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Biology

No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

doi: 10.3791/58236 Published: October 2, 2018

Summary

O objetivo do protocolo é mostrar longitudinal intravital acompanhamento em tempo real de timócitos por laser, microscopia em implantes do timo na câmara anterior do olho do rato. A transparência da córnea e vascularização do enxerto permitem gravar continuamente recrutamento de células progenitoras e egresso de células T maduro.

Abstract

O objetivo do método a ser apresentado é para mostrar, pela primeira vez, o transplante de recém-nascido thymi na câmara anterior do olho do isogénicas ratos adultos na vivo longitudinal monitoramento em tempo real da dinâmica de thymocytes´ dentro de um vascularizado segmento de timo. Após o transplante, laser, microscopia (LSM) através da córnea permite na vivo não invasiva imagens repetidas no nível celular resolução. Importante, a adiciona a maturação de células T intravital anterior modelos de imagem a possibilidade de recrutamento de células progenitoras contínua e gravações de egresso de células T maduras no mesmo animal. Vantagens adicionais do sistema são a transparência da área enxertada, permitindo monitoramento rápido macroscópico do tecido implantado, e a acessibilidade ao implante permitindo localizadas além de tratamentos sistémicos. A principal limitação, sendo o volume do tecido que se encaixa no espaço reduzido da câmara do olho que exige para o aparamento de lobo. Integridade do órgão é maximizada dissecando lobos do timo em padrões mostrados anteriormente para ser funcional para a produção de células T madura. A técnica é potencialmente adequada para interrogar um meio de clinicamente relevantes questões relacionadas com a função do Timo que incluem auto-imunidade, imunodeficiência e tolerância central; processos que permanecem mecanicamente mal definidos. A dissecação bem dos mecanismos orientadores timócitos migração, diferenciação e seleção deve levar a novas estratégias terapêuticas, visando o desenvolvimento de células T.

Introduction

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Diferenciação de células T intratímica e seleção de subpopulação de células T constituem processos-chave para o desenvolvimento e a manutenção da imunidade mediada por células de vertebrados1. Esse processo envolve uma sequência complexa de eventos firmemente organizados, incluindo o recrutamento de progenitores da corrente sanguínea, migração e proliferação celular, expressão diferencial de proteínas de membrana e morte celular programada maciça para subconjuntos seleção. O resultado é a liberação de T-células maduras reativas para um amplo espectro de antígenos estranhos ao exibir respostas minimizadas para autopeptídeos, que acabar-se colonizar os órgãos linfoides secundários do individual2,3. Seleção de timócitos aberrante do repertório αβTCR leva à doença auto-imune ou desequilíbrio imune4 que derivam principalmente de defeitos durante os processos de seleção de precursor negativo ou positivo, respectivamente.

Migração direcional de timócitos através do timo é intrínseca a todas as fases de maturação de células T e é previsto como uma série de simultânea ou sequencial a vários estímulos, incluindo quimiocinas, adesivas, e adesivo de matriz extracelular (ECM) 3,de interações proteína5. O estudo dos tecidos fixos tornou a informação crítica sobre os padrões de expressão de pistas migratórias de timócitos no microambiente tímico definidos5,6, enquanto estudos ex vivo revelou dois prevalente comportamentos migratórios de timócitos em duas áreas histologicamente distintas do órgão: lento movimentos estocásticos no córtex e motilidade rápida, confinada na medula7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. aumento taxas migratórias correlacionam com selecção positiva do Timo13 e seleção negativa é associada com o comportamento de rastreamento apoiam a hipótese de que a cinética da viagem através do Timo determina o próprio maturação dos timócitos. Apesar de sua relevância, a topologia de interações de células estromais de timócitos e a dinâmica da motilidade de timócitos em microambiente do órgão durante a maturação de células T continua mal definida.

A maioria dos ex vivo estudos realizados até à data incluem fetais ou reaggregate órgão tímico culturas14,15, fatias de tecido ou explantes lóbulo tímico intacta, onde os movimentos de timócitos são visualizados por varredura a laser de dois fotões microscopia (TPLSM)8, uma técnica de imagem intravital com um máximo restrito trabalhando a distância e profundidade de 1 mm de acordo com o tecido de imagem examinou16. Em contraste com as culturas de laborioso órgão do Timo que dependem de tempos de incubação prolongado para formar estruturas de 3D, ambos, a técnica de fatia do Timo e a introdução de autorização controlada de abordagem lóbulo tímico intacta de subconjuntos específicos de pre-rotulado timócitos em um ambiente de arquitetura do tecido nativo. No entanto, desde que o fluxo sanguíneo é ausente nestes modelos, eles são claramente limitados para estudar o processo de recrutamento de Timo resolução progenitores (TSPs) para o parênquima do timo ou a dinâmica de egression do timo de células T maduras.

