Summary
وهدف البروتوكول لإظهار تتبع في الوقت الحقيقي إينترافيتال طولية من الثيموسيه بالليزر الفحص المجهري في الغدة الصعترية يزرع في الغرفة الأمامية للعين الماوس. شفافية القرنية والأوعية الدموية للفساد يسمح باستمرار تسجيل السلف خلية التجنيد وخروج تي خلية ناضجة.
Abstract
وغرض الأسلوب الذي تعرض لإظهار زرع ثيمي حديثي الولادة إلى غرفة العين الأمامي من الفئران الكبار اسوي في فيفو طولية في الوقت الحقيقي رصد لديناميات thymocytes´ داخل فاسكولاريزيد، للمرة الأولى، الجزء المتعلق بالغدة الصعترية. وبعد زرع الأعضاء، يسمح الليزر الفحص المجهري (LSM) من خلال القرنية في فيفو موسع التصوير المتكرر على المستوى الخلوي القرار. الأهم من ذلك، يضيف النهج السابق نضج تي خلية إينترافيتال التصوير نماذج إمكانية تجنيد خلية السلف المستمرة وتسجيلات متدفقة تي خلية ناضجة في الحيوان نفسه. مزايا إضافية للنظام شفافية مجال المطعمة، يتيح الرصد السريع العيانية مزروع الأنسجة، وإمكانية الوصول إلى زرع السماح للمترجمة بالإضافة إلى العلاجات الجهازية. القيد الرئيسي يجري حجم الأنسجة التي تناسبها في الفضاء انخفاض الدائرة العين التي تطالب للتشذيب فلقة. سلامة الجهاز مكبراً بتشريح الفصوص الغدة الصعترية في أنماط المبين سابقا يكون جاهزاً للإنتاج تي خلية ناضجة. هذا الأسلوب يحتمل أن تكون مناسبة لاستجواب بيئة ذات الصلة طبيا المسائل المتصلة بوظيفة الغدة الصعترية التي تشمل المناعة الذاتية، ونقص المناعة المكتسب، والتسامح المركزية؛ العمليات التي تظل ميتشانيستيكالي غير المحددة بوضوح. تشريح غرامة آليات توجيه الهجرة ثيموسيتي، والتمايز والتحديد ينبغي أن يؤدي إلى استراتيجيات علاجية رواية استهداف خلايا تي النامية.
Introduction
إينتراثيميك تي خلية المفاضلة والانتقاء يتدنى تي خلية تشكل العمليات الرئيسية لتطوير وصيانة الخلية بوساطة الحصانة في الفقاريات1. تنطوي هذه العملية على تسلسل معقد من أحكام تنظيم الأحداث بما في ذلك تعيين موروث من مجرى الدم، وتكاثر الخلايا، والهجرة، والتعبير التفاضلية من بروتينات الغشاء، وموت الخلايا المبرمج واسعة النطاق لمجموعات فرعية التحديد. النتيجة هو الإفراج عن ناضجة خلايا تي رد الفعل طائفة وافرة من المستضدات الخارجية أثناء عرض استجابات مصغر للنفس-الببتيدات، هي في نهاية المطاف استعمار الأجهزة الطرفية اللمفاوية الفردية2،3. اختيار ثيموسيتي الشاذة مرجع αβTCR يؤدي إلى أمراض المناعة الذاتية أو الاختلال المناعي4 التي تنشأ أساسا من العيوب خلال عمليات التحديد السلائف سلبية أو إيجابية، على التوالي.
اتجاهات هجرة الثيموسيه عبر الغدة الصعترية الجوهرية في جميع مراحل النضج تي خلية ويتوخى كسلسلة متزامنة أو متتابعة المحفزات متعددة، بما في ذلك المستقطبات، لاصقة، ولاصق إزالة الألغام المصفوفة خارج الخلية (ECM) بروتين تفاعلات3،5. دراسة الأنسجة الثابتة قدمت معلومات هامة فيما يتعلق بأنماط التعبير بالنسبة للرموز ثيموسيتي المهاجرة في ميكرونفيرونمينتس الغدة الصعترية المعرفة5،6، بينما كشفت دراسات السابقين فيفو اثنين انتشارا السلوكيات المهاجرة من الثيموسيه في مجالين الأشيع متميزة للجهاز: بطء الحركات العشوائية في القشرة وحركية سريعة، محصورة في لب7،،من89،10 , 11 , 12 , 13-زيادة معدلات الهجرة ترتبط بالتحديد الإيجابي الغدة الصعترية13 والانتقاء السلبي ويرتبط مع سلوك الزحف دعم الفرضية القائلة بأن حركية الرحلة عن طريق الغدة الصعترية يحدد السليم نضوج الثيموسيه. على الرغم من أهميتها، لا تزال طبولوجيا تفاعلات الخلية ثيموسيتي stromal وديناميات حركية ثيموسيتي عبر ميكرونفيرونمينتس الجهاز أثناء نضج تي خلية غير محددة.
