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Biology

Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real

doi: 10.3791/58236 Published: October 2, 2018

Summary

El objetivo del protocolo es mostrar longitudinal intravital seguimiento en tiempo real de los timocitos por microscopía en implantes tímicos en la cámara anterior del ojo de ratón del laser. La transparencia de la córnea y la vascularización del injerto permiten grabar continuamente reclutamiento de células progenitoras y salida de células T madura.

Abstract

El propósito del método presentado es mostrar, por primera vez, el trasplante de thymi recién en la cámara anterior del ojo de ratones adultos isogénicas para en vivo longitudinal seguimiento en tiempo real de la dinámica de thymocytes´ dentro de un vascularizado segmento de timo. Después del trasplante, láser, microscopía (LSM) a través de la córnea permite que en vivo no invasor proyección de imagen repetida a nivel celular de resolución. Lo importante es el enfoque agrega a maduración de células T intravital anterior imagen modelos la posibilidad de reclutamiento de células progenitoras continua y grabaciones de salida de células T maduras en el mismo animal. Ventajas adicionales del sistema son la transparencia de la zona injertada, permitiendo monitoreo rápido macroscópica del tejido implantado, y la accesibilidad al implante que permite localiza además de tratamientos sistémicos. La principal limitación es el volumen del tejido se ajusta en el reducido espacio de la cámara de ojo que exige para el ajuste del lóbulo. Se maximiza la integridad del órgano por disección lóbulos del timo en los patrones previamente demostrados ser funcionales para la producción de células T madura. La técnica es potencialmente adecuada para interrogar a un entorno de médicamente relevantes cuestiones relacionadas con la función del timo que incluyen autoinmunidad, inmunodeficiencia y tolerancia central; procesos que siguen siendo mecánico mal definidos. La disección fina de mecanismos rectores thymocyte migración, diferenciación y selección debe conducir a nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a células T en desarrollo.

Introduction

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Diferenciación intratímica de células T y células T subpoblación selección constituyen procesos claves para el desarrollo y mantenimiento de la inmunidad mediada por células en vertebrados1. Este proceso implica una compleja secuencia de eventos firmemente organizados incluyendo el reclutamiento de progenitores de sangre, proliferación celular y migración, expresión diferencial de proteínas de la membrana y muerte celular programada masiva para subconjuntos selección. El resultado es la liberación de células T maduras reactivas a un amplio espectro de antígenos extraños mientras se muestra minimizado las respuestas para auto-péptidos, que final-hasta colonizar los órganos linfoides periféricos de los2,3. Selección de timocitos aberrante del repertorio αβTCR conduce a enfermedades autoinmunes o desequilibrio inmune4 que derivan principalmente de defectos durante los procesos de selección de precursor positiva o negativa, respectivamente.

La migración direccional de los timocitos en el timo es intrínseca a todas las etapas de maduración de la célula de T y es concebido como una serie de simultáneas o secuenciales múltiples estímulos, como quimioquinas, adhesivo, y pegamento de la matriz extracelular (ECM) proteína las interacciones3,5. El estudio de los tejidos fijos ha prestado información crítica con respecto a los patrones de expresión para señales migratorias thymocyte en microambientes tímicos definido5,6, mientras que los estudios ex vivo ha revelado dos frecuentes comportamientos migratorios de los timocitos en dos áreas histológico del órgano: lentos movimientos estocásticos en la corteza y la movilidad rápida, confinada en la médula7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. aumento tasas migratorias correlacionan con selección positiva tímica13 y selección negativa se asocia con comportamientos rastreros apoyan la hipótesis de que la cinética de la travesía por el timo determina apropiado maduración de los timocitos. A pesar de su importancia, la topología de las interacciones de células estromales de timocitos y la dinámica de movilidad de timocitos en microambientes del órgano durante la maduración de células T siendo mal definida.

Mayoría ex vivo de los estudios realizados hasta la fecha incluyen fetales o reagregarse timo órgano culturas14,15, rebanadas de tejido o explantes lóbulo tímico intacta donde se visualizan los movimientos anti-thymocyte por escaneo láser de dos fotones microscopia (TPLSM)8, una técnica con un máximo restringido distancia y profundidad de 1 mm según el tejido de imágenes intravital examinó16. En contraste con las culturas de órgano timo laboriosa en tiempos de incubación extendido para formar estructuras de 3D, tanto la técnica de slice tímico y la introducción de permiso de control de enfoque lóbulo tímico intacto de subconjuntos particulares de la etiqueta timocitos en un entorno de arquitectura de tejido propio. Sin embargo, puesto que el flujo sanguíneo está ausente en estos modelos, están claramente limitados para estudiar el proceso de contratación de timo colocar progenitores (TSPs) el parénquima del timo o la dinámica de egression timo de células T maduras.