Modelos in vivo para o estudo da fisiologia de maturação de células T do timo em ratos incluem os enxertos de fragmentos ou lóbulos de todo órgão colocados tanto no interior do rim cápsula17 ou18por via intradérmica. Embora essas opções mostraram sua utilidade para interrogar a enxertia funcional sistêmica do tecido, a posição dos enxertos tímicos profundamente dentro do animal ou cobertos por camadas de tecido opaco restringe seu uso para exame na vivo de implantes pela TPLSM.

Câmara anterior do olho fornece um espaço facilmente acessível para monitoramento direto de qualquer tecido enxertado em virtude da transparência das camadas da córnea. De vantagem, a base da câmara formada pela íris é rica em vasos sanguíneos e terminações nervosas autonômicas, permitindo rápida revascularização e reinervação dos enxertos19,20. Dr. Caicedo tem utilizado com sucesso este espaço anatômico para a manutenção e o estudo longitudinal de ilhotas pancreáticas nos últimos21. Aqui, nós mostramos que esta estratégia não só constitui uma abordagem válida para estudar a dinâmica dos timócitos dentro da estrutura do órgão nativo, mas também excepcionalmente permite estender o na vivo gravações longitudinais para o estudo do recrutamento de progenitor e egression de células T madura passos em mouse.

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Protocol

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O cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Miami aprovaram todos os experimentos de acordo com as diretrizes IACUC.

1. isolamento e corte de recém-nascido Thymi

  1. Prepare todos os reagentes e instrumentos por autoclavagem ou outros métodos, garantindo condições estéreis.
  2. Para minimizar as contaminações, execute todos os procedimentos cirúrgicos sob uma capa de fluxo laminar.
  3. Antes da eutanásia ratos doador, encha um prato estéril de 60 mm com estéril prechilled 1x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) e coloque-o no gelo. Ele irá ser usado para enxaguar e armazenar o thymi extirpado de ratos doador antes do transplante.
  4. Proceda à eutanásia de ratos recém-nascido doador por decapitação, em conformidade com as diretrizes éticas.
  5. Coloque o mouse sobre toalhas de papel absorvente estéril em uma posição ereta dorsal e spray e depois limpe, o abdômen de rato com etanol a 70%.
  6. Expor a cavidade torácica, tornando-se uma incisão em forma de V superficial ao nível da parte inferior do abdome e cortar a pele com um par de reta 10cm dissecando a tesoura seguindo uma linha mediana ventral para deixar uma abertura de cerca de 0,5-1 cm no nível do peito. Dobre a pele ao longo de cada lado do peito para expor a cavidade torácica.
  7. Faça dois mais profunda 0,5-1 cm incisões laterais através do diafragma e caixa torácica com o mesmo tipo de tesoura para acessar o mediastino superior na cavidade torácica anterior. O Timo deve aparecer como dois lóbulos pálidos bem acima do coração.
  8. Coloque um conjunto de pinças curvas debaixo do Timo e puxar verticalmente para extrair os órgãos completa. Evitar a foldback da caixa torácica com um par de pinças. Se necessário, use a pinça fina cuidadosamente em pedaços o tecido conjuntivo em torno do órgão sem interromper a cápsula antes de extrair o órgão.
    Nota: Este passo é facilitado por meio de um escopo de dissecação.
  9. Mergulhe o Timo isolado no frio estéril 1X PBS (pH 7,4) anteriormente exibidos em um prato de estéril de 60 mm e cortar o istmo conjuntivo com um bisturi para separar os lóbulos tímicos. Remova todos os restos do prato sem prejudicar a cápsula. Para minimizar o tempo thymi são expostos, aparar lóbulos de tomilho antes do implante.
    Nota: Cada isolado Timo recém-nascido normalmente processará seis segmentos de cerca de 1 mm de largura para um máximo de três ratos do anfitrião ao receber implantes em ambos os olhos.
  10. Repita as etapas de 1,4-1,9 para cada rato do doador. Para minimizar o tempo thymi são expostos, isole um timo de cada vez.