معظم السابقين فيفو دراسات أجريت حتى الآن تشمل الجنين أو ريجريجاتي الجهاز الغدة الصعترية الثقافات14،15، شرائح الأنسجة أو explants الفص الغدة الصعترية سليمة حيث يتم تصور حركات ثيموسيتي قبل يومين-فوتون ليزر المسح الفحص المجهري (تبلسم)8، درست أسلوب تصوير إينترافيتال مع حد أقصى مقيدة تعمل عن بعد والتصوير عمق 1 مم وفقا للأنسجة16. على النقيض من ثقافات الجهاز الغدة الصعترية الشاقة التي تعتمد على أوقات الاحتضان الموسعة لنموذج 3D-الهياكل، على حد سواء، تقنية شريحة الغدة الصعترية ونهج سليمة فص الغدة الصعترية إدخال تصريح الخاضعة لسيطرة مجموعات فرعية معينة من قبل المسمى الثيموسيه إلى بيئة هندسة أنسجة أصلية. ومع ذلك، نظراً لتدفق الدم غائبة في هذه النماذج، فمحدودة ومن الواضح لدراسة عملية التوظيف للغدة الصعترية تسوية موروث (TSPs) حمة الغدة الصعترية أو ديناميات اجريسيون الغدة الصعترية من الخلايا التائية الناضجة.
وتشمل في فيفو نماذج لدراسة فسيولوجيا نضوج تي خلية الغدة الصعترية في الفئران الطعوم من الشظايا أو الفصوص الجهاز كامل وضعها أما داخل كبسولة الكلي17 أو18إينتراديرمالي. على الرغم من أن هذه الخيارات قد أظهرت فائدتها استجواب engraftment الوظيفية النظامية للأنسجة، موقف الطعوم الغدة الصعترية العميق داخل الحيوان أو مغطاة بطبقات من الأنسجة المعتمة يقيد استعمالها للفحص في فيفو يزرع بها تبلسم.
الغرفة الأمامية للعين يوفر مساحة يمكن الوصول بسهولة للرصد المباشر لأي الأنسجة المطعمة بحكم شفافية طبقات القرنية. ميزة، قاعدة الدائرة التي شكلتها قزحية العين الغنية بالأوعية الدموية ونهايات الأعصاب اللاإرادي، تمكين عودة التوعي السريع ورينيرفيشن ل ترقيع19،20. الدكتور كايسيدو قد استخدمت بنجاح هذه المساحة التشريحية للصيانة ودراسة طولية من جزيرات البنكرياس في الماضي21. هنا، نحن تبين أن هذه الاستراتيجية لا يشكل نهجاً سليما لدراسة ديناميات نمو داخل هيكل الجهاز الأصلي، ولكن أيضا شكل فريد يسمح تمديد في فيفو تسجيلات طولية لدراسة التوظيف السلف و الخطوات اجريسيون تي خلية ناضجة في الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميامي وافق جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك.
1-العزلة والتشذيب لحديثي الولادة تيمي
- تحضير جميع المواد الكاشفة والصكوك بالتعقيم أو بطرق أخرى، ضمان ظروف معقمة.
- للتقليل من التلوث، إجراء جميع العمليات الجراحية تحت غطاء الاندفاق الصفحي.
- قبل يوثانيزينج المانحة الفئران، ملء طبق عقيمة 60 ملم مع العقيمة 1 بريشيليد x مخزنة الفوسفات المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4) ووضعه على الجليد. أنها ستستخدم الشطف وتخزين ثيمي قصت من الفئران المانحة قبل زرع الأعضاء.
- انتقل إلى euthanize الفئران حديثي الولادة المانحين بقطع الرأس، وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية.
- ضع الماوس على مناشف ورقية ماصة معقمة في وضع مستقيم الظهرية والرذاذ، ومسح في وقت لاحق، البطن الماوس مع الإيثانول 70%.
- كشف التجويف الصدري عن طريق إجراء شق على شكل V سطحية على مستوى أسفل البطن وقطع الجلد مع زوج من 10 سم على التوالي تشريح المقص أثر خط الوسط البطني لترك فتح حوالي 0.5-1 سم على مستوى الصدر. أمثال الجلد على كل جانب من الصدر لفضح تجويف الصدر.
- جعل اثنين أعمق من 0.5-1 سم شقوق جانبية من خلال الحجاب الحاجز والقفص الصدري مع نفس النوع من المقص الوصول إلى منصف متفوقة في تجويف الصدر الأمامي. يجب أن تظهر الغدة الصعترية الفصوص بالي اثنين الحق فوق القلب.
- وضع مجموعة من الملقط منحنية تحت الغدة الصعترية وسحب عمودياً لاستخراج الجهاز كاملة. منع foldback من القفص الصدري مع زوج من الملقط. إذا لزم الأمر، استخدم الملقط غرامة لعناية تمزق النسيج الضام المحيطة الجهاز دون تعطيل الكبسولة قبل استخراج الجهاز.
ملاحظة: هذه الخطوة يسهل استخدام نطاق تشريح. - غمر الغدة الصعترية معزولة في PBS الباردة العقيمة x 1 (الرقم الهيدروجيني 7.4) سابقا عرض في صحن معقم 60 ملم، وقطع البرزخ الضام مع مشرط لفصل الفصوص الغدة الصعترية. إزالة أي حطام من الطبق دون الأضرار بالكبسولة. لتقليل الوقت ويتعرض تيمي، تقليم الفصوص الزعتر الحق قبل عملية الزرع.
ملاحظة: كل الغدة الصعترية الوليد معزولة عادة ستؤدي إلى ستة قطاعات من حوالي 1 مم بحد أقصى ثلاثة المضيف الفئران عند تلقي يزرع في كلتا العينين. - كرر الخطوات من 1.4-1.9 لكل المانحين الماوس. لتقليل الوقت ويتعرض تيمي، عزل الغدة الصعترية واحد في وقت واحد.