Modelos in vivo para el estudio de la fisiología de maduración de células T tímico en ratones son los injertos de fragmentos o lóbulos del órgano entero colocados ya sea dentro de la cápsula renal17 o por vía intradérmica18. Aunque estas opciones demostraron su utilidad para interrogar sistémico funcional engraftment del tejido, la posición de los injertos tímicos profundos dentro del animal o cubiertos por capas de tejido opaco restringe su uso en vivo examen de implantes por TPLSM.

La cámara anterior del ojo proporciona un espacio de fácil acceso para monitoreo directo de los tejidos injertados en virtud de la transparencia de las capas corneales. De ventaja, la base de la cámara formada por el iris es rica en vasos sanguíneos y las terminaciones nerviosas autonómicas, lo que permite la rápida revascularización y reinervación de los injertos19,20. Dr. Caicedo ha utilizado este espacio anatómico para el mantenimiento y el estudio longitudinal de islotes pancreáticos en los últimos21. Aquí, mostramos que esta estrategia no sólo constituye un enfoque válido para estudiar la dinámica de timocitos dentro de la estructura del órgano nativo, pero también únicamente permite extender el en vivo grabaciones longitudinales para el estudio del reclutamiento del progenitor y pasos de egression células T madurados en ratón.

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Protocol

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El cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Miami aprobaron todos los experimentos según las pautas IACUC.

1. aislamiento y corte de recién nacido Thymi

  1. Preparar todos los reactivos y los instrumentos por autoclave u otros métodos, asegurando las condiciones de esterilidad.
  2. Para minimizar la contaminación, realizar todos los procedimientos quirúrgicos bajo campana de flujo laminar.
  3. Antes euthanizing ratones donantes, llene un recipiente estéril de 60 mm con 1 prechilled estéril x solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y coloque en hielo. Se utilizará para aclarar y almacenar el thymi suprimido de los ratones del donante antes del trasplante.
  4. Proceder a la eutanasia a ratones recién nacidos de donante por decapitación, con arreglo a directrices éticas.
  5. Coloque el ratón sobre toallas de papel absorbente estéril en posición vertical dorsal y spray y limpiar más adelante, el abdomen de ratón con etanol al 70%.
  6. Exponer la cavidad torácica haciendo una incisión superficial en forma de V a nivel de abdomen inferior y cortar la piel con un par de recto 10 cm disección tijera siguiendo una línea media ventral dejar una abertura de aproximadamente 0.5-1 cm a la altura del pecho. Doblar la piel sobre cada lado del pecho para exponer la cavidad torácica.
  7. Hacer dos más 0.5-1 cm incisiones laterales a través del diafragma y caja torácica con el mismo tipo de tijeras a mediastino superior en la cavidad torácica anterior. El timo debe aparecer como dos lóbulos pálidos sobre el corazón.
  8. Lugar una serie de fórceps curvos por debajo de la timo y tirar verticalmente para extraer el órgano completo. Prevenir el foldback de la caja torácica con un par de pinzas. Si es necesario, usar pinzas finas cuidadosamente desgarrando el tejido conectivo que rodea el órgano sin interrumpir la cápsula antes de extraer el órgano.
    Nota: Este paso se facilita mediante el uso de un ámbito de disección.
  9. Sumerja el timo aislado en frío estéril de 1 x PBS (pH 7.4) previamente muestra en un recipiente estéril de 60 mm y cortar el istmo conectivo con bisturí para separar los lóbulos tímicos. Quite los desechos del plato sin dañar la cápsula. Para minimizar el tiempo exponen thymi, recortar lóbulos de tomillo antes de implante.
    Nota: Cada timo recién aislado normalmente hará seis segmentos de aproximadamente 1 mm de ancho por un máximo de tres ratones de host al recibir implantes en ambos ojos.
  10. Repita los pasos 1.4-1.9 para cada ratón donante. Para minimizar el tiempo exponen thymi, aislar un timo a la vez.

