Summary
Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.
Abstract
Die vorgestellte Methode soll zeigen, zum ersten Mal die Transplantation von Neugeborenen Thymi in die vorderen Auge Kammer isogenen Erwachsener Mäuse für in Vivo längs Echtzeit-Überwachung der Thymocytes´ Dynamik innerhalb einer vaskularisierte Thymus-Segment. Nach der Transplantation kann Laser-scanning-Mikroskopie (LSM) durch die Hornhaut in Vivo nicht-invasive wiederholte Bildgebung auf zelluläre Auflösung Ebene. Wichtig ist, verleiht der Ansatz vorherigen intravitalen T-Zell-Reifung imaging-Modelle die Möglichkeit für die kontinuierliche Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg-Aufnahmen im gleichen Tier. Weitere Vorteile des Systems sind die Transparenz der transplantierten Bereich makroskopische schnelle Überwachung des implantierten Gewebes, bei schönem und der Zugriff auf das Implantat, so dass für lokalisierte neben systemischen Behandlungen. Die Haupteinschränkung wird das Volumen des Gewebes, das passt im reduzierten Raum der Auge Kammer die Forderungen nach Lappen trimmen. Orgel-Integrität wird maximiert durch Sezieren Thymus Lappen in den Mustern, die zuvor gezeigt, dass funktional für Reife T-Zell-Produktion. Die Technik eignet sich möglicherweise um ein Milieu der medizinisch relevanten Fragen im Zusammenhang mit Thymus-Funktion zu verhören, die Autoimmunität, Immunschwäche und zentrale Toleranz enthalten; Prozesse, die mechanisch schlecht definierten bleiben. Die feinere Zerlegung des Mechanismen führen Thymocyte Migration, Differenzierung und Auswahl sollte für neue therapeutische Strategien zielen entwickelnde T-Zellen führen.
Introduction
Intrathymic T-Zell-Differenzierung und T-Zell Subpopulation Auswahl bilden wichtige Prozesse für die Entwicklung und Wartung von zellvermittelte Immunität in Wirbeltieren1. Dieser Prozess beinhaltet eine komplexe Abfolge von straff organisierten Veranstaltungen, einschließlich der Rekrutierung von Vorfahren aus Blut, Zell-Proliferation und Migration, differentielle Expression der Membranproteine und massive programmierten Zelltod für Teilmengen Auswahl. Das Ergebnis ist die Freisetzung von Reifen T-Zellen reagiert auf eine ausreichend Bandbreite an fremde Antigene während der Anzeige minimierter Antworten auf selbst-Peptide, welche enden besiedeln die peripheren lymphatischen Organen der einzelnen2,3. Aberranten Thymocyte Auswahl des Repertoires αβTCR führt zur Autoimmunerkrankung oder immun Ungleichgewicht4 , die vor allem von Mängeln während der Prozesse des negativen oder positiven Vorläufer Auswahl bzw. abgeleitet werden.
Gerichtete Migration von Thymozyten in den Thymus ist untrennbar mit allen Phasen der T-Zell-Reifung und es ist geplant als eine Reihe von gleichzeitige oder sequentielle mehrere Reize, einschließlich Chemokine, Klebstoff, und de-Kleber extrazellulären Matrix (ECM) Protein-Interaktionen3,5. Die Studie von festen Geweben hat wiedergegeben, kritische Informationen über die Muster des Ausdrucks für Thymocyte wandernden Cues in definierten zebrafischembryonen Mikroumgebungen5,6, während Ex-Vivo -Studien ergab zwei weit verbreitet wandernde Verhalten der Thymozyten in zwei histologisch verschiedene Bereiche der Orgel: langsame stochastische Bewegungen im Kortex und schnelle, engen Motilität in der Medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. erhöhte wandernden Preise korrelieren mit zebrafischembryonen Positivauswahl13 und negative Auslese krabbelverhalten unterstützen die Hypothese, dass die Kinetik der Reise durch die Thymusdrüse richtig bestimmt zugeordnet ist Reifung der Thymozyten. Trotz ihrer Relevanz bleiben die Topologie des Thymocyte Stromazellen Zell-Interaktionen und die Dynamik der Thymocyte Motilität über Orgel Mikroumgebungen während der T-Zell-Reifung nicht ausreichend geregelt.
Die meisten ex Vivo -Studien durchgeführt, um Datum gehören fetalen oder reaggregate zebrafischembryonen Orgel Kulturen14,15, Gewebe-Scheiben oder intakte zebrafischembryonen Lappen Explantaten wo Thymocyte Bewegungen von zwei-Photonen-Laser-scanning visualisiert werden Mikroskopie (TPLSM)8, untersucht ein intravitalen bildgebendes Verfahren mit einem eingeschränkten Maximum Arbeitsabstand und imaging-Tiefe von 1 mm im Einklang mit dem Gewebe16. Im Gegensatz zu den mühsamen zebrafischembryonen Orgel Kulturen die längere Inkubationszeiten zu 3D-Strukturen abhängen, vorab mit der Bezeichnung zebrafischembryonen Slice-Technik sowohl die intakte zebrafischembryonen Lappen Ansatz Genehmigung kontrolliert Einführung von bestimmten Teilmengen von Thymozyten in einer nativen Gewebe Architektur Umgebung. Jedoch fehlt da Blutfluss ist in diesen Modellen sind sie für das Studium des Recruiting-Prozesses der Thymus Ansiedlung Stammväter (FDA), Thymus Parenchym oder die Dynamik von zebrafischembryonen heraustreten von Reifen T-Zellen deutlich begrenzt.