2-الغدة الصعترية غرس في الغرفة الأمامية للعين
- قبل زرع الأعضاء، العلامة وتزن كل الماوس المتلقية.
- استخدام جرعة بين 1-2% الأبخرة إيسوفلوراني تخدير الماوس المتلقية. ضمان أنيسثيتيزيشن السليم بسبب غياب منعكس قرصه تو التالية قبل بدء العملية الجراحية.
- المضي قدما في زرع أجزاء الغدة الصعترية كما يلي:
- ضع الماوس في جانب أفقي راقد وضع حيث أن العين واحد هو مواجهة يتعرض مباشرة لعدسة نطاق تشريح.
- المكوس أحد الفصوص الغدة الصعترية معزولة الكذب في برنامج تلفزيوني الباردة x 1 (الرقم الهيدروجيني 7.4)-مليئة تصل إلى 1 مم عرض لزرع طبق 60 مم إلى قطع. اتباع نمط التعرج لضمان أن كل قطعة تحتوي على قشرة الغدة الصعترية ولب. استخدام مقص فاناس لاقتطاع وفقا للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في الرقم 1 أ.
ملاحظة: ينبغي أن يتم اقتطاع من الغدة الصعترية الحق قبل عملية الزرع لتحسين انجرافتمينت الأنسجة. - بدءاً من قاعدة القرنية المقابلة لمنطقة العمليات الجراحية، يعرض تلميح إبرة 40 مم G18 لإجراء شق صغير في طبقات القرنية الخارجية بحيث يمكن إدخال تلميح مقص تشريح.
- تجعل من 5-10 ملم الجناح شق مباشرة حول القاعدة القرنية استخدام مقص vannas أثناء إجراء فتح القرنية بحزم لمنع إعادة ختم. استخدام الملقط مع نهايات المسطح لتجنب تلف الأنسجة.
- فهم ظهارة القرنية قطع وفضح فتح بعقد القرنية مع زوج من الملقط انتهت مسطحة بينما يدفع قطعة الغدة الصعترية من خلال فتح. الرطب العين مع العقيمة 1 x برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) أو الدموع الصناعية حسب الحاجة لمنع جفاف الأنسجة حتى يتم التلاعب بالكامل.
- اضغط بهدوء على سطح العين الشريحة الجزء الأنسجة أدخلت إلى موضع أفقي فيما يتعلق بالتلميذ للحفاظ على وظيفة eye´s. تأكد من أن تقع الاختلاس في مكان مقابل العين الافتتاحية لمنع التدخل اللاحق مع التصوير بالعقاب الشديد.
- مع معونة الملقط مسطحة، اضغط بحزم، لحوالي 3-5 ق، بين الجانبين لفتح القرنية ضد بعضها البعض لتشجيع الختم الذاتي. لا تتطلب عملية جراحية أي التدبيس أو الخياطة.
- إذا كان يتم تنفيذ الزرع على كلتا العينين، اقلب الماوس الجانب الأفقي المقابل فضح العين الثانية إلى عدسة مجهر تشريح مباشرة وكرر الخطوات 2.3.2-2.3.7.
- بعد اكتمال عملية جراحية، العودة الماوس إلى قفص فارغ بريوارميد مع مصباح حرارة.
- تأكد من أن يستعيد كل الماوس زرع التنقل الكاملة ووعيه قبل وضعه في قفص مشتركة مع غيرها من الحيوانات. وهذا يجري عادة ضمن ح 1 بعد الجراحة.
- عند زرع الأعضاء، علاج الفئران مع مسكنات الألم عند الحاجة، وتوفير الفئران مع أسيتامينوفين في تركيز من 1.6 ملغ/مل في مياه الشرب.
- كرر الخطوات من 2، 2-2.9 لكل مستلم الماوس.
- مراقبة نشاط الحيوان بعد العمليات الجراحية، فضلا عن مظهر العيون مزروع للكشف عن المضاعفات الصحية المحتملة.
3-[كنفوكل] تصوير "تيمي مزروع" استخدام 3D "وحيدة فوتون Fluorescence [كنفوكل] مجهرية"
- تخدير الماوس المستلم باستخدام جرعة بين 1-2% الأبخرة إيسوفلوراني. ضمان أنيسثيتيزيشن السليم بسبب غياب منعكس قرصه تو التالية قبل البدء في عملية التصوير
- ضع الماوس على منصة مجهر مرحلة ثابتة القادرة على جانب أفقي راقد حتى هو مواجهة ذلك عين واحدة. لوحة حرارة يوضع على منصة المجهر لضمان درجة حرارة الجسم ثابتة من الفئران خلال التسجيلات.
ملاحظة: انظر التكميلية الرقم 1 لمزيد من التفاصيل. - إدراج رأس الماوس هيدهولدير ستيريوتاكسيك وضبط مقبض لكبح جماح رأس الماوس على موقف جانب أفقي السماح بالوصول المباشر الهدف مجهر العين عقد الاختلاس الغدة الصعترية.
- مكان الآنف الماوس إلى قناع غاز للحفاظ على الحيوان تخديره طوال الإجراءات. يسمح هذا تعديل الأبخرة إيسوفلوراني حسب الحاجة.