2. timo implantación en la cámara Anterior del ojo

  1. Antes del trasplante, la etiqueta y pesar cada ratón receptor.
  2. Usar una dosis entre 1-2% de los vapores de isofluorane para anestesiar el ratón receptor. Anestesia adecuada para asegurar la ausencia de reflejo pellizco del dedo del pie siguiente antes de iniciar el procedimiento quirúrgico.
  3. Proceder con el trasplante de timo segmentos como sigue:
    1. Coloque el ratón en una posición decúbito lateral para un ojo quede hacia arriba expuestos directamente a la lente del telescopio disección.
    2. Suprimir uno de los lóbulos tímicos aislados en frío 1 x PBS (pH 7.4)-lleno plato 60 mm en piezas de hasta 1 mm de ancho para el implante. Siguen un patrón de zig-zag para asegurar que cada segmento contiene médula y la corteza tímica. Utilizar tijeras de vannas para recortar según lineamientos en la figura 1A.
      Nota: Ajuste del timo debe hacerse justo antes de implante para optimizar el injerto de tejido.
    3. A partir de la base de la córnea correspondiente al área quirúrgico, introduzca la punta de una aguja de 40 mm G18 para hacer una pequeña incisión en las capas externas de la córnea para que se pueda introducir la punta de tijera de disección.
    4. Hacer un 5-10 mm flanco incisión directamente alrededor de la base de la córnea usando tijeras de vannas manteniendo la apertura de córnea firmemente para evitar que cierre. Utilizar pinzas con puntas planas para evitar daño a los tejidos.
    5. Sujete el epitelio córneo cortado y exponer la apertura mediante la celebración de la córnea con un par de pinzas de punta plana mientras empuja un timo segmento a través de la abertura. Moje el ojo con estéril de 1 x PBS (pH 7.4) o lágrimas artificiales según sea necesario para evitar la desecación del tejido hasta la manipulación.
    6. Presione suavemente sobre la superficie del ojo para el segmento de tejido introducidos a una posición lateral con respecto a la pupila para preservar la función de eye´s. Asegúrese de que el injerto se encuentra en una ubicación frente a los ojos apertura para evitar las interferencias posteriores con la proyección de imagen por novatadas.
    7. Con la ayuda de pinzas planas, presione firmemente, por unos 3-5 s, los dos lados de la apertura corneal uno contra el otro para promover el cierre automático. La cirugía no requiere ningún grapar o coser.
  4. Si los transplantes se realizan en ambos ojos, gire el ratón sobre el lado lateral opuesto directamente exponer el segundo ojo a la lente del microscopio de disección y repita los pasos 2.3.2-2.3.7.
  5. Una vez finalizada la cirugía, devuelva el ratón a una jaula vacía precalentada con una lámpara de calor.
  6. Asegúrese de que cada ratón trasplantado recupere movilidad completa y a conciencia antes de colocarlo en una jaula compartida con otros animales. Esto ocurre generalmente dentro de 1 h después de la cirugía.
  7. Trasplante, tratar a los ratones con analgésicos según sea necesario y proporcionar los ratones con acetaminofén a una concentración de 1,6 mg/mL en el agua potable.
  8. Repita los pasos 2.2-2.9 para cada ratón receptor.
  9. Seguimiento postoperatorio actividad animal, así como la aparición de los ojos implantados para detectar posibles complicaciones de salud.

3. confocal imagen de Thymi implantado utilizando fotones 3D solo fluorescencia Microscopía Confocal