In-Vivo -Modelle für das Studium der zebrafischembryonen T-Zell-Reifung-Physiologie in den Mäusen gehören die Transplantate Fragmente oder ganze Organ Lappen gelegt, entweder innerhalb der Niere Kapsel17 oder mikrodialysemembranen18. Obwohl sich diese Optionen ihre Nützlichkeit, systemische funktionale Engraftment des Gewebes zu befragen, schränkt die Position des zebrafischembryonen Transplantate tief in das Tier oder durch undurchsichtige Gewebeschichten ihre Verwendung zur in-Vivo -Untersuchung von Implantaten durch TPLSM.
Die Vorderkammer des Auges bietet eine leicht zugängliche Raum zur direkten Überwachung der transplantierten Gewebe aufgrund der Transparenz der Hornhaut Schichten. Von Vorteil ist die Basis der Kammer durch die Iris gebildet reich an Blutgefäßen und autonomen Nervenendigungen, ermöglicht rasche Revaskularisation und Reinnervation der Transplantate19,20. Dr. Caicedo wurde erfolgreich diesen anatomischen Raum für die Wartung und Längsschnittstudie des Pankreas Inseln in den letzten21verwendet. Hier zeigen wir, dass diese Strategie nicht nur einen gültigen Ansatz ist um Thymozyten Dynamik innerhalb der nativen Orgel-Struktur zu studieren, sondern auch eindeutig erlaubt, um die in Vivo längs Aufnahmen zum Studium der Stammvater Rekrutierung zu erweitern und Reife T-Zell-heraustreten Schritte bei der Maus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Miami genehmigt die Experimente nach IACUC Richtlinien.
1. Isolierung und Trimmen des Neugeborenen Thymi
- Bereiten Sie alle Reagenzien und Instrumente durch Autoklavieren oder andere Methoden, sterile Bedingungen zu gewährleisten.
- Um Verunreinigungen zu minimieren, führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter einem Laminar-Flow-Haube.
- Füllen Sie vor euthanizing Spender Mäuse einen sterile 60 Millimeter-Teller mit sterilen prechilled 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und auf Eis. Es wird zum Spülen und speichern die ausgeschnittenen Thymi von Spender-Mäuse vor der Transplantation verwendet werden.
- Fahren Sie mit Neugeborenen Spender Mäuse durch Enthauptung, im Einklang mit ethischen Richtlinien einschläfern.
- Platzieren Sie den Mauszeiger auf sterile saugfähiges Küchenpapier in einen dorsalen aufrecht und Spray, und später wischen Sie, die Maus Bauch mit 70 % Ethanol.
- Aussetzen der Brusthöhle durch eine oberflächliche v-förmigen Einschnitt auf der Ebene des Unterleibs und schneiden Sie die Haut mit einem Paar von gerade 10 cm präparierscheren nach einer ventralen Mittellinie lassen Sie eine Öffnung von ca. 0,5-1 cm auf der Brust-Ebene. Falten Sie die Haut auf jeder Seite der Brust, der Brusthöhle verfügbar zu machen.
- Machen zwei tiefer 0,5-1 cm seitliche Einschnitte durch das Zwerchfell und Brustkorb mit der gleichen Art der Schere auf die überlegene Mediastinum in der vorderen Brusthöhle zugreifen. Der Thymus sollte als zwei blasse Lappen direkt über dem Herzen erscheinen.
- Legen Sie die gebogene Pinzetten unter dem Thymus und ziehen vertikal um die komplette Orgel zu extrahieren. Verhindern Sie die Foldback des Brustkorbs mit ein paar Zangen. Wenn nötig, feine Pinzette verwenden, um das Bindegewebe rund um die Orgel ohne Unterbrechung die Kapsel vor dem Extrahieren der Orgel sorgfältig auseinander zu reißen.
Hinweis: Dieser Schritt ist durch die Verwendung eines sezierenden Bereichs erleichtert. - Tauchen Sie die isolierten Thymus in kalten sterilen 1 X PBS (pH 7,4) zuvor in eine sterile Schale 60 mm angezeigt, und die verbindende Landenge mit einem Skalpell schneiden die zebrafischembryonen Lappen zu trennen. Entfernen Sie jeglichen Schmutz aus der Schale ohne Schädigung der Kapsel. Zur Minimierung der Zeit Thymi ausgesetzt sind, schneiden Sie Thymian Lappen vor dem Implantat.
Hinweis: Jede isolierte Neugeborenen Thymus in der Regel sechs Segmente von ca. 1 mm breit für ein Maximum von drei Mäusen, Host rendert beim Empfang Implantate in beiden Augen. - Wiederholen Sie die Schritte 1.4-1.9 für jede Spender-Maus. Zur Minimierung der Zeit Thymi ausgesetzt sind, isolieren Sie eine Thymus zu einem Zeitpunkt.