2. Timo implantação em Câmara Anterior do olho

  1. Antes do transplante, tag e pesar cada destinatário do mouse.
  2. Use uma dose entre 1-2% dos vapores isofluorano para anestesiar o destinatário do mouse. Assegure a adequada anesthetization pela ausência de reflexo seguinte pitada de dedo do pé antes de iniciar o procedimento cirúrgico.
  3. Prosseguir com o transplante de Timo segmentos como segue:
    1. Posicione o mouse em uma posição reclinada lateral de lado para que um olho é virado para cima exposto diretamente para a lente do escopo dissecação.
    2. Um dos lóbulos tímicos isolados mentindo na frio 1X PBS (pH 7,4) impostos especiais de consumo-encheu o prato de 60 mm em pedaços com até 1 mm de largura para implante. Seguem um padrão zig-zag para garantir que cada segmento contém tímico córtex e medula. Use tesoura vannas para o aparamento de acordo com as orientações fornecidas na figura 1A.
      Nota: A remoção do Timo deve ser feita antes do implante para otimizar a enxertia de tecido.
    3. Começando na base da córnea correspondente à área cirúrgica, introduza a ponta de uma agulha de 40mm G18 tornar-se uma pequena incisão em camadas externas córnea para que a ponta de uma tesoura a dissecação pode ser introduzida.
    4. Fazer um 5-10 mm flanco incisão diretamente ao redor da base da córnea usando tesoura vannas, mantendo a abertura da córnea firmemente para impedir que efectuou. Use pinça com as extremidades planas para evitar danos aos tecidos.
    5. Segure o epitélio corneano corte e expor a abertura mantendo a córnea com um par de pinças de cerdas chatas, enquanto empurrando um segmento do Timo através da abertura. Molhe o olho com estéril 1X PBS (pH 7,4) ou lágrimas artificiais como necessário para evitar a dessecação do tecido até a manipulação está completa.
    6. Pressione suavemente na superfície do olho para deslizar o segmento de tecido introduzido para uma posição lateral em relação ao aluno a preservar a função eye´s. Garantir que o enxerto se encontra em uma posição oposta do olho abertura para impedir a interferência posterior com imagem latente, trote.
    7. Com o auxílio de pinça plana, pressione com firmeza, para aproximadamente 3-5 s, os dois lados da abertura da córnea uns contra os outros para promover Auto-selante. A cirurgia não requer qualquer grampeamento ou costura.
  4. Se os transplantes são realizados em ambos os olhos, vire o mouse do lado lateral oposto diretamente expor o segundo olho para a lente do microscópio dissecação e repita etapas 2.3.2-2.3.7.
  5. Após a cirurgia está concluída, retorne o mouse para uma gaiola vazia pré-aquecido com uma lâmpada de calor.
  6. Certifique-se de que cada rato transplantado recupera a mobilidade completa e consciência antes de colocá-lo em uma gaiola, compartilhada com outros animais. Isto normalmente ocorre dentro de 1h após a cirurgia.
  7. Após transplante, tratar os ratos com analgésicos conforme necessário e fornecer os ratos com paracetamol em uma concentração de 1,6 mg/mL na água potável.
  8. Repita as etapas 2.2-2,9 para cada destinatário do mouse.
  9. Monitor de atividade animal no pós-operatório, bem como a aparência dos olhos implantados para detectar possíveis complicações de saúde.

3. confocal Imaging de Thymi implantado usando 3D único fóton fluorescência microscopia Confocal