  1. Anestesiar el ratón receptor usando una dosis entre 1-2% de los vapores de isofluorane. Asegurar adecuada anestesia por la ausencia de reflejo pellizco del dedo del pie siguiente antes de iniciar el procedimiento de proyección de imagen
  2. Coloque el ratón sobre una plataforma de microscopio de escenario fijo en una posición decúbito lateral para un ojo quede hacia arriba. Se coloca una almohadilla de calor en la plataforma de microscopio para asegurar la temperatura del cuerpo constante de ratones durante grabaciones.
    Nota: Ver figura 1 complementaria para obtener más información.
  3. Inserte la cabeza del ratón de un headholder estereotáctica y gire el mando para sujetar la cabeza del ratón en una posición de lado lateral que permite el acceso directo del objetivo del microscopio a la vista con el injerto de timo.
  4. Colocar el hocico del ratón en una máscara de gas para mantener el animal anestesiado durante procedimiento. Esto permite el ajuste de isofluorane vapores según sea necesario.
  5. Para facilitar la estabilización del ojo durante grabaciones evitando la retracción de los párpados, tire de los párpados manteniendo los ojos en el margen corneal con un par de pinzas que tienen sus puntas cubiertas por un tubo de polietileno que se unen a una UST-2 empalme universal del sólido. Este arreglo permite una fijación estable de la cabeza y el ojo y proporciona flexibilidad sin interrupción del flujo de sangre en el ojo, como se describió anteriormente22.
    Nota: Complementario figuras 1B, C mostrar el conjunto completo.
  6. Añadir unas gotas de lágrimas artificiales o solución Salinas estériles como el líquido de inmersión entre la córnea y la lente, antes de colocar el objetivo del microscopio sobre el ojo de ratón.
    Nota: adicionales gotas se dispensan en necesidad durante todo el procedimiento a seguir el camino de microscopio y prevenir la resequedad del ojo.
  7. Primer uso lente de poco aumento (5 X) para localizar el timo en el campo del microscopio. Luego cambiar a más alta resolución (10, 20 y 40 X) agua inmersión sumergir objetivos con distancia de trabajo larga. Evitar el fotoenvejecimiento LSM y blanqueo del implante tímico mediante la aplicación de energía mínima y reducir el tiempo de exploración tanto como sea posible. Esto se logra usando el explorador resonante del microscopio.
    Nota: El microscopio confocal que utilizamos está equipado con espejos de exploración resonantes capaces de recoger imágenes en 25 cuadros/s. Otras marcas tienen sus propios microscopios con escáneres de resonancias.
  8. Seleccione el modo de adquisición mediante el software del microscopio e iniciar el modo de escáner resonante. Seleccione el modo imagen XYZT y configurar los parámetros de adquisición de la siguiente manera:
    1. Encienda el láser de argón y ajustar la potencia al 30% para la excitación de fluorescencia.
    2. Elija una línea láser de excitación y ajuste el control de splitter (AOBS) viga acusto-óptico para longitudes de onda de emisión diferentes. Además, para detectar rayos y delinear la estructura del tejido, utilizar la detección de la reflexión al mismo tiempo.
      Nota: Al seleccionar un conjunto de colores para la excitación (GFP y RFP), el AOBS automáticamente está programado para dirigir estas líneas de excitación sobre el espécimen y transmitir la emisión entre ellos. Por ejemplo, para la GFP y RFP, utilizamos bandas estrechas de la reflexión de luz de excitación alrededor de 488 nm y 561 nm, respectivamente. Esto deja grandes bandas para la colección de fotones fluorescencia emitida, reduciendo así la necesidad de tiempo de poder y adquisición del láser. En modo reflexión, el AOBS se utiliza como un divisor de viga de 50/50 para luz reflejada en cualquier longitud de onda de los utilizados para la detección de emisión de fluorescencia de imagen.
    3. Recoger la emisión a longitud de onda seleccionada, luego seleccione una resolución de 512 × 512 píxeles y empezar en la proyección de imagen presionando el botón de Live , ajustar los niveles de ganancia según sea necesario (ganancia típica es alrededor de 600 V).
    4. Definir el principio y al final de la pila de z, centrándose en la parte superior del implante tímico y seleccione comenzar, luego mover hasta el último plano que puede ser enfocado en el timo implantado y seleccione fin. Utilice un tamaño de paso z de 5 μm. El software automáticamente calcula el número de aviones confocales.
    5. Elegir el intervalo de tiempo para la adquisición de cada pila de z (normalmente de 1.5 a 2 segundos) y seleccione la opción de adquirir hasta para la proyección de imagen continua.
  9. Pulse el botón Start para inicializar.
  10. Los injertos imagen repetidamente en diferentes momentos del mismo animal repitiendo los pasos 3.1-3.9.
    Nota: Si el animal tiene injertos en ambos ojos, grabaciones de cualquiera de los dos ojos pueden tomarse repitiendo los pasos 3.2-3.9 después de cambiar el lado de la posición vertical de la cabeza de ratón.

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Representative Results

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Timo de ratones recién nacidos fueron aislados de B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas ratones como se describe en este protocolo (pasos 1.1-1.9). En estos ratones transgénicos, el promotor de pollo beta actina dirige la expresión de la variante de la proteína fluorescente roja DsRed. MST bajo la influencia de la inmediata temprana potenciador del citomegalovirus (CMV) facilitando el seguimiento de los implantes.