(2) Thymus Implantation in die Vorderkammer des Auges
- Taggen Sie vor der Transplantation und wiegen Sie jeder Empfänger Maus.
- Verwenden Sie eine Dosis zwischen 1-2 % des Isofluorane Dämpfe um die Empfänger Maus zu betäuben. Richtige Anesthetization durch das Fehlen von reflex folgende Zehe Prise vor dem chirurgischen Eingriff zu gewährleisten.
- Mit Thymus-Segmente-Transplantation wie folgt vorgehen:
- Platzieren Sie den Mauszeiger in eine seitliche Liegerad Seitenlage, dass ein Auge nach oben direkt auf die Linse des Bereichs sezierenden ausgesetzt.
- Verbrauchssteuern eines isolierten zebrafischembryonen Lappen liegen mit der kalten 1 X PBS-Puffer (pH 7,4)-60 Millimeter-Teller in Stücke mit bis zu 1 mm Breite für Implantat gefüllt. Folgen Sie einem Zick-Zack-Muster um sicherzustellen, dass jedes Segment zebrafischembryonen Cortex und Medulla enthält. Verwenden Sie Vannas Schere zum Zuschneiden nach Richtlinien in Figur 1A.
Hinweis: Trimmen des Thymus sollte vor Implantat Gewebe Engraftment Optimierung erfolgen. - Beginnend in der Basis der Hornhaut, der OP-Bereich entspricht, stellen Sie eine 40 mm G18 Nadelspitze einen kleinen Schnitt in externen Hornhaut Schichten, so dass die sezierenden Schere Tipp eingeführt werden kann.
- Machen Sie eine 5-10 mm Einschnitt direkt um die Basis der Hornhaut mit Vannas Schere halten Sie die Hornhaut Öffnung fest um zu verhindern Wiederverschließen flankieren. Verwenden Sie Zange mit flachen enden, um Gewebeschäden zu vermeiden.
- Fassen Sie die geschnittenen Hornhaut-Epithel und setzen Sie die Öffnung durch die Hornhaut mit einem Paar der Wohnung beendet Zange halten, während ein zebrafischembryonen Segment durch die Öffnung schieben. Befeuchten Sie das Auge mit sterilen 1 x PBS (pH 7,4) oder künstliche Tränen Bedarf Gewebe Austrocknung zu verhindern, bis die Bearbeitung abgeschlossen ist.
- Drücken Sie sanft auf die Augenoberfläche gleiten Segment eingeführten Gewebe zu einer seitlichen Position in Bezug auf die Pupille zu Archiv-Funktion zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Transplantat an einem Standort gegenüber dem Auge öffnenden hinteren Störungen mit Bildgebung durch Trübung liegt.
- Mit Hilfe der flachen Zange, drücken Sie fest, für ca. 3-5 s, die beiden Seiten der Hornhaut Eröffnung gegeneinander selbstdichtend zu fördern. Die Operation erfordert kein Heften oder nähen.
- Wenn die Transplantate an beiden Augen durchgeführt werden, schalten Sie die Maus über die seitlichen Gegenseite direkt aussetzen des zweiten Auges zu sezierenden Mikroskop-Objektiv und wiederholen die Schritte 2.3.2-2.3.7.
- Nachdem die Operation abgeschlossen ist, zurück die Maus auf einen leeren Käfig mit einer Wärmelampe vorgewärmt.
- Stellen Sie sicher, dass jeder transplantierte Maus komplette Mobilität und Bewusstsein wiedererlangt, bevor sie in einen Käfig geteilt mit anderen Tieren platziert. Dies erfolgt in der Regel innerhalb von 1 h nach der Operation.
- Nach Transplantation behandeln Sie die Mäuse mit Schmerzmitteln zu, je nach Bedarf und liefern Sie die Mäuse mit Paracetamol in einer Konzentration von 1,6 mg/mL im Trinkwasser.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,9 für jede Empfänger Maus.
- Monitor postoperative tierische Aktivität sowie das Erscheinungsbild der implantierten Augen, potenzielle gesundheitliche Komplikationen zu erkennen.
(3) Confocal Imaging implantiert Thymi mit 3D Single Photon konfokale Fluoreszenzmikroskopie
- Die Empfänger Maus mit einer Dosis zwischen 1-2 % des Isofluorane Dämpfe zu betäuben. Richtige Anesthetization durch das Fehlen von reflex folgende Zehe Prise vor Beginn der bildgebenden Verfahrens zu gewährleisten
- Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine fest installierte Bühne-Mikroskop-Plattform in einem seitlichen Liegerad Seitenlage, dass ein Auge nach oben. Ein Wärmekissen befindet sich auf der Mikroskop-Plattform um konstante Körpertemperatur von Mäusen während der Aufnahmen zu gewährleisten.
Hinweis: Weitere Informationen ergänzende Abbildung1 . - Stecken Sie den Kopf der Maus in einer stereotaktischen Headholder und passen Sie den Regler, um die Maus-Kopf auf der lateralen Seitenlage erlaubt Direktzugriff auf das Mikroskopobjektiv für das Auge hält der Thymus-Transplantats zurückhalten.