- لتسهيل تحقيق الاستقرار في العين خلال التسجيلات مع تجنب سحب الجفون، سحب الجفون حين عقد العين في الهامش القرنية مع زوج من ملاقط التي تحتوي على نصائح مشمولة بأنبوب البوليثين الذي يتم إرفاقه أوست-2 الصلبة المشترك العالمي. هذا الترتيب يسمح تثبيت مطرد للرأس والعين، ويوفر المرونة دون انقطاع تدفق الدم في العين، كما هو موضح سابقا22.
ملاحظة: تظهر الأرقام التكميلية 1B، ج الجمعية كاملة. - إضافة بضع قطرات من الدموع المالحة أو اصطناعية العقيمة كالسائل الغمر بين القرنية والعدسة، قبل وضع الهدف المجهر على العين الماوس.
ملاحظة: يتم الاستغناء عن قطرات إضافية على الحاجة طوال فترة الإجراءات الحفاظ على مسار مجهر ومنع جفاف العين. - أولاً استخدام عدسة التكبير المنخفض (5 X) لتحديد موقع الغدة الصعترية في ميدان المجهر. قم بالتبديل إلى القرار (10 و 20 و 40 س) أعلى الماء الغمر غمس الأهداف مع المسافة العمل منذ فترة طويلة. تجنب د LSM وتبيض من زرع الغدة الصعترية بتطبيق قوة الليزر الحد الأدنى وتقليل وقت المسح، قدر الإمكان. ويتحقق ذلك باستخدام الماسح الضوئي مدوية من المجهر.
ملاحظة: المجهر [كنفوكل] نستخدم مجهزة بمرايا المسح الرنانة القادرة على جمع الصور في 25 إطارات/ثانية. العلامات التجارية الأخرى قد المجاهر الخاصة بهم مع الماسحات الضوئية الرنانة. - حدد وضع الحصول على استخدام البرمجيات مجهر وبدء وضع الماسح الضوئي رنانة. ثم اختر طريقة التصوير إكسيزت وتكوين إعدادات الحصول على النحو التالي:
- تشغيل ليزر الأرجون وضبط السلطة إلى 30% للإثارة الأسفار.
- اختر خط ليزر إثارة وتعيين عنصر التحكم أكوستو الضوئية شعاع الخائن (أوبس) لأطوال موجية مختلفة للانبعاثات. وبالإضافة إلى ذلك، للكشف عن تشتت ارتدادي وتحدد بنية الأنسجة، استخدام الكشف عن التفكير في أن واحد.
ملاحظة: عند اختيار مجموعة من الألوان للإثارة (التجارة والنقل وطلب تقديم العروض)، أوبس تلقائياً مبرمجة لتوجيه هذه الخطوط الإثارة على العينة ويحيل انبعاث بينهما. على سبيل المثال، للتجارة والنقل وطلب تقديم العروض، ونحن استخدام نطاقات ضيقة التفكير للإثارة الخفيفة حوالي 488 نانومتر و 561 نيوتن متر، على التوالي. وهذا يترك النطاقات الواسعة لجمع الفوتونات المنبعثة من الأسفار، مما يقلل من الحاجة لليزر السلطة واكتساب الوقت. في طريقة التفكير، أوبس كتقسيم المتساوي شعاع لصورة الضوء المنعكس في الطول الموجي أي بعيداً عن تلك المستخدمة للكشف عن انبعاث الأسفار. - جمع الانبعاثات في الطول الموجي المحدد، ثم حدد قرار 512 × 512 بكسل وبدء يعيش التصوير بالضغط على زر حية ، ضبط مستويات الربح حسب الحاجة (كسب نموذجي هو حوالي 600 V).
- تحديد بداية ونهاية z-المكدس بالتركيز على رأس زرع الغدة الصعترية وحدد البدء، ثم الانتقال إلى آخر الطائرة التي يمكن أن تركز في الغدة الصعترية مزروع وحدد نهاية. استخدام حجم z-خطوة 5 ميكرومتر. سيقوم البرنامج تلقائياً بحساب عدد الطائرات [كنفوكل].
- اختر الفاصل الزمني للحصول على كل كومة z (عادة 1.5 إلى 2 ثانية) وحدد خيار الحصول على حين توقف للتصوير المستمر.
- اضغط على زر بدء التهيئة.
- صورة ترقيع مرارا وتكرارا في أوقات مختلفة من الحيوان نفسه بتكرار الخطوات من 3، 1-3، 9.
ملاحظة: إذا كان هذا الحيوان يحمل الطعوم في كلتا العينين، يمكن اتخاذها التسجيلات من العين أما بتكرار الخطوات من 3، 2-3.9 بعد التحول إلى جانب وضع مستقيم الرأس الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الغدة الصعترية من الفئران حديثي الولادة كانت معزولة من B6. الفريق الاستشاري--Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/جاس الفئران كما هو موضح في هذا البروتوكول (خطوات 1.1-1.9). في هذه الفئران المعدلة وراثيا، يوجه المروج أكتين بيتا دجاج التعبير عن المتغير البروتين الفلورسنت الأحمر دسريد. MST تحت تأثير محسن المبكر الفوري الفيروس المضخم للخلايا (CMV) تيسير تتبع يزرع.
