Summary
نقدم هنا بروتوكول الجيل التالي تسلسل لتسلسل الرنا الريباسي 16S التي تمكن من تحديد وتوصيف المجتمعات الميكروبية داخل الناقلة. هذا الأسلوب ينطوي على استخراج الحمض النووي والتضخيم والمتوازية من عينات عن طريق PCR، تسلسل تدفق الخلايا، والمعلوماتية الحيوية لمطابقة البيانات تسلسل المعلومات النشوء والتطور.
Abstract
في العقود الأخيرة، ظهرت من جديد الأمراض المحمولة بالنواقل والتوسع في معدلات، تسبب قدرا كبيرا من المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم المفزعة. لا توجد لقاحات فعالة ومتاحة على نطاق واسع لغالبية هذه الأمراض، مما يستلزم وضع استراتيجيات التخفيف من آثار المرض الرواية. وتحقيقا لهذه الغاية، يشمل واعدة لمكافحة الأمراض استهداف ميكروبيومي ناقل، مجتمع الميكروبات التي تسكن في ناقلات. ميكروبيومي ناقلات يلعب دوراً محوريا في ديناميات الكائنات الممرضة، والتلاعب ميكروبيومي أدت إلى انتقال ناقلات انخفاض وفرة أو الممرض لحفنة من الأمراض المحمولة بالنواقل. بيد أن ترجمة هذه النتائج إلى تطبيقات التحكم المرض يتطلب فهم شامل لمكافحة ناقلات الإيكولوجيا الميكروبية، محدودة تاريخيا بتكنولوجيا غير كافية في هذا المجال. قد مكن ظهور نهج الجيل التالي تسلسل تسلسل المتوازية العالية والسريعة للمجتمعات الميكروبية المختلفة. استهداف الجين الرنا الريباسي 16S المحافظة جداً سهلت الأوصاف للميكروبات موجودة داخل ناقلات تحت اختلاف الظروف الإيكولوجية والتجريبية. هذا الأسلوب ينطوي على تضخيم الجينات الرنا الريباسي 16S، المتوازية نموذج عن طريق PCR، تحميل عينات على خلية تدفق للتسلسل، ونهج المعلوماتية الحيوية لمطابقة تسلسل البيانات مع معلومات النشوء والتطور. عادة ما يمكن الأنواع أو تحديد مستوى جنس لعدد كبير من replicates من خلال هذا النهج، وبالتالي الالتفاف حول التحديات للكشف عن انخفاض والقرار الناتج من استزراع التقليدية، والفحص المجهري، أو تلطيخ نسيجية تقنيات. ولذلك، هذا الأسلوب مناسبة تماما لوصف ناقلات الجراثيم تحت ظروف متنوعة ولكن حاليا لا يمكن تقديم معلومات عن وظيفة الميكروبية، موقع داخل ناقل، أو استجابة للعلاج بالمضادات الحيوية. عموما، تسلسل الجيل القادم 16S تقنية قوية لفهم أفضل للهوية ودور ناقلات الجراثيم في ديناميات المرض.
Introduction
أن عودة ظهور وانتشار الأمراض المحمولة بالنواقل في العقود الأخيرة تشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان والحياة البرية العالمية. ولا توجد لقاحات فعالة لغالبية هذه الأمراض، وتعيق جهود مكافحة الطبيعة البيولوجية المعقدة ناقلات والتفاعلات ناقل المضيف. فهم دور التفاعلات الميكروبية داخل ناقل في انتقال العوامل الممرضة يمكن أن تسمح لوضع استراتيجيات جديدة والتحايل على هذه التحديات. على وجه الخصوص، التفاعلات بين المرتبطة بمكافحة ناقلات الجراثيم كومينسالس، وسيمبيونتس، ومسببات الأمراض، يشار إلى ميكروبيومي، قد آثار هامة على انتقال العوامل الممرضة. الآن أدلة دامغة تؤيد هذا الزعم، مع أمثلة مما يدل على ارتباط بين ناقلات ميكروبيومي والكفاءة لأمراض من قبيل الملاريا وفيروس زكى، ومرض لايم1،،من23. بيد أن ترجمة هذه النتائج إلى استراتيجيات للسيطرة على الأمراض يتطلب فهم أكثر تفصيلاً لهيكل ووظيفة، ومنشأ متجه ميكروبيوميس. تحديد وتوصيف المجتمع ناقلات الجراثيم تحت اختلاف الظروف الإيكولوجية والتجريبية تشكل مسار هامة إلى الأمام في هذا المجال.
وضع إجراء لتحديد السكان الميكروبية ناقل الممرض يرد هنا باستخدام الغربية أرجل الأسود القراد، باسيفيكوس Ixodes، أنواع ناقلات الأمراض من مسببات المرض مرض لايم البورليه burgdorferi. بينما القراد تأوي أكثر من أنواع مسببات الأمراض البشرية من أي مفصليات الأرجل الأخرى، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول إيكولوجيا الأحياء والمجتمع للقراد ميكروبيوميس4. فمن الواضح أن القراد إيواء مجموعة متنوعة من الفيروسات والبكتيريا والفطريات وبرزويات التي تشمل كومينسالس، اندوسيمبيونتس، وسكان الميكروبية عابر5،4. العمل السابقة أظهرت اختلافات قوية في ميكروبيوميس إيكسوديس المرتبطة بالجغرافيا، والأنواع، والجنس ومرحلة الحياة ووجبة الدم مصدر6،،من78. ولكن الآليات الكامنة وراء هذا الاختلاف لا تزال مجهولة وتبرر أكثر تفصيلاً بالتحقيقات المتعلقة بمنشأ والجمعية هذه المجتمعات الميكروبية. القراد يمكن أن تكتسب الميكروبات عن طريق الانتقال الرأسي، الاتصال بالمضيفين، وامتصاص من البيئة من خلال spiracles والفم، والشرج المسام9. فهم العوامل التي تشكل الأولية تشكيل وتطوير ميكروبيومي القراد، على وجه التحديد المساهمة النسبية لانتقال العدوى الرأسية والبيئية، مهم لفهم الأنماط الطبيعية والتغيرات في التجزئة ميكروبيومي التنوع وكيفية تفاعل هذه المجتمعات أثناء انتقال مسببات المرض، مع التطبيقات الممكنة لمكافحة المرض أو ناقل.