- Setzen Sie die Maus-Schnauze in eine Gasmaske, das Tier während des gesamten Verfahrens betäubt zu halten. Dies ermöglicht die Anpassung der Isofluorane Dämpfe nach Bedarf.
- Um die Stabilisierung des Auges bei Aufnahmen unter Vermeidung der Retraktion der Augenlider zu erleichtern, nach hinten ziehen die Augenlider halten Sie das Auge auf die Hornhaut-Marge mit einer Pinzette, die haben ihre Spitzen bedeckt von einem Polyethylen-Rohr die beigefügt sind eine UST-2 feste Kreuzgelenk. Diese Anordnung ermöglicht eine stabile Fixierung des Kopfes und des Auges und Flexibilität ohne Unterbrechung des Blutflusses im Auge, wie zuvor beschrieben22.
Hinweis: Zusätzliche Figuren 1 b, C zeigen die Komplettmontage. - Fügen Sie einige Tropfen der sterilen Kochsalzlösung oder künstliche Tränen wie die Immersion Flüssigkeit zwischen die Hornhaut und die Linse vor dem Inverkehrbringen der Maus Auge das Mikroskopobjektiv.
Hinweis: zusätzliche Tropfen entfallen auf Notwendigkeit während des Verfahrens zu den Mikroskop Weg und verhindern, dass Auge trocknen. - Zuerst verwenden Sie geringer Vergrößerung (5 X) Objektiv, um Thymus im Mikroskop-Bereich zu finden. Wechseln Sie dann zu höheren Auflösung (10, 20 und 40 X) Eintauchen in Wasser eintauchen Ziele mit langem Arbeitsabstand. Vermeiden Sie LSM lichtbedingten und Bleichen von zebrafischembryonen Implantat durch die Anwendung minimal Laserleistung und reduzieren Sie Scan-Zeit so weit wie möglich. Dies wird erreicht durch die Verwendung des resonanten Scanners des Mikroskops.
Hinweis: Die confocal Mikroskop verwenden wir ist mit resonanten Scan Spiegel in der Lage, Sammeln von Bildern bei 25 Frames/s ausgestattet. Andere Marken haben ihre eigenen Mikroskope mit resonanten Scanner. - Wählen Sie den Kauf-Modus mit der Mikroskop-Software und starten Sie die resonante Scanner-Modus zu. Dann wählen Sie den XYZT-imaging-Modus und konfigurieren Sie die Übernahme Einstellungen wie folgt:
- Den Argon-Laser einschalten und Einstellen der Leistung um 30 % für Fluoreszenzanregung.
- Wählen Sie eine Laserlinie Erregung und den Akusto-optischen Beam Splitter (AOBS) Regler für verschiedene Emission Wellenlängen. Zusätzlich zur Erkennung Backscatter und Gewebestruktur abzugrenzen, verwenden Sie Reflexion Erkennung gleichzeitig.
Hinweis: Wenn Sie eine Reihe von Farben zur Anregung (GFP und RFP) auswählen, ist die AOBS automatisch programmiert leiten diese Erregung Linien auf die Probe und die Emission zwischen ihnen übertragen. Zum Beispiel für GLP und RFP, verwenden wir schmale Reflexion Bänder für Anregungslicht rund 488 nm und 561 nm, beziehungsweise. Dadurch Breite Bändern für die Sammlung von Fluoreszenz emittierten Photonen, wodurch die Notwendigkeit für Laser macht und Erwerb. Im reflektionsmodus dient der AOBS als ein 50/50 Strahlteiler reflektiertes Licht in jede Wellenlänge vom für Fluoreszenz-Emission-Erkennung verwendet Image. - Sammeln die Emission bei ausgewählten Wellenlänge, dann wählen Sie eine Auflösung von 512 × 512 Pixel und starten live imaging durch Drücken der Schaltfläche " Live ", das Gewinn-Niveau anpassen, je nach Bedarf (typische Gewinn beträgt rund 600 V).
- Definieren Sie Beginn und Ende der Z-Stapel durch die Konzentration auf die Oberseite der zebrafischembryonen Implantats zu und wählen Sie beginnen, dann verschieben Sie zur letzten Ebene, die im implantierten Thymus konzentriert werden und wählen Sie Ende. Verwenden einer Z-Schrittweite von 5 µm. Die Software berechnet automatisch die Anzahl der konfokalen Flugzeuge.
- Wählen Sie das Zeitintervall für den Erwerb von jedem Z-Stapel (in der Regel 1,5 bis 2 Sekunden) und wählen Sie die Option bis zum Stillstand gekommen zu erwerben , für die kontinuierliche Bildgebung.
- Drücken Sie die Starttaste zu initialisieren .
- Bild der Grafts wiederholt zu verschiedenen Zeitpunkten aus dem gleichen Tier durch Wiederholen der Schritte 3.1-3.9.
Hinweis: Wenn das Tier Transplantate an beiden Augen hält, können durch Wiederholung der Schritte 3.2-3.9 nach dem Einschalten der aufrechten Position Seite der Maus Aufnahmen aus beiden Augen genommen werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thymus von Neugeborenen Mäusen wurden isoliert von B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas Mäuse wie in diesem Protokoll (Schritte 1.1-1.9) beschrieben. In diesen transgenen Mäusen leitet Huhn Beta-Actin Promotor den Ausdruck der roten fluoreszierenden Proteins Variante DsRed. MST unter dem Einfluss von unmittelbaren frühen Enhancer Cytomegalovirus (CMV) Erleichterung der Verfolgung von Implantaten.