  1. Anestesia o mouse destinatário usando uma dose entre 1-2% dos vapores isofluorano. Assegurar a adequada anesthetization pela ausência de reflexo seguinte pitada de dedo do pé antes de iniciar o procedimento de imagem
  2. Posicione o mouse na plataforma de microscópio palco fixo em uma posição reclinada lateral de lado para que um olho é virado para cima. Uma almofada de calor é colocada na plataforma do microscópio para assegurar a temperatura corporal constante de ratos durante as gravações.
    Nota: Consulte complementar Figura 1 para obter detalhes.
  3. Insira a cabeça do rato um headholder estereotáxica e ajuste o botão para conter a cabeça de rato em uma posição lateral lado permitindo o acesso directo do objectivo microscópio de olhos segurando o enxerto do timo.
  4. Coloque o focinho de rato em uma máscara de gás para manter o animal anestesiado durante todo o processo. Isto permite a regulagem de vapores isofluorano conforme necessário.
  5. Para facilitar a estabilização do olho durante as gravações, evitando a retração das pálpebras, puxe para trás as pálpebras, mantendo o olho à margem da córnea com um par de pinças que têm suas dicas cobertas por um tubo de polietileno, que estão ligados a um UST-2 sólida junção universal. Esta disposição permite uma fixação firme da cabeça e do olho e fornece flexibilidade sem interrupção do fluxo de sangue no olho, como descrito anteriormente,22.
    Nota: Complementar figuras 1B, C mostrar o conjunto completo.
  6. Adicione algumas gotas de lágrimas artificiais ou Salinas estéril como o líquido de imersão entre a córnea e a lente, antes de colocar o objetivo do microscópio no olho do rato.
    Nota: gotas adicionais são dispensadas na necessidade durante todo o procedimento para manter o caminho de microscópio e impedir a secagem do olho.
  7. Primeiro use lente de baixa ampliação (5x) para localizar o Timo no campo do microscópio. Em seguida, alternar para imersão de água mais alta resolução (10, 20 e 40 X) mergulhando objectivos com longa distância de trabalho. Evite LSM Fotodano e branqueamento do implante do timo, aplicando o poder do laser mínima e reduzir o tempo de digitalização tanto quanto possível. Isto é conseguido usando o scanner de ressonância do microscópio.
    Nota: O microscópio confocal que usamos é equipado com espelhos de varredura ressonantes capazes de recolher imagens em 25 frames/s. Outras marcas têm seus próprios microscópios com scanners de ressonância.
  8. Selecione o modo de aquisição, utilizando o software do microscópio e iniciar o modo de scanner ressonante. Em seguida, escolher o modo de imagem XYZT e configurar as configurações de aquisição como segue:
    1. Ligar o laser de argônio e ajustar o poder de 30% para a excitação da fluorescência.
    2. Escolha uma linha de laser de excitação e definir o controle de splitter (AOBS) feixe óptico-acústico para comprimentos de onda de emissão diferentes. Além disso, para detectar retroespalhamento e delinear a estrutura do tecido, use a detecção de reflexão simultaneamente.
      Nota: Ao selecionar um conjunto de cores para a excitação (GFP e RFP), o AOBS é automaticamente programado para direcionar estas linhas de excitação para o espécime e transmitir a emissão entre eles. Por exemplo, para as boas práticas agrícolas e RFP, usamos bandas estreitas de reflexão para luz de excitação em 488 nm e 561 nm, respectivamente. Isto deixa grandes bandas para a coleção de fótons fluorescência emitida, reduzindo assim a necessidade de tempo de poder e aquisição do laser. No modo de reflexão, o AOBS é usado como um divisor de feixe 50/50 para luz refletida em qualquer comprimento de onda longe aqueles utilizados para a detecção de emissão de fluorescência da imagem.
    3. Coletar a emissão no comprimento de onda selecionado, em seguida, selecione uma resolução de 512 × 512 pixels e começar ao vivo de imagem pressionando o botão Live , ajustando os níveis de ganho, conforme necessário (ganho típico é de cerca de 600 V).
    4. Definir o início e fim da z-pilha, centrando-se no topo do implante do Timo e selecione Iniciare, em seguida, mover para o último avião que pode ser focado no timo implantado e selecione final. Use um tamanho de passo-z de 5 µm. O software automaticamente irá calcular o número de aviões confocal.
    5. Escolher o intervalo de tempo para aquisição de cada pilha-z (normalmente 1,5 a 2 segundos) e selecione a opção de adquirir, até que parou para a imagem latente contínua.
  9. Pressione o botão Iniciar para inicializar.
  10. Imagem os enxertos repetidamente em momentos diferentes do mesmo animal, repetindo as etapas 3.1-3.9.
    Nota: Se o animal possui enxertos em ambos os olhos, gravações do olho também podem ser tomadas por repetir passos 3.2-3.9 após a mudança do lado da posição ereta da cabeça do rato.

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Representative Results

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Timo de camundongos recém-nascidos foram isoladas a partir B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas ratos, conforme descrito no presente protocolo (etapas 1,1-1,9). Nestes ratos transgénicos, o promotor do frango beta actina direciona a expressão da variante da proteína fluorescente vermelha DsRed. MST sob a influência do realçador início imediato citomegalovírus (CMV), facilitando o rastreamento dos implantes.