التقنيات الجزيئية القوية، مثل الجيل التالي التسلسل، الآن موجودة لتحديد المجتمعات الميكروبية ويمكن استخدامها لتوصيف ميكروبيوميس ناقل تحت مختلف الظروف البيئية أو التجريبية. قبل ظهور هذه النهج التسلسل الفائق، تحديد الميكروبات تعتمد غالباً على الفحص المجهري والثقافة. أن الفحص المجهري تقنية سريعة وسهلة، فالطرق المورفولوجية للتعرف على الميكروبات طبيعتها الذاتية والخشنة ومحدودة بحساسية منخفضة والكشف عن10. الأساليب المستندة إلى الثقافة وتستخدم على نطاق واسع لتحديد العوامل الجرثومية ويمكن استخدامها لتحديد حساسية الجراثيم للمخدرات العلاجات11. ومع ذلك، هذا الأسلوب أيضا يعاني من حساسية منخفضة، حيث يقدر أن أقل من 2% ميكروبات البيئية يمكن أن تكون مثقف في مختبر لإعداد12. كما استخدمت النهج المصبوغة النسيجي كشف وتعريب الميكروبات محددة داخل الناقلة، وتمكين تحقيقات توزيعات الأنواع المختلفة داخل القراد ودراسة فرضيات حول التفاعلات الميكروبية. المعرفة المسبقة بهوية الميكروبية غير مطلوبة من أجل تحديد البقع الملائمة، مما يجعل هذا النهج غير ملائمة لتوصيف الميكروبية وتحديد الهوية. وعلاوة على ذلك، تلطيخ نسيجية عملية الوقت كثيفة جداً وشاقة وغير مقياس جيد للعينات ذات الأحجام الكبيرة. النهج الجزيئية التقليدية مثل سانغر التسلسل وبالمثل محدودة في الحساسية والكشف عن مختلف المجتمعات الميكروبية.
تسلسل الجيل التالي يسمح للتعرف السريع على الميكروبات من عدد كبير من العينات. تعزيز وجود الجينات علامة قياسية ومرجعية قواعد بيانات أخرى تمكن قرار التقسيم، غالباً على مستوى جنس أو الأنواع. وحدة فرعية صغيرة الريباسي الكشف كثيرا ما تستخدم لتحقيق هذا الهدف، مع الرنا الريباسي 16S ويجري الأكثر شيوعاً نظراً لوجود المناطق المصانة ومتغير داخل الجينات، السماح بإنشاء أجهزة الإشعال العالمي مع أمبليكونس فريدة من نوعها لكل البكتيريا الأنواع13،14. يتضمن هذا التقرير تفاصيل إجراء لتحديد الأصناف في ميكروبيومي التجزئة من خلال تسلسل الجيل الرنا الريباسي 16S. على وجه الخصوص، يؤكد هذا البروتوكول على الخطوات المتبعة في إعداد العينات للتسلسل. المعمم المزيد من التفاصيل بشأن التسلسل والمعلوماتية الحيوية يتم توفير الخطوات، كما أن هناك مجموعة متنوعة من منصات يسلسل وتحليل البرامج المتاحة حاليا، كل مع الوثائق الحالية واسعة النطاق. ويتجلى عموما جدوى هذا النهج الجيل التالي تسلسل تطبيقه تحقيقا للجمعية المجتمع الميكروبي داخل ناقل مرض رئيسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-ضع علامة جمع وتعقيم سطحي
- جمع تعلق القراد عن طريق سحب قطعة من قماش أبيض2 م 1 على موئل المرتبطة بالتجزئة، إزالة القراد إلى الأنواع المضيفة، أو تربية القراد في مختبر15،16. استخدام الملقط غرامة للتلاعب بالقراد وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- مكان القراد في أنابيب PCR الفردية وإزالة الملوثات السطحية التي فورتيكسينج لمدة 15 ثانية تباعا مع 500 ميكروليتر من بيروكسيد الهيدروجين (حاء2يا2) والايثانول 70% ddH2o.
- ضع القراد في أنبوب بكر جديدة وتمكينها من أيردري.
- في هذا الأنبوب، ميكانيكيا تعطيل الأنسجة القراد بسحق القراد بقذائف الهاون والمدقة (المستخدمة في هذه الدراسة)، باستخدام حبات صغيرة في الخافق حبة، أو قطع القراد بعيداً مع مشرط.
2. تنقية الحمض النووي
- تنقية الحمض النووي من القراد الفردية، اتباع الإرشادات المتوفرة في مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي متاحة تجارياً. الوتي لوحدة تخزين نهائي من 100 ميكروليتر.
ملاحظة: تشير إلى الرقم 1 للمحة عامة عن الخطوات 2.2 2.8. تشمل أساليب الاستخراج البديلة الفينول كلوروفورم استخراج17،18، الإيثانول الأمطار19، أو استخراج مع مواد20،شيلاتينغ21. - تأكيد نجاح تنقية الحمض النووي باستخدام فلوروميتير أو جهاز المطياف الضوئي. فلوروميتري، استخدام 10 ميكروليتر من قالب الحمض النووي في مقايسة الحمض النووي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ميكروليتر 190. العائد المتوقع من 0.1-1.0 نانوغرام/ميكروليتر22. لكانت، استخدم 1 ميكروليتر من قالب الحمض النووي في تحديد كمي حمض النووي. نسبة A260/280 المتوقعة هي حوالي 1.823.