Zu verhindern Gewebe Ablehnung, isogenen Einzelpersonen mit Genotyp: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J als Gastgeber ausgewählt wurden. In diesen transgenen Mäusen leitet der menschlichen Ubiquitin C Promoter den Ausdruck der erweiterten grün fluoreszierendes Protein (GFP) in allen Geweben ermöglicht eine klare Differenzierung zwischen Empfänger und Spender Gewebe. Die Aktion des Veranstalters menschlichen Ubiquitin C führt zu differenziellen GFP Expressionsmuster in bestimmten hämatopoetischen Zelltypen. Vor allem T-Zellen präsentieren eine 2-fold höhere GFP Expression Ebenen als CD19+B220+ B Zellen oder anderen peripheren Blutzellen, die ihre Identifikation durch quantitative sensible Techniken, wie z. B. erleichtern können flow Cytometry, ohne Bedarf für zusätzliche Kennzeichnung. Darüber hinaus fluoreszierende Ausdruck in diesen Mäusen beobachtet bei erwachsenen Tieren, sowie in allen embryonalen Stadien und ist einheitlich innerhalb einer Zelle Typ Linie Marker Stabilität zu gewähren.
Das Muster für Thymus trimmen, dargestellt in Abbildung 1A folgt früheren Beschreibungen der funktionalen Thymus-Fragmente in der Niere Capsula23implantiert. Diese Fräsvorgang ermöglicht eine Verringerung des Gesamtvolumens des Gewebes unter Beibehaltung der histologischen grundlegenden Funktionseinheiten des Organs (Kortex, Medulla und Cortico-medullären Kreuzung (CMJ) Blutgefäße) implantiert werden. Der bemerkenswerte Unterschied in der Größe zwischen Neugeborenen Thymus (Abbildung 1A, Links) und Thymus von eins - Wochen alten Mäusen (Abbildung 1A, rechts) sollte zum Trimmen, berücksichtigt werden wie die Platzverhältnisse passen in die Vorderkammer der Maus Implantate Auge ist eingeschränkt. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind die Implantate von Neugeborenen nur erhalten. Abbildung 1 b zeigt eine makroskopische Bild eines zebrafischembryonen Segments implantiert in der Vorderkammer GFP Maus Auge, untergebracht um tierische Vision zu bewahren. Histologische Einzelheiten des Implantats in Bezug auf die Hornhaut (GFP Gewebe neben RFP Implantat) können in der 3D-Rekonstruktion der konfokalen Bilder in ergänzenden Video 1beobachtet werden. Das Engraftment, die Iris ist in Video 1 und Abbildung 2gezeigt.
Abbildung 1 und 1D bzw. veranschaulichen Hellfeld und Fluoreszenzbilder des gleichen Gebietes dienen für eine Doppel-makroskopische follow-up der Gewebewachstum und Involution in Fortsetzung Studien. Abbildung 1 zeigt auch die Vaskularisierung des implantierten Gewebes eindeutig ermöglichen soll, für das Studium Thymus Physiologie Orgel Blutversorgung entlang Zeit abhängig.
Die Vaskularisierung der eingefügten zebrafischembryonen Fragmente innerhalb 72h nach der Implantation aufgetreten. Die schnelle Vaskularisierung erfolgt in guter Übereinstimmung mit der großen Menge der Blutgefäße in der Iris und der Reichtum des Thymus in Produktion von Zytokinen gefunden. Diese Eigenschaften ermöglichen schnelle Engraftment des eingefügten Thymi. Die Vaskularisierung von Implantaten ist daher, in Video 2zeigt das Engraftment zebrafischembryonen Blutgefäße mit den Iris´ des Hosts individuelle (GFP Gewebe neben RFP Implantat), illustriert bestätigt, dass das hier vorgestellte Modell in der Tat ermöglicht Nichtinvasive kontinuierliche Monitorization von vaskularisierte Thymus auf mikroskopischer Ebene. Die Verwendung von LSM, endogene Thymus oder Thymus, die zuvor in verschiedenen anatomischen stellen eingepflanzt zu visualisieren ist durch Gewebe Deckkraft und Gewebe Stärke von mehr als 1 mm beschränkt. Die Vorderkammer des Auges gilt als ein "Fenster" für den Organismus, die Beobachtung des implantierten Gewebes auf mikroskopischer Ebene zu erleichtern.
Hier wird es gezeigt, dass das Modell, entwickelt von unserer Fraktion ermöglicht die Visualisierung der Seelenwanderung der Zellen aus dem Blut Torrent (Video 2) in den implantierten Thymus (vermutlich Vorfahren); für das Tracking der Kontakte der GFP Vorläuferzellen eingehende in das zebrafischembryonen Implantat mit epitheliale und Stromale zebrafischembryonen Bewohner Zellen (RFP bezeichnet), während der Differenzierung und Auswahl Prozesse (Videos 3 und 4) sowie für den Ausstieg (vermutlich Reifen T-Zellen) Zellen in den Blutgefäßen (Video-5).