Para prevenir el rechazo de tejidos, isogénicas individuos con genotipo: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha J fueron elegidos como anfitriones. En estos ratones transgénicos, el promotor ubiquitina humano C dirige la expresión de mayor proteína verde fluorescente (GFP) en todos los tejidos lo que permite una clara diferenciación entre el tejido receptor y donante. La acción del promotor humano ubiquitina C conduce a patrones de expresión de GFP diferenciales en ciertos tipos de células hematopoyéticas. En particular, las células T presentan una expresión de GFP superior 2 veces niveles de CD19+B220+ B células o a otras células de sangre periféricas que puede facilitar su identificación por técnicas cuantitativas sensibles tales como flujo cytometry, sin ningún necesidades adicionales de la etiqueta. Además, expresión fluorescente en estos ratones se observa en animales adultos, así como en todas las etapas embrionarias y es uniforme dentro de un linaje de tipo celular otorgar estabilidad de marcador.

El patrón para el ajuste de la timo que se muestra en la figura 1A sigue descripciones anteriores de timo funcional fragmentos implantados en la capsula renal del23. Este procedimiento de ajuste permite una reducción del volumen total de tejido que se implanta conservando las unidades funcionales de base histológicas del órgano (corteza, médula y Unión córtico-medular (CMJ) vasos). La diferencia notable en el tamaño entre recién nacido timo (figura 1A, izquierda) y el timo de ratones un semana de edad (figura 1A, derecha) debe tenerse en cuenta para el ajuste, como el espacio disponible para implantes en el compartimiento anterior del ratón ojo es restringido. Los resultados presentados aquí incluyen los implantes obtenidos de los recién nacidos solamente. Figura 1B muestra una imagen macroscópica de un timo segmento implantado en la cámara anterior de un ojo de ratón GFP, acomodado para preservar la visión animal. Detalles histológicos del implante en referencia a la córnea (tejido GFP adyacente al implante de la RFP) se observan en la reconstrucción 3D de imágenes confocales en 1 Video complementario. El engraftment del iris se muestra en el Video 1 y figura 2.

Figura 1C y 1D ilustran respectivamente campo brillante y seguimiento de imágenes de fluorescencia de la misma área que puede servir para un doble macroscópica de crecimiento del tejido y de la involución en los estudios de continuación. Figura 1 también muestra la vascularización de los tejidos implantados que únicamente deberían permitir estudiar fisiología de timo dependiente de la fuente de la sangre del órgano a lo largo del tiempo.

La vascularización de los fragmentos insertados tímicas ocurrió dentro de implante después de 72h. El proceso de vascularización rápida está en buen acuerdo con la gran cantidad de vasos sanguíneos en el iris y la riqueza del timo en la producción de citoquinas. Estas características permiten el engraftment rápido de thymi insertado. La vascularización de los implantes está ilustrada en el Video 2, mostrando el engraftment de timo de los vasos sanguíneos con la iris´ del anfitrión individual (GFP tejido adyacente al implante de la RFP) por lo tanto, confirmando que el modelo presentado aquí, de hecho, permite monitorización continua no invasiva de timo vascularizada a nivel microscópico. El uso de la LSM para visualizar endógeno timo o timo previamente implantados en diferentes localizaciones anatómicas es restringido por opacidad tejido y tejido de más de 1 mm. La cámara anterior del ojo se considera como una "ventana" en el organismo facilitando la observación de los tejidos implantados a nivel microscópico.

Aquí, se muestra que el modelo desarrollado por nuestro grupo permite la visualización de la transmigración de las células del torrente sanguíneo (Video 2) en el timo implantado (probablemente progenitores); para el seguimiento de los contactos de células progenitoras GFP entrantes en el implante tímico con residente tímica epitelial y stromal cells (RFP-etiquetado) durante procesos de diferenciación y selección (Videos 3 y 4) y, también, para la salida de células (células T probablemente maduras) en los vasos sanguíneos (vídeo 5).

Lo que describimos así representa la "prueba del principio", basado en grabaciones tomadas entre 72 horas y un mes después del implante de seis individuos transplantados con los segmentos de tres donantes recién independiente, para un animal el modelo permite en vivo seguimiento en tiempo real de la maduración del thymocyte en un fragmento tímica vascularizado por procedimientos no invasivos en el tiempo, y como tal, el protocolo puede ser que necesite más refinamientos. Este modelo podría ser más elaborado haciendo uso de animales transgénicos que marcadores moleculares thymocyte etiquetados, por ejemplo, productos como fluorescentes, lo que permite la visualización directa de los productos intermedios de maduración de células T. El sistema puede ayudar a resolver las controversias y responder incognitas vinculadas a la selección y la diferenciación de timocitos eventos entre otros.