- إذا لم يكن التوجه فورا إلى التضخيم، تخزين العينات في-20 درجة مئوية.
3-16S الرنا الريباسي التضخيم الجيني
- إعداد أمبليكون بكر في رد فعل ميكروليتر 27.5 يحتوي على: 5 ميكروليتر من كل التمهيدي في 1 ميكرومتر؛ ميكروليتر 12.5 من مزيج PCR المتاحة تجارياً؛ و 5 ميكروليتر من الحمض النووي المستخرج من القراد الفردية بتركيز 5 نانوغرام/ميكروليتر.
ملاحظة: استخدم كبسولة تفجير التالية لتضخيم منطقة V3-V4 هايبرفاريابل مورثة الرنا الريباسي 16S13:
5 '-تكجتكجكاجكجتكاجاتجتجتاتاجاجاكاجككتاكججنجكوجكاج-3'،
-جتكتكجتججكتكجاجاتجتجتاتاجاجاكاجاكتاتشفججتاتكتاتكك-3 '5' - نقل أنابيب إلى ثيرموسيكلير المبرمجة ل: تمسخ أولى عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ دورات 25 1) 95 درجة مئوية لمدة 30 ق، 2) 57 درجة مئوية لمدة 30 ق، 3) 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ ملحق نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ وعقد نهائي في 10 درجة مئوية.
- حالما يتم ذلك بكر، تصور المنتج بكر بتحميل 4-6 ميكروليتر/عينة على 1.5% [اغروس] هلام. البحث عن عصابة في 460 شركة بريتيش بتروليوم لتأكيد التضخيم.
ملاحظة: المنتج Amplicon PCR قد لا تكون مرئية في الجل إذا كان تركيز العينة منخفضا جداً (< 10 نغ). التمهيدي ديمر وجود أمر شائع في تركيزات منخفضة العينات. في حالة وجود عصابات غير المستهدفة الأخرى، ضبط درجة الحرارة انلينغ أو إنقاص عدد دورات. - إذا لم يكن التوجه فورا إلى تنقية، تخزين العينات في 4 درجات مئوية.
4-16S Amplicon تنقية
- استخدام أنبوب بكر جديدة لكل عينة، تجمع بين المنتج بكر ddH2س للحصول على المجموع 60 ميكروليتر. للعينات بتركيزات منخفضة من الحمض النووي، أداء amplicon بكر في ثلاث نسخ تقليل التحيز إلى التضخيم وتجمع العينات للتركيز.
- إحضار الخرز باراماجنيتيك إلى درجة حرارة الغرفة ودوامه لهم جيدا قبل الاستخدام.
- إضافة ميكروليتر 48 من حبات باراماجنيتيك إلى 60 ميكروليتر من العينة واحتضانها لأدنى 5 مكان الأنابيب على رف مغناطيسية لمدة 5 دقائق حتى يصبح الحل الواضح. إزالة المادة طافية.
ملاحظة: هذا التركز حبة يستهدف إزالة مبلمر (bp < 60). إذا لزم الأمر، قم بضبط تركيز حبة لإزالة النطاقات غير محددة أخرى. - مع أنابيب على الرف المغناطيسي، إضافة 500 ميكروليتر-طازج 80% EtOH. فورا بعد إضافة EtOH إلى جميع الأنابيب، "الماصة؛" من السائل. لا تقم بإزالة الخرز. كرر EtOH إضافة وازاله مرة أخرى.
- أيردري العينات لإزالة EtOH الزائدة بترك هذه الأنابيب مفتوحة على الرف المغناطيسية لمدة 5 دقائق، أو حتى الشقوق الصغيرة تكون مرئية في الخرز.
- إضافة 20 ميكروليتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، واحتضان العينات قبالة المغناطيس، في درجة حرارة الغرفة، لمدة 5-10 دقائق.
- ضع الأنابيب مرة أخرى على المغناطيس. متى يتم فصل الخرز والسائل، نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد للحصول على منتج PCR تنظيفها.
- (اختياري) تصور المنتج لتأكيد تنقية amplicon ناجحة عن طريق تحميل 4-6 ميكروليتر/عينة على جل 1.5%. الفرقة bp 460 يجب أن تكون مرئية، وينبغي أن يكون هناك لا ديمر التمهيدي.
- في حالة عدم الشروع فورا في فهرس PCR، تخزين العينات 4 درجات مئوية.
5-عينة المتوازية وتنقية
- تعيين تركيبات التمهيدي فريدة من نوعها لكل عينة بتحديد الإشعال إلى الأمام أو عكس، أو كليهما، من مجموعة فهرس مكتبة متاحة تجارياً.
ملاحظة: وسم فريد عينات يسمح للتمايز بعد تسلسل. عادة ما توفر مجموعات الإشعال ما يكفي تسلسل عينات 96-384. - إرفاق الإشعال المزدوج، أو مؤشرات، عينات عن طريق إجراء PCR في رد فعل 25 ميكروليتر المحتوية على ميكروليتر 2.5 لكل التمهيدي (N7xx و S5xx)، 12.5 ميكروليتر من مزيج الرئيسي PCR المتاحة تجارياً، 5 ميكروليتر ddH2س، وميكروليتر 2.5 من المنتج amplicon تنظيفها.
- نقل الأنابيب إلى ثيرموسيكلير المبرمجة ل: تمسخ أولى عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ 8-14 دورات 1) 95 درجة مئوية لمدة 30 ق، 2) 55 درجة مئوية لمدة 30 ق، 3) 72 درجة مئوية لمدة 30 ق؛ ملحق نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ وعقد نهائي في 10 درجة مئوية.
- حالما يتم ذلك بكر، تصور المنتج بكر بتحميل 4-6 ميكروليتر/عينة على 1.5% [اغروس] هلام. البحث عن عصابة في 550 شركة بريتيش بتروليوم لتأكيد التضخيم.