Der Ansatz, den wir, so beschreiben stellt der "Beweis des Prinzips", basierend auf Aufnahmen zwischen 72 Stunden und einen Monat nach der Implantation von sechs Personen, die mit den Segmenten von drei unabhängigen Neugeborenen Spendern transplantiert, für ein Tier zu modellieren in Vivo Echtzeit-Tracking der Thymocyte Reifung in einem vaskularisierte zebrafischembryonen Fragment durch nicht-invasive Verfahren mit der Zeit ermöglicht und so das Protokoll möglicherweise weitere Verfeinerungen. Dieses Modell könnte weiter ausgearbeitet und die Nutzung transgener Tiere beherbergen beschrifteten Thymocyte molekulare Marker, z. B. als fluoreszierende Fusion Produkten, ermöglicht so eine direkten Visualisierung der T-Zell-Reifung-Zwischenprodukte. Das System kann helfen, Kontroversen zu lösen und Antworten, Incognitas Thymocyte Differenzierung und Auswahl Veranstaltungen unter anderem verbunden.
Abbildung 1: Strukturierendes Spender Neugeborenen zebrafischembryonen Lappen und Transplantation in die Vorderkammer des Auges Mäuse. (A) Neugeborenen (links) und eine Woche nach der Geburt (rechts) Thymi Bilder. Dash Linien auf Neugeborene Thymus stehen Anleitungen zur Abschnitte Vorbereitung der Transplantation in die vorderen Auge Kammer von Mäusen, die maximale Anzahl von Transplantationen von einem Spender zu schätzen. (B) repräsentative Darstellung neu implantiert Thymus. (C) repräsentatives Bild der gepfropft, durchblutet Thymus 2 Wochen nach der Implantation. (D) fluoreszenzbild Thymus-Transplantation auf (C) gezeigt. Maßstabsleiste wird (1 mm) angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Konfokale Bild zeigt die Details der Thymus-Segment (rot) Engraftment in der Iris (grün). Bild zu erhalten, mit einem Mikroskop, mit folgenden Einstellungen: 488 und 561 nm Anregung/500 und 575 nm Emission Wellenlängen, Auflösung von 512 x 512 Pixel und 40 X Objektiv mit langem Arbeitsabstand eintauchen. Maßstabsleiste wird (40 µm) angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung 1. Setup für die konfokale Darstellung von zebrafischembryonen Transplantat mit 3D Einzelphotonen Fluoreszenz laser konfokalen Mikroskopie. (A) Heatpad, stereotaktischen Headholder und Gasmaske Details. (B) richten Sie die Maus mit der Thymus-Transplantation für LSM. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Video 1. In-Vivo Bildgebung des Thymus-Implantate in der Vorderkammer des Auges Maus. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 2. Rekrutierung von vermutlich Thymus Ansiedlung Stammväter (TSP) aus dem Blutstrom (GFP) in das zebrafischembryonen Parenchym (RFP). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 3. Stochastische Bewegung der Thymozyten (frühe zebrafischembryonen Vorfahren oder ETPs) in der Hirnrinde. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 4. Wechselwirkung der Thymozyten (GFP) mit zebrafischembryonen Stromazellen Zellen (RFP) cTECs (kortikale zebrafischembryonen Epithelzellen) oder mTECs (medulläre zebrafischembryonen Epithelzellen). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 5. Real-Time Egress Darstellung der möglichen Reifen T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Ergänzende Video 1. 3D -in-Vivo Bildgebung des Thymus-Implantate in der Vorderkammer des Auges Maus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aufgrund der Bedeutung der T-Zell-Reifung für individuelle immun-Kompetenz4 und die mutmaßlichen Auswirkungen der Vorläufer Zelldynamik auf Reifen T-Zellen produziert die Thymusdrüse2,3wurden umfangreiche Bemühungen investiert Alternativen zu den klassischen fixierte Gewebe Snapshot Ansatz zu entwickeln.
Obwohl Gewebe Scheiben und andere Explantaten deutlich überlegen bei der Reproduktion Gewebearchitektur als Monolagen oder aggregierte zebrafischembryonen Orgel Kulturen14,15, das Fehlen von einem Anschluss an das Gefäßsystem schränkt ihre Verwendung zu studieren die Schritte für die Einreise oder TSP (Translokation der Vorfahren über Blutgefäße Endothelzellen Barriere) und Ausgang (Translokation von Reifen T-Zellen durch Blutgefäß Endothelzellen Schranke) der Orgel. Wie es vermutet wird, dass die Dynamik der T-Zelle mit anderen Zellen in Berührung, einschließlich zebrafischembryonen Stromazellen Zellen und ihre Motilität über Mikroumgebungen innerhalb der Cortex und die Medulla zu bestimmen, deren Differenzierung-Status und den Prozess der Teilgesamtheit Auswahl (positiv und negativ)2,3,4,5, und da diese Prozesse von TSP und Reife T-Zell-Egress-Ereignisse abhängen können, ein Modell, das den Anschluss an die einzelne Blutfluss System wäre wünschenswert.