Figure 1
Figura 1. Seccionamiento de lóbulos tímicos recién nacidos de donantes y trasplantes en la cámara anterior del ojo de ratones. (A) recién nacido (izquierda) y una semana después del parto thymi (derecha) imágenes. Líneas de guión en timo recién nacido representan guías para preparar las secciones para el trasplante en la cámara anterior del ojo de ratones para estimar el número máximo de trasplante de un donante. (B) imagen representativa que muestra recientemente había implantado timo. (C) imagen representativa de injertado, vascularizada timo 2 semanas post-implante. (D) imagen de fluorescencia del injerto de timo se muestra en (C). Barra de escala se muestra (1 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Imagen confocal que muestra el detalle del injerto de timo segmento (rojo) en el iris (verde). Imagen obtenida con un microscopio, con la siguiente configuración: 488 y 561 nm excitación/500 y 575 nm emisión las longitudes de onda, resolución de 512 x 512 píxeles y 40 X de inmersión objetivo con distancia de trabajo larga. Barra de escala se muestra (40 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 1
Suplementario Figura 1. Configuración para la proyección de imagen confocal de injerto tímico usando fluorescencia 3D fotón láser microscopia confocal. (A) Heatpad, headholder estereotáctica y detalles con máscara de gas. (B) puesta en marcha del ratón con el injerto de timo para EMPL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1
Video de 1. En vivo la proyección de imagen de timo implantes en la cámara anterior del ojo de ratón. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Video 2
Video 2. Reclutamiento de presumible timo instalarse progenitores (TSP) de la sangre (GFP) en el parénquima tímico (RFP). Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Video 3
Video 3. Movimiento estocástico de los timocitos (progenitores tímicas tempranas o PTE) en la corteza. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Video 4
Video de 4. Interacción de los timocitos (GFP) con las células del estroma tímicas (RFP) cTECs (células epiteliales tímicas corticales) o mTECs (células epiteliales tímicas medulares). Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Video 5
Video 5. La proyección de imagen de salida en tiempo real de las células T maduras potenciales. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Supplementary Video
Video complementario 1. implantes de 3Den vivo imágenes de timo en la cámara anterior del ojo de ratón. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

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Debido a la importancia de la maduración de células T para competencia inmune individual4 y el presunto impacto de precursor celular dinámica en células T maduras producidas por el timo2,3, se han invertido grandes esfuerzos desarrollar alternativas al enfoque clásico tejido fijo instantánea.

Aunque claramente superiores en la reproducción de la arquitectura del tejido de monocapas o agregado órgano timo culturas14,15rebanadas de tejido y otros explantes, la ausencia de una conexión a la vasculatura limita su uso para el estudio de la pasos de entrada o TSP (desplazamiento de progenitores a través de la barrera de las células endoteliales de los vasos sanguíneos) y salida (desplazamiento de células T maduras a través de la barrera de las células endoteliales de los vasos sanguíneos) del órgano. Como se presume que la dinámica de la célula de T en contacto con otras células, incluyendo células del estroma tímicas y su movilidad a través de microambientes dentro de la corteza y la médula de determinar su estado de diferenciación y el proceso de la subpoblación selección (positiva y negativa)2,3,4,5, y puesto que estos procesos dependerá de TSP y eventos de salida de células T maduras, un modelo que incluye la conexión a la individual´s el flujo sanguíneo sistema sería deseable.