ملاحظة: استخدام نتائج التصور لإبلاغ فهرس PCR ظروف ركوب الدراجات. انخفاض عدد دورة للتخفيف من الربط غير محددة أو زيادة عدد دورة للحصول على أشرطة مرئية لكل عينة. - كرر الإجراء تنظيف المسردة في الخطوة رقم 4. لتجنب إضعاف أثناء تنظيف، أداء فهرس PCR في التكرارات وتجميع المنتج هنا.
- إذا لم يكن الانتقال فورا إلى مكتبة القياس الكمي والتطبيع، تخزين العينات في 4 درجات مئوية.
6-مكتبة القياس الكمي والتطبيع
- تقدير تركيز كل منتج المراقب المنقي، من الخطوة 5.5 باستخدام فلوروميتير أو جهاز المطياف الضوئي (راجع الخطوة 2، 2). تمييع هذه العينات في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات للحصول على تركيزات من حوالي الساعة 01:00 م.
ملاحظة: مكتبة القياس الكمي ضروري لتحقيق نموذج تحميل التركيز الموصى بها لمنصة التسلسل. مكتبة القياس الكمي ويتحقق عن طريق قبكر، ولكن تقدير تركيز العينة قبل قبكر يحفظ الكواشف والوقت. ينصح تركيز 01:00 م لزيادة دقة القياس الكمي مكتبة، إلى أن هذا هو متوسط تركيز qPCR المعايير المنصوص عليها في مجموعة أدوات القياس الكمي24. - أداء قبكر في رد فعل 10 ميكروليتر المحتوية على ميكروليتر 6.0 qPCR ميكس الرئيسية (من مكتبة أدوات القياس الكمي) وميكروليتر 2.0 ddH2س 2.0 ميكروليتر من عينة أو معيار. قم بتشغيل كل عينة والقياسية في ثلاث نسخ لقدر أكبر من الدقة والأحكام. تشغيل كل عينة في ثلاثة أو أكثر من مستويات تمييع (على سبيل المثال-، 12:01 م 1 م و 10:00 م لتركيزات انطلاق المقدرة) لضمان دقة القياس الكمي.
ملاحظة: معلومات مفصلة حول تقدم كبسولة تفجير والمعايير سوف تختلف استناداً إلى أدوات القياس الكمي المستخدمة والمتوفرة في ورقة البيانات الفنية للمنتجات. الرجوع إلى الجدول للمواد اللازمة لمجموعة أدوات القياس الكمي المستخدمة في هذه الدراسة. - نقل لوحة qPCR أو أنابيب إلى أداة PCR الوقت الحقيقي المبرمجة ل: تمسخ أولى من 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 35 1) 95 درجة مئوية عن 30 ثانية و 2) 60 درجة مئوية ل 45 ثانية؛ وتفكك خطوة 1) 95 درجة مئوية لمدة 15 ق، 2) 60 درجة مئوية لمدة 30 s، و 3) 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
- حساب متوسط ابتداء من التركيز لكل نموذج، باستخدام قيم القياس الكمي التي تم الحصول عليها من نتائج قبكر ومستويات تمييع العينة المستخدمة.
ملاحظة: على سبيل المثال، بتركيز متوسط قدرة 02:00 م عينة المخفف 1: 100.000 غلة بتركيز انطلاق الأصلي من 200 نانومتر. إذا كان أي من مستويات تمييع لنموذج معين يندرج في نطاق المنحنيات القياسية، نتائج التقدير الكمي قد لا يكون دقيقا؛ في هذه الحالة، ضبط مستويات التخفيف وإعادة إجراء qPCR. - تمييع كل عينة المراقب المنقي، إلى 4 نانومتر في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، استناداً إلى متوسط التركيزات المحسوبة في الخطوة 7، 5.
ملاحظة: على سبيل المثال، لتركيز متوسط عينة من 200 نانومتر، تمييع المخزن المؤقت عينة 01:50 في الشركة المصرية للاتصالات لتحقيق تركيز شمال البحر الأبيض المتوسط 4. يختلف تركيز عينة دقيقة استناداً إلى مجموعة النظام وكاشف التسلسل المستخدمة. أرجع إلى دليل مستخدم نظام التسلسل لتركيز الموصى بها. - إنشاء مكتبة المجمعة عن طريق إضافة كميات متساوية (عادة 5-10 ميكروليتر) لجميع المكتبات الفردية في أنبوب واحد.
ملاحظة: كما يجب أن تكون جميع العينات بتركيز 4 في شمال البحر الأبيض المتوسط، مشيراً إلى أحجام متساوية يحقق بتركيز متساو لجميع العينات في مكتبة المجمعة. - كرر الخطوات من 6.2-6.4 في المكتبة المشتركة للتأكد من تركيز شمال البحر الأبيض المتوسط 4.
- حساب تركيز مكتبة مجتمعة وتمييع أو إعادة تشكيل مكتبة النهائي، المجمعة باستخدام المخزن المؤقت تريس حسب الضرورة لتحقيق 4 نانومتر.
- إذا لم يكن التوجه فورا إلى تحميل عينة، تخزين العينات في-20 درجة مئوية. إجراء تسلسل تشغيل بعد وقت قصير من التحديد الكمي للتقليل من الخسارة أو تغييرات في تركيز الحمض النووي أثناء التخزين.
7-تمسخ المكتبة وتمييع، وتسلسل تشغيل (تنفيذ في نفس اليوم)
- تؤذي المكتبة مجتمعة 4 نانومتر من الخطوة 6.9 مع هيدروكسيد الصوديوم.
ملاحظة: تختلف هذه الخطوات إعداد مكتبة النهائي لكل نظام التسلسل. أرجع إلى دليل مستخدم نظام التسلسل لبروتوكولات أكثر تفصيلاً وحدثت. المستخدمين الجدد سوف تحتاج المرجح لتدريبهم على استخدام منصة التسلسل أو قد يرسل مكتباتها إلى منشأة تسلسل أساسية. - تمييع المكتبة التشويه والتحريف لتركيز التحميل المطلوب باستخدام المخزن المؤقت المنصوص عليه في مجموعة كاشف التسلسل (جدول المواد).