Intrakutane und Niere Kapsel Implantate des Thymus ermöglichen dieses Upgrade17,18. Jedoch bilden sie invasive Methoden mit auferlegten Beschränkungen zur Bildgebung von TPLSM durch die Tiefe Position des Implantats innerhalb des Körpers oder das Vorhandensein von opaken Schichten des Gewebes oberhalb der Prothese. Die Anpassung der Maus vorderen Auge Kammer, früher als ein "Fenster"21,22 längs der Leistungsüberwachung von verschiedenen Geweben, wie eine Website T-Zellen innerhalb eines vaskularisierte Thymus verfolgen mehrere Vorteile bietet im Vergleich zu anderen Transplantation Strategien. Auf der einen Seite ist die Operation einfacher, da keine Nähte erforderlich, führt zu schneller Erholung der Wirtstiere sind. Auf der anderen Seite erfordert die Beobachtung von Implantaten keine weitere Operation, wie es für Niere Kapsel Implantate geschieht, zulassend wiederholte Aufnahmen vom selben Tier. Darüber hinaus ermöglichen die anatomischen Besonderheiten des Auges leicht regulatorischen Eingänge auf den implantierten Gewebe nicht nur systemisch, sondern auch lokal zu modulieren. Wie zuvor beschrieben, mit diesem Ansatz können Substanzen topisch angewendet auf das Auge oder in der vorderen Auge Kammer eingespritzt. Stellt auch eine einfache Möglichkeit zur Einführung von Substanzen oder Zellen direkt in den Thymus (i.e., Vorfahren oder Reifung Zwischenprodukte ex Vivo beschriftet und adoptively übertragen), das ist traditionell ein sehr komplexes Verfahren aufgrund der Thymus anatomischen Lage24,25. Darüber hinaus erlaubt die Perfusion der Vorderkammer den Austausch von das Kammerwasser oder das Laden des Transplantats durch Diffusion mit fluoreszierenden Indikatoren, wie zuvor bei anderen Implantaten26gezeigt.
Der Ansatz, der treuer die Untersuchung der Thymus Physiologie ermöglicht bietet der intravitalen Bildgebung von transgenen Medaka Fisch eindringmittel beschrifteten Lymphozyten Marker zum Ausdruck zu bringen. Die Transparenz der Medaka während der Entwicklung und lebenslang in viele Stämme Medaka macht dieses Organismus vorteilhaft für die Überwachung der zelluläre Dynamik in Vivo21. Die geringe Zahl von bewegliche Thymozyten beobachtet Medaka (29 %)18 in Bezug auf Mouse´s (95 %)13, neben den Unterschieden in Motilität Preise zwischen diesen zwei Organismen, jedoch legt nahe, dass die kalte Blut kleinste Wirbeltier mit einer Adaptive Immunsystem möglicherweise an bestimmte mechanistische Kinetik der höhere vertebrate T-Zell-Reifung-Veranstaltungen enthüllt beschränkt.
Eine Einschränkung der Verwendung von der Vorderkammer des Auges Maus als Standort Thymus-Transplantation ist Raum Einschränkung. Langzeit-Studien könnte daher gefährdet werden, besonders für Neugeborene oder embryonalen Gewebe mit erweiterten Wachstumspotenzial. In diesem Sinne müssen wir feststellen, dass obwohl Neugeborene Implantate präsentiert mit scheinbaren Gewebe-Expansion nach der ersten Woche nach der Implantation in den Augen der Maus (Daten nicht gezeigt), die Erweiterung nicht die Integrität des Auges bis zu gefährden schien zwei Monate Post-Implantat. Dennoch sollte es von Interesse zu bewerten sein, ob die Gewebe-Umgebung des Implantats (Auge Kammer, Niere Kapsel oder Lederhaut) Implant´s Wachstum beeinflusst und/oder Vaskularisierung bevor die Angemessenheit des Ansatzes für hergestellt werden kann definiert Anwendungen.
Der große Schnitt erforderlich, damit sich der Durchgang des zebrafischembryonen Fragments der vorderen Auge Kammer gelegentlich zu einigen führt auf der Hornhaut Trübung auf dieser Ebene (Daten nicht gezeigt), am ehesten im Zusammenhang mit gewissen Fibrose, die für den Heilungsprozess verbunden. Aufmerksamkeit ist gefordert, auf 2.3.6 Schritt des Protokolls um sicherzustellen, dass das hazing tritt minimal mit den nachgeschalteten bildgebenden Schritten stören wird. Der Schnitt auf eine seitliche Ebene durchgeführt wird, sollte das Implantat weder die Trübung Tiere Anblick Leistung erheblich beeinträchtigen.
Die Notwendigkeit zum Trimmen der Gewebe um die Thymusdrüse in der Auge-Kammer passen zu machen scheint ein Nachteil sein, wenn im Vergleich zu anderen anatomischen Websites, die keine Änderung der anatomischen Integritätdes der Orgel. Dennoch hat die Niere Kapsel Ansatz gezeigt, dass die Fragmente des Thymus mit Cortex und Medulla erzielten ähnliche Dissektion Richtlinien wie in Abbildung 1, voll funktionsfähig zu werden, wie sie T-Zelle rekonstruieren kann vermittelte Immunität immungeschwächte thymeless Gastgeber18. Dies spricht für intakte funktionale Merkmale dieser Art von Thymus-Segmente. Auch das Protokoll beschrieben hier betont, die dass die isolierte Thymus in Kälte (Schritt 1.9) gehalten werden muss und erst Recht vor dem Implantat (Schritt 2.3.2), an der Optimierung von Gewebe Engraftment kalten Ischämie und Gewebe minimieren getrimmt.