Para evitar rejeição de tecidos, isogénicas indivíduos com genótipo: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J foram selecionados como anfitriões. Nestes ratos transgénicos, o promotor da ubiquitina humana C direciona a expressão da proteína verde fluorescente melhorada (GFP) em todos os tecidos, permitindo uma diferenciação clara entre o tecido do receptor e do doador. A ação do promotor da ubiquitina humana C leva a padrões de expressão diferenciais GFP em certos tipos de células hematopoiéticas. Em particular, as células T apresentam uma 2 vezes maior expressão de GFP níveis que CD19+B220+ B células ou outras células do sangue periféricas que podem facilitar a sua identificação por técnicas quantitativas sensíveis tais como fluxo cytometry, sem qualquer necessidades para a rotulagem adicional. Além disso, a expressão fluorescente nestes ratos é observada em animais adultos, assim como em todos os estágios embrionários e é uniforme dentro de uma linhagem de células tipo conceder estabilidade de marcador.

O padrão para o aparamento de timo, mostrado na figura 1A segue descrições anteriores de fragmentos de Timo funcional implantados no rim capsula23. Este procedimento de remoção permite uma redução do volume total do tecido a ser implantado, preservando as unidades básicas histológicas funcionais do órgão (córtex, medula e os vasos sanguíneos de junção córtico-medular (CMJ)). A diferença notável no tamanho entre recém-nascido timo (figura 1A, à esquerda) e Timo de ratos um semana de idade (figura 1A, direita) deve ter em conta para aparar, como o espaço disponível para caber implantes na câmara anterior do mouse olho é restrito. Os resultados aqui apresentados incluem os implantes obtidos de recém-nascidos apenas. A figura 1B mostra uma imagem macroscópica de um segmento do Timo implantado na câmara anterior do olho de rato GFP, acomodado para preservar a visão do animal. Detalhes histológicos do implante em referência a córnea (tecido adjacente ao implante RFP do GFP) podem ser observados na reconstrução 3D de imagens confocal em complementar Video 1. A enxertia para a íris é mostrada no Video 1 e Figura 2.

Figura 1 e 1 D ilustram respectivamente campo brilhante e imagens de fluorescência da mesma área que possam servir para uma dupla-macroscópica o acompanhamento do crescimento do tecido e involução em estudos de continuação. A Figura 1 ilustra também a vascularização do tecido implantado que deverá permitir exclusivamente para estudar a fisiologia do Timo dependente de suprimento de sangue do órgão ao longo do tempo.

A vascularização dos fragmentos do Timo inseridos ocorreu dentro pós-implante de 72h. O processo de rápida vascularização é bom de acordo com a grande quantidade de vasos sanguíneos encontrados na íris e a riqueza do timo na produção de citocinas. Estas características permitem rápida enxertia de thymi inserido. A vascularização dos implantes é ilustrada no vídeo 2, mostrando a enxertia de vasos do Timo com a iris´ do host individual (GFP de tecido adjacente ao implante RFP), portanto, confirmando que o modelo apresentado aqui, na verdade, permite monitorização contínua não invasiva de Timo vascularizado em nível microscópico. O uso do LSM Visualizar Timo endógeno ou Timo previamente implantados em locais anatómicos diferentes é restrito pelo tecido opacidade e espessura de tecido de mais de 1 mm. Câmara anterior do olho é considerada como uma "janela" para o organismo, facilitando a observação de tecidos implantados a nível microscópico.

Aqui, é mostrado que o modelo desenvolvido pelo nosso grupo permite a visualização da transmigração das células da torrent sangue (vídeo 2) para o Timo implantado (presumivelmente progenitores); o rastreio dos contactos de células progenitoras GFP entrantes para o implante do Timo com epitelial e do estroma tímico residente células (RFP-rotulado) durante os processos de diferenciação e seleção (vídeos 3 e 4) e, também, para a saída de células (células T-presumivelmente maduras) nos vasos sanguíneos (Video 5).