ملاحظة: تختلف تركيزات التحميل الأمثل بنظام التسلسل، وعادة ما تتراوح بين 1-250 م25. - تؤذي وتخفف من عنصر التحكم التسلسل.
ملاحظة: إضافة عنصر تحكم تسلسل تصحيح لتسلسل القضايا الناشئة عن المكتبات التنوع منخفضة. تجريدها من عنصر تحكم التسلسل باستخدام هيدروكسيد الصوديوم، وتمييع لتركيز نفسه كالمكتبة. - الجمع بين مكتبة وتسلسل التحكم.
ملاحظة: نسبة التحكم التسلسل إلى مكتبة مجتمعة سيتوقف على تنوع المكتبة ونظام التسلسل المستخدمة، إلا أنها عادة 1:126. - تحميل المكتبة المشتركة وتسلسل التحكم المخلوط على تسلسل تدفق الخلية.
8-تحليل تسلسل أمبليكون
- تقييم النجاح الشامل للتشغيل بفحص قياسات التشغيل في بيئة الحوسبة السحابية المقابلة لنظام التسلسل المستخدمة.
ملاحظة: تتنوع مقاييس التشغيل، مثل عدد من تسلسل ما يلي، استناداً إلى تسلسل طقم منصة وكاشف المستخدمة. يتم سرد القيم المستهدفة لنظم مشتركة للتسلسل في الجدول 1. - تحميل بيانات تسلسل الخام والمعلوماتية الحيوية المطلوب برمجيات المصدر المفتوح، "الكمية ثاقبة الإيكولوجيا الميكروبية" (كيم)27 أو28من مزار.
ملاحظة: كلاهما كيم ومزار مفتوحة المصدر ومجانية التحميل. تعليمات مفصلة حول استخدام هذه البرامج يمكن الاطلاع على الإنترنت، وهي مفصلة بما فيه الكفاية لأول مرة للمستخدمين. توفير الخطوات المذكورة أدناه لمحة عامة عن خط أنابيب المعلوماتية الحيوية التي أجريت في كيم. الألفة مع بيثون ليس ضروريا ولكن سوف تسهل تنفيذ البرامج النصية التالية - إنشاء والتحقق من صحة ملف التعيين باستخدام البرنامج النصي "validate_mapping_file.py" في قييمي.
ملاحظة: يحتوي ملف التعيين على جميع البيانات الوصفية اللازمة للقيام بتحليل البيانات، بما في ذلك معرف عينة وتسلسلات التمهيدي أمبليكون ووصف العينة. خطوة التحقق من الصحة التحقق من أن جميع البيانات اللازمة تم إدخالها بالشكل السليم. - ديمولتيبليكس وتصفية تسلسل باستخدام البرنامج النصي "split_libraries.py" (الشكل 1).
ملاحظة: هذا البرنامج النصي يعين المراقب ما يلي للعينات على أساس مجموعات الفهرس التمهيدي ومعرّفات نموذج إدخال في ملف التعيين. كما ينفذ عدة جودة تصفية خطوات لمراقبة لتسلسل خطأ استناداً إلى المعرفة من قبل المستخدم على انقطاع لدرجة دنيا للجودة وتسلسل أطوال والتشذيب نهاية. - تعيين الوحدات التصنيفية التشغيلية (OTUs) إلى تسلسل باستخدام البرنامج النصي "pick_open_references_otus.py".
ملاحظة: في هذه الخطوة، تم تجميع تسلسل ضد مجموعة تسلسل المراجع استناداً إلى الحد الأدنى للهوية (عادة من 97 في المائة). القراءات التي لا تتطابق مع مجموعة تسلسل المراجع تتجمع ضد بعضها البعض. دي نوفو وأغلقت إشارة أسامة انتقاء خيارات متاحة أيضا، ولكن ينصح بالانتقاء فتح مرجع من قبل المطورين كيم. - تطبيع أسامة الجدول باستخدام البرنامج النصي "alpha_rarefaction.py" أو "normalize_table.py".
ملاحظة: هذه الخطوة بتصحيح للتباين في العمود مبالغ، أو تسلسل مجموع يقرأ كل عينة، التي تنجم عن التكنولوجيات الحديثة التسلسل. التطبيع يمكن أن يؤديها باستخدام الاستنفاد التقليدية، أو عن طريق أساليب بديلة مثل رفع المجموع التراكمي. - أداء عدة التنوع ألفا وبيتا-التنوع، والتحليلات تنوع تكوين التصنيفية مرة واحدة باستخدام البرنامج النصي "core_diversity_analysis.py".