Eine weitere mögliche Einschränkung des Ansatzes liegt in der Zusammensetzung Unterschiede zwischen das Kammerwasser in die Vorderkammer des Auges und Blutplasma, Thema, das muss beachtet werden beim Dolmetschen Beobachtungen an diesem anatomischen Ort . Frühere Studien mit anderen Geweben haben keine offensichtlichen Auswirkungen auf die normale Organfunktion durch die lokalen Auge Umwelt22jedoch nicht gemeldet. Obwohl die Erfahrung mit dem hier vorgestellten Modell auf wenige Personen beschränkt ist (N = 6 und N = 3 für Empfänger und Spender, beziehungsweise) derzeit beobachteten wir keine großen Veränderungen zur Seite bei zebrafischembryonen Implantaten in einem Implantat verbunden die Personen entweder.
Die hier vorgestellten Protokoll bildet ein Proof-of-Prinzip für die Studie der intravitalen längs Bildgebung der Thymocyte Dynamik durch Implantation von zebrafischembryonen Gewebe in der Vorderkammer des Auges Maus. Durch die Auswahl der immunkompetenten Empfänger erlaubte das System nicht die systemische Funktion des Transplantats in Frage zu stellen. Zukünftige Studien können auf diesem Ansatz durch die Wahl verschiedener Spender oder Empfänger und/oder durch die Gastgeber, Bestrahlung und Knochenmarktransplantation (BM) nach bestimmten Studiendesigns zu unterwerfen bauen. Zum Beispiel die Wahl des SCID (Severe Combined Immunodeficiency) Mäuse als Empfänger entfällt die Einmischung der körpereigenen T-Zellen, und die Wahl der transgenen Mäusen Spender (zebrafischembryonen Implantat und/oder BM) präsentiert T-Zell-Marker, DC-Marker, zebrafischembryonen Stromazellen Zelle-Marker, etc.., einzeln oder in Kombinationen sollte direkt in Vivo Verfolgung von zellulären Subpopulationen ermöglichen. Alternativ könnte Subpopulationen von Zellen in der vorderen Auge Kammer von Mäusen verfolgt werden, wie zuvor beschrieben, durch in-Vivo Fluoreszenz Cytolabeling26.
Ein großer Vorteil des hier vorgestellten Modells ist, dass es für das Studium Vorläuferzellen und Reife T-Zellen Translokation von und zu den Blutgefäßen ermöglicht. Somit sollte es um festzustellen, ob die schnell erworbene Vaskularisierung des Thymus nach implantiert in der vorderen Auge Kammer das endogene Gefäßsystem rekapituliert relevant sein. Zu Gunsten dieser Möglichkeit sollte erwähnt werden, dass der Neovaskularisation in der vorderen Maus Kammer scheint durch die Transplantat-18,-20 nicht durch den Empfänger und somit die Anbindung an das Gefäßsystem Iris diktiert werden sollte die Integrität des endogenen Thymus medullären Cortico Kreuzung (CMJ) Domäne bewahren.
Ein weiterer Vorteil stammt aus der Tatsache, dass das System die Auswertung von zwei unabhängigen Implantaten (zwei vorderen Auge Kammern ermöglicht) auf identische individuellen Hintergrund (ein einzelner Host). Studien erfordern Kombinationen von Geweben finden es auch vorteilhaft, dieses System zu verwenden.
Wie die Thymusdrüse eine wichtige Rolle bei Autoimmun- und immun mangelhaft Pathologien spielt, könnte dieser Ansatz verwendet werden, um eine Vielzahl von möglichen Fragen anzugehen. Insbesondere sollte das System neben Intra-Orgel Bildgebung für die Progression der Thymus-Involution makroskopischen ermöglichen. Es kann auch dazu dienen, Transplantation Toleranz Ereignisse und immune Störungen im Zusammenhang mit Infektionen zu studieren. Es ist wahrscheinlich, dass die feinere Zerlegung des Mechanismen Thymocyte Reifung neue Hinweise für die Gestaltung der zusätzliche therapeutische Strategien entwickelnde T-Zellen gezielt zur Verfügung stellen wird.
Transplantation des Thymus, die Vorderkammer des Auges nimmt weniger als 45 min, einschließlich Neugeborenen Thymus Isolierung und Trimmen für jeden Host individuelle mit Implantaten in beiden Augen. In-Vivo Image Aufnahmen benötigen 1 bis 5 h, abhängig von den überwachten Funktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH-Stipendien R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) und R21ES025673 (AC) und durch die besten/2015/043-Bewilligung (Consellería de Educació, Cultura ich Esport, Generalitat Valenciana, Valencia, Spanien) (EO). Autoren danken dem SENT-Team an der Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanien und Alberto Hernandez am Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanien für ihre Hilfe mit video Dreh und Schnitt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