A abordagem que descrevemos, portanto, representa a "prova de princípio", com base em gravações feitas entre 72 h e um mês pós-implantes de seis indivíduos transplantados com os segmentos de três doadores recém-nascidos independentes, para um animal que modelo permite na vivo seguimento tempo real de maturação de timócitos em um fragmento do Timo vascularizado por procedimentos não-invasivos ao longo do tempo, e como tal, o protocolo pode precisar ainda mais refinamentos. Este modelo poderia ser mais trabalhado para fora fazendo uso de animais transgénicos, abrigando timócitos rotulado marcadores moleculares, por exemplo, produtos de fusão como fluorescentes, permitindo assim a visualização directa de intermediários de maturação de células T. O sistema pode ajudar a resolução de controvérsias e responder incognitas ligada à seleção e diferenciação de timócitos eventos entre outros.

Figure 1
Figura 1. Corte de lóbulos tímicos recém-nascido do doador e o transplante na câmara anterior do olho de ratos. (A) recém-nascido (à esquerda) e imagens de uma semana pós-natal thymi (à direita). As linhas de traço no timo recém-nascido representam guias para preparar seções para transplante na câmara anterior do olho de ratos para estimar o número máximo de transplante de um doador. (B) imagem representativa mostrando recentemente implantado o timo. (C) a imagem representativa da enxertada, vascularizado Timo 2 semanas pós implante. (D) imagem de fluorescência de enxerto de Timo mostrado em (C). Barra de escala é mostrada (1 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Confocal imagem mostrando o detalhe da enxertia de segmento (vermelho) do timo na íris (verde). Imagem obtida com um microscópio, usando as seguintes configurações: 561 e 488 nm excitação/500 e 575 nm de emissão comprimentos de onda, 512 x 512 pixels de resolução e 40 X mergulhando objetivo com longa distância de trabalho. Barra de escala é mostrada (40 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplementary Figure 1
Complementar Figura 1. Instalação para a imagem latente confocal de enxerto do Timo usando fluorescência 3D único fóton laser microscopia confocal. (A) Heatpad, headholder estereotáxica e detalhes de máscara de gás. (B) configurar o mouse segurando o enxerto do timo para LSM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Video 1
Vídeo de 1. Na vivo por imagens do Timo implantes na câmara anterior do olho do rato. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Video 2
Vídeo 2. Recrutamento de presumível Timo progenitores (TSP) do fluxo de sangue (GFP) fixando-se no parênquima tímico (RFP). Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Video 3
Vídeo de 3. Movimento estocástico de timócitos (primeiros progenitores do timo ou PTE) no córtex. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Video 4
Vídeo 4. Interação de timócitos (GFP) com células do estroma tímicas (RFP) ou cTECs (células epiteliais tímicas corticais) ou mTECs (células epiteliais tímicas medulares). Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Video 5
Vídeo de 5. Imagens de saída em tempo real de potenciais células T maduras. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Supplementary Video
Complementar Video 1. 3Dna vivo de imagem de Timo implantes na câmara anterior do olho do rato. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

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Devido a importância do processo de maturação de células T de competência imunológica individual4 e o presumível impacto da dinâmica de célula precursora na T-células maduras, produzidas pela Timo2,3, grandes esforços foram investidos desenvolver alternativas para a abordagem de instantâneo clássico tecido fixo.

Apesar de fatias de tecido e outros explantes são claramente superiores em reproduzir a arquitetura do tecido do que monocamadas ou órgão tímico agregada culturas14,15, a ausência de uma conexão para a vasculatura limita seu uso para estudar o etapas de entrada ou TSP (translocação de progenitores através de barreira de células endoteliais dos vasos sanguíneos) e saída (translocação de células T maduras através de barreira de células endoteliais dos vasos sanguíneos) do órgão. Como é a hipótese de que a dinâmica de células T está em contacto com outras células, incluindo células do estroma tímicas e sua motilidade através de microambiente dentro do córtex e medula determinar seu status de diferenciação e o processo da subpopulação seleção (positivos e negativos)2,3,4,5, e desde que esses processos podem depender de TSP e eventos de saída de células T maduros, um modelo que inclui a conexão para o individual´s o fluxo de sangue sistema seria desejável.