Implantes cápsulas intradérmica y riñón del timo permiten esta actualización17,18. Sin embargo, constituyen métodos invasivos con limitaciones impuestas a la proyección de imagen por TPLSM debido a la posición profunda del implante dentro del cuerpo o la presencia de capas opacas de tejido por encima del injerto. La adaptación de la cámara anterior ojo de ratón, utilizada anteriormente como una "ventana"21,22 longitudinalmente, supervisar el rendimiento de varios tejidos, como un sitio de seguimiento de las células T en un timo vascularizado proporciona varias ventajas frente a otras estrategias de trasplante. Por un lado, la cirugía es más simple porque no las suturas son necesarias, llevando a una recuperación más rápida de los animales del anfitrión. En el otro lado, la observación de los implantes no requieren una cirugía adicional como sucede para los implantes cápsula renal, permitiendo grabaciones repetidas del mismo animal. Además, las particularidades anatómicas del ojo permiten modular fácilmente entradas reglamentarias en el tejido implantado no sólo sistémica pero también localmente. Según se describió anteriormente, con este enfoque, sustancias pueden ser aplicadas tópicamente en el ojo o inyectadas en la cámara anterior del ojo. También representa una opción fácil para introducir sustancias o células directamente en el timo (es decir., progenitores o intermedios de maduración etiquetado ex vivo y eventualmente transferido), que tradicionalmente ha sido un procedimiento muy complejo debido a la localización anatómica de timo24,25. Además, la perfusión de la cámara anterior permite el intercambio de humor acuoso o carga del injerto por difusión con indicadores fluorescentes, como se ha demostrado para otro tipo de implantes26.

El método que más fielmente permite el estudio de la fisiología de la timo es proporcionado por la proyección de imagen intravital de peces medaka transgénicos expresan marcadores de linfocitos fluorescencia marcada. La transparencia de medaka durante el desarrollo y durante toda la vida en muchas cepas de medaka hace este organismo ventajoso para el monitoreo de la dinámica celular en vivo21. El bajo número de timocitos móviles observados en medaka (29%)18 , en referencia a mouse´s (95%)13, además de diferencias en las tasas de movilidad entre estos dos organismos, sin embargo, sugiere que el frío de la sangre vertebrado más pequeño con un sistema inmune adaptante puede limitarse revelar cinética particular mecanicista de más eventos de maduración de células T vertebrados.

Una limitación del uso de la cámara anterior del ojo de ratón como el sitio para el trasplante de timo es restricción de espacio. Estudios a largo plazo podrían ser, por tanto, comprometidos; especialmente para recién nacidos o embrionarios tejidos con potencial de crecimiento agrandado. En este sentido, debemos indicar que aunque los implantes recién nacidos presentados con extensión evidente del tejido después de la primera semana post-implante en el ojo de ratón (datos no mostrados), la ampliación no parecen poner la integridad del ojo en riesgo hasta dos meses después del implante. Sin embargo, debe ser de interés para evaluar si el ambiente del tejido del implante (compartimiento del ojo, la cápsula renal o dermis) influencias implant´s crecimiento y vascularización antes de la adecuación del enfoque puede ser establecida para definir aplicaciones.

La gran incisión necesaria en la córnea para permitir que el paso del fragmento del timo a la cámara anterior del ojo conduce en ocasiones a algunas novatadas en este nivel (datos no mostrados), muy probablemente con cierto grado de fibrosis asociada con el proceso de curación. Atención se exige el paso 2.3.6 del protocolo para garantizar que en caso novatada mínimamente interferirá con los pasos de abajo. Como se hace la incisión a nivel lateral, ni el implante ni la novatada debe afectó significativamente la performance de vista de los animales.

La necesidad de recorte de tejido hacer el timo entra en el compartimiento del ojo parece ser una desventaja si se compara con otros sitios anatómicos que no requieren alterar la integridad anatómica del órgano. Sin embargo, el enfoque de cápsula renal ha demostrado que los fragmentos del timo que contiene ambos, corteza y médula obtenida por directrices similares de disección que se muestra en la figura 1, se convierten en completamente funcional como puede reconstituir la célula de T Inmunidad mediada en inmunodeficientes hosts thymeless18. Este es un argumento a favor de rasgos funcionales intactos de este tipo de segmentos de timo. Además, el protocolo había descrito aquí destaca que el timo aislado debe conservarse en frío (paso 1.9) y recortado sólo justo antes de implante (paso 2.3.2) para minimizar la exposición de la isquemia y el tejido frío hacia optimización de injerto de tejido.

Una limitación potencial adicional del enfoque reside en las diferencias de composición entre el humor acuoso en la cámara anterior del ojo y del plasma de sangre, cuestión que debe tenerse en cuenta al interpretar observaciones hechas en esta localización anatómica . Estudios previos con otros tejidos, sin embargo, no han informado ningún efecto evidente en la función normal del injerto por el ojo local medio ambiente22. Aunque la experiencia con el modelo presentado aquí está restringida a unos pocos individuos (N = 6 y N = 3 para los receptores y donantes, respectivamente) en la actualidad, no observamos alteraciones importantes asociadas al implante de sitio en el caso de implantes tímicos en cualquiera de los personas cualquiera.