ملاحظة: بدلاً من ذلك، هذه التحليلات يمكن تشغيلها بشكل منفصل باستخدام البرامج النصية الفردية (سبيل المثال، "alpha_diversity.py").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ما مجموعة 42 القراد من البيض منفصلة ثلاثة براثن والتعرض البيئي فترتين، 0 و 2 أسابيع في التربة، وجهزت للتسلسل ميكروبيومي. كل مجموعة العلاج، تعتبر مرة واحدة مخلب والتعرض، الواردة في 6-8 تكرار عينات القراد. تم تحميلها على التسلسل الجيل المقبل هذه المقتطفات القراد المجهزة وأسفرت عن 12,885,713 يقرأ إقران نهاية تمرير عامل التصفية. المدرجة في هذا المدى كانت عناصر سلبية 3 من الخطوة الاستخراج، مما أسفر عن مجموعة من 211,214 على ما يلي (المدرجة في العدد السابق). كذلك مقاييس جودة التشغيل جنبا إلى جنب مع القيم المثلى لكل مقياس مفصلة في الجدول 2. المنحنيات الاستنفاد، والتي تتعلق بجهد تسلسل عدد OTUs في العينة، وأشار إلى أن عمق التسلسل، أو عدد من تسلسل فريد يقرأ كل عينة، من يقرأ 2,129 كافية لالتقاط صورة كافية التنوع (المجتمع الميكروبي الشكل 2). وسوف تختلف باختلاف نوع العينة مستويات الاستنفاد ويجب أن يتحدد فردياً لكل تسلسل تشغيل. بعد راريفيينج إلى هذا العمق، حددت 1,714 OTUs عبر جميع العينات بمعدل 93.3 ± 4.3 OTUs كل عينة. لتجنب تحليل المتلقين للمعلومات تم تجميع القضايا الناشئة من مصفوفات متفرق وإزالة الملوثات المحتملة، جميع OTUs غير موجود في نموذج واحد على الأقل في وفرة ≥ 1% في فئة عامة نادرة. علاوة على ذلك، استخدمت مجموعة ديكونتام في البحث والتطوير لتحديد OTUs تمثيلاً زائداً في عناصر سلبية بالنسبة إلى عينات حقيقية، وأزيلت هذه OTUs من تحليل المتلقين للمعلومات.
أجريت التحليلات الإيكولوجيا المجتمع باستخدام سير عمل تحليلات التنوع كيم لإظهار أنواع التنوع ألفا وبيتا التنوع، وتصنيف تكوين التنوع الإخراج التي تم إنشاؤها باستخدام خط أنابيب المعلوماتية بسيطة. على سبيل المثال، قد أنتجت تحليلات الإحداثيات الرئيسية أونيفراك المرجحة وغير مرجحة باستخدام البرنامج النصي "core_diversity_analyses.py"، وأنها كشفت عن التكتل المكاني للقراد اليرقات استناداً إلى هوية مخلب (الشكل 3). وتعول "بوكسبلوتس أسامة" متفاوتة التعرض البيئي مرات تولدت أيضا من خلال هذا البرنامج النصي، إظهار الاختلافات في ثراء الأنواع ميكروبيومي على مر الزمن (الشكل 4). وتجري هذه التحليلات تنوع ألفا وبيتا استناداً إلى فئات المعرفة من قبل المستخدم المسرودة في ملف التعيين، ولكن الأرقام والإحصاءات المتعلقة بالمعلومات التصنيفية العامة تتولد أيضا لجميع العينات (الشكل 5).
الشكل 1 : سير العمل تسلسل ميكروبيومي. يتم عرض الخطوات الرئيسية لسير العمل تسلسل ميكروبيومي مع دعوة الرافضة لخطوات تحليل إعداد وترتيب المكتبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : منحنيات المطروح لتسلسل عد التطبيع. منحنيات الاستنفاد، سيظهر لكل فوج من القراد، تتعلق الملاحظة أسامة التهم لأخذ عينات من جهد. أشرطة الخطأ موجودة بسبب تكرار نماذج موجودة داخل كل مخلب، وأنها تدل على انحراف معياري واحد. يجب تحديد عمق تسلسل في أو بعد النقطة التي يصبح فيها المنحنى مستقرة لالتقاط التنوع الكامل ل OTUs على نحو كاف. هنا، يظهر عمق تسلسل من يقرأ 2,000 المناسبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الرئيسية تنسيق التحليل مخلب. غير مرجحة أونيفراك الرئيسية تنسيق (بكوا) يبين تحليل التباين في التكوين ميكروبيومي بين علامات التجزئة اليرقات من براثن مختلفة، ومن الكبار. كل نقطة بيانات تدل تجزئة فردية. يتم إنشاء هذا الرقم تلقائياً من خلال البرنامج النصي كيم "core_diversity_analyses.py". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : بوكسبلوتس التنوع ألفا من وقت التعرض. بوكسبلوتس يصور أسامة التهم للتعرض البيئي مجموعات إظهار التباين في التنوع الميكروبي على مر الزمن. يتم إنشاء هذا الرقم تلقائياً من خلال البرنامج النصي كيم "core_diversity_analyses.py". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : تحديد مستوى الأسرة في اللغات الميكروبية مخلب واحد. ويرد تشكيل ميكروبيومي لعينات القراد الفردية من براثن واحدة على مستوى الأسرة في اللغات. يتم تلقائياً إنشاء هذا الشكل، فضلا عن معلومات موجزة في أدنى المستويات التصنيفية، من خلال البرنامج النصي كيم "core_diversity_analyses.py". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| متري | تعريف | النتائج التي توصلنا إليها (ميسيق V3) | الأمثل مسك V3 | الأمثل للوضع السريع هيسيق | |
| يقرأ PF | يقرأ عدد من تسلسل تمرير عامل التصفية العفة. قراءة تمرير عامل التصفية إذا كان استدعاء قاعدة لا يزيد عن 1 قيمة عفة أدناه 0.6 في الدورات الأولى 25 | 12,885,713 | 14 مليون | 600 مليون | |
| نسبة الخطأ | النسبة المئوية لأزواج قاعدة تسمى بشكل غير صحيح أثناء دورة، استناداً إلى ما يلي: الانحياز للتحكم | 3.28 ±0.10 | * يعتمد على قيم لمقاييس أخرى | * يعتمد على قيم لمقاييس أخرى | |
| % ≥Q30 | النسبة المئوية للقواعد مع ≥ نقاط ف 30، مما يدل دقة استدعاء قاعدة 99.9% | 68.94 | > 70% | > 80% | |
| كتلة الجبهة الوطنية (%) | النسبة المئوية لمجموعات تمرير عامل التصفية العفة. | 85.61 ±0.81 | 90% | 90% | |
| الكثافة | كثافة كتل على فلووسيل-مقياس رئيسي لنوعية البيانات والنواتج | 552 ± 35 الكتلة/mm ^ 2 | 1200-1400 الكتلة/mm ^ 2 | 850-1000 الكتلة/mm ^ 2 | |
الجدول 1: مفتاح معلمات الأداء لإخراج خ ع. استناداً إلى قيم البيانات والهدف المستخدم تقريرا عن الطقم منصة وكاشف التسلسل المستخدمة في هذه الدراسة (جدول المواد) وإضافة عنصر تحكم تسلسل 25%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجيل التالي تسلسل الرنا الريباسي 16S أصبح نهجاً موحدا لتحديد العوامل الجرثومية ومكنت الدراسة كيف ميكروبيوميس ناقلات الأمراض تؤثر على انتقال العوامل الممرضة. تفاصيل البروتوكول المبينة هنا استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في الجمعية المجتمع الميكروبي في باسيفيكوس أولاً، نوع ناقل لمرض لايم؛ ومع ذلك، يمكن تطبيقها على دراسة أنواع القراد أو أنواع ناقلات الأمراض المفصلية الأخرى بسهولة.