لمنع رفض الأنسجة، الأفراد اسوي مع النمط الوراثي: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/ي اختيرت كمضيفين. في هذه الفئران المعدلة وراثيا، يوجه المروج ubiquitin البشرية ج التعبير عن البروتين المعزز الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في جميع الأنسجة التي تسمح بتمييز واضح بين الأنسجة المتلقية والمانحة. عمل المروج ubiquitin البشرية ج يؤدي إلى أنماط التعبير بروتينات فلورية خضراء التفضيلية في بعض أنواع الخلايا المكونة للدم. على وجه الخصوص، يقدم خلايا تي تعبير بروتينات فلورية خضراء إضعاف أعلى مستويات من CD19+B220+ ب الخلايا أو غيرها خلايا الدم المحيطية التي قد تسهل التعرف عليها بالتقنيات الحساسة الكمية مثل التدفق الخلوي، دون أي الاحتياجات للعلامات الإضافية. وعلاوة على ذلك، يلاحظ التعبير الفلورسنت في هذه الفئران في الحيوانات الكبار، وكذلك في جميع المراحل الجنينية وموحدة ضمن نسب نوع خلية منح الاستقرار علامة.
يتبع النمط للتشذيب الغدة الصعترية هو موضح في الشكل 1A الأوصاف السابقة من شظايا وظيفية الغدة الصعترية مزروع في كابسولا الكلي23. يسمح هذا الإجراء التشذيب لتخفيض الحجم الإجمالي للأنسجة يتم زرعها مع الحفاظ على الوحدات الأساسية النسيجي الوظيفية للجهاز (قشرة ولب والأوعية الدموية مفرق كورتيكو-النخاع (المتحف)). الفرق الملحوظ في الحجم بين الولدان الغدة الصعترية (الشكل 1A، اليسار) والغدة الصعترية من الفئران البالغ من العمر واحدة في الأسبوع (الشكل 1A، حق) ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار للتشذيب، كما يزرع المساحة المتاحة لتناسب في الغرفة الأمامية من الماوس العين مقيد. وتشمل النتائج المعروضة هنا يزرع الحصول عليها من حديثي الولادة فقط. ويبين الشكل 1B صورة عيانية لشريحة الغدة الصعترية مزروع في الغرفة الأمامية للعين الماوس التجارة والنقل، واستيعابها للحفاظ على رؤية الحيوان. يمكن ملاحظة النسيجي تفاصيل عملية الزرع في إشارة إلى القرنية (بروتينات فلورية خضراء الأنسجة المجاورة لزرع RFP) في تعمير 3D صور [كنفوكل] في التكميلي فيديو 1. ويبين انجرافتمينت إلى القزحية فيديو 1 و الشكل 2.
الرقم 1 ود 1 على التوالي توضيح مجال مشرق ومتابعة الصور الأسفار من نفس المنطقة التي قد تخدم لازدواجية العيانية لنمو الأنسجة والالتفاف في مواصلة الدراسات. كما يوضح الشكل 1 الأوعية الدموية مزروع الأنسجة التي ينبغي أن تسمح فريد لدراسة فيزيولوجيا الغدة الصعترية تعتمد على إمدادات الدم الجهاز على طول الوقت.
حدث الأوعية الدموية أجزاء الغدة الصعترية المدرج ضمن ح 72 بعد عملية الزرع. عملية الأوعية السريع اتفاق جيد مع كمية كبيرة من الأوعية الدموية الموجودة في القزحية وثراء الغدة الصعترية في إنتاج سيتوكين. تمكين هذه الخصائص انجرافتمينت سريعة من تيمي المدرج. الأوعية الدموية يزرع هو موضح في الفيديو 2عرض engraftment الغدة الصعترية الأوعية الدموية مع iris´ المضيف الفردية (بروتينات فلورية خضراء الأنسجة المجاورة لزرع RFP)، ولذلك، يؤكد أن النموذج المعروض هنا، في الواقع، يسمح مونيتوريزيشن مستمر موسع للغدة الصعترية vascularized على المستوى المجهري. استخدام LSM لتصور الغدة الصعترية الذاتية أو الغدة الصعترية سبق زرعها في مختلف المواقع التشريحية مقيد بواسطة العتامة الأنسجة والأنسجة سماكة تزيد عن 1 مم. ويعتبر "نافذة" للكائن الحي تسهيل مراقبة أنسجة مزروع على المستوى المجهري الغرفة الأمامية للعين.
هنا، فإنه يظهر أن النموذج الذي وضعته مجموعتنا يسمح تصور التهجير الخلايا من سيل الدم (2 فيديو) في الغدة الصعترية مزروع (يفترض أن المتكفل)؛ لتعقب جهات الاتصال من بروتينات فلورية خضراء السلف الخلايا الواردة إلى زرع الغدة الصعترية مع المقيم الغدة الصعترية الظهارية و stromal خلايا (المسمى RFP) خلال عمليات المفاضلة والاختيار (أشرطة الفيديو 3 و 4)، وأيضا، لخروج من الخلايا (خلايا تي يفترض أنها ناضجة) في الأوعية الدموية (5 فيديو).
