjene til at studere transplantation tolerance begivenheder og immunforsvarsforstyrrelser relateret til infektioner. Det er sandsynligt, at den fine dissektion af mekanismer for thymocyte modning vil give nye spor til design af yderligere terapeutiske strategier rettet mod udviklingslandene T celler.
Transplantation af thymus til den forreste kammer i øjet tager mindre end 45 min, herunder neonatal thymus isolation og trimning for hver vært individuelle med implantater i begge øje. In vivo billeddannelse optagelser kræver 1-5 h, afhængigt af overvågede funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) og R21ES025673 (AC), og den bedste/2015/043 grant (Consellería de Educació, cultura jeg esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spanien) (EO). Forfattere takke sendte holdet på Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanien og Alberto Hernandez på Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanien for deres hjælp med video filme og redigere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