في الواقع، تسلسل الرنا الريباسي 16S لتحليل ميكروبيومي قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة ميكروبيوميس لناقلات الأمراض بما في ذلك البعوض، بسيليدس، وذباب التسي تسي29،،من3031. وتشمل أساليب أخرى لتحديد العوامل الجرثومية داخل الناقلة الفحص المجهري، واستزراع وتلطيخ نسيجية. قد تكون هذه الأساليب أكثر ملاءمة من التسلسل إذا كان الهدف هو تحديد ووصف ميكروب رواية (مجهرية)، وتقييم تأثير الأدوية المضادة للميكروبات (الثقافة)، أو ترجمة الميكروبات محددة ومعروفة في مكافحة ناقلات (تلطيخ نسيجية). ومع ذلك، هذه الأساليب يعانون من نوعية منخفضة، والكشف، وقابلية، وهكذا هي أقل ملاءمة لتحديد الطائفة الكاملة من الجراثيم داخل ناقل أو تميز ميكروبيومي ناقل تحت متفاوتة الإيكولوجية والتجريبية شروط. على العكس من ذلك، يتيح تحديد البكتيريا وفرة منخفضة وغير كولتورابل الفائق تسلسل الجين الرنا الريباسي 16S ويوفر دقة عالية والكشف عنها نظراً لقواعد بيانات مرجعية شاملة ويمكن أن توفر تبعاً للنسخ المتماثل عالية في تغطية الاحتياجات.
أثناء تسلسل الرنا الريباسي 16S الآن يستخدم على نطاق واسع لتحديد العوامل الجرثومية، هذا الأسلوب لا يخلو من القيود. أساسا، يمكن أن يحجب تفسير نتائج التسلسل التلوث الميكروبي وارباك معنى البيولوجية32. وعلاوة على ذلك، نظراً لاستخدام العالمي الإشعال البكتيرية والحساسية لانخفاض ابتداء من تركيزات المتأصلة لتسلسل الرنا الريباسي 16S، هو التلوث الميكروبي المشتركة32. وتشمل مصادر التلوث الكواشف بكر، مستلزمات استخراج الحمض النووي، مختبر الأسطح، والجلد والملبس الباحثين33،،من3435. يمكن التقليل من آثار الملوثات الميكروبية التي تعمل في بيئة معملية معقمة، باستخدام عناصر سلبية و replicates التقنية، والاحتفاظ بسجل لجميع مجموعات والكواشف المستخدمة36.
بالإضافة إلى التلوث بالجراثيم، يمكن إلى حد كبير يعوق إخراج تسلسل منخفضة الجودة قابليتها للاستخدام ميكروبيومي تسلسل البيانات. ويمكن تقييم نوعية بيانات عدد من مقاييس التشغيل بما في ذلك عدد القراءات تمرير مرشح، والنسبة المئوية للقراءات أعلاه على درجة Q (مقياس لتوقع احتمال الخطأ في استدعاء قاعدة) 30، وكثافة الكتلة. قيم لهذه المقاييس تختلف حسب عدد العينات تشغيل، نظام التسلسل، خرطوشة الكاشف، والنسبة المئوية لتسلسل عنصر تحكم المستخدم، ولكن القيم المثلى على أساس شروط التشغيل متوفرة على الإنترنت. على وجه الخصوص، كثافة الكتلة، عدد مجموعات المكتبة على متن طائرة معينة من الخلية تدفق قبل التسلسل، معلمة رئيسية لتحسين نوعية البيانات والإنتاجية. فوق وتحت المجموعات يمكن خفض إنتاج البيانات وتؤدي العينات التي يتم استبعادها من التحليل بسبب عدم كفاية التغطية. كثافة الكتلة الفقيرة غالباً ما يعكس التقدير الكمي مكتبة غير دقيقة؛ ومن ثم، ينبغي الحرص على أداء سليم الحمض النووي تنظيف، تقدير حجم العينة الفردية، والتقدير الكمي مكتبة كاملة.
بافتراض تحقيق بيانات عالية الجودة والمردود، النهج المتباينة في تحليل البيانات المستخدمة للتغلب على التحديات الإحصائية لمجموعات البيانات الكبيرة تشكل قيد آخر لهذا النهج. على سبيل المثال، توجد أساليب متعددة لمعالجة التباين في قراءة التهم بين العينات. المطروح، الذي ينطوي على العينات ما يلي لتحقيق عمق تسلسل متساوية عبر كافة العينات الفرعية، يستخدم بشكل متكرر ولكن قد تخضع لنقد مؤخرا لاهدار كميات كبيرة من البيانات واختيار ذاتي لعمق التسلسل الحد الأدنى37 ،،من3839. المبلغ التراكمي القياس (CSS)، الذي يحافظ على تسلسل جميع يقرأ لكن يزن لهم استناداً إلى مجموع تراكمي من التهم داخل القيمة مئوية المعطاة، وقد وضعت كأسلوب بديل. ومع ذلك، المغلق قد لا اعتمدت على نطاق واسع سبب الجدة النسبية وفائدة مؤكدة من الاستنفاد للتطبيع قبل حضور/غياب التحليلات.