النهج الذي يصف لنا وبالتالي يمثل "دليلاً على مبدأ"، استناداً إلى التسجيلات التي اتخذت بين ح 72 وشهر واحد بعد انتهاء عملية الزرع من ستة أفراد زرعها مع الشرائح من ثلاث جهات مانحة الوليد المستقلة، لحيوان النموذجية التي يسمح بتتبع في فيفو الوقت الحقيقي نضج ثيموسيتي في جزء الغدة الصعترية vascularized بإجراءات موسع على طول الوقت، وعلى هذا النحو، البروتوكول قد تحتاج إلى مزيد من التحسينات. هذا النموذج يمكن أن يكون كذلك وضعت الاستفادة من الحيوانات المحورة وراثيا إيواء علامات ثيموسيتي المسمى الجزيئية، على سبيل المثال، نيون الانصهار المنتجات، مما يسمح بتصور مباشرة من وسيطة نضوج تي خلية. النظام قد تساعد على حل الخلافات والاستجابة إينكوجنيتاس مرتبطة بالتمايز ثيموسيتي واختيار الأحداث بين أمور أخرى.
رقم 1. تقطيع الفصوص الغدة الصعترية الوليد المانحين وزرع في الغرفة الأمامية للعين الفئران. الوليد (A) (يسار) وصور تيمي (يمين) بعد الولادة أسبوع واحد. خطوط داش على الغدة الصعترية حديثي الولادة تمثل أدلة لإعداد مقاطع لزرع الأعضاء في قاعة العين الأمامي من الفئران لتقدير الحد الأقصى لعدد عمليات زرع الأعضاء من مانح واحد. (ب) صورة تمثيلية تظهر حديثا مزروع الغدة الصعترية. (ج) صورة تمثيلية المطعمة، vascularized الغدة الصعترية 2 أسابيع بعد عملية الزرع. (د) صورة Fluorescence الاختلاس الغدة الصعترية المبين في (ج). يتم عرض شريط مقياس (1 مم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. [كنفوكل] صورة تبين تفاصيل engraftment الجزء (أحمر) الغدة الصعترية في القزحية (الأخضر)- الحصول على الصورة مجهر، باستخدام الإعدادات التالية: 488 و 561 نانومتر الإثارة/500 و 575 نانومتر انبعاث الموجات، 512 × 512 بكسل و 40 × غمس الهدف مع المسافة العمل منذ فترة طويلة. يتم عرض شريط مقياس (40 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 1. الإعداد لتصوير [كنفوكل] للاختلاس الغدة الصعترية fluorescence فوتون واحد ثلاثي الأبعاد باستخدام الليزر مجهرية [كنفوكل]- (A) هياتباد وهيادهولدير ستيريوتاكسيك وتفاصيل قناع غاز. (ب) إعداد الماوس عقد الاختلاس الغدة الصعترية ل LSM. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1 من . في فيفو تصوير الغدة الصعترية يزرع في الغرفة الأمامية للعين الماوس. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 2 من . التوظيف من المفترض الغدة الصعترية تسوية موروث (ملعقة صغيرة) من مجرى الدم (التجارة والنقل) في حمة الغدة الصعترية (RFP). من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 3 من . الحركة العشوائية الثيموسيه (المتكفل الغدة الصعترية المبكر أو دائرة الشرطة) في القشرة. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 4 من . تفاعل الثيموسيه (بروتينات فلورية خضراء) مع الخلايا اللحمية الغدة الصعترية (RFP) كتكس (الخلايا الظهارية الغدة الصعترية القشرية) أو متيكس (النخاع الخلايا الظهارية الغدة الصعترية). من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 5 من . تصوير خروج الوقت الحقيقي للخلايا التائية الناضجة المحتملة. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
التكميلي فيديو 1-3D-في فيفو التصوير للغدة الصعترية يزرع في الغرفة الأمامية للعين الماوس. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظراً لأهمية عملية نضج تي خلية للكفاءات الفردية المناعي4 وأثر المفترضة لديناميات السلائف الخلية في الخلايا التائية الناضجة التي تنتجها الغدة الصعترية2،3، وقد استثمرت جهودا مكثفة تطوير بدائل للنهج اللقطة الأنسجة الثابتة الكلاسيكية.
على الرغم من وضوح متفوقة في استنساخ الأنسجة الهندسة المعمارية من مونولاييرس أو الجهاز الغدة الصعترية التجميعية الثقافات14،15شرائح الأنسجة وغيرها explants، عدم وجود اتصال المفرج يحد من استخدامها للدراسة خطوات الدخول أو ملعقة صغيرة (إزفاء فروعه عبر حاجز غشائي خلايا الأوعية الدموية) والخروج (إزفاء الخلايا التائية الناضجة عبر حاجز غشائي خلايا الأوعية الدموية) من الجهاز. كما أنه يتم الافتراض بأن ديناميات تي خلية الاتصالات مع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخلايا اللحمية الغدة الصعترية، وعلى الحركة عبر ميكرونفيرونمينتس داخل القشرة ولب تحديد مركزها التمايز وعملية يتدنى التحديد (الإيجابية والسلبية)2،3،،من45، وحيث أن هذه العمليات قد تعتمد على ملعقة صغيرة وأحداث الخروج تي خلية ناضجة، تدفق الدم نموذج يتضمن الاتصال individual´s النظام سيكون مرغوباً فيه.