Os implantes intradérmico e rim cápsula do Timo permitem esta atualização17,18. No entanto, eles constituem métodos invasivos com limitações impostas à imagem por TPLSM devido a posição profunda do implante dentro do corpo ou a presença de camadas opacas de tecido acima do enxerto. A adaptação da câmara anterior do olho de rato, anteriormente usada como uma "janela"21,22 longitudinalmente, monitorar o desempenho de vários tecidos, como um site para rastrear as células-T dentro de um timo vascularizado oferece várias vantagens contra outras estratégias de transplante. De um lado, a cirurgia é mais simples porque não suturas são necessárias, levando a recuperação mais rápida dos animais do anfitrião. Do outro lado, a observação de implantes não requer uma cirurgia adicional como acontece para os implantes da cápsula renal, permitindo gravações repetidas do mesmo animal. Além disso, as características anatômicas particulares do olho permitem modular facilmente entradas regulamentares sobre o tecido implantado não só sistemicamente mas também localmente. Como descrito anteriormente, com essa abordagem, as substâncias podem ser aplicadas topicamente no olho ou injetadas na câmara anterior do olho. Também representa uma opção fácil para introduzir substâncias ou células diretamente no timo (i. e., progenitores ou intermediários de maturação rotulado ex vivo e enviaram transferido), que tem sido tradicionalmente um procedimento altamente complexo devido o Timo local anatómico24,25. Além disso, a perfusão de câmara anterior permite a troca de humor aquoso ou carregamento do enxerto por difusão com indicadores fluorescentes, como anteriormente indicado para outro tipo de implantes26.

A abordagem que mais fielmente permite o estudo da fisiologia do timo é fornecida pela intravital imagem de peixe medaka transgênicas expressando marcadores de linfócitos fluorescente etiquetadas. A transparência do medaka durante o desenvolvimento e ao longo da vida em muitas cepas de medaka faz com que este organismo vantajoso para monitoração dinâmica celular na vivo21. O baixo número de timócitos motile observada em medaka (29%)18 em referência mouse´s (95%)13, além de diferenças nas taxas de motilidade entre estes dois organismos, no entanto, sugere que o frio sangue menor vertebrado com um sistema imune adaptativo pode ser limitado no revelando particular cinética mecanicista dos maiores eventos de maturação de células T vertebrados.

Uma limitação do uso de câmara anterior do olho do rato como o site de transplante de timo é a restrição de espaço. Estudos a longo prazo podem ser, portanto, comprometidos; particularmente para tecidos embrionários ou recém-nascido com potencial de crescimento alargada. Neste sentido, temos de dizer que, embora implantes recém-nascidos apresentados com expansão de tecido aparente após o primeira semana pós-implante no olho do rato (dados não mostrados), o alargamento não parece colocar a integridade do olho em risco até dois meses pós-implante. No entanto, deve ser de interesse para avaliar se o ambiente de tecido do implante (câmara de olho, cápsula renal ou derme) influencia o crescimento de implant´s e/ou definido de vascularização antes a adequação da abordagem pode ser estabelecida para aplicações.

A grande incisão necessária na córnea para permitir que a passagem do fragmento do timo para a câmara anterior do olho ocasionalmente leva a alguns trotes a este nível (dados não mostrados), provavelmente relacionado com certo grau de fibrose associada ao processo de cura. Atenção é exigida na etapa 2.3.6 do protocolo para garantir que se trote ocorre minimamente interferirá com as etapas a jusante de imagem. Como a incisão é feita em um nível lateral, nem o implante, nem o trote deve afetar significativamente desempenho visão de animais.

A necessidade de corte de tecido fazer o Timo caber dentro da câmara de olho parece ser uma desvantagem se comparado a outros sites anatômicos que não exigem alterando a integridade anatômica do órgão. No entanto, a abordagem da cápsula renal demonstrou que os fragmentos do Timo que contém, ambos, córtex e medula obtidos pelas diretrizes de dissecação semelhantes àqueles mostrados na Figura 1, tornam-se totalmente funcional, como eles podem reconstituir células T imunidade mediada em hospedeiros imunodeficientes de thymeless18. Este argumenta em favor de intactas características funcionais deste tipo de segmentos de timo. Também, o protocolo descrito aqui salienta que o Timo isolado deve ser mantido em frio (passo 1.9) e aparado apenas direito antes de implante (etapa 2.3.2) para minimizar a exposição fria de isquemia e o tecido no sentido de otimizar a enxertia de tecido.

Uma limitação potencial adicional da abordagem reside nas diferenças de composição entre o humor aquoso na câmara anterior do olho e o plasma sanguíneo, problema que precisa ser mantido em mente quando a interpretação de observações feitas neste local anatômico . Estudos anteriores com outros tecidos, entretanto, não relataram qualquer efeitos óbvios na função do enxerto normal pelo olho local ambiente22. Embora a experiência com o modelo apresentado aqui é restrita a alguns indivíduos (N = 6 e N = 3 para destinatários & doadores, respectivamente), actualmente, não observamos qualquer grandes alterações associadas para implante local no caso de implantes do timo em qualquer um do os indivíduos também.