El protocolo presentado aquí constituye una prueba del principio para el estudio de la imagen longitudinal intravital de la dinámica anti-thymocyte implantando tejido tímico en la cámara anterior del ojo de ratón. Debido a la selección de los receptores inmunocompetentes, el sistema no permite cuestionar la función sistémica del injerto. Futuros estudios pueden aprovechar este enfoque eligiendo diferentes donantes y los receptores o por someter a los anfitriones a la irradiación y el trasplante de médula ósea (MO) según los diseños de estudio en particular. Por ejemplo, la elección de los ratones de SCID (inmunodeficiencia severa combinada) como destinatarios elimina la interferencia endógenas-de células de T, y la elección de los donantes de ratones transgénicos (implante tímica o BM) presentan marcadores del T-cell, marcadores DC, tímicos estromal marcadores de la célula, etcetera., individualmente o en combinaciones debe permitir seguimiento directo en vivo de subpoblaciones celulares. Alternativamente, podrían rastrearse las subpoblaciones de células en el compartimiento anterior del ojo de ratones, como se describió anteriormente, por en vivo fluorescencia cytolabeling26.

Una de las ventajas principales del modelo presentado aquí es que permite para el estudio del progenitor y desplazamiento de las células T madura desde y hacia los vasos sanguíneos. Por lo tanto, debe ser relevante determinar si la vascularización rápidamente adquirida del timo después de ser implantado en la cámara anterior del ojo recapitula la vasculatura endógena. A favor de esta posibilidad, cabe mencionar que la neovascularización en la cámara anterior del ratón parece ser dictada por el injerto18,20 y no por el destinatario y por lo tanto las conexiones a la vasculatura de iris debe preservar la integridad del dominio de Unión córtico-medular (CMJ) timo endógena.

Una ventaja adicional viene del hecho de que el sistema permite la evaluación de dos implantes independientes (dos compartimientos del ojo anterior) sobre idéntico fondo individual (un solo host). Estudios que requieren combinaciones de tejidos también pueden encontrar ventajoso usar este sistema.

Como el timo desempeña un papel importante en patologías autoinmunes e inmunes deficientes, este enfoque podría ser utilizado para tratar una miríada de preguntas posibles. En particular, el sistema debe permitir macroscópico además de proyección de imagen de órgano intra para la progresión de la involución del timo. También puede servir para estudiar eventos de tolerancia del trasplante y disfunciones inmunes relacionadas con infecciones. Es probable que la fina disección de los mecanismos que regulan la maduración del thymocyte proporcionará nuevas pistas para el diseño de estrategias terapéuticas adicionales dirigidos a células T en desarrollo.

Trasplante de timo a la cámara anterior del ojo toma menos de 45 minutos, incluyendo aislamiento timo neonatal y del ajuste para cada host individual con implantes en ambos ojos. En vivo imagen grabaciones requieren 1 a 5 horas, dependiendo de características monitoreadas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH R56DK084321 (CA), R01DK084321 (CA), R01DK111538 (CA), R01DK113093 (CA) y R21ES025673 (CA) y por la concesión del mejor/2015/043 (Consellería de Educació, cultura i esport, Generalitat valenciana, Valencia, España) (EO). Autores agradecen al equipo enviado a la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, España y Alberto Hernández en el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, España por su ayuda con video filmación y edición.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane Kent Scientific Corp VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source Zeiss Stemi 305
Fine dissection forceps WPI 500455
Medium dissection forceps WPI 501252
Curved tip fine dissection forceps WPI 15917
Vannas scissors WPI 503371
Dissecting scissors WPI 503243
Scalpel WPI 500353
40 mm 18G needles BD 304622
Disposable transfer pipette Thermofisher 201C
Heat pad and heat lamp Kent Scientific Corp Infrarred
Ethanol 70% VWR 83,813,360
60 mm sterile dish SIGMA CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4) Thermofisher 10010023
Sterile wipes Kimberly-Clark LD004
Drugs for pain management Sigma-Aldrich A3035-1VL
Saline solution or Viscotears Novartis N/A
Stereomicroscope Leica MZ FLIII
Head-holding adapter Narishige SG-4N-S
Gas mask Narishige GM-4_S
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Laminar flow hood Telstar BIO IIA

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References

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Seguimiento <em>en Vivo</em> de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real
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Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).More

Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).

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