زراعة كبسولة الأدمة والكلى للغدة الصعترية تسمح لهذه الترقية17،18. ومع ذلك، أنها تشكل أساليب الغازية مع القيود المفروضة على التصوير بواسطة تبلسم بسبب موقف عميق للزرع داخل الجسم أو وجود طبقات مبهمة من الأنسجة أعلاه الاختلاس. تكييف قاعة العين الأمامي الماوس، كانت تستخدم ك21،"نافذة"22 إلى طوليا رصد أداء أنسجة عدة، كما يوفر موقع لتعقب الخلايا التائية داخل الغدة الصعترية فاسكولاريزيد العديد من المزايا مقابل الاستراتيجيات الأخرى المتعلقة بزرع الأعضاء. على جانب واحد، الجراحة أبسط لأن لا خيوط مطلوبة، مما أدى إلى انتعاش أسرع من الحيوانات المضيف. على الجانب الآخر، الملاحظة التي يزرع لا تتطلب جراحة إضافية كما يحدث ليزرع كبسولة الكلي، مما يسمح للتسجيلات المتكررة من الحيوان نفسه. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح الخصائص التشريحية الخاصة بالعين لسهولة تعديل المدخلات التنظيمية على أنسجة مزروع النظامية، بل أيضا محلياً. كما هو موضح سابقا، مع هذا النهج، يمكن تطبيقها على العين موضعياً المواد أو حقن في قاعة العين الأمامي. كما أنه يمثل خياراً سهلاً لإدخال مواد أو الخلايا مباشرة في الغدة الصعترية (أي.، موروث أو وسيطة نضوج المسمى السابقين فيفو ونقل أدوبتيفيلي)، التي كانت تقليديا إجراءات معقدة للغاية سبب24،الغدة الصعترية موقع التشريحية25. وعلاوة على ذلك، يسمح نضح الغرفة الأمامية تبادل الخلط المائي أو تحميل الاختلاس قبل نشرها مع مؤشرات الفلورسنت، سيظهر كما سبق لنوع آخر من يزرع26.
أن النهج الذي يتيح دراسة فيزيولوجيا الغدة الصعترية أكثر دقة يتم توفيرها من قبل تصوير الأسماك المحورة وراثيا الميداكا معربا عن علامات اللمفاويات فلوريسسينتلي المسمى إينترافيتال. شفافية الميداكا أثناء التطوير وطوال الحياة في العديد من سلالات الميداكا يجعل هذا الكائن مفيداً لرصد ديناميات الخلوية في فيفو21. انخفاض عدد الثيموسيه متحركة في الميداكا (29 في المائة)18 إشارة إلى mouse´s (95 في المائة)13، بالإضافة إلى الاختلافات في معدلات الحركة بين هذه الكائنات اثنين، ومع ذلك، تشير إلى أن البرد الدم فقاريات أصغر مع الجهاز المناعي التكيفي قد تكون محدودة في الكشف عن حركية ميكانيكية خاصة أعلى الأحداث نضوج تي خلية الفقاريات.
واحد الحد من استخدام الغرفة الأمامية للعين الماوس كالموقع لزرع الغدة الصعترية تقييد الفضاء. قد يكون، الدراسات الطويلة الأجل للخطر ولذلك؛ خاصة بالنسبة للأطفال حديثي الولادة أو الأجنة الأنسجة مع إمكانات النمو الموسع. وبهذا المعني، يتعين علينا أن نقول أن على الرغم من أن يزرع الوليد قدم مع توسيع الأنسجة الظاهر بعد زرع ما بعد الأسبوع الأول في العين الماوس (البيانات لا تظهر)، التوسيع لا يبدو للخطر سلامة العين تصل إلى شهرين بعد عملية الزرع. ومع ذلك، ينبغي أن يكون الاهتمام بتقييم ما إذا كانت البيئة الأنسجة من الزرع (دائرة العين، كبسولة الكلي أو الأدمة) يؤثر على النمو implant´s و/أو الأوعية الدموية قبل أن يمكن تأسيس كفاية النهج لتعريف التطبيقات.
شق كبير مطلوب على القرنية للسماح بمرور جزء على الغدة الصعترية إلى قاعة العين الأمامي يؤدي أحياناً إلى بعض العقاب الشديد على هذا الصعيد (البيانات لا تظهر)، وعلى الأرجح المتصلة بدرجة معينة من التليف المرتبطة بعملية الشفاء. هو طالب الاهتمام على خطوة 2.3.6 البروتوكول ضمان أن تدخل الحد الأدنى إذا كان العقاب الشديد يحدث سوف مع خطوات التصوير المتلقين للمعلومات. كما يتم إجراء شق المستوى أفقي، الزرع لا العقاب الشديد ينبغي أن تؤثر تأثيراً كبيرا على أداء مشهد الحيوانات.
الحاجة إلى اقتطاع أنسجة لجعل الغدة الصعترية تندرج في دائرة العين يبدو أن عيب إذا ما قورنت بغيرها من المواقع التشريحية التي لا تتطلب تغيير سلامة التشريحية للجهاز. ومع ذلك، النهج كبسولة الكلي قد أظهرت أن الأجزاء من الغدة الصعترية التي تتضمن، على حد سواء، قشرة ولب التي حصل عليها مبادئ توجيهية تشريح مماثلة لما هو مبين في الشكل 1، أصبحت تعمل بكامل طاقتها كما أنها يمكن أن تعيد تشكيل تي خلية وساطة من الحصانة في العوز المضيفين ثيميليس18. وهذا يدفع صالح سمات وظيفية سليمة لهذا النوع من شرائح الغدة الصعترية. أيضا، البروتوكول الموصوفة هنا تؤكد أنه يجب إبقاء الغدة الصعترية معزولة في البرد (الخطوة 1.9) وقلص فقط الحق قبل الزرع (الخطوة 2.3.2) للحد من التعرض الاسكيمية والأنسجة الباردة نحو تحسين انجرافتمينت الأنسجة.