كما تفتقر إلى إجراءات تحليل البيانات القياسية للتعامل مع ما يلي تسلسل في عناصر سلبية والتمييز بين هذه من القراءات وفرة منخفضة. ترتيب عناصر التحكم السلبية الناتجة من الخطوة استخراج الحمض النووي ينصح كما ذكر، للمساعدة في التمييز بين سكان ميكروبيومي النواقل صحيح من الملوثات الميكروبية أثناء التحليل. حتى الآن، يفتقر إلى نهج موحد ودقيق إحصائيا لتحديد وتصفية المواد الملوثة. نهج مشترك إزالة OTUs موجودة في عناصر سلبية من جميع العينات. ومع ذلك، قد تكون هذه الطريقة متحفظة أكثر من اللازم نظراً للعديد من هذه الميكروبات المحتمل تنبع من عينات حقيقية بدلاً من مجموعة الكواشف40. تقنية شائعة أخرى ينطوي على تجميع الميكروبات في < 1% في فئة "نادرة" على افتراض أن الملوثات الميكروبية نادرة في عينات حقيقية8،41. ومع ذلك، هذا الأسلوب قد إزالة الميكروبات النواقل صحيح موجودة في وفرة منخفضة، لا سيما عندما تهيمن ميكروبيومي اندوسيمبيونت كما رأينا في باسيفيكوس أولاً و أولاً هولوسيكلوس7،42. وفي هذه الحالات، الكشف عن الميكروبات نادرة تتطلب التسلسل أعمق، وضع الإشعال التي تمنع التضخيم اندوسيمبيونت خلال PCR amplicon42، أو إزالة حسابياً في اندوسيمبيونت أثناء تحليل تسلسل 7-اختيار بين مختلف الأساليب لمعالجة نادرة والملوث OTUs يخلق الفرصة للتحيز وعدم الموضوعية في تحليل البيانات ميكروبيومي، والتي قد تحد من القدرة على مقارنة النتائج عبر الدراسات.
اختيار قاعدة بيانات مرجعية، اللازمة لتعيين التصنيف والمعلومات النشوء والتطور لتسلسل ما يلي: فرصة أخرى للاختلاف والذاتية. بينما مهمة تتصل جينوم أصل التي تم تحديدها ما يلي تسلسل من منطقة جين متغير صعبة أصلاً، قاعدة بيانات مرجعية موثوق بها أمر حاسم لدقة الإحالة النشوء والتطور. وقد ظهرت قواعد بيانات متعددة لمواجهة هذا التحدي، مثل سيلفا43و44من جرينجينيس RDP45نكبي46. سيلفا أكبر من التصنيفات المستندة إلى 16، لكن سيلفا، فضلا عن برنامج التعمير والتنمية، ويوفر المعلومات التصنيفية وصولاً إلى مستوى جنس فقط. جرينجينيس يوفر معلومات على مستوى الأنواع ويتم تضمينها في حزم تحليلات الجينومية مثل كيم، ولكن أنه لم يتم تحديثه في أكثر من أربع سنوات. نكبي، في حين ليس مصدرا رئيسيا للمعلومات التصنيفية، يوفر تصنيفات محدثة يوميا من تسلسل المستخدم وقدم، ولكن أونكوراتيد. في حين يعتمد الاختيار بين قواعد البيانات عادة على احتياجات المستخدمين فيما يتعلق بالقرار، والتغطية، والعملة، له أثر كبير على الإحالة النشوء والتطور، وتحليل المتلقين للمعلومات47،48. وهكذا يتحتم توافق في الآراء بين المحققين فيما يتعلق بأي قاعدة بيانات مرجعية لاستخدام لتجنب التحيز إضافية في التحليلات.
سوف تظهر النهج الموحدة لهذه التحديات معالجة البيانات المحتمل أن تسلسل الرنا الريباسي 16S يصبح أسلوباً شائعا بصورة متزايدة. سيتم تعميم التخفيضات المتواصلة في تسلسل التكاليف والوقت كذلك هذا الأسلوب. وستمكن زيادة استخدام هذه التكنولوجيا تحقيقات أعمق في تكوينها وإيكولوجيا النواقل ميكروبيوميس تحت ظروف متنوعة. هذه الأنواع من الدراسات الوصفية كما علم البيولوجيا ميكروبيومي ناقل لا تزال في مهدها، خطوة أولى حاسمة سبقت محاولات للتأثير ميكروبيومي كوسيلة لمكافحة ناقلات الأمراض. ومع ذلك، حقاً فهم دور ميكروبيومي في انتقال العوامل الممرضة، تحديد العوامل الجرثومية يجب أن تقترن بالمعرفة للدور الوظيفي لهذه الميكروبات. تسلسل الحمض النووي الريبي والنهج ترانسكريبتوميك، والتي تنطوي على التعيين والتحديد الكمي للتعبير الجيني، تمكين استدلالات في الدور الوظيفي للميكروبات ولكن تتطلب التسلسل العميق وتجميعها الكامل الجينوم للأنواع المستهدفة. التحايل على هذه التحديات، أدوات حسابية للتنبؤ بتكوين الوظيفية من الرنا الريباسي 16S تسلسل البيانات قد وضعت مؤخرا ولكن لم تعتمد على نطاق واسع حتى الآن49. تطوير مثل هذه الأدوات، فضلا عن النظرية الإيكولوجية، ربط هوية الميكروبية ودور وظيفي داخل الناقلة ستزيد فائدة البيانات تسلسل الرنا الريباسي 16S في الدراسات ميكروبيومي متجه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها "المؤسسة الوطنية للعلوم" منحا إلى أ. س. (ديب #1427772، 1745411، 1750037).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
- Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