O protocolo aqui apresentado constitui uma prova de princípio para o estudo de intravital imagem longitudinal da dinâmica de timócitos por implantar tecido tímico na câmara anterior do olho do rato. Devido a seleção de destinatários imunocompetentes, o sistema não permitiu questionar a função sistêmica do enxerto. Estudos futuros podem construir sobre essa abordagem, escolhendo diferentes doadores e/ou beneficiários e/ou sujeitando os anfitriões a irradiação e transplante de medula óssea (BM) de acordo com projetos de estudo particular. Por exemplo, a escolha dos ratos SCID (imunodeficiência combinada de grave) como destinatários elimina a interferência de células-T endógenas, e a escolha dos doadores ratos transgénicos (implante do Timo e/ou BM) apresentando marcadores de células T, marcadores de DC, tímicos estromais marcadores de célula, etc., individualmente ou em combinações deve permitir acompanhamento direto no vivo de subpopulações celulares. Alternativamente, subpopulações de células na câmara anterior do olho de ratos poderiam ser rastreadas, como descrito anteriormente, na vivo fluorescência cytolabeling26.

Uma das principais vantagens do modelo apresentado aqui é que ela permite estudar o progenitor e translocação de células T madura de e para os vasos sanguíneos. Assim, deve ser relevante determinar se a vascularização rapidamente adquirida do Timo após ser implantado na câmara anterior do olho recapitula a vasculatura endógena. A favor desta possibilidade, deve ser mencionado que a neovascularização na câmara anterior do mouse parece ser ditada pelo enxerto18,20 em vez do destinatário e, portanto, as conexões para a vasculatura de íris deve preservar a integridade do domínio de junção córtico-medular (CMJ) timo endógena.

Uma vantagem adicional vem do fato de que o sistema permite a avaliação de dois implantes independentes (duas câmaras anterior do olho) em fundo individual idêntico (um único host). Estudos que exigem combinações de tecidos também podem achar vantajoso usar este sistema.

Como o Timo desempenha um papel importante em patologias deficientes auto-imune e imunes, esta abordagem poderia ser usada para resolver uma miríade de questões potenciais. Em particular, o sistema deve permitir macroscópico além de imagem intraórgão para a progressão da involução do timo. Também pode servir para estudar eventos de tolerância de transplante e disfunções imunitárias relacionadas com infecções. É provável que a dissecação bem dos mecanismos que regem a maturação de timócitos irá fornecer novas pistas para a concepção de estratégias terapêuticas adicionais, visando o desenvolvimento de células T.

Transplante de timo para a câmara anterior do olho leva menos de 45 min, incluindo o isolamento de Timo neonatal e aparar para cada host individual com implantes em cada olho. Na vivo gravações de imagens exigem h 1 a 5, dependendo de recursos monitorados.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por doações de NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) e R21ES025673 (AC) e pela concessão melhor/2015/043 (Consellería de Educació, cultura eu esport, Generalitat valenciana, Valência, Espanha) (EO). Autores agradecer a equipe enviada na Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valência, Espanha e Alberto Hernandez no Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valência, Espanha, por sua ajuda com filmagem e edição de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane Kent Scientific Corp VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source Zeiss Stemi 305
Fine dissection forceps WPI 500455
Medium dissection forceps WPI 501252
Curved tip fine dissection forceps WPI 15917
Vannas scissors WPI 503371
Dissecting scissors WPI 503243
Scalpel WPI 500353
40 mm 18G needles BD 304622
Disposable transfer pipette Thermofisher 201C
Heat pad and heat lamp Kent Scientific Corp Infrarred
Ethanol 70% VWR 83,813,360
60 mm sterile dish SIGMA CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4) Thermofisher 10010023
Sterile wipes Kimberly-Clark LD004
Drugs for pain management Sigma-Aldrich A3035-1VL
Saline solution or Viscotears Novartis N/A
Stereomicroscope Leica MZ FLIII
Head-holding adapter Narishige SG-4N-S
Gas mask Narishige GM-4_S
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Laminar flow hood Telstar BIO IIA

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References

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<em>No Vivo</em> controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real
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Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).More

Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).

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