حد محتملة إضافية للنهج الذي يقيم في الاختلافات التكوين بين الخلط المائي في الغرفة الأمامية للعين وبلازما الدم، مسألة تحتاج إلى أن يوضع في الاعتبار عند تفسير الملاحظات في هذا الموقع التشريحية . الدراسات السابقة مع الأنسجة الأخرى، ومع ذلك، لم تبلغ أي آثار واضحة على وظيفة الاختلاس العادي ب البيئة المحلية العين22. على الرغم من أن تجربة النموذج المعروض هنا يقتصر على عدد قليل من الأفراد (N = 6 و N = 3 للجهات المتلقية والجهات المانحة، على التوالي) في الوقت الحاضر، ونحن لم يلاحظ أي تغييرات رئيسية مرتبطة بزرع الموقع في حالة الغدة الصعترية يزرع في أي من الأفراد أما.
ويشكل البروتوكول المعروضة هنا إثبات لمبدأ لدراسة إينترافيتال التصوير الطولي لديناميات ثيموسيتي بزرع أنسجة الغدة الصعترية في الغرفة الأمامية للعين الماوس. سبب اختيار الأشخاص المتلقين، لم يسمح النظام التشكيك منهجية مهمة الاختلاس. الدراسات المستقبلية قد بناء على هذا النهج عن طريق اختيار الجهات المانحة المختلفة و/أو المستفيدين و/أو إخضاع المضيفين التشعيع وزرع نخاع العظم (بي أم) وفقا لدراسة معينة والنماذج. على سبيل المثال، اختيار الفئران إخضاعها (شديد المجمعة نقص المناعة المكتسب) كمتلقين يلغي تدخل خلايا تي الذاتية، واختيار الجهات المانحة الفئران المحورة وراثيا (زرع الغدة الصعترية و/أو بي أم) عرض علامات خلية T، علامات DC، الغدة الصعترية stromal علامات خلية، إلخ.، فرادى أو في مجموعات ينبغي أن تسمح بتتبع مباشرة في فيفو من الجمهرات الخلوية الفرعية. بدلاً من ذلك، يمكن تعقب الفئات السكانية الفرعية خلايا في قاعة العين الأمامي من الفئران، كما سبق ذكره، خلال في فيفو الأسفار سيتولابيلينج26.
ميزة واحدة كبرى للنموذج المعروض هنا أنه يسمح لدراسة السلف وناضجة إزفاء خلايا تي من ونحو الأوعية الدموية. وبالتالي، ينبغي أن يكون ذات الصلة لتحديد إذا كانت الأوعية المكتسبة بسرعة من الغدة الصعترية بعد يتم زرعها في قاعة العين الأمامي ويجمل المفرج الذاتية. صالح هذه الإمكانية، وتجدر الإشارة إلى أن نيوفاسكولاريزيشن في قاعة الماوس الأمامي يبدو أن تملي بالاختلاس من18،20 بدلاً من المستلم، ومن ثم الاتصالات إلى المفرج القزحية وينبغي الحفاظ على سلامة المجال مفرق كورتيكو-النخاع (المتحف) الغدة الصعترية الذاتية.
ميزة إضافية تأتي من حقيقة أن يسمح النظام بتقييم يزرع المستقلة اثنين (دائرتي العين الأمامية) على خلفية فردية متطابقة (مضيف واحد). الدراسات التي تتطلب مجموعات من الأنسجة قد تجد من المفيد استخدام هذا النظام.
كما الغدة الصعترية تلعب دوراً هاما في أمراض نقص المناعة الذاتية، ومحصنة، يمكن استخدام هذا النهج لمعالجة عدد كبير أسئلة المحتملة. على وجه الخصوص، ينبغي أن يسمح النظام العيانية بالإضافة إلى تصوير داخل الجهاز لتقدم الالتفاف الغدة الصعترية. أنها قد تستخدم أيضا دراسة الأحداث زرع التسامح والاختلالات المناعية المتعلقة بالإصابات. ومن المرجح أن تشريح غرامة للآليات التي تحكم نضوج ثيموسيتي ستقدم أدلة جديدة لتصميم استراتيجيات علاجية إضافية تستهدف تطوير خلايا تي.
زرع الغدة الصعترية للغرفة الأمامية للعين يستغرق أقل من 45 دقيقة، بما في ذلك عزل الغدة الصعترية الولدان والتشذيب لكل مضيف الفردية مع يزرع في العين أما. في فيفو تسجيلات التصوير تتطلب ح 1 إلى 5، اعتماداً على ميزات المراقبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يؤيد منح المعاهد الوطنية للصحة R56DK084321 (ميلان)، R01DK084321 (ميلان)، R01DK111538 (ميلان)، R01DK113093 (AC)، و R21ES025673 (AC)، ومنحة أفضل/2015/043 (Consellería de Educació، والثقافة وأنا اسبورت، محافظة فالنسيا، فالنسيا، إسبانيا) (EO). يشكر المؤلفون الفريق المرسلة في الجامعة الكاثوليكية فالنسيا دي سان فيسنتي مارتير، فالنسيا، إسبانيا وألبرتو هيرنانديز في مركز بحوث وبرنشيبيه فيليبي، فالنسيا، إسبانيا لمساعدتهم بتصوير الفيديو وتحريرها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
